Il-12rβ2 nebuvimas cd33 + cd38 + vaikų ūmiose mieloidinės leukemijos ląstelėse skatina pelių, progresuojančių nod / scid / il2rγc trūkumą, progresavimą | leukemija

Il-12rβ2 nebuvimas cd33 + cd38 + vaikų ūmiose mieloidinės leukemijos ląstelėse skatina pelių, progresuojančių nod / scid / il2rγc trūkumą, progresavimą | leukemija

Anonim

Anotacija

Vaikystėje ūmi mieloidinė leukemija (AML) yra hematologinis piktybinis navikas, kurio metu naviko krūvį nuolat papildo leukemiją sukeliančios ląstelės (IC), kurios lėtai dauginasi ir yra atsparios chemoterapiniams vaistams. Mes ištyrėme, ar interleukinas (IL) -12, imunomoduliuojantis citokinas, turintis priešnavikinį aktyvumą, gali nukreipti į AML blastus (CD45 + CD33 + ) ir populiacijas, kuriose yra leukemijos IC (ty CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - ląstelės). Pirmą kartą parodome, kad: i) AML blastai ir jų CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 +, CD44 + CD38 - pogrupiai išreiškia heterodimerinį IL-12 receptorių (IL-12R), ii) AML ląstelės, švirkščiamos po oda į NOD / SCID / Il2rg - / - (NSG) pelėms išsivystė lokalizuota naviko masė, kurioje buvo leukeminių IC ir blastų, kurie praktiškai buvo pašalinti gydant IL-12, iii) AML ląstelės, švirkščiamos į veną NSG pelėms, persodintoms per pirmąjį mėnesį blužnyje, bet ne kaulų čiulpuose ar periferiniame kraujyje. Šiuo metu IL-12 dramatiškai sušvelnino AML CD45 + CD33 +, CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - populiacijas, taupydamas tik likusias CD33 + CD38 + ląsteles, kurios neišreiškė IL-12Rβ2. Po 30–60 dienų po pradinio užkrėtimo, šios IL-12 nereaguojančios ląstelės išsiplėtė ir metastazavo tiek kontrolinėse, tiek IL-12 apdorotose NSG pelėse. Mūsų duomenys rodo, kad IL-12Rβ2 nebuvimas vaikų AML ląstelėse skatina leukemijos progresavimą pelėms, sergančioms NOD / SCID / IL2Rγc.

Įvadas

Ūminė mieloleukemija (AML) yra hematologinis navikas, atsirandantis dėl piktybinio mieloidinės kilmės blastų, kurie dauginasi ir kaupiasi kaulų čiulpuose (BM), transformacijos. 1, 2 AML yra kliniškai ir genetiškai nevienalytė liga, sukelianti daugiau nei pusę visų vaikų leukemija sergančių pacientų mirtinų atvejų. 3, 4, 4 AML inicijuojančios ląstelės (IC) yra funkciškai apibrėžtos kaip žmogaus ląstelės, kurios sukelia serijinę transplantuojamą leukemiją pelėms, kurių imunodeficitas yra sunkus. AML-IC atsinaujina ir palaiko didžiąją dalį leukemijos ląstelių. 5, 6 AML-IC yra ramioje būsenoje, lėtai dalijasi ląstelės, esančios BM nišose, kuriose jos sukuria palankias mikroaplinkos sąlygas, kad išlaikytų kamieną, ilgus metus išliktų ramybės būsenoje ir atsispirtų chemoterapiniams preparatams. 7, 8, 9 Be to, neseniai buvo pasiūlyta, kad tūriniai navikai turėtų fenotipinį plastiškumą tarp naviko IC ir ne IC, ir kad tarp šių dviejų populiacijų tam tikroje navikoje gali egzistuoti dinaminė pusiausvyra. 10 Skirtingi mikroaplinkos dirgikliai tokią pusiausvyrą gali perkelti bet kuria kryptimi. Taigi, remiantis šiais faktais, idealiuose terapiniuose protokoluose, skirtuose prieš AML, turėtų būti agentų, nukreiptų tiek į IC, tiek į blastą, ir atliekantiems antiangiogenines funkcijas, veikiančius leukemijos IC kraujagyslių nišą. 9, 11 pradinės AML ląstelių analizės, pasirinktos remiantis ląstelių paviršiaus žymeklio ekspresija, parodė, kad IC yra CD34 + CD38 - ; priešingai, CD34 + CD38 + ir CD34 frakcijose nebuvo ląstelių, turinčių šias savybes. 6, 7, 12, 13, tačiau naujesni tyrimai rodo, kad reikia persvarstyti imunofenotipinį AML-IC apibrėžimą. Iš tiesų buvo nustatyta, kad anti-CD38 antikūnai (Abs) daro stiprų slopinamąjį poveikį pirminių AML ląstelių persodinimui NOD / SCID pelėms ir sunkesnio imunodeficito NOD / SCID / Il2rg - / - (NSG) pelėms. 14 Panašiai, kai CD44 ir CD123 paviršiaus žymenys yra ekspresuojami AML-IC, nukreipimas į šias molekules pašalina AML-IC ir atitinkamai leukemijos naštą SCID / NOD pelėms. 15, 16 Visai neseniai Sarry ir kt. 17 parodė, kad AML-IC yra nevienalytės, jos gali būti CD38 + AML pogrupyje ir nebūtinai gaunamos iš kraujodaros kamieninių ląstelių, kaip iš pradžių buvo spėjama.

Mes ištyrėme interleukino (IL) -12 gebėjimą veikti kaip priešnavikinį agentą prieš AML blastus ir skirtingas AML populiacijas, turinčias ląsteles, turinčias IC savybes, ir slopinti angiogeninį AML ląstelių aktyvumą. Šiuo atžvilgiu mes ir kiti parodėme, kad IL-12, jungiantis prie heterodimerinio receptoriaus (R), sudaryto iš β1 ir β2 grandinių, 18, 19, 20, slopina kietų ir hematologinių piktybinių navikų (tai yra išsėtinės mielomos) augimą. ) veikdami tiesiogiai naviko ląsteles arba naudodamiesi netiesioginiais mechanizmais, tokiais kaip antinavikinių natūralių žudikų ir citotoksinių T limfocitų reakcijų indukcija arba angiogenezės slopinimas. 21, 22, 23, 24

Pacientai ir metodai

Pacientų

IRCCS Fondazione Policlinico San Matteo, Pavia, Italija, Vaikų hematologijos ir onkologijos skyriaus institucinė apžvalgos taryba patvirtino tyrimo projektą. Šis tyrimas atitiko Helsinkio deklaracijos principus. Pradinė AML diagnozė kartu su potipiu buvo nustatyta pagal PSO (Pasaulio sveikatos organizacija) ir Prancūzijos, Amerikos ir Didžiosios Britanijos klasifikaciją. Iš viso iš eilės buvo įtraukta 20 vaikų, sergančių AML, iš kurių 14 buvo vyrai ir 6 moterys. Blastų rinkimo metu visi pacientai nebuvo gydomi. Paciento amžius svyravo nuo 3 mėnesių iki 19 metų. Šeši pacientai turėjo M2, keturis M5, keturis M3, tris M4, du M6 ir vieną M1 AML. Tyrime dalyvavusių vaikų klinikinės charakteristikos išsamiai aprašytos 1 lentelėje. Diagnozės tikslais atlikti pacientų BM aspiratų mėginių kiekiai buvo gauti gavus rašytinį informuotą sutikimą diagnozuojant ir juose buvo ne mažiau kaip 85% neoplastinių ląstelių. Tiriant onkologinius sutrikimus nepatenkintus šešis amžius asmenų, siekiančių diagnozuoti BM mėginius, buvo gauti alikvotai, gavus informuotą sutikimą. Vienbranduolės ląstelės buvo išskirtos iš BM, naudojant Ficoll-Hypaque tankio gradientą („Sigma Chemical Co.“, Sent Luisas, MO, JAV), ir ląstelės buvo surinktos ir konservuotos konservuotam vėlesniam naudojimui.

Pilno dydžio lentelė

Antikūnai, reagentai ir srauto citometrija

Srauto citometrinei analizei buvo naudojami šie abs: PE-konjuguotas anti-žmogaus IL-12Rβ1; ožkos IgG anti-žmogaus IL-12Rβ2 (Santa Kruso biotechnologija, Santa Krusas, CA, JAV); PE-, FITC-, alofilococianino (APC) arba trispalvių (TC) -konjuguoto anti-žmogaus CD45 (Caltag, Burlingame, CA, JAV); FITC arba PE-anti-žmogaus CD33 (Caltag); FITC arba PE arba TC konjuguotas anti-žmogaus CD34 (Caltag); PE-, FITC-, APC- arba TC-konjuguotas anti-žmogaus CD38 (Caltag); APC arba FITC konjuguotas anti-žmogaus CD44, FITC konjuguotas anti-žmogaus Ki67 (DAKO, Glostrup, Danija). Visi aukščiau išvardyti monokloniniai (m) abs reagavo tik su žmogaus ląstelėmis. Antižmogiškas IL-12Rβ2 ožkos IgG nustato viduląstelinį IL-12Rβ2 epitopą, todėl jis buvo patikrintas naudojant BD Cytofix / Cytoperm fiksavimo / permeabilizacijos rinkinį (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, JAV). Kontrolėmis buvo naudojami arba nespecifinio specifiškumo, atitinkantys izotipą Ab, arba neimuninis ožkos IgG (Caltag). Ląstelės buvo įvertintos „Gallios“ srauto citometrija ir duomenys buvo apdoroti naudojant „Kaluza 1.1“ programinę įrangą (Beckman Coulter, Brea, CA, JAV). Duomenys buvo išreikšti teigiamų ląstelių procentine išraiška arba fluorescencijos intensyvumo (MRFI) santykiniu vidurkiu, apskaičiuotu taip: fluorescencijos intensyvumas, gautas naudojant specifinį mAb / fluorescencijos intensyvumas, gautas naudojant nereikšmingą izotipą atitinkantį mAb.

hrIL-12, maloniai paaukotas Wyeth (Kembridžas, MA, JAV), buvo naudojamas in vivo ir in vitro tyrimams.

AML ląstelių transplantacija NSG pelėms

Penkių / šešių savaičių NSG pelės (Džeksono laboratorija, Bar Harboras, ME, JAV) buvo laikomos specialiomis sąlygomis be patogenų. Visos procedūros, susijusios su gyvūnais, buvo vykdomos pagal galiojančius nacionalinius ir tarptautinius reglamentus (DL 27/01/1992, Nr. 1116, Europos ekonominės bendrijos tarybos direktyva 86/609, OL L 358, 1987 m. Gruodžio 1 d.). Iš viso 8 x 106 AML ląstelės iš paciento (Pt) # 16 buvo sušvirkštos į poodį į dvi keturių gyvūnų grupes. Viena pelių grupė buvo gydoma sc po dvi hrIL-12 dozes per savaitę (1 μg / pelė / dozė), praėjus 3 dienoms po naviko ląstelių injekcijos. Kita gyvūnų grupė buvo gydoma fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS; kontrolinės medžiagos) pagal tą patį laiko grafiką.

Kitame eksperimentų rinkinyje 10 NSG pelių buvo įšvirkštos į veną (iv) 3–5 × 106 AML ląstelių suspensijos (iš Pt # 4, # 5, # 6, # 11, # 17, # 18, # 19 arba # 20). Šie mėginiai buvo atrinkti, nes jie buvo labai praturtinti (> 95%) neoplastinėmis ląstelėmis, kurių dauguma ekspresijavo IL-12Rβ2 (mažiausiai 82% IL-12Rβ2 + CD33 + ląstelės). Pelės buvo padalintos į dvi grupes po penkis gyvūnus, kiekvienam gavusiems iv hrIL-12 arba PBS pagal tą patį aukščiau nurodytą grafiką. Pelės buvo nužudytos, kai paaiškėjo prastos sveikatos požymiai. Iš kiekvieno gyvūno buvo surinkti šie audiniai: blužnis, periferinis kraujas (PB) iš retroorbitalinės venos ir BM, gautas šlaunikauliu plaunant. Kaip biologiškai reikšmingas ribas buvo panaudotas daugiau kaip 1% žmogaus CD45 + ląstelių įsiskverbimo kriterijus vienatūrėse ląstelėse iš pelių audinių, įvertintas srauto citometrija.

Iš kontrolinių pelių blužnies buvo imamos serijinės žmogaus ląstelių, atskirtų imunomagnetiniais granulėmis, padengtos anti-žmogaus CD45 mAb (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Vokietija), transplantacijos. Pirminių ir antrinių recipientų CD45 + ląstelėms buvo atlikta atrinktų polimorfinių trumpųjų tandemų pakartotinių lokusų molekulinė analizė, kaip aprašyta 26, 27. Kai kuriuose eksperimentuose CD38 + ląstelės buvo išskirtos imunomagnetinėmis granulėmis, padengtomis antihumaniniais CD38 mAb (Miltenyi Biotec GmbH). iš dviejų su PBS ir dviem IL-12 gydytų pelių blužnies ir BM ir sušvirkšta į antrinius recipientus (7–9 x 105 ląstelės kiekvienam gyvūnui).

Morfologinės ir imunohistocheminės analizės

Auglių, išskiriamų iš gyvūnų, kuriems buvo sušvirkštos pirminės AML ląstelės, morfologinė ir imunohistocheminė analizė buvo atlikta, kaip aprašyta. 28, 29 Trumpai tariant, su apoptoze susijęs DNR suskaidymas buvo aptiktas terminalaus dezoksinukleotidiltransferazės dUTP slapyvardžio žymėjimo būdu, dažant ApopTag Plus peroksidazės in situ apoptozės rinkinyje (Millipore, Billerica, MA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Parafinu įterptos sekcijos buvo imunizuotos anti-žmogaus IL-6 (Abcam, Kembridžas, JK) arba anti-žmogaus CD44 (AbD Serotec, Oxford, UK) arba žiurkių anti-pelių CD31 (klonas SZ31; Dianova, Hamburgas, Vokietija).

Realaus laiko PGR

Diagnozės metu visa RNR buvo ekstrahuota iš dviejų AML mėginių (Pt # 6 ir # 9) ir iš CD45 + ląstelių, išskirtų iš trijų BMS PBS apdorotų pelių ir dviejų iš hrIL-12 gydytų pelių, įšvirkštų tų pačių mėginių, naudojant „RNeasy“ mikro rinkinys („QIAGEN“, GmbH, Hilden, Vokietija). Apskritai, 1 μg RNR buvo transkribuota naudojant „RevertAid First Strand“ cDNR sintezės rinkinį („Fermentas“, „Thermo Fisher Scientific“, MA, JAV) ir realiuoju laiku atlikta PGR, naudojant ABI PRISM 7700 sekos detektorių iš „Applied Biosystems“ (Carlsbad, CA, USA). JAV). Amplifikacija buvo atlikta naudojant IL-12Rβ2 ir GAPDH pradmenų rinkinius ir RT 2 qPCR Master Mix (SABiosciences, Frederick, MD, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Santykinis IL-12Rβ2 nuorašo kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant 2 - (ΔΔCt) metodą, naudojant kalibratorių normalias B ląsteles.

Statistinė analizė

CAM tyrime suformuotų kraujagyslių skaičiaus skirtumai (žr. Papildomus metodus) ir procentų bei absoliučių skaičių skirtumai buvo įvertinti Studento t testu 99% pasikliovimo intervalu (GraphPad Prism 3, GraphPad Software, La Jolla, CA, JAV). Visi statistiniai testai buvo dvipusiai. Statistiškai reikšminga buvo mažesnė nei 0, 05 P vertė .

Rezultatai

IL-12R ekspresija vaikų AML blastose ir CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 +, CD44 + CD38 - populiacijos iš AML sergančių pacientų ir sveikų donorų

Pirmiausia srauto citometrijos būdu ištirta IL-12Rβ1 ir β2 grandinių raiška BM AML sprogdinimo ląstelėse iš 20 pacientų. AML blastinės ląstelės buvo identifikuotos pagal CD33 paviršiaus žymens išraišką. Kaip parodyta 1a paveiksle, šios ląstelės iš esmės ekspresuoja abi IL-12R grandines (vidutinis IL-12Rβ1 + ląstelių procentas 64%, diapazonas 61–66%; MRFI IL-12Rβ1 + ląstelės 3, 7, diapazonas 2, 7–5; vidutinis IL procentas) -12Rβ2 + ląstelės 79%, diapazonas 62–98%; MRFI IL-12Rβ2 + ląstelės 15, diapazonas 4–22, 2).

Image

IL-12R ekspresija CD33 +, CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - AML ląstelėse iš BM vaikų. ( a ) IL-12Rβ1 ir IL-12Rβ2 paviršiaus ekspresija turimose CD33 + (CD33 FITC) AML ląstelėse. Iš viso parodomi 3 tipiniai eksperimentai iš 20. Tamsus profilis: IL-12Rβ1 (viršutinės plokštės) arba IL-12Rβ2 (apatinės plokštės) dažymas; atviras profilis: dažymas pagal izotipą Ab. ( b, c ) IL-12Rβ1 ir IL-12Rβ2 paviršiaus ekspresija CD34 + CD38 - (CD34 TC, CD38 APC; viršutinės plokštės), CD33 + CD38 + (CD33 FITC, CD38 APC; vidurinės plokštės) ir CD44 + CD38 - ( CD44 FITC, CD38 APC; apatinės plokštės) normaliose BM ( b ) ar AML ( c ) populiacijose. Tamsus profilis: IL-12Rβ1 (kairysis skydelis) arba IL-12Rβ2 (dešinysis skydas) dažymas; atviras profilis: dažymas pagal izotipą Ab.

Visas dydis

Toliau mes išanalizavome IL-12Rβ1 ir IL-12Rβ2 raišką CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - pogrupiuose, kuriuose yra ląstelės su leukeminėmis IC. 5, 7, 12, 17 Šie eksperimentai, atlikti su ląstelių mėginiais iš Pt # 5, # 6, # 7, # 12 ir # 16, parodė, kad abi IL-12R grandinės buvo nuosekliai ekspresuojamos. Visų pirma, CD34 + CD38 - pogrupis išreiškė IL-12Rβ1, kai vidutinis procentas yra 89%, diapazonas yra 85–94% (vienas reprezentatyvus eksperimentas parodytas 1b paveiksle, viršutinė kairioji plokštė) ir IL-12Rβ2, kai vidutinis procentas yra 94%, diapazonas 93–96% (1b paveikslas, viršutinis dešinysis skydas); CD33 + CD38 + pogrupis išreiškė IL-12Rβ1, kai vidutinis procentas buvo 78%, intervalas 73–82% (1b paveikslas, vidurinė kairioji plokštė), ir IL-12Rβ2, kai vidutinis procentas buvo 72%, intervalas 64–76% (1b paveikslas, vidurinis dešinysis skydelis). Galiausiai IL-12Rβ1 ir IL-12Rβ2 buvo išreikšti CD44 + CD38 - pogrupyje - atitinkamai atitinkamai 65%, diapazonas 56–71% ir 68%, 62–74% (p. 1b paveikslas, apatinė kairioji ir dešinė plokštės). ).

Šie eksperimentai parodė, kad IL-12 gali būti nukreiptas į AML sprogmenis ir įvairius AML ląstelių pogrupius, kuriuose yra leukemijos IC.

Galiausiai, abiejų IL-12R grandinių raiška buvo ištirta CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - pogrupiuose iš šešių amžių atitinkančių sveikų asmenų BM aspiracijų. Ši analizė atskleidė, kad šie subpopuliatoriai išreiškė ir IL-12Rβ1, ir IL-12Rβ2 grandines (1c paveikslas).

Greitas IL-12, kaip naujo vaisto nuo AML, priešnavikinio aktyvumo patikrinimas: sc in vivo modelis

Tiesioginis anti-navikinis IL-12 aktyvumas skirtingų AML ląstelių pogrupių atžvilgiu buvo išbandytas in vivo NSG pelėms, kurios yra tinkamiausias pirminio neoplastinių ląstelių ir IC efektyvaus įsodinimo modelis. 30, 31 m. Mūsų pirmasis eksperimentas buvo atliktas injekuojant pirmines AML ląsteles (Pt # 16) sc NSG pelėms, nes šis tyrimas yra plačiai naudojamas greitam naujojo vaisto priešnavikinio aktyvumo patikrinimui.

Pirmiausia diagnozuojant iš paciento šviežiai išskirtas 8 × 106 AML ląsteles (Pt # 16, 93% CD33 + IL-12Rβ2 + ir 82% CD33 + IL-12Rβ1 + ląstelės), buvo sušvirkštos į dvi grupes (tai yra kontrolinės ir IL-12 gydytų) po keturias NSG peles.

Praėjus vienai savaitei po AML ląstelių injekcijos, visoms NSG pelėms auglio ląstelių inokuliacijos vietoje atsirado jautrus mazgelis. Po septynių dienų visoms hrIL-12 gydytoms pelėms buvo nustatyta odos nekrozinė sritis netoli mazgelio. Visos pelės buvo nužudytos 18-tą dieną, nes kontrolė parodė raukšlėtą kailį ir sisteminę ligą. Srauto citometrinė analizė parodė, kad kontrolinių pelių auglius sudarė 85 ± 4% žmogaus CD45 + ląstelių, iš kurių 10 ± 1, 5% sudarė CD34 + CD38 - didžioji dauguma buvo CD33 + CD38 + (2A paveikslas, viršutinės plokštės). Pastarosios ląstelės taip pat ekspresuoja CD44 žymeklį (žr. Žemiau). Priešingai, hrIL-12 gydytų pelių navikų masėse buvo tik 7 ± 1, 2% CD45 + ląstelių ir menkos CD33 + CD38 + ląstelės (2A paveikslas, apatinės plokštės). CD34 + CD38 - ląstelės nebuvo aptinkamos.

Image

IL-12 priešnavikinis aktyvumas sc gyvūno modelyje. ( A ) Žmogaus CD45 + (kairės plokštės), CD34 + CD38 - (vidurinės plokštės), CD33 + CD38 + (dešinės plokštės) AML ląstelės, rastos navikuose iš kontrolinių pelių (viršutinės plokštės) ir hrIL-12 gydytų pelių (apatinės plokštės) ) injekuota sc su AML ląstelėmis iš Pt # 16. Parodytas vienas reprezentatyvus eksperimentas iš keturių. ( B ) Morfologiniai ir imunohistocheminiai navikai iš gyvūnų, kuriems buvo sušvirkštos pirminės AML ląstelės ir kurie buvo gydomi PBS (a – d) arba hrIL-12 (e – h) (a, e: × 200; b, f: × 630; c, d, g, h: × 400). Šie navikai buvo ištirti dėl mikrovelenų susidarymo (dažymas CD31: c, g), apoptozės (galutinio dezoksinukleotidiltransferazės dUTP slapyvardžio žymėjimas: d, h) ir ( C ) IL-6 ekspresija (× 1000). ( D ) Žmogaus CD45 + (kairysis skydelis) ir CD34 + CD38 - ląstelės (vidurinis skydelis), rastos antrinių recipientų blužniuose, įpurškiamose AML ląstelėse, surinktose iš pirminių kontrolinių recipientų. Parodytas vienas reprezentatyvus eksperimentas iš keturių. Dešiniajame skydelyje atlikta polimorfinių trumpų tandemų pakartotinių lokusų (žmogaus FGA) gelinė molekulinė analizė AML blastų iš Pt # 16 diagnozės metu (2 juosta), CD45 + ląstelėse, išskirtose iš vieno reprezentatyvaus pirminio recipiento naviko masės, įšvirkšto sc (3 juosta) ir CD45 + ląstelėse iš vieno tipinio antrinio recipiento blužnies buvo sušvirkštos CD45 + ląstelės, išskirtos iš navikų, užaugintų pirminiame kontroliniame recipiente (4 juosta). 1 juosta rodo molekulinio svorio žymenis.

Visas dydis

Morfologiniai tyrimai parodė, kad kontrolinių NSG pelių auglius sudarė mažo ir vidutinio dydžio blastai (2B paveikslas, a papunktis), turintys nedaug citoplazmos, aukštą branduolio / citoplazmos santykį ir menką granulocitinę diferenciaciją (2B paveikslas, b dalis). Kontroliniams navikams buvo suteiktas smulkiai išsišakojęs mikrovaskuliaras, kaip atskleidė CD31 imuninis dažymas (2B paveikslas, c poskyris) ir retos apoptozinės ląstelės (2B paveikslas, d poskyris), įvertintos atliekant galinį deoksinukleotidil-transferazės dUTP slaptojo galo žymėjimo testą. Gydymas hrIL-12 smarkiai pakenkė daugumos AML blastų gyvybingumui (2B paveikslas, e dalis) ir sukėlė nekrozinį-hemoraginį naviko masės (2B paveikslas, f skydelis), kurią kerta mikroverstinių sienelių fragmentai, suskaidymą (2B paveikslas, 2B paveikslas). g dalis) ir keletas etatikos indų, užsikimšusių nekrotinių sričių įdarbintų granulocitų. Be to, šios masės parodė dažnesnius apoptozinius įvykius nei kontrolinės grupės navikai (2B paveikslas, h panelis).

Kadangi nustatyta, kad IL-12 sumažina angiogeninį pirminių AML ląstelių aktyvumą ir sumažina IL-6 ekspresiją in vitro (žr. Papildomą 1c paveikslą), kuris parodo autokrininį / paracrininį AML ląstelių augimo faktorių, 32 mes išbandėme IL-12 turi įtakos IL-6 raiškai in vivo . Kaip parodyta 2C paveiksle, kontrolinių pelių navikai parodė difuzinę IL-6 ekspresiją (kairioji skydinė dalis), tuo tarpu masė, gauta iš pelių, gautų iš IL-12, pelių (dešinė panelė) buvo menka.

Aukščiau aprašyti eksperimentai atskleidė, kad poodiniai navikai, susidarę pirminių AML ląstelių kontrolinėse NSG pelėse, turėjo CD34 + CD38 - ir CD33 + CD38 + ląstelių frakcijas, kurios, kaip anksčiau buvo įrodyta, turi leukemijos IC. 6, 7, 12, 17 Taigi mes išbandėme, ar šiems gyvūnams įskiepytos žmogaus ląstelės išlaiko sugebėjimą augti antriniuose recipientuose. Šiuo tikslu CD45 + ląstelės, išgrynintos imunomagnetiniais granulėmis iš dviejų skirtingų kontrolinių pelių navikų, buvo įšvirkštos į antrinius recipientus ( n = 2, 1 x 106 ląstelių kiekvienoje). Kadangi šioms pelėms nebuvo susiformavęs mazgelis, jos buvo sunaikintos praėjus dviem su puse mėnesio po auglio ląstelių inokuliacijos, o blužnis, PB ir BM buvo surinkti. Srauto citometrijos analizė parodė, kad žmogaus CD45 + ląstelės nebuvo aptinkamos BM ir PB, bet buvo aptinkamos abiejų gyvūnų blužnyje (vidurkis ± sd%: 45 ± 5%; vienas reprezentatyvus eksperimentas parodytas 2D paveiksle, kairiajame skydelyje). Pastarosios ląstelės daugiausia buvo sudarytos iš CD38 + leukemijos ląstelių su mažesnėmis CD34 + CD38 ląstelių proporcijomis (vidutinis ± sd%: 5 ± 0, 5%; 2D paveikslas, vidurinė plokštė). Molekulinė analizė parodė, kad išvalytos CD45 + ląstelės iš antrinių recipientų blužnies vienareikšmiškai priklausė pradiniam AML klonui (Pt # 16), apie kurį liudija tie patys polimorfiniai trumpalaikiai tandemo pakartojimo lokai, nustatyti ir pirminėse AML ląstelėse diagnozuojant, ir navikai iš pirminio kontrolinio recipiento (2D paveikslas, dešinė panelė).

Negalėjome įvertinti antrinių liekanų žmogaus CD45 + ląstelių, gautų iš IL-12 gydytų pirminių recipientų, tumorigeniškumo dėl prasto kelių ląstelių, likusių po citokinų sukeltos ekstensyvios audinių nekrozės, gyvybingumo.

IL-12 slopina AML ląstelių augimą, veikdamas skirtingas ląstelių frakcijas ankstyvosiose in vivo augimo fazėse

Toliau mes ištyrėme, ar hrIL-12 gali užkirsti kelią leukemijos plitimui po iv. Pirminių AML ląstelių injekcijos. Šis gyvūnų modelis atidžiai imituoja žmogaus AML ląstelių plitimą.

Eksperimentai buvo atlikti inokuliuojant iv 3 × 106 pirmines AML ląsteles, gautas iš Pt # 4, # 5, # 6, # 11, # 17, # 18, # 19 ar # 20 NSG pelėms. Kiekvieno eksperimento metu penki gyvūnai buvo gydomi hrIL-12, kiti penki - PBS, laikantis to paties grafiko, nurodyto sc eksperimentuose. Praėjus keturioms savaitėms po AML ląstelių užkrėtimo, pelės buvo nužudytos, o PB, blužnies ir BM ląstelės (gautos iš šlaunikaulio kaulų). Kiekvieno paciento AML ląstelės buvo efektyviai įsodintos į visas kontrolines ir hrIL-12 gydytas peles, tai patvirtina mažiausiai 1% žmogaus CD45 + ląstelių blužnyje (3a pav.). Žmogaus ląstelių nebuvo iš PB ir BM (žmogaus CD45 + ląstelės <1%) iš visų IL-12 gydytų ir kontrolinių pelių. Iš kontrolinių pelių ištirtų blužnies srauto citometrinė analizė parodė, kad 69–79% mononuklearuotų pacientų populiacijos išreiškė žmogaus CD45 žymeklį (žr. 3a paveikslą procentais ir 3b paveikslą absoliučiais skaičiais, viršutinę plokštę). Žmogaus CD45 + ląstelės buvo sudarytos iš trijų pogrupių šiomis proporcijomis: 10 ± 3% CD34 + CD38 - ląstelės (3a paveikslas, apatinis kairysis skydelis), 72 ± 4% CD33 + CD38 + ląstelės (3a paveikslas, apatinė vidurinė plokštė) ir 15 ± 4% CD44 + CD38 - ląstelės (3a paveikslas, apatinis dešinysis skydelis). Kiekvieno pogrupio absoliutūs skaičiai nurodyti 3b paveiksle. CD44 žymeklis taip pat buvo aptiktas CD33 + CD38 + pogrupyje (neparodytas).

Image

Žmogaus ląstelių, paimtų iš NSG pelių, švirkštų į veną AML ląsteles iš vaikų, 30 ir 60 dienomis analizė. ( a, b ) Procentas ( a ) ir absoliutus skaičius ( b ) žmogaus CD45 + (CD45 TC; viršutinė histograma abiejose plokštėse), CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - ląstelių (CD34 PE, CD38 APC, CD33 FITC, CD44 FITC; apatinės plokštės), įskiepytos į pelių, apdorotų PBS (CTR, baltos juostos) arba hrIL-12 (pilkos juostos), blužnius 30 dieną po AML ląstelių injekcijos. Rodomi sujungti rezultatai. Duomenys pateikiami kaip vidutinis ± sd gelis dešinėje rodo polimorfinių trumpų tandemų pakartotinių lokusų (žmogaus FGA) molekulinę analizę blastose iš Pt # 6 diagnozės metu (2 juosta), CD45 + ląstelėse, išskirtose iš vieno reprezentatyvaus pirminio blužnies. recipientas (3 juosta) ir CD45 + ląstelėse iš vieno tipiško antrinio recipiento blužnies (4 juosta). 1 juosta rodo molekulinio svorio žymenis ( c ). Žmogaus CD45 + ląstelių (CD45 PE) procentas, rastas NSG pelių, apdorotų PBS arba hrIL-12, blužniuose, PB ir BM 60 dieną 60 dienų po AML ląstelių injekcijos. Parodyti sukaupti visų eksperimentų rezultatai. „Whisker“ linijos žymi aukščiausias ir mažiausias vertes, horizontalios linijos - vidutines reikšmes. ( d ) Parodytas vienas reprezentatyvus CD38 ekspresijos (CD38TC) eksperimentas su CD45 + CD33 + ląstelėmis, surinktomis 60 dieną iš blužnies, PB ir BM iš kontrolinių (CTR) ar IL-12 gydytų NSG pelių, įšvirkštų leukemijos ląstelėmis.

Visas dydis

Pelių, gautų iš hrIL-12, pelėse buvo žymiai mažesnė žmogaus CD45 + ląstelių dalis ( P <0, 0001, 1–19% sukibusių ląstelių, žr. 3a ir b paveikslus, viršutinės plokštės) nei kontrolinėse. Buvusiose pelėse buvo rasti trys pagrindiniai leukemijos pogrupiai, sutapę su pastarosiose aptiktais. Taigi, 3, 5 ± 0, 5% žmogaus CD45 + ląstelių buvo CD34 + CD38 - ląstelės (3a paveikslas, apatinė kairioji plokštė), 85 ± 5% buvo CD33 + CD38 + (apatinė vidurinė plokštė) ir 15 ± 5% buvo CD44 + CD38 -. (3a pav., Apatinis dešinysis skydas).

Galiausiai paaiškėjo, kad žmogaus CD45 + ląstelės, išgrynintos iš dviejų kontrolinių pelių, įšvirkštų AML ląstelių iš Pt # 17, blužnies, antriniuose recipientuose. Šis eksperimentas buvo neįmanomas pelėmis, gydomomis IL-12, dėl labai mažo likusio leukemijos ląstelių absoliutaus skaičiaus (žr. Reikšmes 3a ir b paveiksluose) ir dėl to neįmanoma jų išskirti. Kaip ir tikėtasi, pirminio ir antrinio recipiento blužnies CD45 + ląstelėse buvo nustatyti tie patys trumpi tandemo pakartojimo lokusai, nustatyti diagnozuojant pirminiame paciento mėginyje (3a paveikslas, gelis dešinėje).

Paaiškinimas, kad pirminės AML ląstelės nesukontroliuoja BM po 1 mėnesio po auglio ląstelių pasėjimo, buvo gana nustebęs; taigi, buvo atlikti papildomi eksperimentai, pratęsiant pelių, įšvirkštų pirminėmis AML ląstelėmis, tikrinimo laiką. Šiuo tikslu į PG # 6 ir iš keturių papildomų AML ląstelių suspensijų (Pt Nr. 17, Nr. 18, Nr. 19 arba Nr. 20) AML ląstelės buvo įšvirkštos į NSG peles, kurios buvo nužudytos po 2 mėnesių. Šiuo metu pelės, gydomos PBS arba IL-12, pradėjo mirti nuo ligos. Iš kontrolinių ir IL-12 gydytų pelių surinktų PB, blužnies ir BM srauto citometrinė analizė parodė panašias leukemijos ląstelių proporcijas visuose skyriuose, įskaitant BM (3c paveikslas). Fenotipinė leukemijos ląstelių iš blužnies, PB ir BM analizė parodė, kad dauguma jų buvo CD33 + CD38 + (vidurkis ± sd%: kontrolinės (CTR) pelės = 92 ± 7%; IL-12 gydytos pelės = 95 ± 8%; žr. 3d pav.) ir išreiškė CD44 žymeklį (žr. žemiau), tuo tarpu CD34 + CD38 ir CD44 + CD38 populiacijose buvo tik nedidelės frakcijos visuose skyriuose (CD34 + CD38 - vidutinis ± sd%: CTR pelės = 8 ± 3%)., Pelės, gautos IL-12, = 7 ± 2%; CD44 + CD38 - vidutinis ± sd%: CTR pelės = 6 ± 3%, IL-12 apdorotos pelės = 6 ± 2%). Išvalytos žmogaus CD38 + ląstelės iš BM, dviejų kontrolinių ir dviejų IL-12 gydytų pelių blužniai buvo sušvirkšti į antrinius NSG gavėjus ( n = 10), kad būtų galima įvertinti leukemijos IC buvimą. Šie gyvūnai buvo nužudyti 60 dieną po ląstelių inokuliacijos, o blužniai, PB ir BM buvo analizuojami srauto citometrija. CD45 + CD38 + CD33 + ląstelės buvo aptiktos visuose skyriuose (CD45 + CD38 + CD33 + vidurkis ± sd%: blužnis = 3, 4 ± 0, 4; PB = 1, 7 ± 0, 5; BM = 2, 7 ± 0, 8; žr. Papildomą 3 paveikslą), taip parodant, kaip pranešta anksčiau, 17, kad CD38 + AML ląstelių frakcija turi galimybę sukelti NSG pelių leukemiją (neparodyta).

IL-12 antileukemijos aktyvumo stokos mechanizmai vėlyvose in vivo augimo fazėse

Intriguojantys rezultatai, gauti mūsų in vivo modeliuose, paskatino ištirti galimus mechanizmus, pagrindžiančius IL-12 priešnavikinio aktyvumo stoką vėlyvose leukemijos augimo fazėse. Šiuo tikslu mes pirmiausia išanalizavome IL-12Rβ2 ekspresiją žmogaus ląstelėse, rastose kontrolinėse pelėse 30 dieną, ir abiejose kontrolinėse bei IL-12 gydytose pelėse 60 dieną po AML ląstelių inokuliacijos. Srauto citometrinė analizė parodė, kad: (i) IL-12Rβ2 buvo nuolat ekspresuojamas (IL-12Rβ2 + CD33 + CD38 + ląstelės> 40%) leukemijos ląstelėse iš kontrolinių pelių blužnies 30 ir 60 dienomis (4A ir B paveikslai viršutinėje kairiajame skydelyje). atitinkamai), (ii) 60-tą dieną IL-12Rβ2 (IL-12Rβ2 + CD33 + CD38 + <0, 7%) AML CD33 + CD38 + ląstelėse iš PB ir BM praktiškai nebuvo (4B paveikslas, viršutinė vidurinė ir dešinė). 60-tą dieną iš IL-12 gydytų gyvūnų blužnių, PB ir BM (4B paveikslas, apatinės plokštės). Be to, molekulinė analizė atlikus kiekybinę PGR parodė, kad metastazavusios ląstelės, paimtos iš kontrolinių pelių BM, neišreiškė IL-12Rβ2 mRNR (4B pav., Dešinė histograma), taip parodydamos, kad receptoriaus nebuvimas ląstelės paviršiuje atsirado dėl to, kad trūko ląstelių paviršiaus. genų transkripcija.

Image

Galimi mechanizmai, lemiantys anti-leukemijos IL-12 trūkumą vėlyvose in vivo augimo fazėse. ( A ) IL-12Rβ2 ekspresija tiriamose CD33 + (CD33 FITC) ląstelėse iš vienos reprezentatyvios kontrolinės pelės blužnies 30 dieną, įvertinant srauto citometriją. ( B ) IL-12Rβ2 ekspresija tiriamose CD33 + ląstelėse, surinktose iš blužnies, PB ir BM PBS (CTR) ir hrIL-12 gydytų pelių 60 dieną, kaip įvertinta srauto citometrija. Parodytas vienas reprezentacinis eksperimentas. Dešinė histograma parodo santykinį IL-12Rβ2 kiekybinį nustatymą AML ląstelių mėginiuose (Pt # 6 ir # 19) prieš injekciją pelėms (pre) ir išgrynintose CD45 + ląstelėse iš kontrolinių BM (CTR) ir hrIL-12 apdorotų pelių. 60 diena. ( C ) CD44 + CD33 + (CD44 FITC, CD33 PE) ir CD34 + CD38 - (CD34 TC, CD38 APC) - (CD34 TC, CD38 APC) ląstelių, įsodintų į spuogus iš pelių, apdorotų PBS (CTR, baltos juostos) arba su hrIL, procentas. 12 (pilkos juostos) 30 dieną po AML ląstelių injekcijos. Parodomi suvestiniai rezultatai. Duomenys pateikiami kaip vidutinis ± sd ( D ) navikas, išsivystęs NSG pelėms po žmogaus pirminių AML ląstelių injekcijos sc., Turinčios CD44 + ląsteles, turinčias AML sprogimo požymius, kurios sudarė 40–50% visų naviko ląstelių (a, b). . Po gydymo hrIL12 (c, d) (a, c: × 200; b, d: × 400) daugiau nei 50% šių ląstelių gyvybingumas smarkiai sumažėjo. ( E ) CD44 + AML ląstelių (CD44APC), rastų navikuose iš kontrolinių pelių (CTR, balta juosta) ir hrIL-12 gydytų pelių (pilka juosta) procentinė dalis, švirkščiamų AML ląstelių. Duomenys pateikiami kaip vidutinis ± sd ( F ) CD44 + ląstelių (CD44 FITC), įsodintų blužnyje, PB ir BM, procentas iš pelių, gydytų PBS (CTR, baltos juostos) arba hrIL-12 (pilkos juostos) 60-ą dieną. po AML ląstelių injekcijos. Parodomi suvestiniai rezultatai. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd

Visas dydis

Toliau nagrinėjome klausimą, ar IL-12 paveikė CD44 + AML ląsteles sc ir iv modeliuose, pasirinktuose remiantis šiais samprotavimais. Pirma, CD44 yra pagrindinis žmogaus CD34 + kamieninių / progenitorinių ląstelių prekybos BM reguliatorius; Antra, CD44 yra susijęs su vėžio platinimu; Trečia, CD44 yra pagrindinė AML IC biologijos molekulė; Ketvirta, didelis adhezijos molekulės CD44 ant AML ląstelių lygis yra būtinas, kad leukemija atsirastų pašalinus pirminį įvykį. 35

Srauto citometrijos analizė parodė, kad pelėms, kurioms buvo sušvirkšta iv AML ląstelių, o po to apdorotos IL-12, nustatyta trigubai sumažėjusi CD44 + CD33 + ląstelių blužnis, palyginti su kontrolėmis 30-tą dieną po AML ląstelių injekcijos (4C paveikslas, viršutinis skydelis). Tuo metu CD44 + ląstelės, esančios likusiuose CD34 + CD38 - AML skyriuose nuo IL-12 gydytų gyvūnų blužnies, buvo sumažintos perpus, palyginti su CD34 + CD38 - ląstelėmis iš kontrolinės blužnies (kontrolė: balti brūkšniai, vidurkis). 61, 4%; IL-12 gydyti gyvūnai: pilkos juostos, vidutiniškai 30, 2%; 4C paveikslas, apatinė plokštė). Panašūs rezultatai buvo gauti analizuojant AML ląsteles, esančias poodiniuose navikuose iš pelių, gydytų IL-12, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, kaip parodyta imunohistocheminiu (4D paveikslas, poskyrio a – d) ir srauto citometrine analize (CD44 + ląstelės reiškia ± sd%: CTR). = 80, 5 ± 4, 5%; IL-12 = 12, 2 ± 3, 2%; 4E paveikslas).

Galiausiai CD44 + CD38 + AML ląstelių frakcija, kuri 30 dieną buvo įsodinta blužnyje, nebuvo modifikuota apdorojant IL-12 (neparodyta). Taip pat srauto citometrinė analizė neparodė reikšmingų skirtumų CD44 paviršiaus ekspresijos atžvilgiu AML populiacijose, esančiose PB, blužnyje ir BM nuo kontrolinių ir IL-12 gydytų pelių 60 dieną (CD44 + ląstelės reiškia ± sd%: CTR: blužnis). = 72 ± 5, 6%, PB = 62 ± 7, 3%, BM = 70 ± 5, 6%; IL-12: blužnis = 70 ± 6, 8%, PB = 64 ± 5, 1%, BM = 68, 7 ± 2, 6%; žr. 4F pav.).

Šie rezultatai rodo, kad nuo 30 iki 60 dienų po pradinio inokuliavimo AML ląstelės, galinčios plisti ir plėstis NSG pelėse, iš esmės nereagavo į IL-12 ir išreiškė CD44 aukštu lygiu.

Diskusija

Šiame tyrime mes atkreipėme dėmesį į klausimą, ar IL-12 gali veikti kaip priešnavikinis agentas prieš vaikų AML ląsteles, nukreipdamas į AML blastus ir (arba) tas populiacijas, kuriose yra leukemijos IC. Čia pirmą kartą parodome, kad pirminės AML ląstelės ekspresuoja funkcinį IL-12R ir kad IL-12 yra efektyvus priešnavikinis agentas prieš vaikų AML ankstyvosiose in vivo augimo fazėse.

In vivo eksperimentai buvo atlikti naudojant NSG peles, veiksmingą gyvūnų modelį, skirtą naviko IC ir iš pacientų išskirtų tūrinių navikų ląstelių transplantacijai. 30, 31, 36 Be to, šie gyvūnai leidžia įvertinti anti-navikinį žmogaus IL-12, kuris yra specifiškas žmogaus ląstelėms, aktyvumą, nesant imuninio atsako. 18

Mes pasirinkome nešvitintus šeimininkus, o visiems NSG gyvūnams buvo aptiktos pirminės AML ląstelės. Ankstesniuose tyrimuose 15, 16, 30, 33, 37 buvo pranešta apie mažesnį AML įsisavinimo veiksmingumą gyvūnams, kuriems imunodeficitas , išskyrus Sarry ir kt. 17 Galima įsivaizduoti, kad aukštas įsisavinimo laipsnis, pasiektas mūsų tyrime, priklauso nuo skirtingų kintamųjų, įskaitant vidines injekuotų pirminės leukemijos ląstelių savybes ir (arba) nešvitintų vs apšvitintų NSG pelių naudojimą. Šiuo atžvilgiu naujausiame tyrime, atliktame su NOD / SCID gavėjais, nustatyta, kad radiacija skatina stromos ląstelių išvesto faktoriaus-1 padidėjimą, o tai savo ruožtu sąlygojo sumažėjusį ūmaus limfoblastinės leukemijos sprogimo įsiskverbimą. Taigi nešvitintos NSG pelės gali būti geriausias tyrimas ikiklinikinių tyrimų metu, naudojant navikines ląsteles, šviežiai išskirtas iš pacientų, kaip siūlo ir kiti. 36

Pelių, į kurias buvo švirkščiamos pirminės AML ląstelės, gydymas IL-12 (modelis, naudojamas kaip pirmasis IL-12 priešnavikinio aktyvumo patikrinimas) lėmė: (i) naviko indų ardymą, slopinant proangiogeninį pačios naviko ląstelės ir (ii) IL-6, kuris veikia kaip AML ląstelių autokrininis / paracrininis augimo faktorius, reguliavimas. 32 Apie IL-12 gebėjimą slopinti IL-6 buvo pranešta apie kitus žmogaus navikus, tokius kaip daugybinė mieloma ir plaučių adenokarcinoma, kuriuose, kaip ir AML, IL-6 reiškia autokrininio / parakrino augimo faktorių. 21, 22, 32, 38, 39 Anksčiau paskelbtose ataskaitose 40 ir in vitro eksperimentuose su pirminėmis AML ląstelėmis mes nustatėme, kad papildomi angiogeniniai veiksniai, tokie kaip VEGF-D ir ypač neuropilinas 2, dvi pagrindinės molekulės, dalyvaujančios limfangiogenezėje. ir metastazių sumažėjo AML ląstelėse, apdorotose in vitro IL-12. Atvirkščiai, nustatyta, kad VEGF-C reguliuoja IL-12. Pažymėtina, kad neuropilinas 2 yra VEGF-C pagrindinis receptorius ir sudaro kompleksą su VEGFR2 ir VEGFR3, būtinus VEGF-C veiklai. Taigi proangiogeninio VEGF-C padidėjimas, stebimas pirminėse AML ląstelėse, gali reikšti navikinių ląstelių bandymą stimuliuoti mikroveislių susidarymą, kurį kritiškai paveikė IL-12. Dėl stipraus angiogenezės slopinimo, kurį veikė IL-12, atsirado naviko ląstelių apoptozė ir nekrozė. Apoptozė buvo įsivaizduojamas netiesioginis IL-12 poveikis AML ląstelėms, nes ji nebuvo nustatyta in vitro eksperimentuose su pirminėmis leukemijos ląstelėmis.

Mes pademonstravome, kad IL-12 tiesiogiai nukreiptos į in vivo CD45 + CD33 + AML ląsteles, taip pat CD34 + CD38 -, CD33 + CD38 + ir CD44 + CD38 - pogrupius, kuriuose yra ląstelių, turinčių leukemiją sukeliančių savybių. 6, 12, 14, 15, 17 Po 1 mėnesio sc gydymas IL-12 pašalino beveik visas minėtas AML ląstelių frakcijas, todėl jų atskirti neįmanoma. Priešingai, AML ląstelės buvo sėkmingai išvalytos nuo kontrolinių (ty iš PBS apdorotų) pelių ir nustatyta, kad jos išlaiko sugebėjimą įsiskiepyti antriniuose recipientuose. Neoplastinės ląstelės, užaugintos pirminiuose ir antriniuose recipientuose, vienareikšmiškai atsirado iš pirminio paciento mėginio, kaip įrodyta toje pačioje polimorfinio trumpo tandemo pakartojimo lokiose, kurie diagnozuojant buvo nustatyti AML ląstelėse.

Kai vaikų AML ląstelės buvo švirkščiamos į veną NSG pelėms, buvo stebimi du visiškai skirtingi scenarijai, atsižvelgiant į laiką. Pelėms, nužudytoms po 1 mėnesio, AML ląstelės buvo aptiktos kontrolinių pelių blužnyje, bet ne PB ar BM. Visos AML ląstelių frakcijos, praturtintos blastų ar leukemijos IC, buvo rastos kontrolinėse pelėse, tuo tarpu IL-12 gydytų pelių jų labai nedaug. Retos leukemijos ląstelės, likusios IL-12 gydytų pelių blužnyje, neišreiškė IL-12Rβ2 mRNR ar baltymo. Tai rodo, kad jų refrakcija atspindėjo vėlesnius IL-12 vartojimo ciklus. Priešingai, AML ląstelės, išskirtos iš kontrolinių pelių blužnies, išlaikė IL-12Rβ2 ekspresiją.

Pelėms, nužudytoms po 2 mėnesių nuo AML ląstelių inokuliacijos, naviko ląstelės išsiplėtė blužnyje, PB ir BM iš kontrolinių ar IL-12 gydytų pelių. Šiose ląstelėse vyravo CD33 + CD38 + imunofenotipas, išreikštas CD44 ir įsodintas antriniuose recipientuose, atitinkantis naujausius Sarry et al rezultatus. 17

Siekiant gauti daugiau informacijos apie AML plitimo mechanizmus in vivo nuo 30 iki 60 dienų, nepaisant gydymo IL-12, 60-tą dieną buvo tiriama IL-12Rβ2 mRNR ir baltymų ekspresija leukemijos ląstelėse iš blužnies, PB ir BM. Tiek PB, tiek BM, AML ląstelės neišreiškė nei IL-12Rβ2 mRNR, nei baltymo. Priešingai, leukemijos ląstelės, išskirtos iš kontrolinių pelių blužnies, ekspresavo IL-12Rβ2, tuo tarpu ląstelės, gautos iš IL-12 gydytų pelių blužnies, ne. Šie rezultatai parodė, kad AML progresavimas ir plitimas NSG pelėse buvo pastebėtas ir lydimas IL-12Rβ2 geno nutildymo, galbūt per epigenetinius įvykius. Šiuo atžvilgiu mes anksčiau įrodėme, kad esant lėtiniams B ląstelių piktybiniams susirgimams, IL-12Rβ2 geno ekspresija yra išjungiama metilinant CpG salą 1 egzone, tokiu būdu leidžiant išvengti navikinių ląstelių nuo tiesioginio IL naviko aktyvumo. -12. Išvada, kad kontrolinių pelių blužnyje vis dar buvo IL-12Rβ2 + AML ląstelių, leidžia manyti, kad ši anatominė vieta atspindi leukemijos ląstelių rezervuarą, kuriame dar nebuvo atlikti metastaziniai pokyčiai ir išlaikė jautrumą gydymui IL-12, kaip rodo jų virtualus nebuvimas Pelės, gautos IL-12.

Mechanizmas, padedantis paaiškinti trumpalaikį AML ląstelių augimo slopinimą IL-12 per pirmąjį mėnesį, yra susijęs su CD44 ekspresijos sumažėjimu citokino valdomose leukemijos ląstelėse. AML progresavimas ir išplitimas į PB ir BM antrą mėnesį buvo susijęs su CD44 + leukemijos ląstelių pogrupio padidėjimu. CD44 yra adhezijos molekulė, kurią ekspresuoja daugelio tipų navikai ir kuri, kaip pranešama, yra susijusi su neoplastinių ląstelių kaupimu ir plitimu, padidindama jų migraciją per aferentinius limfinius aparatus. 34 Be to, buvo įrodyta, kad CD44 yra pagrindinis AML IC reguliatorius ir yra būtinas norint tinkamai pridėti AML ląsteles prie mikroaplinkos nišų ir palaikyti kamieną. 15, 34

Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad IL-12 yra veiksminga anti-AML molekulė ankstyvosiose vaikų AML ląstelių augimo fazėse NSG pelėms, tuo tarpu naviko progresavimui būdinga tai, kad leukemijos ląstelės praranda jautrumą IL-12 dėl IL nutildymo. -12RB2 genas. Vertimo požiūriu IL-12 galėtų būti naudojamas kaip adjuvantinis vaikų AML gydymas nustatant minimalią likutinę ligą. Preliminarūs mūsų laboratorijų rezultatai rodo, kad IL-12 gali nukreipti suaugusiųjų AML ląsteles panašiai kaip vaikų AML, tai rodo, kad šį citokiną galima išbandyti klinikinėje aplinkoje daugeliui pacientų. Šiuo atžvilgiu buvo įrodyta, kad IL-12 gali turėti teigiamą poveikį normaliai kraujodarai, taip pat kamieninių ląstelių įsisavinimui, dažnai leukemija sergantiems pacientams. 42, 43 Be to, IL-12 galėtų derinti tiesioginį antileukemijos aktyvumą su priešnavikinių imuninių efektorių mechanizmų aktyvinimu. Galimas įspėjimas atsiranda dėl sisteminio citokinų toksiškumo, tačiau, remiantis naujausiais klinikiniais tyrimais, tai atrodo įmanoma valdyti. 44, 45, 46, 47

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomi rezultatai

  2. 2.

    Papildomos figūros legendos

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento Leukemijos svetainėje (//www.nature.com/leu)