8- (tosilamino) chinolinas slopina makrofagų sukeltą uždegimą slopindamas nf-κb signalus | acta pharmaologica sinica

8- (tosilamino) chinolinas slopina makrofagų sukeltą uždegimą slopindamas nf-κb signalus | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Makrofagų sukeltas uždegiminis atsakas gali prisidėti prie vėžio, diabeto, aterosklerozės ir septinio šoko išsivystymo. Šis tyrimas turėjo apibūdinti keletą naujų junginių, slopinančių makrofagų sukeltą uždegimą.

Metodai:

Buvo tiriami pilvaplėvės makrofagai iš C57BL / 6 pelių patinų ir RAW264.7 ląstelių. Lipo polisacharido (LPS) paveiktose ląstelėse buvo įvertintas priešuždegiminis aktyvumas. Priešuždegiminio aktyvumo mechanizmai buvo ištirti išmatuojant transkripcijos faktoriaus aktyvaciją reaguojant į specifinius signalus ir tiriant tikslinių kinazių aktyvumą.

Rezultatai:

Iš 7 tirtų junginių kandidatų stipriausias buvo 8- (tosilamino) chinolino (8-TQ, 7 junginys) slopinantis NO, TNF-α ir PGE2 susidarymą LPS aktyvuotose RAW264.7 ląstelėse ir pilvaplėvės makrofaguose ( IC50 vertės = 1–5 μmol / L). Šis junginys (1, 25−20 μmol / L) nuo dozės priklausomai slopino iNOS, COX-2, TNF-α ir citokinų IL-1β ir IL-6 priešuždegiminių genų ekspresiją LPS transkripcijos lygyje. aktyvuotos RAW264.7 ląstelės. 8-TQ (20 μmol / L) reikšmingai slopino NF-κB ir jo priešakyje esančių signalinių elementų, įskaitant κB (IκBα), IκBα kinazės (IKK) ir Akt inhibitorius, aktyvaciją LPS aktyvuotose RAW264.7 ląstelėse. In vivo eksperimentuose, vartojant per burną 20 ir 40 mg / kg 8-TQ 3 dienas, žymiai palengvėjo LPS sukelto hepatito ir HCl / EtOH sukelto gastrito požymiai atitinkamai ICR pelėms.

Išvada:

8-TQ (7 junginys) daro reikšmingą priešuždegiminį poveikį slopindamas Akt / NF-κB kelią, todėl gali būti sukurtas kaip naujas vaistas nuo uždegimo.

Įvadas

Makrofagams, galutinai diferencijuotiems monocitų palikuonims, būdingi uždegiminio atsako ląstelių paviršiaus žymenys, įskaitant rinkliavos panašius receptorius (TLR), Fc receptorius ir komplemento receptorius. Nors makrofagai pirmiausia veikia kaip fagocitai ir antigenus pristatančios ląstelės, jie taip pat gali suaktyvinti kitas imunoreguliacines ląsteles, įskaitant neutrofilus ir T- ir B-limfocitus 1, 2, gamindami priešuždegiminius citokinus, tokius kaip interleukinai (IL) ir naviko nekrozės faktoriaus (TNF) -α; chemokinai; ir uždegimo mediatoriai, tokie kaip azoto oksidas (NO) ir prostaglandinas E2 (PGE2). Uždegiminių ir imuninių ląstelių aktyvacija ir chemotaktinė migracija į audinius vaidina svarbų vaidmenį apsisaugojant nuo virusinių, bakterinių ir grybelinių infekcijų. Tačiau atskirti nuo įprastos kontrolės imuninio atsako komponentai gali sukelti įvairius ūminius ir lėtinius sutrikimus, įskaitant vėžį, diabetą, septinį šoką, autoimunines ligas ir aterosklerozę 3, 4, 5 . Esant šiems sutrikimams, tarp ląstelių, tiesiogiai sužeidžiančių audinius, vyrauja su audiniais susiję makrofagai. Šie samprotavimai paskatino mus sukurti vaistą, kuris galėtų slopinti makrofagų sukeltą uždegimą. Atliekant vaistų patikrinimo tyrimus buvo naudojami įvairūs uždegiminės ligos in vitro ir in vivo modeliai. Šių sistemų makrofagai gali būti suaktyvinami apdorojant ligandais, tokiais kaip lipopolisaharidas (LPS), peptidoglikanas ir poli (I: C) 6 .

Naujausi vaistų nuo uždegimo kūrimo metodai sutelkė dėmesį į pagrindinius signalinius baltymus kaip taikinius ir išbandė junginių aktyvumą prieš juos. Anksčiau tiksliniams baltymams buvo priskiriami transkripcijos faktoriai, branduolinis faktorius (NF) -KB ir aktyvatorius baltymas (AP) -1 bei jų priešakyje aktyvuojantys fermentai, įskaitant κB (IκBα), IκBα kinazės (IKK), Akt inhibitorius, nuo fosfoinositido priklausomą kinazę-1. (PDK1), fosfoinositido 3-kinazės (PI3K), tirozino kinazės Syk ir Src ir mitogeno suaktyvintos baltymų kinazės (MAPK) kaskados fermentai [tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė (ERK), c-Jun N-galinė kinazė ( JNK) ir p38]. Šie baltymai vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant priešuždegiminę genų raišką.

BAY11-7082 yra tipiškas IKK inhibitorius, kuris aktyviai slopina įvairius uždegiminius citokinus 7, hemo oksidazės-1 8 indukciją ir ICAM-1 ekspresiją 9 ir gali sustiprinti neutrofilų apoptozę 10 . Šis junginys gali būti naudingas gydant uždegimines ligas, tokias kaip artritas 11 . Kadangi mes iš pradžių neidentifikavome šio junginio, tačiau jį kurdami, susiduriame su apribojimais. Manome, kad galime įveikti tokius apribojimus naudodami pirminio junginio darinius. Šiam tyrimui pasirinkome septynis parduodamus junginius (nuo 1 iki 7) pagal struktūros panašumą su BAY 11-7082. Mes įvertinome šių septynių analogų priešuždegiminį poveikį ir ištyrėme jų molekulinius mechanizmus.

medžiagos ir metodai

Medžiagos

Tiriamieji junginiai nuo 1 iki 7 buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich Co (Sent Luisas, MO, JAV), grynumas didesnis kaip 95%. Taip pat buvo gauta natrio karboksimetilceliuliozė (NaCMC), polietilenglikolis 400, (3-4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), GM-CSF ir LPS ( E coli 0111: B4). iš Sigmos. LY294002 (LY), BAY11-7082 (BAY), U0126 ir wortmanninas buvo iš Calbiochem (La Jolla, CA, JAV). Buvo panaudotos luciferazės konstrukcijos, turinčios NF-κB ir AP-1 rišančius promotorius, kaip buvo pranešta anksčiau, 12, 13 . Fermentų imunologinio tyrimo (EIA) rinkiniai ir fermentais sujungto imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkiniai PGE2 ir TNF-α buvo įsigyti iš Amersham (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). Galvijų vaisiaus serumas ir RPMI-1640 terpė buvo gauti iš GIBCO (Grand Island, NY, JAV). RAW264.7 ląstelės buvo įsigytos iš ATCC (Rockville, MD, JAV). Visos kitos cheminės medžiagos buvo „Sigma“ reagento klasės. Fosfams būdingi arba bendrieji antikūnai prieš transkripcijos faktorius (p65, p50, c-Jun, STAT-1 ir c-Fos), ERK (su tarpląsteliniu signalu susijusi kinazė), p38, JNK (c-Jun N-galinė kinazė), IκBα, IKKβ, Akt, p85 / PI3K, γ-tubulinas, β-aktinas ir tirozino kinazės be receptorių (Src ir Syk) buvo gautos iš „Cell Signaling Technology Inc“ (Beverlis, MA, JAV).

Gyvūnai

C57BL / 6 patinai (6–8 savaičių amžiaus, 17–21 g), gauti iš „Dae Han Bio Link Co Ltd“, Chungbuk, Korėja, buvo laikomi plastikiniuose narvuose įprastomis sąlygomis. Dietos vandens ir granulėmis (Samyang Corp, Daejeon, Korėja) buvo laikomos ad libitum . Tyrimai buvo atlikti vadovaujantis Kangwono universiteto institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto nustatytomis gairėmis.

Pilvaplėvės ir kaulų čiulpų makrofagų paruošimas

Pilvaplėvės eksudatai buvo gauti iš C57BL / 6 pelių (7–8 savaičių, 17–21 g), išplovus 4 d., Po pilvaplėvės ertmės injekcijos į pilvaplėvės ertmę 1 ml sterilaus 4% tioglikolato sultinio („Difco Laboratories“, Detroitas, MI, JAV). anksčiau pranešta 14, 15 . Po plovimo RPMI-1640 terpe, turinčioje 2% FBS, pilvaplėvės makrofagai (1x106 ląstelių / ml) 4 valandas buvo pasodinti į 100 mm audinių kultūros lėkšteles, esant 37 ° C, 5% CO 2 drėkintoje atmosferoje. Norėdami paruošti iš kaulų čiulpų gaunamus makrofagus, iš pelių buvo atskirtos šlaunikauliai ir blauzdikauliai, raumenys pašalinti. Kaulai buvo supjaustyti žirklėmis iš abiejų galų ir praplauti 5 ml RPMI-1640 su 25 dydžio adata. Ląstelės buvo sėjamos 2x105 branduolių kaulų čiulpų ląstelių / cm 2 tankumu RPMI-1640, turinčioje 10% FBS, 100 V / ml penicilino, 0, 1 mg / ml streptomicino, 2 mmol / L L-glutamino ir 50 ng. / ml GM-CSF 6 šulinėlių „CellBIND“ plokštelėse (Corning Life Sciences, Lowell, MA, JAV), kurių kiekvienoje duobutėje yra 3 ml. Po 24 valandų inkubacijos ląstelės tris kartus buvo praplaunamos 3 ml RPMI-1640, kad būtų pašalintos neprilipusios ląstelės, ir toliau kultivuojamos naudojant 3 ml RPMI-1640, turinčio 10% FBS, 100 V / ml penicilino, 0, 1 mg / ml streptomicino, 2 mmol / L L- gliutamino ir 50 ng / ml GM-CSF, toliau vadinamu „visa terpe“. Ląstelių auginimo terpė kas 3 dienas buvo keičiama nauja šviežia visa terpe. Po 3 savaičių auginimo eksperimentai buvo atlikti su RPMI-1640, neturinčiu serumo, su 50 ng / ml GM-CSF ir papildymais, kaip nurodyta.

Ląstelių kultūros

Pilvaplėvės makrofagai ir ląstelių linijos (RAW264.7 ir HEK293 ląstelės) buvo kultivuojami RPMI-1640 terpe, papildyta 10% karščiu inaktyvuoto galvijo vaisiaus serumo (Gibco, Grand Island, NY, JAV), glutamino ir antibiotikų (penicilino ir streptomicino). esant 37 ° C, esant 5% CO 2 . Kiekvieno eksperimento metu ląstelės buvo atskirtos ląstelių grandikliu. Pagal mūsų eksperimentinį ląstelių tankį (2 × 106 ląstelių / ml), mirusių ląstelių dalis buvo mažesnė nei 1% pagal tripano mėlynos spalvos dažų išskyrimo testus.

NO, PGE 2 ir TNF-α gamyba

Po 18 valandų išankstinio inkubavimo RAW264.7 ląstelėse arba pilvaplėvės makrofaguose (1 × 106 ląstelių / ml), ląstelės 30 min buvo iš anksto apdorotos 1–7 bandomaisiais junginiais ir po to inkubuojamos su LPS (1 μg / ml). ) 24 val. Tiriamųjų junginių slopinamasis poveikis NO, PGE2 ir TNF-α gamybai buvo nustatytas analizuojant NO, PGE2 ir TNF-α lygius naudojant Grieso reagentą ir fermentais sujungto imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkinius, kaip aprašyta. anksčiau 16, 17, 18 .

Ląstelių gyvybingumo testas

RAW264.7 ląstelės (1x106 ląstelių / ml) buvo inkubuotos 18 valandų ir po to inkubuojamos 24 valandas, pridedant prie ląstelių 1-7 bandomuosius junginius. Citotoksinis poveikis buvo įvertintas MTT tyrimu 19 . Likus 3 valandoms iki kultūros pasibaigimo, pridedama 10 μL MTT tirpalo (10 mg / ml fosfato buferiniame druskos tirpale, pH 7, 4) ir ląstelės buvo grąžintos į kultūrą iki eksperimento pabaigos. Inkubacija buvo sustabdyta pridedant 15% natrio dodecilsulfato į kiekvieną šulinėlį, kad būtų tirpinamas formazanas 20 . Absorbcija esant 570 nm (OD 570–630 nm ) buvo matuojama naudojant „SpectraMax 250“ mikro plokštelių skaitytuvą.

mRNR analizė atliekant pusiau kokybinę atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją (RT-PGR)

Citokinų mRNR ekspresijos lygiams nustatyti pagal RPS metodo reagentą (Gibco BRL) iš LPS apdorotų RAW264.7 ląstelių buvo išskirta visa RNR, remiantis gamintojo instrukcijomis. Iki naudojimo visa RNR buvo laikoma –70 ° C temperatūroje. MRNR analizė taip pat buvo atlikta naudojant pusiau kiekybinę RT-PGR pagal gamintojo instrukcijas (Bioneer, Daejeon, Korėja), kaip buvo pranešta anksčiau 21 . Rezultatai buvo išreikšti kaip optinio tankio, esant 280 nm, ir GAPDH mRNR koncentracijos santykis. Naudoti pradmenys (Bioneer) išvardyti 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Liuciferazės reporterio geno aktyvumo tyrimas

HEK293 ląstelės (1 × 106 ląstelių / ml) buvo transfekuotos 1 μg NF-κB-Luc, CREB-Luc arba AP-1-Luc plazmidės, be β-galaktozidazės plazmidės, esant arba neturint Akt konstruktas, naudojant polietilenimino metodą, 12 šulinėlių plokštelėje pagal gamintojo protokolą 22 . Ląstelės buvo naudojamos eksperimentams 48 valandas po transfekcijos. Liuciferazės testai buvo atlikti naudojant Luciferase Assay System (Promega), kaip aprašyta anksčiau 23, 24.

Bendrų lizatų ir branduolinių frakcijų paruošimas, imunoblotų nustatymas ir imunoprecipitacija

RAW264.7 ląstelės (5 × 106 ląstelių / ml) arba kepenys 3 kartus plaunamos šaltu PBS su 1 mmol / l natrio ortovanadatu ir lizuojamos lizės buferiu (20 mmol / l Tris-HCl, pH 7, 4, 2 mmol / L). EDTA, 2 mmol / L etilenglikotetraacto rūgšties, 50 mmol / L β-glicerofosfato, 1 mmol / L natrio ortovanadato, 1 mmol / L ditiotreitolio, 1% Triton X-100, 10% glicerolio, 10 μg / ml aprotinino, 10 μg / ml. ml pepstatino, 1 mmol / L benzimido ir 2 mmol / L PMSF) 30 min., sukant 4 ° C temperatūroje. Lizatai praskaidrinami centrifuguojant 16 000 x g 10 minučių 4 ° C temperatūroje ir laikomi -20 ° C temperatūroje, kol prireiks.

Branduoliniai lizatai buvo paruošti trijų etapų procedūra 25 . Po apdorojimo ląstelės buvo surinktos guminiu policistu, nuplautos 1x PBS ir lizuotos 500 μl lizės buferio ant ledo 4 minutes. Tada ląstelių lizatai buvo centrifuguoti 19 326 x g greičiu 1 min. Mikrocentrifūgoje. Antrame etape granulės (branduolinė frakcija) vieną kartą buvo plaunamos skalbimo buferiu, kuris buvo toks pat kaip lizės buferis be Nonidet P-40. Paskutiniame etape branduoliai buvo apdoroti ekstrahavimo buferiu, kuriame yra 500 mmol / L KCl, 10% glicerolio ir keliais kitais reagentais, kaip ir lizės buferyje. Branduolių / ekstrahavimo buferio mišinys buvo užšaldytas -80 ° C temperatūroje, atšildytas ant ledo ir 5 minutes centrifuguotas 19 326 x g greičiu. Supernatantas buvo surinktas kaip branduolinis ekstraktas.

Imuniniam nusėdimui ląstelių lizatai, turintys vienodą baltymų kiekį (500 μg) iš RAW264.7 ląstelių, auginamų 1 × 107 ląstelių / ml ir apdorotų ar neapdorotų LPS (1 μg / ml) 2, 5 min., Buvo iš anksto išvalyti 10 μL baltymų A-sujungtų Sepharose granulių (50% v / v ) (Amersham, UK) 1 val. 4 ° C temperatūroje. Iš anksto išvalyti mėginiai buvo inkubuojami su 5 μL anti-Akt antikūnų per naktį 4 ° C temperatūroje. Imuniniai kompleksai buvo sumaišyti su 10 μL su baltymu A sujungtų Sepharose granulių (50% VV ) ir maišomi sukant 3 valandas 4 ° C temperatūroje.

Tirpūs ląstelių lizatai arba virti imunoprecipiduoti granulės buvo analizuojami atliekant Western blot analizę ir fosforilintus arba suminius transkripcijos faktorius (p65, c-Jun ir c-Fos), MAPK baltymus (ERK, p38 ir JNK), IκBα, IKKα / β, Akt, p85 / PI3K, PDK1, γ-tubulinas, β-aktinas ir tirozino kinazės be receptorių (Src ir Syk) buvo vizualizuotos, kaip anksčiau pranešta 26 .

Akt ir PI3K kinazės tyrimai

Įvertinant ekstraktų Akt ir PI3K kinazių veiklą, naudojant išgrynintus fermentus, buvo naudojama kinazės profiliavimo tarnyba iš Millipore (//www.millipore.com/life_sciences/flx4/ld_kinases). Galutiniame 25 μL reakcijos tūryje Akt (1, 2 ir 3) arba PI3K (α, β ir γ; žmogus; 1–5 mU) baltymai buvo inkubuoti su reakcijos buferiu. Reakcija buvo inicijuota pridedant MgATP. Po 40 minučių inkubavimo kambario temperatūroje reakcija buvo sustabdyta pridedant 5 ml 3% fosforo rūgšties tirpalo. Dešimt mikrolitrų reakcijos produkto buvo nušviesta ant GF / P30 filtrato (PerkinElmer, Inc), po to tris kartus plaunama 5 minutes 75 mmol / l fosforo rūgštyje ir vieną kartą metanolyje prieš džiovinimą ir scintiliacijos skaičiavimą.

EtOH / HCl sukeltas gastritas, LPS sukeltas hepatitas ir ūmaus toksiškumo testai

Skrandžio uždegimas buvo sukeltas EtOH / HCl naudojant paskelbtą metodą 27 . Sutirštėjusios ICR pelės buvo gydomos 7 junginiu (nuo 10 iki 40 mg / kg) arba ranitidinu (40 mg / kg), suspenduotu 5% NaCMC. Po trisdešimt minučių per burną buvo sušvirkšta 400 μL 60% etanolio, esančio 150 mmol / l HCl. Kiekvienas gyvūnas buvo eutanazuotas perdozavus uretano praėjus 1 val. Po nekrotizuojančių agentų vartojimo. Skrandis buvo išimtas ir švelniai nuplaunamas po tekančiu vandentiekio vandeniu. Atidarius skrandį išilgai didesnio kreivumo ir paskleidus jį ant lentos, pikselių skaitikliu išmatuotas gleivinės erozinių pažeidimų plotas (mm 2 ). Kepenų uždegimas sukėlė LPS injekciją pagal paskelbtą metodą 28 . Patrintos C57BL / 6 pelės buvo peroraliai gydomos 7 junginiu (20 mg / kg) vieną kartą per dieną 6 dienas. Praėjus valandai po paskutinio vartojimo, į pilvaplėvės ertmę buvo suleista LPS (10 mg / kg). Kiekvienas gyvūnas anestezuotas perdozavus uretano per 1 val. Po hepatito induktorių, ir kraujas buvo imamas iš vartų venos. Tada kepenėlės buvo išpjautos ir švelniai nuplaunamos po tekančiu vandentiekio vandeniu. Serumas buvo gautas centrifuguojant kraują 3000 r / min 15 minučių. Alanino aminotransferazės (ALT) ir aspartato aminotransferazės (AST) koncentracija serume buvo išmatuota naudojant „Roche“ modulinį spektrofotometrinį autoanalizatorių. Atliekant ūmaus toksiškumo testą, 7 junginys buvo ištirpintas 20% PEG 400, praskiestas 5% BSA H2O arba suspenduotas 5% NaCMC ir sušvirkštas per burną arba injekcijomis į pilvaplėvės ertmę. Mirtingumas ir kūno svorio pokyčiai nustatyti po 7 d.

Statistinė analizė

Duomenys rodo mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų, kiekvienų atliktų trimis egzemplioriais, vidurkį ± standartinius nuokrypius (SD) (SD) arba jie atspindi tris skirtingus eksperimentus su panašiais rezultatais. Statistiniams palyginimams gauti rezultatai buvo analizuojami naudojant dispersijos analizę naudojant Scheffe post-hoc testą ir Kruskal-Wallis / Mann-Whitney U testą. Laikoma, kad P vertė <0, 05 reiškia reikšmingą skirtumą. Visi statistiniai testai buvo atlikti naudojant SPSS (Socialinių mokslų statistikos paketas, SPSS Inc, Čikaga, IL, JAV).

Rezultatai ir DISKUSIJA

Ieškodami naujų vaistų nuo uždegimo, atrinkome junginius (1A pav.), Panašios struktūros kaip BAY 11-7082, IKK inhibitorius, ir išbandėme juos dėl slopinamojo poveikio uždegimo tarpininkams NO, TNF-α ir PGE2. 7 junginys [8- (tosilamino) chinolinas] slopino NO gamybą priklausomai nuo dozės, nepaveikdamas ląstelių gyvybingumo (2 paveikslas), tuo tarpu kiti tirti junginiai neturėjo slopinamojo poveikio (1B paveikslas). 7 junginys slopino NO, PGE2 ir TNF-α išsiskyrimą RAW264.7 ląstelėse (2A paveikslas), pilvaplėvės makrofaguose (2B paveikslas) ir kaulų čiulpų makrofaguose (2C paveikslas) LPS ekspozicijos metu, esant IC50 reikšmėms. nuo 1 iki 5 μmol / L (2 lentelė). 7 junginio slopinamasis aktyvumas buvo panašus į BAY11-7082 (1C paveikslas), kai BAY11-7082 buvo tiriamas kaip gydymas artritu 11 . Šie atradimai patvirtina tolesnį 7 junginio kaip priešuždegiminio vaisto vystymąsi.

Image

1-7 ir BAY11-7082 junginių poveikis NO gamybai. (A) 1–7 junginių cheminės struktūros. (B ir C kairiajame skydelyje) Griess tyrimas buvo naudojamas NO lygiams nustatyti RAW264.7 ląstelių arba pilvaplėvės makrofagų, apdorotų bandomaisiais junginiais ir LPS (1 μg / l), kultūros supernatantuose. ml) 12 arba 24 valandas. (C dešinė panelė) RAW264.7 ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu. Vidurkis ± SD. n = 4. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontroline.

Visas dydis

Image

7 junginio poveikis uždegiminių mediatorių gamybai. (A, B ir C) NO, PGE 2 ir TNF-α lygiai buvo nustatyti atliekant Griess analizę, EIA ir ELISA RAW264.7 ląstelių, pilvaplėvės makrofagų ar kaulų čiulpų makrofagų, apdorotų junginiu, supernatantuose. 7 ir LPS (1 μg / ml) 6 arba 24 valandas. RAW264.7 ląstelių ir pilvaplėvės makrofagų gyvybingumas buvo nustatytas naudojant MTT tyrimą. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontroline.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Norėdami ištirti 7 junginio slopinamąjį mechanizmą, išanalizavome šio junginio poveikį genų, koduojančių uždegimo mediatorius, transkripcijai. 7 junginys nuo dozės priklausomai sumažino TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, COX-2 ir iNOS mRNR lygius, suponuodamas, kad šis vaistas slopina uždegiminių mediatorių gamybą transkripcijos lygiu (3 paveikslas). . Norėdami nustatyti transkripcijos veiksnius, kuriems taikomas 7 junginys, mes išmatuojome transkripcijos faktoriaus lygį branduolinėse frakcijose ląstelėse, paveiktose LPS, kaip uždegiminį dirgiklį. Šiuo parametru 7 junginys slopino p65 padidėjusį reguliavimą po 15 minučių ir 2 valandų, nedarant slopinamojo poveikio c-Jun ir c-Fos (4A paveikslas, kairysis skydelis). Mes nustatėme panašų slopinimo modelį LPS apdorotuose pilvaplėvės makrofaguose (4A paveikslas, dešinė panelė). Žurnalisto geno tyrime, atliktame su konstruktais, turinčiais NF-κB, CREB arba AP-1 surišimo promotorius, buvo stebimas panašus slopinamasis poveikis transkripcijos veiksnių aktyvacijai. Taigi, 7 junginys slopino NF-κB tarpininkaujamą luciferazės veiklą, kurią stimuliavo PMA arba kotransfekcija su kitomis adapterio molekulėmis, tokiomis kaip TRIF ir MyD88 (4B paveikslas), tačiau šis junginys neslopino AP-1 ar CREB aktyvumo (4C pav.). Šie rezultatai rodo, kad 7 junginys ankstyvoje stadijoje moduliuoja NF-κB signalizaciją.

Image

7 junginio poveikis priešuždegiminių genų ekspresijai. INOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6 ir IL-12 p40 mRNR lygiai buvo nustatyti pusiau kiekybine RT-PGR.

Visas dydis

Image

7 junginio poveikis transkripcijos veiksnių (NF-κB ir AP-1) aktyvavimui. (A) NF-κB (p65), STAT-1 ir AP-1 (c-Jun / c-Fos) lygis branduolinėse frakcijose iš LPS apdorotų RAW264.7 ląstelių ir pilvaplėvės makrofagų buvo nustatyti imunoblotų analizės būdu su antikūnai prieš visus baltymus. (B ir C) HEK293 ląstelės, kotransfekuotos NF-KB-Luc, CREB-Luc arba AP-1-Luc plazmidžių konstruktais; adapterio molekulės (MyD88 ir TRIF) (kiekviena po 1 μg / ml); ir β-gal (kaip transfekcijos kontrolė) buvo apdoroti 7 junginiu, BAY (BAY11-7082) arba U0 (U0126), esant arba neturint PMA (100 nmol / L). Luciferazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant luminometrą. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontroline.

Visas dydis

Kadangi NF-κB aktyvacija yra susijusi su kinazės aktyvavimo kaskadu, mes siekėme nustatyti tikslų junginio 7 taikinį, nustatydami fosforilinto IκBα, IKK, Akt, PDK1, PI3K ir Src ar Syk lygius po LPS stimuliacijos. Po 5 ir 60 minučių 7 junginys stipriai slopino IκBα fosforilinimą (5A pav.). Dėl 5 minučių poveikio mes atkreipėme dėmesį į ankstyvuosius signalizacijos įvykius, norėdami ištirti 7 junginio taikinį. Įdomu tai, kad IκBα ir jo priešakinė kinazė IKKα / β buvo fosforilinti per 1 min., O Akt fosforilinimas tuo metu nesumažėjo. Sutikdamas su šiuo rezultatu, 7 junginys neslopino Syk ar Src fosforilinimo, tirozino kinazės, kurios prisideda prie IκBα fosforilinimo per 5 minutes 29 . Šie duomenys rodo, kad 7 junginys tiesiogiai arba netiesiogiai nukreiptas į prieš IKK esančias molekules, tokias kaip Akt kinazė. Norint patvirtinti šias galimybes, buvo atliktas tiesioginis kinazės tyrimas su išgrynintu PI3K ir Akt. Priešingai nei tikėtasi, jokie PI3K ir Akt tipai nebuvo slopinami (5C pav.). Nepaisant to, gydymas 7 junginiu (5D pav.) Pastebimas molekulinis ryšys tarp Akt ir IKK buvo aiškiai sumažintas, tai rodo, kad atrodo, kad šis junginys yra skirtas jungčiai tarp Akt ir jo substrato baltymo IKK. Tuo tarpu, norėdami patvirtinti, kad 7 junginys neslopina AP-1, įvertinome fosforilintų su MAPK susijusių kinazių (ERK, JNK ir p38) lygius. Kaip ir tikėtasi, 7 junginys neslopino šių fermentų fosforilinimo (5E pav.).

Image

7 junginio poveikis signalizuojančių fermentų aktyvacijai prieš NF-κB translokaciją. (A, B ir E) IκBα, IKKα / β, Akt, ERK, p38, JNK ir β-aktino fosforo ir bendrųjų baltymų kiekis ląstelių lizatuose buvo nustatyti naudojant fosfo-specifinius ir bendro baltymo antikūnus, atitinkamai. (C) Akt ir PI3K kinazės aktyvumas buvo nustatytas tiesioginiu kinazės tyrimu, naudojant išgrynintus fermentus. Kiekvieno fermento (Akt arba PI3K) kontrolinis aktyvumas buvo nustatytas 100%. (D) 7 junginio poveikis signalinio komplekso, sudaryto iš Akt ir fosfo-IKK, susidarymui visuose LPS apdorotų RAW264.7 ląstelių (5x106 ląstelių / ml) lizatuose buvo nustatytas imunoprecipitacija su -Akt antikūnas ir imunoblotai su antikūnais prieš p-IKK.

Visas dydis

Akt kelias, laikomas vienu pagrindinių 7 junginio taikinių, iš pradžių buvo pripažintas kaip reikšmingas ląstelių išgyvenimo signalas, o vėliau kaip galimas taikinys vėžio terapijai. Tačiau remiantis naujausiais įrodymais, dėmesys nukrypo į Akt signalizacijos vaidmenį LPS sukeltose uždegiminėse reakcijose 30 . Pažymėtina, kad priešuždegiminiai žolelių ekstraktai iš Eleutherococcus senticosus , Dichroa feb rifuga ir Cymbopogon citratus 31, 32, 33 bei etnofarmakologiniai agentai, tokie kaip kurkuminas, resveratrolis ir kvercetinas 34, 35, 36, gali slopinti Akt kelią. Akt inhibitoriai LY294002 ir wortmanninas turėjo priešuždegiminį aktyvumą, kurį atspindi slopinant NO ir PGE2 (6A pav.). Be to, per didelis Akt ekspresas sukėlė NF-κB aktyvaciją iki 2, 5 karto, įvertinus matuojant NF-κB tarpininkaujamą luciferazės aktyvumą (6B paveikslas). Šie duomenys rodo, kad Akt kelio slopinimas gali būti lemiamas 7 junginio tarpininkaujamo priešuždegiminio poveikio įvykis. Mes ištirsime, kaip šis junginys tarpininkauja Akt-IKK surišimo slopinimui, nepaveikdamas Akt kinazės aktyvumo būsimuose eksperimentuose mūsų laboratorijoje. Šiuose eksperimentuose bus analizuojamas jungimosi tarp Akt ir IKK būdas ir šio jungimosi slopinimas 7 junginiu, naudojant šių baltymų mutantinius konstruktus ir imuninį nusodinimą.

Image

Funkcinis Akt vaidmuo sukeliant uždegimines reakcijas. (A) Kultūros supernatantuose, paruoštuose iš LPS apdorotų RAW264.7 ląstelių, iš anksto apdorotų standartiniais PI3K / Akt inhibitoriais [LY294002 (LY) ir wortmannin (Wort)], buvo tiriama, ar nėra NO, TNF-α ir PGE2. (B) HEK293 ląstelės buvo kotransfekuotos plazmidžių konstruktais, skirtuose NF-κB-Luc arba Akt (po 1 μg / ml kiekvienam) ir β-gal (kaip transfekcijos kontrolė). Luciferazės aktyvumas buvo matuojamas luminometru. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontroline. e P <0, 05, f P <0, 01 palyginti su normaliu.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar 7 junginys yra aktyvus peroraliniu būdu, mes išbandėme jo poveikį nuo EtOH / HCl stimuliuojamo gastrito - uždegiminės ligos in vivo modelio, plačiai naudojamo kuriant vaistus. Pavartojus vienkartinę 40 mg / kg dozę, 7 junginys žymiai sumažino skrandžio audinio sužalojimą suleidus EtOH / HCl, kaip ir teigiamos kontrolės ranitidinas (40 mg / kg) (7A pav.). Be to, šis junginys taip pat slopino LPS sukeltus hepatito simptomus, įvertintus išmatuojant fermentų (ALT ir AST) koncentraciją serume, rodančius kepenų pažeidimą, o tai reiškia, kad šis junginys taip pat palengvina in vivo TLR4 sukeltus uždegimo simptomus. Ūmus 7 junginio vartojimas pelėms, vartojant 500 mg / kg kūno svorio per savaitę per burną arba į pilvaplėvės ertmę, nesukelia jokio kūno svorio sutrikimo ar mirtingumo pokyčių (7C paveikslas). Šie rezultatai patvirtina tolesnį 7 junginio, kaip geriamojo, gerai toleruojamo priešuždegiminio vaisto, tyrimą 37 .

Image

7 junginio poveikis pelių skrandžio uždegimui, kurį sukelia gydymas HCl / EtOH, ir ūminiam toksiškumui. (A) Pelės buvo gydomos per burną 7 junginiu arba ranitidinu 3 dienas, po to buvo gydomos HCl / EtOH. Po 24 val. Skrandžio pažeidimai buvo išmatuoti pikseliais skaičiuojant dešinįjį skydelį) ir nufotografuoti (kairysis skydelis). Skrandžio pažeidimų, esančių po gydymo vien induktoriumi, plotas yra 100%. (B) Pelės, išgertos 7 junginiu 6 dienas, buvo pilvaplėvės ertmėje gydomos LPS. Po 1 valandos buvo paruoštas serumas, kad būtų galima išmatuoti biocheminius parametrus (AST ir ALT) (viršutinė plokštė), o p-IKK ir β-aktino lygiai buvo analizuojami atliekant kepenų lizato Western blot analizę (apatinė panelė). (C) 7 dienas po geriamojo vartojimo (1 g / kg) arba į pilvaplėvės ertmės 7-ojo junginio (500 mg / kg) injekcijos buvo stebimas mirtingumas ir kūno svorio pokyčiai. b P <0, 05 palyginti su kontrole.

Visas dydis

Apibendrinant, mes parodėme, kad 7 junginys gali slopinti NO, TNF-α ir PGE2 susidarymą LPS paveiktuose makrofaguose ir susilpninti HCl / EtOH sukeltą gastritą. Tyrinėdami 7 junginio priešuždegiminį mechanizmą, nustatėme, kad šis junginys gali blokuoti NF-κB aktyvaciją slopindamas IκBα, IKK ir Akt signalizaciją prieš srovę (8 paveikslas). Mes siūlome, kad 7 junginys galėtų būti naudojamas kaip naujas vaistas nuo uždegimo. Norėdami ištirti šią paraišką, ikiklinikinio tyrimo metu ištirsime 7 junginio veiksmingumą in vivo, naudodami ūminių sutrikimų (septinio šoko ir karagenino sukeltą artritą) ir lėtinių sutrikimų (kolageno arba adjuvanto sukeltas artritas) modelius.

Image

Spėjamas LPS suaktyvinto uždegiminio signalo slopinimo 7 junginiu būdas.

Visas dydis

Autoriaus indėlis

Yongwoo JUNG, Sungyoul HONG ir Jae Youl CHO sukūrė tyrimus; Yongwoo JUNG, Se Eun BYEON, Dae Sung YOO, Tao YU, Yanyan YANG, Ji Hye KIM, Eunji Kim, Yong Gyu LEE ir Deok JEONG atliko tyrimus; Yongwoo JUNG, Man Hee RHEE, Eui Su CHOUNG, Sungyoul HONG ir Jae Youl CHO išanalizavo duomenis; ir Jae Youl CHO parašė darbą.

Santrumpos

ERK, su tarpląsteliniu signalu susijusi kinazė; TLR, į rinkliavas panašūs receptoriai; MAPK, mitogenu aktyvuota baltymo kinazė; NF-KB, branduolinis faktorius-KB; AP-1, aktyvatoriaus baltymas-1; JNK, c-Jun N-galo kinazė; Akt, baltymo kinazė B; ATF2, aktyvuojantis 2 transkripcijos faktorių; CREB, cAMP atsako elementų surišimas; IKK, IκBα kinazė; IRAK1, su interleukin-1 receptoriais susijusi kinazė 1; MKK, MAP kinazės kinazė; MyD88, mieloidinės diferenciacijos pirminio atsako baltymas-88; TRAF6, naviko nekrozės faktoriaus-receptoriaus susijęs faktorius-6; TAK1, TGF-β-aktyvuota kinazė-1; PDK1, nuo fosfoinositido priklausomas baltymo kinazė-1; Syk, blužnies tirozinkinazė; TRIF, TIR srities domeną turintis adapteris, sukeliantis interferoną β; PAV, fermento imunologinis tyrimas; ELISA, su fermentais susijęs imunosorbentų tyrimas; MTT, 3-4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromidas; PI3K, fosfoinositido 3-kinazė; LPS, lipopolisaharidas; RT-PGR, atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija; ALT, serumo alanino aminotransferazė; AST, aspartato aminotransferazė