Resveratrolio darinys 4′-chlor-3,5-dihidroksistilbenas sukelia plaučių vėžio ląstelių žūtį | acta pharmaologica sinica

Resveratrolio darinys 4′-chlor-3,5-dihidroksistilbenas sukelia plaučių vėžio ląstelių žūtį | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti resveratrolio darinio 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno priešnavikinį poveikį plaučių adenokarcinomos A549 ląstelėms.

Metodai:

Citotoksinis IC50 buvo nustatytas tiesiogiai skaičiuojant ląsteles. Srauto citometrija, monodansilkadaverino (MDC) dažymas, transfekcija, Western blot ir proteasomų aktyvumo tyrimas buvo naudojami tiriant 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno ląstelių mechanizmą. Priešnavikinio poveikio in vivo analizei buvo naudojamas ksenografas nuogas pelės modelis.

Rezultatai:

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė greitą ir nuolatinį ląstelių reaktyviųjų deguonies rūšių padidėjimą ląstelėse, tačiau ląstelių žūties negalėjo slopinti du antioksidantai. Darinys sukėlė sub-G1 susidarymą, mitochondrijų membranos potencialo sumažėjimą ir poli (ADP-ribozės) polimerazės skilimą, o kaspazės inhibitorius Z-VAD-FMK galėjo iš dalies išvengti ląstelių mirties. Tai taip pat sukėlė reikšmingą tarpląstelinių rūgščių vakuolių padidėjimą, LC3-II susidarymą ir tarpląstelinę GFP-LC3 agregaciją. Autofaginis inhibitorius iš dalies panaikino ląstelių mirtį. Be to, 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė visur esančių konjugatų kaupimąsi ir slopino proteasomų aktyvumą ląstelėse. In vivo tyrime 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sulėtino auglių augimą nuogas pelėms.

Išvada:

Šie duomenys rodo, kad resveratrolio darinys 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas galėtų būti sukurtas kaip priešnavikinis junginys.

Įvadas

Ieškant naujų vėžio chemoprevencinių ir chemoterapinių vaistų per pastaruosius kelerius metus, noras sukurti naujas medžiagas iš žmonių vartojamų vaisių ir daržovių buvo pageidautinas tikslas. Resveratrolis (3, 5, 4′-trihidroksi-trans-stilbenas) yra vienas iš natūralių fitoeleksinų, kuriuos gamina įvairūs augalai, pavyzdžiui, vynuogės, žemės riešutai ir šilkmedžiai, reaguodami į stresą, žalą, ultravioletinį spindulį, švitinimą ar grybelinė infekcija 1 . Todėl manoma, kad biologinė resveratrolio funkcija yra augalų apsauga nuo grybelių ir aplinkos streso. Buvo pranešta, kad tabako augalai, pertvarkyti su stilbeno sintazės genais, yra atsparesni Botrytis cinerea 2 infekcijai. Tyrinėjant resveratrolio biologinę funkciją gyvūnams ir žmonėms, buvo pranešta apie širdies ligų 3 prevenciją, eikozanoidų sintezės makrofaguose 4 sumažinimą ir MTL oksidacijos slopinimą 5 . Be to, resveratrolis taip pat rodo vėžio chemoprevencinį aktyvumą naviko pradžios, skatinimo ir progresavimo stadijose 6 .

Resveratrolis, be chemoprevencinio poveikio, turi ir chemoterapinį poveikį. In vitro tyrime resveratrolis slopino kelių naviko ląstelių linijų augimą, įskaitant žmogaus promielocitinės leukemijos ląsteles, žmogaus krūties vėžio ląsteles, žmogaus storosios žarnos vėžio ląsteles ir žmogaus plaučių karcinomos ląsteles 7 . In vivo tyrimais su gyvūnais taip pat nustatyta, kad resveratrolis turi priešnavikinį poveikį8. Atsižvelgiant į resveratrolio priešnavikinį potencialą, tikslinga sukurti naujus chemoterapinius vaistus, naudojant protvera kaip resveratrolį. Buvo pranešta, kad resveratrolio darinys 3, 4, 5, 4′-tetrametoksistilbenas pasižymi stipresnėmis antiproliferacinėmis savybėmis žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelėse 9 . Todėl mes susintetinome metoksigrupės modifikuotų stilbenų seriją ir išbandėme jų citotoksiškumą žmogaus plaučių vėžio ląstelėse (papildoma informacija). Kita vertus, apie halogenų grupės pridėjimą modifikuojant resveratrolį retai buvo pranešta. Remdamiesi tuo, kad halogeno tirpumas vandenyje yra geresnis nei metoksilo grupė, mes taip pat susintetinome halogenų grupės modifikuotų stilbenų seriją ir nustatėme, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas turi geresnį priešnavikinį auglį. veikla (papildoma informacija).

Plaučių vėžys yra pagrindinė su vėžiu susijusios mirties priežastis pasaulyje ir Taivane 10, 11 . Todėl mes ištyrėme 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno citotoksiškumą žmogaus plaučių adenokarcinomos A549 ląstelėse, išaiškinome ląstelių mirties molekulinį mechanizmą ir patikrinome jo poveikį in vivo .

medžiagos ir metodai

Chemikalai

„F12 Kaighn“ terpė (F12K), galvijų serumas ir „Lipofectamine 2000“ buvo nupirkti iš „Invitrogen“ (Didžioji sala, NY). 1- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -3, 5-difenilformazanas (MTT), anti-β-aktino antikūnai, propidium jodidas (PI), 2, 7-dichlorfluorescin (DCF), N- acetil- L -cisteinas (NAC), glutationas, monodansilkadaverinas (MDC), oranžinis akridinas, MG132, 3-metiladeninas (3-MA), 4- (2-aminoetil) benzensulfonilfluorido hidrochloridas (AEBSF), N-CBZ-PHE-ALA fluorometilketonas (Z-FA-FMK), N- tozil- L- fenilalanino chlormetilketonas (TPCK) ir N- a- tozil- L- lizino chlormetilketono hidrochloridas (TLCK) buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich (Sent Luisas, MO). [L-3- trans - (propilkarbamoil) oksiran-2-karbonil] - L- izoleucil- L- prolino metilo esteris (CA074-Me) buvo įsigytas iš Peptidų instituto (Osaka, Japonija). Antikūnai prieš ciklinus, p21, Bcl-2 ir Bax, buvo įsigyti iš „Lab Vision“ (Fremontas, Kalifornija). Antikūnas prieš procaspazę-3 buvo įsigytas iš „Active Motif“ (Carlsbad, CA). Antikūnas prieš poli (ADP-ribozės) polimerazę (PARP) buvo nupirktas iš Cell Signaling Technology (Beverly, MA). „SuperSignal West Pico“ chemiliuminescencinis substratas buvo gautas iš Pierce (Rockford, IL). PRO-PREP baltymų ekstrahavimo tirpalas buvo iš „iNtRON Biotechnology“ (Kyungki-Do, Korėja). „Bio-Rad“ baltymų tyrimo rinkinys buvo įsigytas iš „Bio-Rad“ (Hercules, CA). Fluorogeninių peptidų substratai proteasomų aktyvumo tyrimui buvo įsigyti iš „Biomol“ (Butler Pike, PA).

Ląstelių kultūros

Žmogaus nesmulkialąstelinės plaučių adenokarcinomos A549 ląstelės buvo gautos iš Bioresursų surinkimo ir tyrimų centro (Hsinchu, Taivanas) ir buvo auginamos F12K, papildytame 10% karščiu inaktyvuoto galvijo vaisiaus serumo. Ląstelės buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje su 5% CO 2 .

Trypano mėlynojo dažų išskyrimo metodas

Ląstelių skaičius buvo nustatytas tiesioginiu ląstelių skaičiavimu. A549 ląstelės buvo kultivuojamos 24 šulinėlių plokštelėse, kurių tankis 2x104 ląstelės / duobutėje, 24 valandas, po to inkubuojamos su įvairiomis koncentracijomis resveratroliu arba 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu 2 dienas. Tada ląstelės buvo atskirtos tripsinu-EDTA, dažytos trypano mėlynu dažymu ir suskaičiuotos hemocitometru. Rezultatas buvo išreikštas procentais, palyginti su tirpikliu apdorotose kontrolinėse inkubacijose, ir buvo apskaičiuotos IC50 vertės.

Tarpląstelinių reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) matavimas

Intraląstelinės ROS susidarymas buvo aptiktas srauto citometrijos metodu, naudojant DCFH-DA. A549 ląstelės buvo kultivuojamos 60 mm audinių kultūros induose, kurių tankis 8x105 ląstelių / lėkštelėje 24 valandas, po to įvairų laiką buvo apdorojamos DMSO arba 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu. Po apdorojimo ląstelės 30 minučių buvo veikiamos 10 μmol / l DCFH-DA tamsoje, vieną kartą plaunamos PBS, atskiriamos tripsinu, surenkamos centrifuguojant ir vėl suspenduojamos PBS. Tarpląstelinė ROS, kurią rodo dichlorfluorescino (DCF) fluorescencija, buvo išmatuota naudojant „Becton-Dickinson FACScan“ srauto citometrą, naudojant „CellQuest“ programinę įrangą.

Ląstelės membranos vientisumo matavimas

Ląstelių membranos vientisumas buvo nustatytas dažant PI. A549 ląstelės buvo kultivuojamos 60 mm ilgio audinių kultūros induose 24 valandas, po to inkubuojamos su įvairiais inhibitoriais 60 min. Tada į ląsteles nurodytu laiku buvo pridėta DMSO arba 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno. Po apdorojimo tripsinizuotos ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos PBS ir 10 minučių nudažytos 5 μg / ml PI. Nudažytos ląstelės sužadinamos, veikiant argono lazeriu, esant 488 nm, o fluorescencijos emisija buvo surinkta 580 nm. Mažiausiai 10 000 ląstelių buvo suskaičiuotos naudojant „Becton-Dickinson FACScan“ srauto citometrą, naudojant „CellQuest“ programinę įrangą. Gyvos ląstelės neleidžia patekti propidium jodidui, nurodydamos visišką ląstelės membranos vientisumą, o negyvos ląstelės nudažomos propidium jodidu, nurodydamos ląstelių membranų pažeidimus.

Ląstelių ciklo analizė

A549 ląstelės buvo kultivuojamos 100 mm storio audinių kultūros lėkštelėse 1x106 ląstelių / lėkštelės tankumu 24 valandas, po to įvairų laiką buvo apdorojamos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno. Po apdorojimo ląstelės surenkamos ir plaunamos PBS, fiksuojamos PBS-metanolio (1: 2, tūris / tūris) tirpalu ir laikomos 4 ° C temperatūroje mažiausiai 18 valandų. Po dar dviejų PBS plovimų ląstelių granulės buvo dažytos 30 minučių kambario temperatūroje tamsoje fluorescenciniu zondo tirpalu, kuriame buvo PBS, 40 μg / ml PI ir 40 μg / ml DNR neturinčios RNaseA. PI dažytų ląstelių DNR fluorescencija buvo įvertinta sužadinimo metu esant 488 nm bangos ilgiui ir aptinkama per 630/22 nm bangos juostos filtrą, naudojant „Becton-Dickinson FACScan“ srauto citometrą. Viename mėginyje buvo išanalizuota mažiausiai 10 000 ląstelių, o DNR histogramos buvo atplėštos ir toliau analizuojamos naudojant „Modfit“ programinę įrangą, kad būtų galima įvertinti ląstelių procentą įvairiose ląstelių ciklo fazėse.

Mitochondrijų membranų potencialo matavimas

Mitochondrijų membranos potencialas (MMP) buvo aptiktas srauto citometrijos metodu, naudojant rodamino123 fluorescencinius dažus (Ex / Em = 430 nm / 535 nm). A549 ląstelės buvo kultivuojamos 60 mm audinių kultūros lėkštelėse, kurių tankis buvo 8 × 105 ląstelių / lėkštelėje 24 valandas, po to 24 valandas ir 48 valandas buvo apdorojamos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno. Po apdorojimo kultūrinė terpė buvo pakeista šviežia terpe, kurioje yra 5 μmol / L rodamino123, ir ląstelės buvo inkubuojamos 30 minučių tamsoje. Po inkubacijos pakopos ląstelės buvo plaunamos PBS, atskiriamos tripsinu, surinktos centrifuguojant ir vėl suspenduotos PBS. MMP, kaip rodo rodamino123 fluorescencijos lygis, buvo išmatuotas naudojant „Becton-Dickinson FACScan“ srauto citometrą, naudojant „CellQuest“ programinę įrangą.

Rūgščių vakuolių matavimas dažant MDC ir akridino oranžine spalva

A549 ląstelės buvo kultivuojamos 100 mm storio audinių kultūros lėkštelėse 1x106 ląstelių / lėkštelės tankumu 24 valandas, po to dar 24 valandas buvo apdorojamos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu. Po apdorojimo kultūrinė terpė buvo pakeista šviežia terpe, kurioje yra 50 μmol / l MDC arba 1 μg / ml akridino apelsino, ir ląstelės buvo inkubuojamos 30 minučių tamsoje. MDC dažymui ląstelės buvo plaunamos PBS ir nuotraukos buvo darytos fluorescenciniu mikroskopu. Akridino oranžinės spalvos dažymui ląstelės buvo atskirtos tripsinu, surinktos centrifuguojant ir vėl suspenduotos PBS. Akridino oranžinės fluorescencijos lygis buvo išmatuotas naudojant „Becton-Dickinson FACScan“ srauto citometrą, naudojant „CellQuest“ programinę įrangą.

LC3 lokalizacijos matavimas imunofluorescencine mikroskopija

Žalia su fluorescenciniais baltymais pažymėtas autofaginis markeris, susijęs su mikrotubuliais, susietas su 3 baltymo 3 lengvosios grandinės (GFP-LC3) 12 plazmidė, buvo laikinai perkeltas į A549 ląsteles, naudojant Lipofectamine 2000 pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo pakeistos 16 val. Prieš transfekciją 5000 ląstelių tankio 1 ml kultūrinės terpės 12 šulinėlių plastikiniame inde. Transfekcijos metu Lipofectamine 2000 buvo inkubuotas su GFP-LC3 (1 μL Lipofectamine 2000 / 0, 5 μg DNR / duobutėje) 0, 1 ml OPTI-MEM 20 minučių kambario temperatūroje. Mišinys įlašinamas po ląsteles į ląsteles ir inkubuojamas 6 valandas. DNR / Lipofectamine 2000 terpė buvo pakeista 1 ml šviežios terpės ir ląstelės buvo kultivuojamos dar 18 valandų. Tada į ląsteles pridedama 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno, kad būtų galima stebėti GFP-LC3 lokalizaciją imunofluorescencinės mikroskopijos būdu.

Proteasomos aktyvumo tyrimas

A549 ląstelės buvo apdorotos DMSO, 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu arba proteasomų inhibitoriumi MG132 nuo 30 iki 90 min. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir 10 μg jų buvo inkubuojami 2 valandas 37 ° C temperatūroje su 40 μmol / L fluorogeninio peptido substratu (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, norint gauti panašų chimotripsiną, Ac-Gly-Pro-Leu -Asp-AMC ir Z-Leu-Leu-Glu-AMC, panašios į kaspazę, ir Boc-Leu-Arg-Arg-AMC ir Ac-Arg-Leu-Arg-AMC, panašios į tripsiną) 100 μl tyrimo buferio. (20 mmol / l Tris-HCl, pH 8, 0). Hidrolizuotas AMC buvo matuojamas fluorometru su sužadinimo filtru, kurio bangos ilgis 360 nm, o emisijos filtru - 460 nm.

Gyvūno modelis

Penkių savaičių amžiaus nuogų pelių patelės buvo aprūpintos Nacionaliniame laboratorijos gyvūnų centre (Taipėjus, Taivanas) ir prieš vartojimą buvo laikomos mūsų gyvūnų priežiūros įstaigoje vieną savaitę. Pelės buvo laikomos ribotoje prieinamoje vietoje kontroliuojamos kambario temperatūros maistu ir vandeniu, esant ad libitum . Pelės buvo suskirstytos į dvi grupes dviem skirtingais eksperimentais (tik tirpikliui ir 50 mg / kg 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno). Visus eksperimentus patvirtino Nacionalinio Chiayi universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Statistinė analizė

Buvo atlikti trys ar daugiau atskirų eksperimentų. Statistinė analizė atlikta naudojant Studento testą. Tyrimas su gyvūnais buvo analizuotas naudojant vienpusę ANOVA, po kurios sekė Tukey testas. Laikoma, kad P <0, 05 rodo reikšmingą skirtumą tarp gydomų ir kontrolinių grupių.

Rezultatai

Resveratrolio ir 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno poveikis ląstelių gyvybingumui

Palyginus 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno citotoksiškumą A549 ląstelėse, resveratrolio IC50 (25, 5 μmol / L) yra maždaug 1, 5 karto didesnis nei 4′-chlor-3, 5 -dihidroksistilbenas (17, 4 μmol / L), o maksimalus citotoksinis aktyvumas buvo 100% vartojant 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeną, bet tik 80% - naudojant resveratrolį (1A paveikslas). Be A549 ląstelių, 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas taip pat parodė didesnį citotoksiškumą nei resveratrolis kitose kitose plaučių vėžio ląstelių linijose - NCI-H23 ir NCI-H1299 (1A pav.). A549 ląstelės, apdorotos 100 μmol / l resveratrolio, 24 val. Turėjo susitraukusią formą ir pradėjo atsiskleisti po 48 val. (1B paveikslas). Naudodamos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno, ląstelės po 24 val. Išsiurbė vakuumą ir po 48 valandų apdorojimo beveik suapvalėjo ir atsiskyrė (1B paveikslas). Šis rezultatas leido manyti, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas buvo stipresnis nei resveratrolis ir kad jo citotoksinis mechanizmas gali skirtis nuo resveratrolio žmogaus plaučių karcinomos ląstelėse.

Image

Citotoksinis IC 50 ir morfologiniai pokyčiai resveratrolio ir 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbene apdorotose A549 ląstelėse. (A) Resveratrolio ir 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno citotoksiškumas IC50. A549, NCI-H23 ir NCI-H1299 ląstelės 48 valandas buvo gydomos įvairiomis koncentracijomis resveratroliu arba 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu. Ląstelių skaičius buvo apskaičiuotas trypano mėlynojo dažų išskyrimo metodu, naudojant hemocitometrą. Neapdorotų ląstelių skaičius buvo 100%, o kiti duomenys buvo pateikti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. (B) A549 ląstelių, apdorotų resveratroliu arba 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu, morfologiniai pokyčiai. A549 ląstelės buvo apdorotos DMSO, 100 μmol / L resveratroliu arba 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenenu 24 arba 48 valandas. Ląstelės buvo nufotografuotos „Axio Observer A1“ fazinio kontrasto mikroskopu. Didinimas × 200.

Visas dydis

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė ląstelių ROS padidėjimą, kuris nebuvo pagrindinis ląstelių žūties veiksnys. Kadangi buvo pranešta, kad ROS sukelia citotoksiškumą vėžio ląstelėse 13, mes DCFH-DA dažymo metodu išanalizavome 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno įtaką ląstelių ROS susidarymui. Intraląstelinė ROS padidėjo po 1 valandos gydymo 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu ir pamažu padidėjo per 48 valandas. Intraceliulinė ROS padidėjo maždaug 1, 6, 2, 4, 2, 7, 3, 2 ir 5, 6 karto po apdorojimo 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu atitinkamai 1 h, 3 h, 6 h, 24 h ir 48 h (paveikslas). 2A). Norint toliau apibūdinti ROS ir ląstelių žūties ryšį, buvo naudojami du antioksidantai - NAC ir glutationas - tiriant apsauginį 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu apdorotų ląstelių poveikį. 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą ROS gamybą beveik visiškai slopino 10 mmol / L NAC arba 10 mmol / L glutationo (2B paveikslas); tačiau šie du antioksidantai negalėjo apsaugoti nuo ląstelių žūties (2C paveikslas). Šis rezultatas parodė, kad ROS padidėjimas, kurį sukėlė 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas, nebuvo pagrindinė ląstelių mirties priežastis.

Image

ROS įtaka 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltai A549 ląstelių žūčiai. (A) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltas ROS susidarymas. A549 ląstelės buvo neapdorotos arba apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno 1, 3, 6, 24 ir 48 valandas. Likus 30 minučių iki derliaus nuėmimo, ląstelės buvo inkubuotos su 10 μmol / l DCF-DA. Po inkubacijos ląstelės buvo surinktos analizuoti FACS. Kiekvienos plokštės duomenys rodo DCF fluorescencijos intensyvumą ląstelėse. Kiekvienu laiko momentu kontrolinių ląstelių vidutinis intensyvumas buvo lygus 100, o kiti duomenys buvo išmatuoti šia nustatyta būsena. Pateiktos vertės yra trijų nustatymų vidurkis ± SD. (B) Antioksidantų poveikis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltai ROS. 10 val. / L NAC arba 10 mmol / l glutationo buvo pridėta 1 val., Po to 3 valandas apdorota 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu. Ląstelės buvo surinktos analizei FACS. Pateiktos vertės yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiai ± SD. b P <0, 05, palyginti su 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno grupe. (C) Antioksidantų poveikis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltiems ląstelių membranų vientisumo pažeidimams. Ląstelės vieną valandą veikiamos 10 mmol / L NAC arba 10 mmol / L glutationo, po to 36 valandas apdorojamos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu. A549 ląstelės buvo surinktos ir nudažytos propidium jodidu ir išanalizuotos FACS.

Visas dydis

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno poveikis ląstelių ciklo pasiskirstymui

Kadangi 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas slopino A549 ląstelių augimą, tada išanalizavome ląstelių ciklo populiacijos pasiskirstymą A549 ląstelėse su 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu arba be jo. Kaip parodyta 3A paveiksle, ląstelių, apdorotų 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenenu, sub-G1 frakcija palaipsniui padidėjo iki 18% ir 43% atitinkamai per 24 ir 48 valandas. Duomenys parodė, kad 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė DNR suskaidymą priklausomai nuo laiko. Prieš susidarant sub-G1 frakcijai, ląstelės iš pradžių buvo kaupiamos G2 / M fazėje, tačiau ląstelių, esančių G1 fazėje, nesumažėjo, kai jos buvo apdorotos 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu. Kai įvyko G 2 / M fazių sustojimas, G 1 fazės santykis turėjo sumažėti, jei ląstelės G1 ir toliau išliktų iki S be M sugrąžintų ląstelių. Mūsų tyrime G1 fazės santykis buvo panašus į kontrolinių ląstelių santykį, o tai rodo, kad G′ ir G2 / M fazėse 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sulaikė ląsteles ir kad šis sulaikymas gali sukelti sub- G 1 formavimas. Resveratrolis sukėlė ląstelių ciklo sustojimą G1 fazėje, kuris skyrėsi nuo rezultatų, gautų naudojant 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeną (3A pav.). Western blot analizė (3B paveikslas) parodė, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sumažino ciklino D1 ir ciklino D3 ekspresiją, dėl ko galėjo būti sustabdyta G1 fazė. 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas taip pat sumažino ciklino B1 ekspresiją, o tai galėjo sukelti G2 fazės sustabdymą. 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sumažino p21 raišką, o tai leido manyti, kad ląstelių ciklo sustabdymas nebuvo tarpininkaujamas p53-p21 keliu.

Image

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno ir resveratrolio poveikis ląstelių ciklo pasiskirstymui. (A) Ląstelių ciklo pasiskirstymas keičiamas apdorojant 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu arba resveratroliu. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba 100 μmol / L resveratroliu 24, 36 arba 48 valandas. Ląstelės buvo surinktos, pritvirtintos etanoliu ir nudažytos PI. DNR kiekis buvo analizuotas srauto citometrija. Reprezentacinė propidium jodidu dažytų A549 ląstelių FACS skenavimo diagrama rodo G 0 / G 1, S, G 2 / M ir sub-G 1 ląstelių ciklo fazių procentus kiekviename grafike. Pateiktos vertės yra trijų nustatymų vidurkis. (B) 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltų ciklinų skaidymo laikas. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo 12, 24, 36 ir 48 valandas. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir analizuojami atliekant Western blot analizę su antikūnais prieš cikliną E, cikliną D1, cikliną D3, cikliną B1 ir p21.

Visas dydis

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė apoptozę, kuri buvo nedidelė ląstelių mirties priežastis

Padidėjęs mitochondrijų pralaidumas yra vienas iš mitochondrijų priklausomų ląstelių mirties būdų 14 . Todėl mes išmatuojome mitochondrijų pralaidumą reguliuojančius baltymus Bcl-2 ir Bax, naudodami Western blot analizę. A549 ląstelių apdorojimas 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukėlė reikšmingą anti-apoptozinio baltymo Bcl-2 sumažėjimą per laikotarpį nuo 12 h iki 48 h (4A pav.), Taip pat sumažėjęs proapoptozinis baltymas Bax. Todėl rodaminas 123 buvo aptiktas MMP, kuris parodė, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sumažino MMP per 24 ir 48 valandas (4B paveikslas). Dėl sub-G1 frakcijos susidarymo ir MMP sumažėjimo 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbene apdorotose ląstelėse, mes ištyrėme, ar 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė apoptozės aktyvaciją. efektoriniai baltymai. Buvo išanalizuoti PARP ir procaspazės-3 skilimo produktai. 5A pav. Parodyta, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė PARP skilimą ir procaspazės-3 sumažėjimą. Šių dviejų baltymų pokytis prasidėjo po 24 valandų gydymo 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu ir išliko 48 valandas. Tada kaspazės inhibitorius Z-VAD-FMK buvo naudojamas apoptozės ir ląstelių mirties ryšiui nustatyti. Parodyta, kad Z-VAD-FMK slopino 4′-chloro-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą sub-G1 formavimąsi (5B pav.) Ir atvirkščiai pakeitė PARP skilimą priklausomai nuo dozės (5C pav.). ROS yra viena iš ląstelių apoptozės priežasčių; mes taip pat išanalizavome ROS vaidmenį formuojant 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą sub-G1. Rezultatai parodė, kad du antioksidantai slopino 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą sub-G1 formavimąsi 30%, o resveratrolio sukeltą sub-G1 formavimąsi daugiau kaip 50% (5D paveikslas). Šis rezultatas rodo, kad ROS yra viena iš priežastis, dėl kurios atsiranda 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukelta apoptozė. Kadangi šie du antioksidantai negalėjo panaikinti 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltos ląstelių mirties (2C pav.), Atvirkštinis poveikis buvo toliau analizuojamas naudojant Z-VAD-FMK. Rezultatai parodė, kad Z-VAD-FMK tik šiek tiek pakeitė ląstelių mirtį (5E pav.), Nors Z-VAD-FMK beveik visiškai slopino apoptozę (5B paveikslas, 5C). Šie duomenys leido manyti, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltas ląstelių žūtis buvo esminė tarp kaspazės priklausomos apoptozės. Kadangi Z-VAD-FMK tik šiek tiek pakeitė 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą ląstelių mirtį, ROS inhibitorių grįžtamoji ląstelių mirtis gali būti per maža, kad būtų galima nustatyti.

Image

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno poveikis mitochondrijų membranos potencialui. (A) Bcl-2 ir Bax 4'-chlor-3, 5-dihidroksi-stilbeno sukeltos skaidymo trukmė. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo 12, 24, 36 ir 48 valandas. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir analizuojami atliekant Western blot analizę su antikūnais prieš Bcl-2, Bax ir β-aktiną. (B) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sumažino MMP. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo 24 arba 48 valandas. Ląstelės buvo surinktos ir išanalizuotos FACS. Tipiška FACS skenavimo diagrama rodo žemo MMP procentinę dalį kiekviename grafike. Pateiktos vertės yra trijų nustatymų vidurkis ± SD.

Visas dydis

Image

Apoptotiniai 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu apdorotų A549 ląstelių parametrai. (A) PARP ir procaspazės-3 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltos skaidymo trukmė. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo 12, 24, 36 ir 48 valandas. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir išanalizuoti atlikus Western blot analizę su antikūnais prieš dvi PARP formas, priešskaldymą kaspazės-3 ir β-aktiną. (B) Z-VAD-FMK poveikis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltam sub-G1 susidarymui. Z-VAD-FMK buvo pridėtas 1 valandą prieš apdorojimą 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu 48 valandas. Ląstelės buvo surinktos, pritvirtintos ir nudažytos propidium jodidu ir išanalizuotos FACS. Parodytos vertės yra trijų nustatymų (C) Z-VAD-FMK poveikio vidurkis ± SD (C) apie 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą PARP skilimą. Z-VAD-FMK buvo pridėtas 1 val. Prieš apdorojimą 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu 24 valandas. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir analizuojami atliekant Western blot analizę su antikūnais prieš dvi PARP formas ir β-aktiną. (D) NAC ir glutationo poveikis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltai sub-G1 formavimuisi. NAC arba glutationas buvo įpiltas 1 val. Prieš apdorojimą 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba 100 μmol / L resveratrolio 48 valandas. Ląstelės buvo surinktos, pritvirtintos ir nudažytos propidium jodidu ir išanalizuotos FACS. Pateiktos vertės yra trijų nustatymų vidurkis ± SD. (E) Z-VAD-FMK poveikis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltiems ląstelių membranų vientisumo pažeidimams. Z-VAD-FMK buvo pridėtas 1 valandą prieš apdorojimą 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu 48 valandas. A549 ląstelės buvo surinktos ir nudažytos propidium jodidu ir išanalizuotos FACS. Pateiktos vertės yra trijų nustatymų vidurkis ± SD. b P <0, 05, palyginti su 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno grupe.

Visas dydis

Ankstyvojo autofaginio reiškinio indukcija 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu

Jei 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltas ląstelių žūtis nebuvo visiškai tarpininkaujama apoptozės būdu, mirtį galėjo sukelti ne apoptozinis kelias, pavyzdžiui, autofagija, nekrozė ar kitas procesas 15 . Remiantis morfologiniais pokyčiais, kuriuos sukelia 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas ir kurie parodė vakuolę ląstelėse (1B pav.), Autofaginis procesas yra tikėtinas15. Tada mes bandėme aptikti rūgščių vakuolių susidarymą ląstelėse. Kaip parodyta 6A ir 6B paveiksluose, 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas padidino tarpląstelinių rūgščių vakuolių susidarymą. Toliau autofaginį reiškinį bandėme patvirtinti konkretesniais metodais. Pirmiausia parodėme, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė akivaizdesnį LC3-II susidarymą nei resveratrolis (6C paveikslas). Be to, GFP-LC3, kurį gamina transfekuotos ląstelės, buvo naudojamas 12, 16 autofagijos procesui patvirtinti. Citoplazminiai LC3 baltymai lokalizuojasi autofaginėse vakuolėse, kai ląstelė pradeda 17, 18 autofagiją. GFP-LC3 plazmidės DNR buvo atlikta laikina transfekcija, kad būtų galima ekspresuoti GFP-LC3 sulietą baltymą A549 ląstelėse. GFP-LC3 transfekuotose A549 ląstelėse buvo rasti difuziniai GFP-LC3 baltymai per visą ląstelę (6D paveikslas). Po 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno apdorojimo GFP-LC3 tapo agreguotais taškais ląstelėse, tai rodo, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė LC3 lokalizaciją ir inicijavo ankstyvą autofaginį reiškinį. Toliau mes panaudojome farmakologinį inhibitorių, kad nustatytume ryšį tarp autofagijos ir ląstelių mirties. Kaip parodyta 6E paveiksle, 3-MA galėjo iš dalies panaikinti ląstelių mirtį, o tai rodo, kad 4′-chloro-3, 5-dihidroksistilbeno sukelta ląstelių mirtis iš dalies buvo sukelta autofagijos. Be to, mes panaudojome įvairius proteazės inhibitorius, norėdami išanalizuoti, ar ląstelių mirtį sukėlė rūgštinė lizosomų proteazė 19, 20 . Kaip parodyta 6E paveiksle, du katepsino inhibitoriai (CA074-Me ir Z-FA-FMK), du serino proteazės inhibitoriai (TLCK ir AEBSF) ir vienas proteasomos inhibitorius (MG132) negalėjo užkirsti kelio ląstelių žūties; tik vienas serino proteazės inhibitorius, TPCK, šiek tiek pakeitė ląstelių mirtį. Šis rezultatas leido manyti, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą ląstelių žūtį iš dalies sąlygojo lizosomų nutekėjimas, bet ne proteasomų aktyvinimas. Kaspazės inhibitorius Z-VAD-FMK taip pat iš dalies slopino resveratrolio sukeltą ląstelių mirtį.

Image

Autofaginiai 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu apdorotų A549 ląstelių parametrai. (A) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas padidino rūgščių vakuolius, nustatytus MDC dažymo metodu. A549 ląstelės 24 valandas buvo gydomos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo. Tada ląstelės buvo nudažytos MDC fotografavimui. Didinimas × 200. (B) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas padidino rūgščių vakuolius, nustatytus akridino oranžinio dažymo metodu. A549 ląstelės 24 valandas buvo gydomos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo. Tada ląstelės buvo nudažytos akridino apelsinu srauto citometrijos analizei. b P <0, 05, palyginti su kontrole. (C) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas skatina LC3-II susidarymą. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba 100 μmol / L resveratroliu arba be jo 24 ir 48 valandas. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir analizuojami atliekant Western blot analizę su antikūnais prieš LC3 ir. (D) 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltos GFP-LC3 agregacijos A549 ląstelėse laikas. A549 ląstelės buvo laikinai transfekuotos GFP-LC3 plazmidėmis. Po transfekcijos ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba be jo 24 ir 30 valandas. Ląstelės buvo nufotografuotos naudojant „Olympus IX70“ fluorescencinį mikroskopą. Didinimas × 200. (E ir F) Autofagijos inhibitoriaus (3-MA), proteazės inhibitorių (AEBSF, Z-FA-FMK, TPCK, TLCK, CA074-Me), kaspazės inhibitoriaus (Z-VAD-FMK) ir proteasomų inhibitoriaus (MG132) poveikis. dėl 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltos ląstelių mirties. A549 ląstelės buvo atskirai apdorotos DMSO arba įvairiais inhibitoriais 1 val., Po to 36 val. Pridėta 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba 100 μmol / L resveratrolio. A549 ląstelės buvo surinktos, nudažytos propidium jodidu ir išanalizuotos FACS. Pateiktos vertės yra trijų nustatymų vidurkis ± SD.

Visas dydis

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas slopino proteasomų aktyvumą A549 ląstelėse

Stebėdami MG132 apdorotų ląstelių morfologinius pokyčius, aptikome vakuolių susidarymą, panašų į tą, kurį sukelia 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas (7A pav.). Kadangi MG132 yra standartinis proteasomų inhibitorius, naudojamas atliekant priešvėžinius tyrimus, bandėme palyginti biocheminį MG132 ir 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno gydymo ląstelėse poveikį. 7B paveiksle parodytas visur esančių konjugatų kaupimasis, sukeltas 10 μmol / L ir 50 μmol / L MG132. 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas taip pat sukėlė visur priklausančių konjugatų padidėjimą nuo dozės. Papildomame tyrime mes išanalizavome proteasomų aktyvumą po 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba MG132 apdorojimo. Šis tyrimas parodė, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas iš dalies slopina substrato skaidymąsi į chimotripsino ir kaspazės tipo proteasomas (7C pav.).

Image

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas slopino proteasomų aktyvumą A549 ląstelėse. (A) Morfologiniai pokyčiai, kuriuos sukelia 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas ir MG132. A549 ląstelės 48 valandas buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba 10 μmol / L MG132 ir ląstelės buvo nufotografuotos. Didinimas × 200. (B) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno poveikis visur esančių konjugatų kaupimuisi. A549 ląstelės 60 minučių buvo apdorojamos įvairiomis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba MG132 koncentracijomis. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir analizuojami atliekant Western blot analizę su antikūnais prieš ubiquitiną ir β-aktiną. (C) 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno poveikis proteasomų aktyvumui. A549 ląstelės buvo apdorotos 80 μmol / L 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno arba 10 μmol / L MG132 nuo 30 iki 90 min. Ląstelių lizatai buvo surinkti ir išanalizuoti naudojant baltymingų fluorogeninių peptidų substratus.

Visas dydis

4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sulėtino auglio augimą nuogas pelėms

4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno priešnavikinis poveikis buvo tiriamas nuoga pelėms, pasėtas A549 ląstelėmis. 8 paveiksle parodyta, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sulėtino auglio augimą in vivo , tai rodo jo, kaip vaisto nuo naviko, potencialą.

Image

Antivėžinis 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno poveikis in vivo . Penkių savaičių patelės nuogoms pelėms buvo sušvirkštos 1 × 107 A549 ląstelės 100 µL Matrigel viename užpakaliniame šone. Kai naviko tūris pasiekė 100 mm 3, pelėms buvo duodama nešiklio ( n = 7, kontrolinė) arba 50 mg / kg 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno ( n = 7) ip kartą per dieną nuo 1 iki 4 dienos ir 7-10 dienos. Naviko tūris buvo apskaičiuojamas pagal formulę mm 3 = (ilgoji ašis) × (trumpoji ašis) 2/2. b P <0, 05, palyginti su kontrole.

Visas dydis

Diskusija

Resveratrolis buvo pasiūlytas kaip galimas chemoterapinis junginys. Todėl šiame darbe buvo tiriama resveratrolio funkcinės grupės modifikacija. Analizuojant struktūros ir aktyvumo ryšį, atrodė, kad resveratrolio hidroksilo grupės pakeitimas metoksi grupe nepadidina jos citotoksinio aktyvumo (papildoma informacija). Resveratrolio 4′-hidroksilo grupės pakeitimas halogeno grupe, priešingai, padidino citotoksinį aktyvumą (papildoma informacija). Palyginus resveratrolio ir 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno IC50, pastarasis parodė didesnę augimo slopinimo galią trijose plaučių vėžio ląstelių linijose (1A pav.). Atliekant ląstelių ciklo analizę, 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė ląstelių sustojimą G1 ir G 2 / M fazėse (3A ir 3B paveikslai), tačiau resveratrolis daugiausia sulaiko ląsteles G 1 ir S fazėse 21, 22, 23, 24 dienomis . Šis rezultatas rodo, kad paprastas natūralių junginių funkcinis pakeitimas gali pakeisti jo priešvėžinį aktyvumą.

ROS yra vienas iš faktorių, sukeliančių ląstelių žūtį, kurio gali išvengti antioksidantai 25, 26 . Šiame tyrime antioksidantai galėjo sumažinti 4'-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltos ROS susidarymą (2B paveikslas), tačiau ląstelių žūties išvengti nebuvo galima (2C paveikslas). Toliau mes parodėme, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė apoptozę, nes sukėlė sub-G1 formavimąsi (3A pav.), Mitochondrijų membranos potencialo sumažėjimą (4B paveikslas) ir PARP bei prokaspazės-3 skilimą. (5A pav.). MMP sumažėjimas yra viena iš ląstelių mirties priežasčių 27, o Bcl-2 šeimos baltymai yra viena iš grupių, reguliuojančių MMP 14 . Pranešama, kad resveratrolis sukelia apoptozę per Bcl-2-mitochondrijų 28 kelią, tačiau 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė Bcl-2 ir Bax baltymų sumažėjimą (4A pav.). Todėl MMP buvo tiesiogiai išanalizuotas ir mes parodėme, kad jis sumažėjo 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenu (4B paveikslas). PARP, visur esantis namų tvarkymo fermentas, signalizuoja apie DNR pažeidimą, katalizuodamas ADP ribozės vienetų pridėjimą prie DNR, histonų ir įvairių DNR taisymo fermentų ir palengvina DNR atstatymą 29 . Apskritai apoptozę suaktyvina PARP suskaidymas, kuris vyksta per aktyvuotą kaspazę-3, todėl kaspazės aktyvacijai blokuoti naudojame pan-kaspazės inhibitorių Z-VAD-FMK. Nors Z-VAD-FMK blokavo 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą sub-G1 susidarymą (5B paveikslas), jis tik šiek tiek sumažino 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno sukeltą ląstelių mirtį (5B pav.) 5E pav.). Šis rezultatas rodo, kad be apoptozės yra ir kitų mechanizmų, sukeliančių ląstelių žūtį dėl 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno.

Dėl to, kad po 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno apdorojimo ląstelėse susidarė vakuumai, manėme, kad galėjo būti sukeltas autofagocitozė. Autofagija yra procesas, kurio metu tarpląstelinės autofagosomos sudaro ir atskiria ląstelių turinį skilimui 18 . Su mikrotubuliu susijęs lengvasis 3 grandinės baltymas (LC3), mielių ortologas mielės Atg8, yra būdingas baltymas, kuris kaupiasi ant autofaginių pūslelių membranos 12 . Autofagija gali skatinti ląstelių adaptaciją ir išgyvenimą esant tokiems stresams kaip badas ir patogeno infekcija, tačiau tam tikromis sąlygomis tai taip pat gali sukelti ląstelių žūtį. Šiame tyrime mes parodėme, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas A549 ląstelėse sukėlė autofagiją, nes sukėlė LC3-II susidarymą (6C paveikslas) ir GFP-LC3 agregaciją (6D paveikslas). Chemikalai, tokie kaip tamoksifenas 30, natrio butiratas 31, rapamicinas 32 ir resveratrolis 33, sukelia autofaginę ląstelių mirtį ir gydant vėžį suteikia neapoptozinę ląstelių mirtį. Priešingai, pranešta, kad autofagija yra apsauginis mechanizmas negydant nelfinaviro sukeltoms ląstelėms 34 . Šiame tyrime mes parodėme, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas sukėlė autofaginį reiškinį. Kaip ir apoptozės inhibitorius, autofaginis inhibitorius 3-MA ir lizosomų proteazės inhibitorius TPCK galėtų iš dalies panaikinti ląstelių mirtį (6E pav.).

Kadangi tiek 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas, tiek proteasomų inhibitorius MG132 sukelia specifinį vakuolės susidarymą, jie gali naudoti tą patį mechanizmą. Ubiquitin-proteasome sistema yra naujas vėžio gydymo tikslas 35 . 26S proteasomų komplekso proteolitiniame šerdyje yra trys peptidazės aktyvumo tipai, ir jie apima chimotripsinui būdingą, į tripsiną ir kaspazę panašų aktyvumą 36 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad MG132 ir 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas slopino į chimotripsiną panašų ir į kaspazę panašų proteasominį aktyvumą (7C pav.), Tačiau jie neslopino į tripsiną panašaus proteasominio aktyvumo (duomenys neparodyti) ). Proteasomų slopinimas dėl 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbeno suteikia papildomų įrodymų apie jo citotoksiškumą. Galiausiai mes ištyrėme priešnavikinį aktyvumą in vivo ir parodėme, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas reikšmingai sulėtino pelių augimą (8 paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad 4′-chlor-3, 5-dihidroksistilbenas, resveratrolio darinys, gali gydyti žmogaus nesmulkialąstelinę plaučių adenokarcinomą daugeliu mechanizmų.

Autoriaus indėlis

Yi-wen LIU ir Kun-wei TSAI suprojektavo tyrimą ir parašė darbą. Tyrimus atliko Jin-yi WU, Jia-jen SHEE, Yi-zhen LI, Ching-hsein CHEN ir Jing-jing CHUANG. „Jin-yi WU“ pateikė naujų reagentų. Jia-jen SHEE ir Yi-wen LIU išanalizavo duomenis.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Resveratrolio darinių struktūra ir citotoksiškumas.