1-oksoeudesmas-11 (13) -eno-12,8a-laktonas in vitro sukelia glioblastomos ląstelių g2 / m sulaikymą ir apoptozę | acta pharmaologica sinica

1-oksoeudesmas-11 (13) -eno-12,8a-laktonas in vitro sukelia glioblastomos ląstelių g2 / m sulaikymą ir apoptozę | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Norėdami ištirti naujojo eudesmane tipo seskviterpeno, išskirto iš Aster himalaicus , 1-oksoeudemo-11 (13) eno-12, 8a-laktono (OEL) poveikį ląstelių ciklui ir apoptozę žmogaus glioblastomos ląstelėse in vitro .

Metodai:

Buvo naudojamos žmogaus piktybinės glioblastomos U87 ir A172 ląstelių linijos. Citotoksiškumas OEL buvo ištirtas naudojant MTT analizę. Ląstelių apoptozė buvo įvertinta naudojant DAPI dažymą ir srauto citometriją. DNR pažeidimas buvo nustatytas išmatuojant H2AX fosforilinimą naudojant imunofluorescencinį dažymą ir Western blot analizę. Ląstelių ciklo profiliai buvo išmatuoti srauto citometrija. P53 ir p21Waf1 / Cip1 mRNR raiška buvo tiriama naudojant realaus laiko PGR. Γ-H2AX, kaspazės-9, kaspazės-3, p53, p21Waf1 / Cip1, ciklino B1 ir cdc2 baltymų ekspresija buvo analizuojama atliekant Western blot analizę.

Rezultatai:

Piktybinių glioblastomos ląstelių gydymas OEL slopino ląstelių augimą priklausomai nuo dozės ir laiko (IC 50 reikšmės 48 ir 72 val. Buvo atitinkamai 29, 5 ir 16, 99 μmol / L U87 ląstelėse; 7, 2 ir 9, 5 μmol / L atitinkamai A172 ląstelėse). OEL (10–30 μmol / l) sukėlė apoptozę ir G 2 / M fazės sustabdymą tiek U87, tiek A172 ląstelėse. OEL sukėlė cdc2, nuo C 2 / M fazės priklausomos kinazės, fosforilinimą ir sumažino ciklino B1 raišką, reikalingą progresuoti per G 2 / M fazę U87 ląstelėse. Šis junginys nepaprastai padidino H2AX fosforilinimą U87 ląstelėse. Be to, OEL padidino p53 ir jos tikslinio geno p21 Waf1 / Cip1 mRNR ir baltymų lygį U87 ląstelėse. Junginys taip pat sukėlė p53 fosforilinimą. Išankstinis gydymas PFT-α, specifiniu p53 transkripcijos aktyvumo inhibitoriumi, galėtų iš dalies panaikinti OEL slopinimą U87 ir A172 ląstelių gyvybingumui.

Išvada:

OEL slopina žmogaus glioblastomos ląstelių augimą in vitro , sukeldamas DNR pažeidimą, p53 sąlygotą ląstelių ciklo sustabdymą ir apoptozę, todėl būtina atlikti tolesnius tyrimus kaip pagrindinį anti-glioblastomos vaistą.

Įvadas

Piktybiniai gliomai, dažniausiai pasitaikantys pirminiai smegenų navikai, yra agresyvūs, sunkiai gydomi ir labai blogai prognozuojami. Pacientų, sergančių piktybinėmis gliomomis, išgyvenamumo vidurkis yra mažesnis nei 15 mėnesių, net atrinktose klinikinių tyrimų populiacijose ir naudojant multimodalinį gydymą, įskaitant chirurgiją, radioterapiją ir chemoterapiją 1 . Pagrindinės priežastys, lemiančios chemoterapijos nesėkmę piktybinėse gliomose, yra greitas vėžio ląstelių dauginimasis, dažnas vaistams atsparių fenotipų įgijimas ir antrinių piktybinių navikų atsiradimas 2, 3 . Be to, dar reikia nustatyti chemoterapijos naudą paciento prognozėms dėl pažengusių piktybinių gliomų. Todėl naujų ir piktybinei gliomai gydyti skirtų vaistų kūrimas yra svarbus ir neatidėliotinas rūpestis.

Apoptozė yra evoliuciškai konservuotas ir organizuotas ląstelių mirties procesas, kuriam būdingas membranos pūtimas, citoplazmos susitraukimas, DNR suskaidymas ir atskirų apoptozinių kūnų, kuriuose yra mirštančios ląstelės komponentai, formavimasis. Šis procesas taip pat yra pagrindinis chemoterapeutų sukeltas veikimo mechanizmas kovojant su vėžinėmis ląstelėmis 4, 5 . Tyrimai parodė, kad chemoterapija ir γ-švitinimas pirmiausia naikina vėžio ląsteles, sukeldami apoptozę 6, 7 . Todėl naujų priešvėžinių vaistų, sukeliančių apoptozę naviko ląstelėse, kūrimas yra patraukli strategija ir svarbus vėžio tyrimų srities tikslas 8, 9, 10 .

Chemikalai, trukdantys ląstelių ciklo progresui, tyrinėjant vėžį sulaukia vis didesnio dėmesio. Eukariotų ląstelių dalijimasis yra labai kontroliuojamas procesas 11 . Labai konservatyvios baltymų kinazių šeimos, tokios kaip nuo ciklino priklausomos kinazės (CDK), aktyvinimas skatina naviko progresavimą per ląstelių ciklą. CDK aktyvavimui reikia prisijungimo prie ciklinų, kurie yra norminiai subvienetai. Šie ciklino / CDK kompleksai yra universalūs ląstelių ciklo reguliatoriai, kurių kiekvienas kontroliuoja specifinį perėjimą tarp ląstelės ciklo fazių.

Natūralių augalų produktai yra vertingas naujų junginių, kurie gali būti naudojami kovojant su navikinėmis ląstelėmis, šaltinis. Įvairūs vaistai, tokie kaip taksanas, vinca alkaloidai ir hidroksikamptotecinas, yra gaunami iš žolelių augalų ir pasižymi puikiu antiproliferaciniu poveikiu prieš vėžines ląsteles 12, 13 . Aster ( Compositae ) gentį sudaro maždaug 250 augalų rūšių. Tradicinėje kinų medicinoje gydant gyvatės įkandimus, karščiavimą, peršalimą, tonzilitą ir pneumoniją buvo naudojama daugiau kaip 20 asterių rūšių 14 . Šiame tyrime mes ištyrėme 1-oksoeudesmą-11 (13) -eno-12, 8a-laktoną (OEL), naują, eudesmane tipo seskviterpeno junginį, išskirtą iš Kinijos žolelės Aster himalaicus , kurį aprašėme ankstesniame mūsų ankstesniame aprašyme. 14 ataskaita. Mes taip pat ištyrėme priešvėžinį OEL aktyvumą ir veikimo mechanizmus žmogaus piktybinių gliomų ląstelių linijose U87 ir A172.

medžiagos ir metodai

Chemikalai ir reagentai

Iš Aster himalaicus išskirtos OEL struktūra buvo nustatyta pagal spektrinius duomenis, kaip anksčiau aprašyta 14 (1A pav.). Išgrynintas OEL (> 98%) buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO) esant 10 mmol / l pradiniam kiekiui ir pagal bandymo reikalavimus atskiestas prireikus.

Image

(A) 1-oksoeudesmas-11 (13) eno-12, 8a-laktono (OEL) cheminė struktūra. (B, C) U87 ir A172 ląstelės buvo gydomos OEL (nuo 5 μmol / L iki 40 μmol / L) nuo 24 iki 72 h. Ląstelių gyvybingumas buvo nurodytas kaip negydyto kontrolinio preparato procentinė dalis (OEL 0 μmol / L) tuo pačiu metu. Duomenys išreiškiami kaip trijų bandinių eksperimentų vidurkis ± SD.

Visas dydis

3- (4, 5-dimetiltiazol) -2, 5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) ir 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolis (DAPI) buvo įsigyti iš „Sigma Co“, JAV. Galvijų vaisiaus serumas (FBS) ir Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM) buvo gauti iš GIBCO BRL (Gaithersburg, MD). Visos kitos cheminės medžiagos buvo reagentų klasės komerciniai produktai.

Pradinis OEL tirpalas buvo paruoštas 10 mmol / L koncentracijos DMSO ir iki naudojimo buvo laikomas –20 ° C. Visiems eksperimentams galutinė bandomo junginio koncentracija buvo paruošta praskiedžiant pradinį mišinį DMEM. Kontrolinės kultūros buvo gautos nešiklio tirpiklyje (0, 1% DMSO).

Ląstelių linijos ir ląstelių kultūra

U87 ir A172 (su plataus tipo p53), U251 (su mutantu p53) ir „Saos-2“ (su p53 trūkumu) ląsteles maloniai pateikė Dr. Bing YAN ir Dr. Changjun ZHU iš Shandong universiteto. Normalios ląstelių linijos, įskaitant žmogaus hepatocitų ląstelių liniją (HL7702), žiurkės kardiomiocitų ląstelių liniją (H9C2) ir pelių embriono fibroblastų ląstelių liniją (3T3), buvo gautos iš Šanchajaus biologinių mokslų instituto (SIBS), Kinijos mokslų akademijos. (Kinija). Visos ląstelių linijos buvo palaikomos DMEM (Gibco, Invitrogen) arba RPMI-1640 (Hyclone) terpėje, papildytoje 10% FBS, 100 vienetų / ml penicilino G ir 100 μg / ml streptomicino, drėgnoje 37 ° C atmosferoje. ir 5% CO 2 .

Citotoksiškumo tyrimas

Citotoksiškumas OEL buvo įvertintas naudojant MTT tyrimą. Ląstelės buvo kultivuojamos 5 × 103 ląstelių / šulinėlio tankumu 96 šulinėlių plokštelėse (Costar, Kembridžas, Masačusetsas, JAV) per naktį. Po dvidešimt keturių valandų ląstelės buvo apdorotos nešikliu arba PFT-α nurodytomis koncentracijomis 1 valandą prieš nurodyto laiko tarpą skiriant OEL. Tada į kiekvieną duobutę įpilama 20 μL MTT (5 g / l) ir inkubuojama 4 valandas 37 ° C temperatūroje. IC50 vertės (koncentracija, sukelianti 50% ląstelių augimo slopinimą) buvo apskaičiuotos nubraižant rezultatus, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis, kurios buvo laikomos 100%. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais.

Imunofluorescencinis dažymas

Ląstelės buvo pasėtos ant 12 mm apvalių stiklinių dangtelių plokštelių 24 šulinėlių plokštelėse. Likus nuliui iki 6 val. Po OEL apdorojimo, ląstelės buvo fiksuotos šaltu metanolio: acetonu (1: 1) 5 minutes, du kartus plaunamos šaltu PBS ir permeabilizuojamos 0, 1% Triton X-100 10 minučių. Siekiant užkirsti kelią nespecifiniam antikūnų prisijungimui, ląstelės buvo inkubuotos su 3% ožkos serumu. Tada dangtelio plokštelės 2 valandas buvo inkubuojamos su anti-fosfo-H2AX antikūnu, plaunamos PBS ir 1 valandą kambario temperatūroje inkubuojamos su TRITC konjuguotu ožkos anti-triušio antriniu antikūnu. Tada ląstelės tris kartus plaunamos PBS ir prieš tai išlaikomos DAPI. Fluorescenciniai vaizdai buvo užfiksuoti konokaliniu mikroskopu 15 .

Apoptozės analizė srauto citometrija

Apoptozei įvertinti buvo naudojamas „BD Pharmingen Annexin V“: FITC apoptozės aptikimo rinkinys. Į 6 duobučių plokšteles ląstelės buvo sėjamos 3 x 104 ląstelių / ml tankumu. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės buvo veikiamos įvairiomis OEL koncentracijomis ir inkubuojamos dar 24 valandas. Nurodytais laiko momentais ląstelės buvo du kartus plaunamos lediniu PBS ir tripsinu. Tada 100 μl kiekvieno ląstelės mėginio buvo perkelta į atskirus mėgintuvėlius ir 5 minutes centrifuguota 200 x g greičiu. Supernatantas buvo pašalintas, o ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 100 μl aneksino V-FITC rišančio buferio ir inkubuojamos kambario temperatūroje tamsoje 15 min. Su 5 μL aneksino V-FITC. Tada 5 minutes buvo pridėta 5 μL propidium jodido (PI; 50 mg / l). Remiantis gamintojo instrukcijomis, apoptozinis santykis buvo analizuojamas srauto citometrijos (Becton Dickinson, JAV) 16 ir WinMDI 2.9 programine įranga. Anneksino V teigiamos ląstelės buvo laikomos apoptozinėmis.

RNR ekstrahavimas ir santykinis kiekybinis įvertinimas realaus laiko PGR

Bendra RNR buvo ekstrahuota naudojant „RNAeasy“ rinkinį pagal gamintojo instrukcijas (Bioecon Biotec Co Ltd, Kinija). RNR grynumas buvo matuojamas apskaičiuojant RNR mėginių OD 260/280 (> 1, 8). cDNR buvo susintetinta naudojant atvirkštinę transkripciją, naudojant M-MLV atvirkštinę transkriptazę ir Oligo (dT) pradmenis. P53 ir p21 Waf1 / Cip1 genų ekspresijos lygiai buvo nustatyti naudojant realaus laiko PGR testus. PGR amplifikacija buvo atlikta trimis egzemplioriais 8 vamzdelių juostelių formatu (Axygen, Union City, CA), naudojant „Mastercycler ep realplex“ aparatą (Eppendorf, Vokietija). Kiekvienoje reakcijoje buvo 1 × SYBR Green PCR Master mišinys, 1 μL priekinis gruntas ir atvirkštinis pradmuo bei 1 μL šablono cDNR, kurio galutinis tūris buvo 20 μL. P53 ir p21 Waf1 / Cip1 genų ekspresijai aptikti buvo naudojami šie pradmenys: sensas: 5′-TAACAGTTCCTGCATGGGCGGC-3 ′ ir antisense: 5′-AGGACAGGCACAAACACGCACC-3 ′, produkto dydis 121 bp; prasmė: 5′-CACTCCAAACGCCGGCTGATCTTC-3 ′ ir antisense: 5′-TGTAGAGCGGGCCTTTGAGGCCCTC-3 ′, produkto dydis 101 bp 17 . GAPDH genui, kuris buvo viso RNR kiekio kontrolė, buvo naudojami šie pradmenys: senso: 5′-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3 ′ ir antisense: 5′-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC -3 ′. Amplifikacija buvo atliekama 45 nuoseklios denatūracijos (95 ° C, 2 min.), Atkaitinimo (60 ° C, 15 s) ir prailginimo (72 ° C, 20 s) ciklais. Duomenų rinkimas ir realiojo laiko PGR tyrimo analizė buvo atlikta naudojant Mastercycler ep realplex. Kiekvienas fluorescencinio reporterio signalas buvo išmatuotas pagal vidinį etaloninį dažų signalą, kad būtų galima normalizuoti su PCR nesusijusius fluorescencijos svyravimus tarp šulinėlių. Visiems mėginiams realaus laiko PGR buvo atlikta per tris nepriklausomus eksperimentus. Visi pradmenys buvo susintetinti „Sangon Co, Ltd“ (Šanchajus, Kinija).

Ląstelių ciklo pasiskirstymas srauto citometrine analize

Ląstelės buvo sėjamos į 6 šulinėlių plokšteles ir apdorojamos skirtingomis OEL koncentracijomis. Pasibaigus nustatytiems laiko intervalams, ląstelės buvo atskirtos tripsinu ir surinktos centrifuguojant, po to plaunant, fiksuojant ir dažant PI. Ląstelių ciklo pasiskirstymas buvo ištirtas srauto citometrijos metodu, o duomenys buvo analizuojami naudojant Modfit programą (Becton Dickinson, JAV).

Western blot analizė

Baltymai iš sveikų ląstelių lizatų buvo analizuojami Western blot metodu. Mėginiai virinami 1 × Laemmli buferiu, jiems buvo atlikta 12% SDS-poliakrilamido gelio elektroforezė ir perkelta į nitroceliuliozės membranas. Membranos buvo nuplaunamos distiliuotu vandeniu ir užblokuotos 5% neriebiu pienu TBS-T buferyje (10 mmol / l Tris-HCl, 150 mmol / L NaCl ir 0, 05% ( t / t ) Tween-20; pH). 7.8) mažiausiai 1 valandą kambario temperatūroje. Po trumpo plovimo TBS-T buferiu, membranos buvo inkubuotos tirpale, kuriame yra monokloninių antikūnų, būdingų kaspazei-9, p53, p21 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, JAV), suskaidytai kaspazei-3, GAPDH, γ-H2AX ( Cell Signal Technology, JAV), ciklinas B1, cdc2, p-cdc2 (Thr14 ir Tyr15) (Bioworld Technology, Inc, JAV) mažiausiai 2 valandas kambario temperatūroje arba per naktį 4 ° C temperatūroje. Po to membranos buvo inkubuotos su biotinu konjuguotu ožkos anti-pelės IgG arba anti-triušio IgG antriniu antikūnu (praskiestu santykiu 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc, JAV). Baltymai buvo vizualizuojami naudojant patobulintą chemiliuminescencijos aptikimo sistemą (ECL ®, Amersham Biosciences).

Statistinė analizė

Visi eksperimentai buvo atlikti bent tris kartus. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant dispersijos analizę (ANOVA), po kurios sekė Turkijos t- testas. P vertės <0, 05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.

Rezultatai

OEL slopina ląstelių išgyvenimą žmogaus glioblastomos ląstelėse

Mes atlikome MTT kolorimetrinį tyrimą, norėdami įvertinti citotoksinį OEL poveikį žmogaus glioblastomos ląstelių proliferacijai. Dvi žmogaus glioblastomos ląstelių linijos (U87 ir A172) buvo gydomos OEL nuo 24 iki 72 valandų. OEL gydymas sukėlė nepaprastą augimo slopinimą priklausomai nuo dozės ir laiko (1B ir 1C paveikslai) tiek U87, tiek A172. UEL ląstelėse OEL IC50 per 48 ir 72 valandas buvo atitinkamai 29, 5 ir 16, 99 μmol / L, o A172 ląstelėse - atitinkamai 7, 2 ir 9, 5 μmol / L.

Be to, mes išbandėme OEL poveikį dviem papildomoms vėžio ląstelių linijoms (U251 ir Saos-2) ir trims normalioms ląstelių linijoms (HL7702, H9C2 ir 3T3). Kaip parodyta 1 lentelėje, OEL slopino U251 ir Saos-2 ląstelių augimą, o OEL buvo mažiau citotoksiškas normalioms ląstelių linijoms, palyginti su šiomis vėžio ląstelių linijomis. OEL IC50 per 48 valandas HL7702, H9C2 ir 3T3 ląstelėse buvo atitinkamai 45, 89, 75, 31 ir 73, 02 μmol / L (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

OEL sukelia apoptozinį poveikį U87 ir A172 ląstelėms

Norėdami apibūdinti ląstelių augimo slopinimą reaguojant į OEL, mes stebėjome U87 ląstelių morfologijos pokyčius. Palyginti su kontrolinėmis medžiagomis, OEL gydymas sukėlė ryškius morfologinius pakitimus, susijusius su apoptoze, įskaitant ląstelių susitraukimą ir granuliuotus apoptozinius kūnus (2A pav.).

Image

OEL sukelta apoptozė buvo pastebėta U87 ir A172 ląstelėse. Ląstelės 24 valandas buvo veikiamos OEL (0, 10, 20 ir 30 μmol / l). (A) neapdorotų ir OEL apdorotų U87 ir A172 ląstelių fluorescenciniai mikroskopai po DAPI dažymo; padidinimas: × 63. (B, C) OEL sukeltos apoptozės U87 ir A172 ląstelėse kiekybinis įvertinimas naudojant srauto citometrinę analizę. b P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su kontroline (OEL, 0 μmol / L) grupe.

Visas dydis

Srauto citometrija buvo naudojama kiekybiškai analizuoti apoptozę U87 ląstelėse, naudojant dvigubą dažymą FITC-aneksinu V ir propidium jodidu (PI). Srauto citometrinė analizė parodė, kad ląstelių, nudažytų aneksinu V, dalis padidėjo OEL apdorotose ląstelėse priklausomai nuo dozės. Anneksino V teigiamų ląstelių procentas po gydymo 24 μmol / l - 30 μmol / L OEL 24% buvo 8, 9%, 14, 8%, 18, 9% ir 46, 7% (U87) ir 1, 4%, 16, 8%, 35, 7%, ir 47, 3% (A172) (2B ir 2C paveikslai).

OEL sukelia G 2 / M fazės sustabdymą U87 ir A172 ląstelėse

Patekę į skirtingas OEL koncentracijas nurodytais laiko tarpais, mes panaudojome srauto citometriją, norėdami ištirti ląstelių ciklą ir nustatyti, ar OEL slopinantį poveikį sukėlė ląstelių ciklo sustabdymą, be apoptozės. OEL pakeitė U87 ir A172 ląstelių ląstelių ciklo pasiskirstymą (3A ir 3C paveikslai). Ląstelių procentas G 2 / M fazėje padidėjo kartu sumažėjus ląstelėms G 0 / G 1 fazėje. Ląstelių, sulaikytų G 2 / M fazėje, dalis pastebimai padidėjo esant didesnei OEL koncentracijai (20 ir 30 μmol / L) U87 ląstelėse. Tada mes išanalizavome U87 ląstelių, apdorotų OEL 48 ir 72 valandas, ciklo profilį. Nesant OEL, tik 2, 06% U87 ląstelių buvo G / M fazėje (3C paveikslas). Po OEL apdorojimo 48 valandas (19, 9%) ir 72 h (27, 6%) reikšmingai U87 ląstelės kaupėsi G 2 / M. Palyginti su negydytomis ląstelėmis, po OEL valymo 48 val., Dramatiškai padaugėjo sub-G1 populiacijos. Šis rezultatas rodo, kad OEL prieš apoptozės indukciją sukėlė G2 / M fazės sustojimą. Taigi šie rezultatai rodo, kad OEL sukelia ląstelių ciklo sustojimą G 2 / M fazėje, o po to seka apoptozė priklausomai nuo dozės ir laiko.

Image

OEL sukeltas ląstelių ciklo sustojimas G 2 / M fazėje. (A) Ląstelės 24 valandas buvo gydomos įvairiomis OEL koncentracijomis (0–30 μmol / L), o ląstelių ciklo profilis buvo įvertintas naudojant srauto citometriją. Reprezentatyvūs U87 ir A172 ląstelių ciklų profiliai. (B) reprezentatyvios U87 ląstelių, apdorotų OEL 24 valandas, ląstelių ciklo pasiskirstymo histogramos. Duomenys parodomi kaip keturių nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. c P <0, 01, palyginti su kontroline (OEL, 0 μmol / L) grupe. (C) U87 ląstelių, apdorotų OEL, ląstelių ciklo modeliai 0, 48 ir 72 valandas, naudojant srauto citometrinę analizę.

Visas dydis

Ląstelių ciklo baltymai ir kaspazės aktyvavimas yra OEL sukeltos G 2 / M fazės sustabdymas ir apoptozė

Tada Western blotting buvo naudojamas analizuoti ląstelių ciklą reguliuojančius baltymus, susijusius su G 2 / M faze, įskaitant cikliną B1, cdc2 ir fosforilintą cdc2 (p-cdc2) U87 ląstelėse po apdorojimo 10–30 μmol / l OEL. 24 val. Reaguodami į OEL gydymą, stebėjome ciklino B1 ekspresijos sumažėjimą ir cdc2 fosforilinimo indukciją (Thr14 ir Tyr15), tuo tarpu absoliutus cdc2 baltymų lygis neturėjo įtakos (4A pav.).

Image

Ląstelių ciklo kontrolinio taško baltymų ekspresijos Western blot analizė ir kaspazės-9 bei kaspazės-3 aktyvacija bendrame OEL apdorotų U87 ląstelių ląstelių lizate. Ląstelės, apdorotos OEL (0, 10, 20 ir 30 μmol / L) 24 valandas, buvo tiriamos Western blot. (A) OEL neturėjo įtakos cdc2 lygiui, tačiau padidino p-cdc2 (Thr14, Tyr15) lygį ir sumažino ciklino B1 kiekį U87 ląstelių lyzatuose. (B) OEL paskatino kaspazės-9 ir kaspazės-3 aktyvaciją U87 ląstelėse.

Visas dydis

U87 ląstelės 24 valandas buvo gydomos įvairiomis OEL koncentracijomis, o kaspazės-9 ir kaspazės-3 aktyvumas buvo nustatytas Western blot metodu. OEL skatino kaspazės-9 ir kaspazės-3 (4B paveikslas) aktyvaciją priklausomai nuo dozės. Šie rezultatai rodo, kad OEL sukeltą apoptozę sukelia kaspazės-9 ir -3 aktyvacija U87 ląstelėse.

OEL sukelia DNR pažeidimą žmogaus glioblastomos ląstelėse

DNR pažeidimas sukelia ląstelių ciklo sustabdymą ir apoptozę 18 . Norėdami išsiaiškinti galimus OEL sukeltų G 2 / M sulaikymo ir apoptozės mechanizmus, įvertinome H2AX (γ-H2AX) fosforilinimo pokyčius OEL apdorotose U87 ląstelėse. H2AX, varianto formos H2A histonas, tampa fosforilinamas (γ-H2AX) prie 139 serino, reaguodamas į DNR dvigubų stygų pertraukas 19 . Palyginti su neapdorotomis ląstelėmis, OEL gydymas padidino H2AX fosforilinimą po 2 val., Kaip nustatyta dažant imunofluorescenciniu tyrimu ir imunoblotų analize (5 pav.). Šie rezultatai rodo, kad OEL sąlytis sukelia DNR pažeidimą, taip sukeldamas ląstelių ciklo sustojimą ir apoptozę.

Image

DNR pažeidimo U87 ląstelėse, apdorotose OEL, matavimas. (A) γ-H2AX židinių imunofluorescencinis dažymas U87 ląstelėse. Ląstelės buvo valomos OEL (30 μmol / L) 0–6 valandas ir 1 valandą dažytos pelių anti-γ-H2AX antikūnais ir TRITC konjuguotu ožkos anti-triušio antriniu antikūnu (raudona). Branduoliai buvo priešpriešiniai naudojant DAPI. (B) γ-H2AX Western blot analizė U87 ląstelėse po OEL apdorojimo.

Visas dydis

OEL padidina p53 ir p21 Waf1 / Cip1 raiškos lygius

Western blot analizė ir RT-PCR analizė atskleidė, kad p53 ir p21 Waf1 / Cip1 mRNR ir baltymų lygiai buvo žymiai sureguliuoti po 6–12 val. OEL (6A ir 6B paveikslai).

Image

(A) p53 ir p21 Waf1 / Cip1 ekspresijos Western blot analizė OEL apdorotų U87 ląstelių lizatuose. (B) p53 ir p21 Waf1 / Cip1 mRNR santykinė išraiška U87 ląstelėse. Ląstelės buvo apdorotos 30 μmol / L OEL arba be jo 6 ir 12 valandų. P53 ir p21 Waf1 / Cip1 mRNR santykinė išraiška buvo nustatyta kiekybiškai atlikus realaus laiko PGR. RNR lygis (normalizuotas iki GAPDH RNR lygio) nurodomas kaip padidėjimas arba sumažėjimas raukšlės lyginant su kontroliniu štamu. Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD.

Visas dydis

OEL sukeltas ląstelių ciklo sustabdymas ir apoptozė priklauso nuo p53 funkcijos

Norėdami ištirti p53 indėlį į OEL sukeltą ląstelių žūtį, stebėjome ląstelių gyvybingumą su PFT-α, specifiniu p53 transkripcijos aktyvumo inhibitoriumi, arba be jo, nesant OEL ir A872 ląstelėse OEL ar jos nėra. Iš anksto apdorojus ląsteles nuo 10 μmol / L iki 30 μmol / L PFT-α, buvo užtemdytas slopinamasis OEL poveikis ląstelių gyvybingumui ir iš dalies panaikinta OEL sukeltos apoptozė U87 (7A ir 7C pav.) Ir A172 ląstelėse (7B ir 7D paveikslai). . Be to, buvo tiriama OEL sukelta apoptozė U251 (mutantas p53) ir Saos-2 ląstelėse (trūko p53). OEL sukelta apoptozė U251 ir Saos-2 ląstelėse buvo mažiau dramatiška nei U87 ir A172 ląstelėse (8A ir 8B paveikslai). Šie duomenys rodo, kad OEL sukelta apoptozė priklauso nuo p53 funkcijos.

Image

PFT-α poveikis OEL sukeltai ląstelių gyvybingumo sumažėjimui ir apoptozės padidėjimui U87 ir A172 ląstelėse. Ląstelės 24 val. Buvo gydomos 30 μmol / L OEL, esant arba neturint 10–30 μmol / L PFT-α. Ląstelių gyvybingumo santykis (A, B) ir apoptozinis santykis (C, D, E, F) buvo išmatuoti MTT ir srauto citometrine analize. b P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su vien OEL grupe. Duomenys išreiškiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD.

Visas dydis

Image

OEL sukeltas poveikis pastebėtas U251 (mutantinių p53 glioblastomos ląstelių linija) ir Saos-2 (p53 trūkumo osteosarkomos ląstelių linijoje). (A, B) OEL sukėlė apoptozę U251 ir Saos-2 ląstelėse. (C, D) OEL sukeltas ląstelių ciklo sulaikymas buvo įvertintas atliekant citometrinę analizę U251 ir Saos-2 ląstelėse. Atitinkamos ląstelių ciklo pasiskirstymo histogramos (E, F). b P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

U251 ir Saos-2 ląstelės buvo nudažytos PI ir išanalizuotos srauto citometrija, siekiant patvirtinti, kad p53 vaidina lemiamą vaidmenį OEL sukeltoje G 2 / M sulaikyme. Reaguodamos į OEL gydymą, U251 (8C ir 8E paveikslai) ir Saos-2 (8D ir 8F paveikslai) ląstelės nesikaupė G 2 / M fazėje, palyginti su U87 ir A172 ląstelėmis. Mes taip pat ištyrėme ląstelių ciklo pasiskirstymo pokyčius su PFT-α (specifiniu p53 transkripcijos aktyvumo inhibitoriumi) arba be jo, nesant OEL ir A872 ląstelėse ar jų nėra. Kaip parodyta 9 paveiksle, p53 specifinis transkripcijos inhibitorius PFT-α iš dalies pakeitė OEL poveikį G 2 / M sulaikymui. Šie rezultatai dar patvirtina, kad OEL sukeltas G 2 / M sulaikymas priklauso nuo p53 funkcijos.

Image

PFT-α poveikis OEL sukeltų ląstelių ciklo sustojimui G 2 / M fazėje U87 ir A172 ląstelėse. (A, B) Ląstelės buvo veikiamos 30 μmol / L OEL 24 valandas, esant arba 20 μmol / L PFT-α. Ląstelių ciklo pasiskirstymas buvo įvertintas srauto citometrine analize. Atitinkamos ląstelių ciklo pasiskirstymo histogramos (C, D). b P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su kontroline grupe. Duomenys išreiškiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD.

Visas dydis

Diskusija

1-oksoeudesmas-11 (13) -eno-12, 8a-laktonas (OEL) (1A pav.) Yra naujas, eudesmano tipo seskviterpeno junginys, pasižymintis priešvėžinėmis savybėmis. Pagrindiniai šio tyrimo tikslai buvo parodyti priešvėžines OEL savybes ir apibrėžti pagrindinius veikimo mechanizmus. Čia mes parodome, kad OEL daro įtaką glioblastomos ląstelių augimui, trukdydamas ląstelių ciklo progresui ir sukeldamas apoptozę. Taip pat buvo išsamiai ištirti signalizacijos keliai, kuriais OEL daro biologinį poveikį.

OEL reikšmingai sumažino U87 ir A172 glioblastomos ląstelių gyvybingumą priklausomai nuo koncentracijos ir laiko. Kaip atskleidė imunofluorescencija, OEL apdorotos ląstelės turėjo akivaizdžių apoptozės ląstelių ypatybių. Be to, atliekant kiekybinę fosfatidilserino pašalinimo analizę naudojant aneksiną V-FITC ir PI dažymą, paaiškėjo, kad apdorojant OEL, aneksino V teigiamų ląstelių populiacija padidėjo. Šis reiškinys patvirtino, kad OEL sukelia apoptozę U87 ir A172 glioblastomos ląstelėse.

Ląstelių ciklo trukdžiai yra vienas iš svarbiausių mechanizmų, susijusių su priešvėžinių vaistų citotoksiniu poveikiu ir apoptozė20. Srauto citometriniai rezultatai parodė, kad glioblastomos ląstelių linijų gydymas OEL reikšmingai slopino ląstelių ciklo progresavimą ir sulaikė ląsteles G 2 / M fazėje. Ląstelių ciklo metu G 2 / M patikros taškas yra galimas vėžio terapijos taikinys, kuris neleidžia DNR pažeistoms ląstelėms patekti į mitozę ir leidžia atkurti DNR, kuri buvo pažeista vėlyvosiose S arba G 2 fazėse, prieš mitozę 21 . Iš pradžių ciklino B / cdc2 kompleksas buvo apibrėžtas kaip brendimą skatinantis faktorius. Komplekso aktyvumas kontroliuojamas G 2 / M fazėje ir reikalingas norint patekti į mitozę eukariotuose. G2 fazės metu ciklinas B / cdc2 yra inaktyvuotas fosforilinant du reguliavimo likučius - Thr14 ir Tyr15. Thr14 ir Tyr15 defosforilinimas cdc25c pavidalu vėlyvojoje G 2 fazėje aktyvina ciklino B / cdc2 kompleksą ir sukelia mitozės pradžią 22, 23 . Mes ištyrėme pagrindinių baltymų, dalyvaujančių ląstelių ciklo reguliavime, raiškos pokyčius, kad išaiškintume mechanizmą, kuriuo OEL sukelia G2 / M sulaikymą. Mes stebėjome cdc2 būklę po gydymo įvairiomis OEL koncentracijomis ir pastebėjome, kad po gydymo padidėja slopinantis cdc2 (p-cdc2) fosforilinimas, o bendras cdc2 lygis nepakito. Kaip alternatyva, ciklino B1 baltymo lygis kinetiškai elgėsi skirtingai - sumažėjo po 24 val. Taigi, padidėjęs cdc2 fosforilinimas ir sumažėjusi ciklino B1 ekspresija rodo, kad OEL sukeltos G 2 / M fazės sustabdymas U87 glioblastomos ląstelėse yra susijęs su slopinančiu cdc2 aktyvumą. Ląstelių ciklo progresavimo sustabdymas G 2 / M fazėje suteikia ląstelėms galimybę arba atlikti remonto mechanizmus, arba sekti apoptozės keliu.

Tyrimai parodė, kad p53 yra svarbus naviką slopinantis baltymas, veikiantis kaip branduolio transkripcijos faktorius ir transaktivizuojantis daugelį genų, dalyvaujančių apoptozėje, ląstelių ciklo reguliavime ir daugelyje kitų procesų. 6, 17, 24 . Šiame tyrime mes parodėme, kad OEL stipriai padidino p53 fosforilinimą ir p53 bei p21 Waf1 / Cip1, kurie yra pagrindinis p53 transkripcijos taikinys, mRNR raiškos lygius. Mūsų rezultatai atskleidė, kad apoptozės indukcija ir ląstelių gyvybingumo sumažėjimas reaguojant į OEL buvo mažiau dramatiški U251 (mutantas p53) ir Saos-2 (p53 trūkumas) ląstelėse nei U87 ir A172 ląstelėse. Be to, specifinis p53 transkripcijos inhibitorius PFT-α iš dalies panaikino OEL poveikį U87 ir A172 ląstelių proliferacijai ir apoptozei. Todėl, norint OEL slopinti ląstelių augimą, reikalingas funkcinis p53.

P53 prisideda prie DNR vientisumo palaikymo ir kontroliuoja mitozinius verpstės tikrinimo taškus, kurie užkerta kelią DNR sintezei prieš chromosomų atskyrimą 25 . Be to, p21 Waf1 / Cip1 yra nuo ciklino priklausomas kinazės inhibitorius, būtinas visose 26 ląstelių ciklo fazėse. CyclinB1 yra reguliuojamasis cdc2 kinazės subvienetas ir reikalingas mitozės inicijavimui. Šiame tyrime OEL sukėlė p21 Waf1 / Cip1 ir sumažino ciklinB1, todėl sukėlė ląstelių ciklo sustojimą G2 fazėje. Be to, specifinius p53 inhibitorius OEL sukeltą G 2 / M fazės sustabdymą gali iš dalies pakeisti; tačiau poveikis nėra toks akivaizdus U251 ląstelėse (mutantinis p53) ir Saos-2 ląstelėse (trūksta p53) nei U87 ir A172 ląstelėse (laukinio tipo p53). Šie radiniai rodo, kad p21 / WAF1 aktyvacija per p53 kelią lemia OEL sukeltą ląstelių ciklo progreso blokadą.

DNR pažeidimas yra vienas iš molekulinių įvykių, susijusių su ląstelių ciklo sustabdymu ir apoptozė, o keli priešvėžiniai reagentai sukelia DNR pažeidimą 27 . Šiame tyrime OEL po 2 valandų gydymo padarė DNR žalą, tai patvirtina susidarę γ-H2AX židiniai ir padidėjęs γ-H2AX baltymų kiekis. p53 sukelia įvairius ląstelių ciklo reguliavimo įvykius, norėdamas apriboti pažeistų ląstelių dauginimąsi, reaguodamas į DNR žalą. Tada prasideda p53 kontroliuojamas ląstelių ciklas, padidėjus p21 baltymų ekspresijai, sulaikant ląsteles G 2 / M fazėje ir suteikiant laiko DNR pataisymui 28 . Tačiau p53 baltymai aktyvuoja įvairių su apoptoze susijusių genų transkripciją, kai DNR pažeidimas viršija ląstelės atkuriamąjį pajėgumą, sukeldamas apoptozę 29 .

p53 taip pat gali sustiprinti tik proapopotinių BH3 turinčių baltymų Noxa ir Puma, kurie netiesiogiai skatina Bax aktyvaciją, slopindami antiapoptotinius baltymus Bcl-2 arba Bcl-xL 30, rezultatus ir sukelia mitochondrijų membraną. permeabilizacija ir citochromo c išsiskyrimas, sukeliantis apoptozę ir kaspazės aktyvaciją. Šis tyrimas rodo, kad OEL suaktyvintos kaspazės-9 ir -3 yra U87 ląstelėse, o tai patvirtina kaspazės suaktyvintą kelią OEL sukeltai apoptozei glioblastomos ląstelėse.

Šiame tyrime OEL slopina augimą glioblastomos ląstelėse. U87 ir A172 ląstelės (laukinio tipo p53) pasižymi didesniu jautrumu OEL nei U251 (mutantas p53) ir Saos-2 (trūksta p53). OEL buvo mažiau citotoksiškas normalioms ląstelėms, palyginti su navikinių ląstelių linijomis, ir tai rodo, kad šis junginys yra perspektyvus glioblastomos gydymui.

Todėl OEL slopina glioblastomos U87 ir A172 ląstelių dauginimąsi per DNR pažeidimus, o tai dar labiau skatina p53 aktyvaciją ir sukelia nuo p53 priklausomas ląstelių reakcijas, įskaitant ląstelių ciklo sustabdymą ir apoptozę. Dabartinė OEL būklė ir būsima pažanga bus naudinga kuriant chemoterapinius vaistus nuo glioblastomos.

Autoriaus indėlis

Prof. Xia LI sukūrė tyrimą ir peržiūrėjo rankraštį; Shan-shan LIU atliko tyrimą, išanalizavo duomenis ir parašė darbą; Dalis tyrimų padėjo Yan-feng WANG, Li-sha MA, Bei-bei ZHENG, Lin LI ir Wei-dong XIE.