Acetilcholinas veikia per muskarino receptorius m3, suaktyvindamas signalus egfr ir skrandžio vėžio ląstelių dauginimąsi | mokslinės ataskaitos

Acetilcholinas veikia per muskarino receptorius m3, suaktyvindamas signalus egfr ir skrandžio vėžio ląstelių dauginimąsi | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių augimas
  • Virškinimo trakto vėžys

Anotacija

Acetilcholinas (ACh), žinomas kaip neuromediatorius, reguliuoja daugelio pagrindinių centrinės ir periferinės nervų sistemos funkcijas. Neseniai atsiradę įrodymai rodo, kad ACh taip pat vaidina svarbų vaidmenį navikogenezėje. Tačiau mažai žinoma apie ACh vaidmenį skrandžio vėžyje. Čia mes pranešėme, kad ACh gali būti automatiškai sintetinamas ir išsiskiria iš MKN45 ir BGC823 skrandžio vėžio ląstelių. Išorinis ACh skatino ląstelių dauginimąsi priklausomai nuo to. M3R antagonistas 4-DAMP, bet ne M1R antagonistas triheksifenidilas ir M2 / 4 R antagonistas AFDX-116, galėtų pakeisti ACh sukeltą ląstelių proliferaciją. Be to, ACh per M3R suaktyvino EGFR signalizaciją, kad sukeltų ERK1 / 2 ir AKT fosforilinimą, ir blokuodamas EGFR kelią specifiniu inhibitoriumi AG1478 slopino ACh sukeltą ląstelių proliferaciją. Be to, M3R antagonistas 4-DAMP ir darifenacinas galėjo pastebimai slopinti skrandžio naviko susidarymą in vivo . 4-DAMP taip pat galėtų žymiai sustiprinti 5-Fu citotoksinį aktyvumą MKN45 ir BGC823 ląstelių atžvilgiu ir paskatinti su apoptoze susijusių baltymų, tokių kaip Bax ir Caspase-3, ekspresiją. Kartu šie atradimai parodė, kad autokrininė ACh gali veikti per M3R ir EGFR signalus, kad skatintų skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, nukreipimas į M3R arba EGFR gali suteikti mums galimą skrandžio vėžio gydymo terapinę strategiją.

Įvadas

Skrandžio vėžys yra antra su vėžiu susijusios mirties priežastis visame pasaulyje 1, 2 . Nors skrandžio vėžio dažnis ir mirštamumas per pastaruosius dešimtmečius sumažėjo, vis dar yra daugybė pacientų, sergančių skrandžio vėžiu, diagnozuotų jau pažengusių stadijoje ir mirusių per 2 metus, nepaisant operacijos ar kitokio gydymo 3 . Taigi labai svarbu surasti naują mechanizmą, prisidedantį prie skrandžio vėžio progresavimo. Šis mechanizmas ne tik sustiprins mūsų skrandžio kancerogenezės supratimą, bet ir suteiks mums naujų veiksmingų skrandžio vėžio gydymo strategijų.

Acetilcholinas, svarbus neuromediatorius, yra pagrindinis tarpininkas centrinėje ir periferinėje nervų sistemose ir vaidina lemiamą reikšmę mokymuisi, atminčiai, autonominei kontrolei ir raumenų susitraukimui. 4, 5, 6, 7 . Neseniai atlikti daugelis tyrimų atskleidė, kad ACh taip pat vaidina neneuroninį vaidmenį kai kuriuose fiziologiniuose ir patologiniuose procesuose, įskaitant uždegimines ligas 8, 9, funkcinius žarnyno sutrikimus 10, 11, taip pat kelių rūšių vėžį 12, 13 . Keli pranešimai nurodė, kad ACh gali veikti kaip potencialus augimo faktorius, skatindamas vėžio ląstelių dauginimąsi plaučių vėžiui 14, krūties vėžiui 15, storosios žarnos vėžiui 16 ir kt . Be to, ACh taip pat gali būti sintetinamas ir laikomas autostimuliuojančiu kai kurių vėžio rūšių augimo faktoriu 17, 18 . Visai neseniai Wang ir kt . pranešė, kad M3 muskarininių receptorių sukeltas ACh sukeltas proliferacija skrandžio vėžio ląstelėse 19 . Tačiau kol kas neaišku, koks yra ACh neuroonalinis vaidmuo skrandžio kancerogenezėje.

Čia mes parodėme, kad skrandžio vėžio ląstelėse egzistuoja autokrininė ACh kilpa, o ACh gali veikti kaip augimo faktorius, skatinantis ląstelių dauginimąsi. M3R ir EGFR kelio aktyvinimas gali būti galimas ACh sukeltų ląstelių augimo mechanizmas. O M3R antagonizmas 4-DAMP kartu su 5-fluorouracilu (5-Fu) galėtų žymiai sumažinti ląstelių gyvybingumą ir sustiprinti apoptozę MKN45 ir BGC823 skrandžio vėžio ląstelėse.

Rezultatai

ChAT baltymo ekspresija skrandžio vėžio ląstelėse

Pirmiausia mes nustatėme, ar ChAT - greitį ribojantis fermentas, sintezuojantis ACh, yra ekspresuojamas skirtingose ​​žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijose ir normaliose skrandžio epitelio ląstelėse. Kaip parodyta 1a pav., ChAT baltymas buvo skirtingai ekspresuojamas žmogaus skrandžio ląstelių linijose, jis buvo stipriai ekspresuojamas MKN28, MKN45, BGC823, MGC803 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelėse, tuo tarpu silpnas teigiamas normaliose skrandžio epitelio ląstelėse (GES-1). . Imunohistocheminis dažymas buvo skirtas patikrinti ChAT raišką MKN45 ir BGC823 ląstelėse. Rezultatai parodė, kad ChAT buvo per daug ekspresuotas ir daugiausia išsidėstęs dviejų ląstelių linijų citoplazmoje (1b pav.).

Image

( a ) ChAT raiška buvo analizuojama atliekant Western blot analizę skrandžio vėžio ląstelių linijose MKN28, MKN45, BGC823, MGC803, SGC7901 ir normaliose skrandžio epitelio ląstelėse GES-1. ( b ) Imunohistocheminė analizė parodė ChAT ekspresiją MKN45 ir BGC823 ląstelėse. Originalus padidinimas × 200.

Visas dydis

ACh sekrecija žmogaus skrandžio vėžio ląstelėse

Kadangi ChAT yra ekspresuojamas skirtingose ​​žmogaus GC ląstelių linijose, susintetintas ACh gali būti išleistas į auginimo terpę. Tolesnė LC-MSMS analizė parodė, kad ACh koncentracija buvo atitinkamai 0, 44 ± 0, 06 ng / ml ir 0, 72 ± 0, 19 ng / ml MKN45 ir BGC823 serumų neturinčioje ląstelių kultūros terpėje. Ir ACh koncentracija buvo dramatiškai padidinta iki atitinkamai 10, 91 ± 1, 33 ng / ml ir 11, 72 ± 1, 52 ng / ml ( p <0, 01), pridedant acetilcholinesterazės inhibitoriaus neostigmino abiejose ląstelių linijose. Nors ACh koncentraciją vargu ar buvo galima išmatuoti MKN45 ir BGC823 ląstelių auginimo terpėje ChAT smūgiu (2a, b pav.). Šie duomenys kartu parodė, kad skrandžio vėžio ląstelės galėjo sintetinti ir slapti ACh per ChAT.

Image

a ) ACh koncentracija MKN45 ir BGC823; b ) ląstelių auginimo terpėse. Neostigminas buvo pridėtas 50 μM koncentracijos, po to, kai buvo apdengtas plauku, ir ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas, o ChAT baltymas ląstelėse buvo nugriautas perkėlus siRNR 48 valandas, tada terpė be serumo buvo pašalinta LC-MS / MS tyrimui. ACh, o numušimo efektyvumas buvo patikrintas Western blot būdu. (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

ACh skatina ląstelių dauginimąsi ir stimuliuoja ERK ir AKT fosforilinimą skrandžio vėžio ląstelėse

Norėdami ištirti biologinę ACh funkciją žmogaus skrandžio vėžio ląstelėse, pirmiausia įsitikinome, kad visi penki muskarininių ACh receptorių potipiai yra ekspresuojami skirtingose ​​skrandžio vėžio ląstelių linijose (papildomas 1a pav.), Taip pat ištirta pagrindinė endogeninių ACh koncentracija. skirtingose ​​ląstelių auginimo terpėse. MKN45 ir BGC823 ląstelės buvo atrinktos norint ištirti išorinio ACh poveikį ląstelių proliferacijai dėl santykinai žemo endogeninio ACh lygio (papildomas 1b pav.). Kaip parodyta 3a pav., ACh galėtų skatinti ląstelių dauginimąsi priklausomai nuo to, ar jos koncentracija svyruoja nuo 50 μM iki 300 μM, o ji pasiekė piką esant 200 μM koncentracijai. Tada mes ištyrėme ACh sukeltą p-ERK1 / 2 ir p-AKT raišką ir nustatėme, kad 200 μM ACh stimuliacija padidino p-ERK1 / 2 ir p-AKT fosforilinimo lygį nuo 15 min iki 2 h (3b pav. ). Mes taip pat nustatėme, kad egzogeninis ACh turi panašų poveikį skatindamas ląstelių dauginimąsi ir stimuliuodamas p-ERK1 / 2 ir p-AKT fosforilinimo lygį SGC7901 ląstelėse, turinčiose mažiausią endogeninį ACh (papildomas 2a, b pav.). Šie rezultatai rodo, kad išorinė ACh stimuliacija gali skatinti ląstelių dauginimąsi ir padidinti ERK ir AKT fosforilinimą skrandžio vėžio ląstelėse.

Image

( a ) MKN45 ir BGC823 ląstelės buvo inkubuotos su ACh 72 valandas nurodytomis koncentracijomis. Vėžio ląstelių proliferacijai nustatyti buvo naudojamas CCK-8 tyrimas. ( b ) Buvo atliktas Western blot tyrimas, siekiant parodyti nurodytų baltymų ekspresijos pokyčius, apdorojant ląsteles 200 μM ACh nuo 15 iki 120 minučių (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

M3 AChR tarpininkauja ACh sukeltai ląstelių proliferacijai ir fosforilinimui ERK1 / 2 ir AKT

ACh daugiausia veikia per muskarininius receptorius, kad galėtų perduoti tarpląstelinius signalus navikogenezėje 20, 21 . Kaip parodyta aukščiau pateiktuose duomenyse, abu M1 ~ M5 muskarininiai receptoriai buvo ekspresuojami MKN45 ir BGC823 ląstelėse. Norėdami nustatyti, kuris potipis daugiausia tarpininkauja ACh sukeltai skrandžio vėžio ląstelių proliferacijai, pirmiausia panaudojome M1 ~ 4 receptorių antagonistus atskirai, norėdami slopinti endogeninio ACh poveikį MKN45 ir BGC823. Kaip parodyta 4a, b pav., M3 selektyvusis antagonistas 4-DAMP 5 dienomis pastebimai slopino ląstelių dauginimąsi, tuo tarpu selektyvusis M1 antagonistas triheksifenidilas ir M2 / M4 selektyvusis antagonistas AFDX-116 beveik neturi jokio poveikio skrandžio vėžio ląstelių proliferacijai. Slopinimo efektas taip pat buvo pastebėtas, kai ląstelės buvo transfekuotos M3R siRNR (papildomas 3a, b pav.). Vien tik 4-DAMP galėjo dramatiškai slopinti p-ERK1 / 2 ir p-AKT raišką MKN45 ir BGC823 ląstelėse (4c pav.). Be to, išorės ACh sukeltą ląstelių dauginimąsi gali pakeisti 4-DAMP, bet ne selektyvus M1 antagonistas triheksifenidilas ir M2 / M4 selektyvus antagonistas AFDX-116 (5a pav.). Baltymų lygyje tik 4-DAMP, bet ne triheksifenidilas ir AFDX-116, galėtų pakeisti ACK sukeltą ERK1 / 2 ir AKT fosforilinimą (5b pav., C). Šie rezultatai rodo, kad M3R vaidina lemiamą vaidmenį endogeninių ir egzogeninių ACh sukeltų ląstelių proliferacijoje ir ERK ir AKT fosforilinime skrandžio vėžio ląstelėse.

Image

Po to, kai ląstelės 5 dienas buvo gydomos triheksifenidiliu (M1R antagonistu), AFDX-116 (M2R / M4R antagonistu) ir 4-DAMP (M3R antagonistais) nurodytomis koncentracijomis, CCK-8 tyrimas buvo naudojamas ląstelių augimui MKN45 nustatyti ( a ) ir BGC823 ląstelės ( b ). ( c ) Western blot rodė p-ERK1 / 2 ir p-AKT ekspresijos pokyčius MKN45 ir BGC823 ląstelėse 0, 01 μM - 10 μM 4-DAMP apdorojimo metu 4 valandas. (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

Image

a ) M1R (triheksifenidilo), M2R / M4R (AFDX-116) ir M3R (4-DAMP) inhibitoriai buvo dedami į auginimo terpę 4 val. prieš pridedant 200 μM ACh, CCK-8 tyrimas buvo naudojamas norint nustatyti, kuris muskarininis receptorius daugiausia tarpininkauja išorinio ACh poveikiui ląstelių augimui. ( b) Buvo atliktas Western blot tyrimas siekiant ištirti, kuris muskarininis receptorius tarpininkauja ACh sukeltam ERK1 / 2 ir AKT fosforilinimui. ( c ) Western blot parodė fosforilintų ERK1 / 2 ir AKT ekspresijos pokyčius ląstelėse po 0, 01 μM ~ 10 μM koncentracijos apdorojimo 4-DAMP 4 valandas prieš 200 μM ACh pridėjimą. (* P <0, 05; ** P <0, 01).

Visas dydis

ACh veikia per M3R, kad suaktyvintų EGFR signalizaciją ir skatina ląstelių dauginimąsi skrandžio vėžio ląstelėse

Ankstesni tyrimai parodė, kad G baltymų sujungto receptoriaus (GPCR) šeimos nariai galėjo trans-suaktyvinti EGFR signalizaciją, tokiu būdu paskatindami ERK1 / 2 ir AKT 22 fosforilinimą. Mūsų aukščiau paminėti duomenys parodė, kad ACh gali veikti per M3R, kad sukeltų ERK1 / 2 ir AKT fosforilinimą, o M3R priklauso GPCR nariams. Tada mes ištyrėme, ar ACh gali veikti per M3R, kad suaktyvintų EGFR signalus skrandžio vėžio ląstelėse. Iš tikrųjų, p-EGFR buvo žymiai padidintas stimuliuojant ACh (6a pav.). Tuo pat metu p-EGFR taip pat buvo sustiprintas ACh, priklausomai nuo laiko, nuo 15 minučių iki 2 h (6b pav.). Norint nustatyti, ar M3R dalyvavo EGFR transaktyvacijoje, ląstelės buvo transfekuotos M3R siRNR (siM3R) arba kontroline siRNR (siCtrl) 72 val., Po to stimuliuotos ACh 2 val. Kaip parodyta 6c pav., ACh sukeltas EGFR aktyvavimas buvo reikšmingai atvirkštinis, kai buvo numuštas M3R, ir šie duomenys parodė, kad ACh galėjo veikti per M3R, kad suaktyvintų EGFR. Toliau mes panaudojome AG1478, specifinį EGFR inhibitorių, kad ištirtume jo funkcinį vaidmenį ACh sukeltoje ląstelių proliferacijoje, ir rezultatai parodė, kad ACh sukeltas EGFR, ERK1 / 2 ir AKT fosforilinimas gali būti pakeistas 10 μM AG1478 (6d pav.). AG1478 taip pat gali neutralizuoti ACh sukeltą ląstelių dauginimąsi MKN45 ir BGC823 ląstelėse (6e pav.). Be to, mes taip pat panaudojome ERK specifinį inhibitorių U0126 ir AKT specifinį inhibitorių MK2206, norėdami toliau ištirti jų vaidmenį ACh sukeltoje proliferacijoje ir nustatėme, kad AC-stimuliuojamas p-ERK ir p-AKT sustiprėjimas gali būti pakeistas U0126 ir MK2206. atitinkamai (papildomas 4a, b pav.). U0126 ir MK2206 taip pat gali blokuoti proliferaciją, kurią sukelia ACh stimuliacija MKN45 ir BGC823 ląstelėse (papildomas 4c pav.). Aukščiau pateikti duomenys parodė, kad ACh gali veikti per M3R, kad suaktyvintų EGFR signalizaciją ir skatintų ląstelių dauginimąsi skrandžio vėžio ląstelėse.

Image

( a ) Ląstelės buvo apdorotos nurodytomis ACh koncentracijomis 2 valandas, EGFR ir fosforilintas EGFR buvo ištirtas Western blot būdu. ( b ) Ląstelės buvo apdorotos 200 μM ACh nuo 15 iki 120 min., EGFR ir fosforilintas EGFR buvo analizuotas Western blot būdu. ( c ) Po M3 AChR ekspresijos, transfekuojant mažas trukdančias RNR, AC-stimuliuojama p-EGFR ekspresija buvo analizuojama Western blot būdu MKN45 ir BGC823 ląstelėse. ( d ) Pridedant 10 μM specifinio EGFR inhibitoriaus AG1478 2 val. prieš pridedant ACh, baltymų pokyčiai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę. ( e ) AG1478 buvo pridėtas 2 valandas prieš pridedant ACh, CCK-8 tyrimas buvo naudojamas EGFR vaidmens ACh sukeltų ląstelių proliferacijai ištirti. (** P <0, 01).

Visas dydis

M3R inhibitoriai slopina skrandžio naviko susidarymą

Norint išsamiau ištirti M3R funkciją skrandžio vėžio augime in vivo , buvo naudojami du M3R antagonistai - 4-DAMP ir darifenacinas - norint ištirti galimą M3R vaidmenį auglio ksenografų augime nuogai pelėms. Kaip parodyta 7a pav., MKN45 ir BGC823 ksenografuose naviko dydis buvo dramatiškai sumažintas, naudojant 12 dienų 4-DAMP arba darifenacino gydymą. MKN45 ir BGC823 kontrolinėse grupėse naviko tūris buvo 468, 76 ± 93, 44 mm 3 ir 988, 58 ± 65, 69 mm 3, kuris atitinkamai sumažėjo iki 136, 31 ± 30, 51 mm 3 ir 522, 13 ± 177, 17 mm 3, gydant 4-DAMP, ir šie duomenys darifenacine. grupės buvo atitinkamai 185, 45 ± 41, 67 mm 3 ir 669, 38 ± 122, 90 mm 3 (7b pav.) (abi p <0, 01). Skrandžio vėžio ksenografų naviko svoris 4-DAMP ir darifenacino grupėse turi tą pačią tendenciją kaip naviko tūris. MKN45 ir BGC823 kontrolinėje grupėje svoriai buvo 0, 22 ± 0, 08 g ir 0, 51 ± 0, 02 g, o reikšmingai sumažėjo iki 0, 06 ± 0, 01 g ir 0, 29 ± 0, 09 g 4-DAMP grupėje, o 0, 08 ± 0, 03 g ir 0, 37 ± 0, 05 g. atitinkamai darifenacino grupė (7c pav.) (abu p <0, 01). Šie rezultatai parodė, kad M3R vaidino lemiamą vaidmenį skrandžio navikogenezėje ir blokuodamas M3R funkciją gali kliudyti skrandžio vėžio augimui in vivo .

Image

( a ) Po 12 dienų, apdorotų 4-DAMP ir darifenacinu, buvo išmatuota MKN45 ir BGC823 grupių ksenografų morfologija ir naviko dydis. ( b ) Kiekybinis kiekvienos grupės naviko tūris MKN45 ir BGC823 ksenografuose buvo išmatuotas. c ) Buvo išmatuotas kiekvienos grupės naviko svoris MKN45 ir BGC823 ksenografuose. (** P <0, 01).

Visas dydis

M3R inhibitorius 4-DAMP gali padidinti skrandžio vėžio ląstelių jautrumą 5-Fu

Aukščiau pateikti duomenys parodė, kad M3 muskarininis receptorius yra būtinas ACh sukeltai ląstelių proliferacijai in vitro ir in vivo , todėl toliau tyrėme, ar M3R inhibitorius 4-DAMP galėtų pagerinti citotoksinį chemoterapinių vaistų poveikį. Pirmiausia ištyrėme bendro chemoterapinio vaisto 5-Fu IC50 reikšmę skrandžio vėžio ląstelių linijose, duomenys parodė, kad MKN45 ir BGC823 ląstelės turėjo aukščiausią IC50 tarp visų ląstelių linijų, kurių IC50 reikšmė buvo 17, 0 μg / ml ir Atitinkamai 6, 95 μg / ml (papildomas 5 pav.). 10 μM 4-DAMP ir 5 μM 5-Fu derinys sumažino ląstelių gyvybingumą atitinkamai (30 ± 4, 0)% ir (35 ± 6, 0)% MKN45 ir BGC823 ląstelėse, kurios turėjo reikšmingą skirtumą, palyginti su 4-DAMP ir Vien 5-FU grupė ( p <0, 01) (8a pav.). Kolonijų susidarymo rezultatai atitiko CCK-8 tyrimo duomenis (8b pav.). Toliau išanalizavome su apoptoze susijusių baltymų raišką ir nustatėme, kad Bcl-xl ir Bcl-2 yra reikšmingai sumažintos, o Bax ir suskaidytos kaspazės-3 reikšmingai padidintos kombinuotoje grupėje, palyginti su kontroline grupe ir 4-DAMP arba Vien 5-FU grupė (8c pav.). Apskritai šie duomenys parodė, kad M3R inhibitorius 4-DAMP gali padidinti 5-Fu cheminį jautrumą ir sukelti su apoptoze susijusių baltymų ekspresiją skrandžio vėžio ląstelėse.

Image

( a ) CCK-8 tyrimas buvo atliktas ląstelių gyvybingumui analizuoti vien tik 4-DAMP, atskirai 5-Fu ir 4-DAMP ir 5-Fu kombinuotoje grupėje. ( b ) Nurodytos grupės klonų formavimai buvo nustatyti plokštelių klonų tyrimu. c ) Su apoptozė susiję baltymai buvo analizuojami Western blot metodu. (** P <0, 01).

Visas dydis

Diskusija

Kai kuriais atvejais vėžio ląstelės gali augti aplink nervus ir ilgainiui į juos įsibrauti. Šis procesas buvo apibūdinamas kaip tarpvietės invazija, vaidinanti svarbų vaidmenį naviko progresavime daugeliui vėžio rūšių 23, 24 . Perineurinės invazijos metu nervai yra pasyvūs ir sudaro kelią vėžinėms ląstelėms plisti. Tačiau mažai žinoma apie nervų ir neuromediatorių įtaką naviko vystymuisi ir progresavimui 25 .

Neseniai Magnonas ir jo kolegos pranešė, kad autonominis simpatinis ir parasimpatinis nervų sudygimas yra būtinas vėžio progresavimui pelių prostatos navikuose, norepinefrinas ir acetilcholinas, simpatinio ir parasimpatinio nervo neurotransmiteris gali stimuliuoti prostatos vėžio augimą ir metastazes 26 . Vėliau Zhao ir kt . 27 parodyta, kad chirurginis ar farmakologinis skrandžio denervacija stipriai sumažino naviko dažnį ir skrandžio vėžio progresavimą bei galėjo sustiprinti sisteminės chemoterapijos terapinį poveikį. Šie tyrimai aiškiai rodo, kad neuromediatoriai ACh gali atlikti svarbų vaidmenį naviko progresavime. Dabartiniame tyrime mes parodėme, kad ACh taip pat gali skatinti skrandžio vėžio ląstelių dauginimąsi. Iš tiesų, ACh gali būti automatiškai sintetinamas ir išskiriamas kaip ląstelių augimo stimuliatorius skrandžio vėžio ląstelėse, o autokrininė ACh kilpa iš tikrųjų egzistuoja šiose ląstelėse (9a pav.). Mūsų duomenys taip pat atitiko Wang ir kt . Atliktą tyrimą, kuriame nurodomas ACh proliferaciją skatinantis vaidmuo skrandžio vėžio ląstelėse 19 .

Image

a ) Skrandžio vėžio ląstelėse citoplazmos ChAT baltymas katalizuoja ACh sintezę, tada ACh išskiriamas ir išleidžiamas į tarpląstelinę erdvę, tarpląstelinis ACh galėtų sujungti ir suaktyvinti M3 receptorius, esančius ląstelių citomembranoje, suaktyvinus EGFR signalus, o vėliau p-ERK1 / 2 ir p-AKT padidėjimas, taigi, skatina skrandžio vėžio ląstelių dauginimąsi ir išgyvenimą. ( b ) Kai M3R funkciją blokuoja specifiniai antagonistai (pvz., 4-DAMP) arba jo pasroviui veikiantis efektorius EGFR, slopinamas specifinio inhibitoriaus AG1478, automatinis ACh vaidmuo ląstelių proliferacijoje tam tikru laipsniu susilpnėja. M3R / EGFR signalizacijos inhibitoriai gali padidinti 5-Fu cheminį jautrumą ir sumažinti ląstelių gyvybingumą sergant skrandžio vėžiu. Kombinuota strategija gali pateikti įgyvendinamą skrandžio vėžio terapijos strategiją.

Visas dydis

Daugybė tyrimų parodė, kad ACh daugiausia veikia per muskarininius receptorius, kad galėtų perduoti ląstelių išorinius signalus, ir vaidina svarbų vaidmenį navikogenezėje 28, 29 . Muskarino receptorius sudarė penki potipiai, įskaitant M1 ~ 5 receptorius. Mūsų rezultatai parodė, kad M3 potipis, bet ne kiti muskarininiai receptoriai, tarpininkavo ląstelių proliferacijai, kurią stimuliuoja egzogeninis arba endogeninis ACh. M3 receptorius, selektyviai konjuguojantis su Gq šeimos G baltymais, gali aktyvinti keletą antrųjų pasiuntinių ir modifikuoti daugybę pagrindinių funkcijų centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje 30, 31 . Pastaraisiais metais daugėja įrodymų, kad M3R gali atlikti gyvybiškai svarbų vaidmenį daugelio vėžio rūšių, įskaitant storosios žarnos vėžį, plaučių vėžį ir cholangiokarcinomą, kancerogenezėje - 32, 33, 34 . Pažymėtina, kad žmogaus skrandžio vėžio audinyje M3R buvo per daug išreikštas ir koreliavo su vėžio stadija ir limfmazgių metastazėmis 19 . Šie tyrimai kartu su išankstiniais duomenimis parodė, kad M3R vaidina pagrindinį vaidmenį stimuliuojant skrandžio ląstelių ACh.

Mes įrodėme, kad ACh gali veikti per M3R, kad suaktyvintų EGFR kelią, o M3R numušimas ar slopinimas EGFR galėtų pakeisti ląstelių proliferaciją ir ERK ir AKT fosforilinimą, kurį sukelia ACh stimuliacija skrandžio vėžiui. Duomenys rodo, kad EGFR buvo nepakeičiama molekulė vykstant ACh stimuliuojamam skrandžio vėžio ląstelių dauginimuisi. Dėl skrandžio vėžio tikslus M3R ir EGFR tikslumas nėra aiškus. Storosios žarnos vėžio tyrimai atskleidė, kad M3R galėjo skatinti MMP7, kad katalizuotų HB-EGF išsiskyrimą ir tokiu būdu palengvintų ACh sukeltą EGFR signalo aktyvaciją 35 . Tačiau, ar tas pats mechanizmas vis dar veikia sergant skrandžio vėžiu, reikia papildomai ištirti.

Šie duomenys parodė, kad blokuodama M3R funkciją, gali ne tik slopinti skrandžio vėžio augimą in vitro ir in vivo , bet ir sustiprinti 5-Fu citotoksinį poveikį skrandžio vėžio ląstelėms, suponuodami, kad M3R gali būti potencialus skrandžio vėžio taikinys. Be to, M3R funkcinis slopinimas mažomis trukdžių RNR taip pat prisidėjo prie apoptozės ir suvaržytos ląstelių invazijos / migracijos skrandžio vėžyje 36 . Daina ir kt . pranešė, kad slopindamas M3R funkciją, gali slopinti navikų pelių augimą nuogoms pelėms, kenčiančioms nuo mažų ląstelių plaučių karcinomos ksenografijos37. Šie rezultatai kartu su mūsų pasiūlytais teiginiais, kad taikymas į M3R, ko gero, buvo nauja terapinė skrandžio vėžio gydymo strategija.

Apskritai šis tyrimas parodė, kad acetilcholinas gali veikti per M3 muskarininius receptorius, kad suaktyvintų EGFR signalus ir skatintų skrandžio vėžio ląstelių dauginimąsi. Blokuodamas M3R funkciją, jis gali ne tik išjungti tarpląstelinį ACh transdukciją ląstelių augimui skatinti, bet ir sustiprinti 5-Fu citotoksinį aktyvumą prieš skrandžio vėžį (9b pav.). Šie atradimai suteikia mums papildomos informacijos apie skrandžio kancerogenezę ir pateikia naujas skrandžio vėžio gydymo strategijas.

Medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra, reagentai ir gyvūnas

Žmogaus ląstelių linijos (MKN28, MKN45, MGC803, BGC823, SGC7901 ir GES-1) buvo gautos iš Kinijos mokslų akademijos ląstelių biologijos instituto (Šanchajus, Kinija). Visos ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM, aukštos gliukozės kiekiu) (Gibco, Grand Island, NY, JAV), papildyta 10% (v / v) vaisiaus galvijo vaisiaus serumu (FBS) (Gibco), sudrėkintame inkubatoriuje 37 ° C C su 5% CO 2 . ACh, neostigminas ir AFDX-116 buvo gauti iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO, JAV), AG1478, triheksifenidilas ir darifenacinas buvo gauti iš MCE (Monmouth Junction, NJ, JAV). Triušio anti-ChAT antikūnas buvo įsigytas iš „Boster Biotech“ (Uhanas, Kinija), o M3R antikūnas - iš „Santa Cruz“ (Dalasas, TX, JAV). Kiti šiame tyrime naudojami antikūnai buvo įsigyti iš „CellSignaling Technology“ (Danvers, MA, JAV). BALB / c-nu pelės buvo įsigytos iš „Da Suo“ laboratorinių gyvūnų co., LTD (Chengdu, Kinija).

Ląstelių proliferacijos tyrimas

Norint įvertinti egzogeninio ACh poveikį ląstelių proliferacijai, tiek MKN45, tiek BGC823 ląstelės buvo pasėtos 96 šulinėlių plokštelėje 1 x 10 3 ląstelių / duobutėje ir auginamos 12 valandų. Tada ląstelės 3 dienas buvo apdorojamos ACh arba be ACh terpėje, kurioje nėra serumo. Norint nustatyti, su kokiais muskarino AChR potipio sąlygotais ląstelių augimo atsakais buvo naudojami selektyvūs M1 AChR (triheksifenidilo), M2 / M4 AChR (AFDX-116) ir M3 AChR (4-DAMP) antagonistai. Ląstelės buvo pasodintos 1 × 103 ląstelių / duobutėje 96 šulinėlių plokštelėse ir kultivuojamos 5 dienas. Vaistai, kurių koncentracija buvo 100 μl, buvo įpilti iškart po ląstelių įdėjimo. Kas 3 dienas buvo keičiami terpės pliusai. Ląstelių gyvybingumas buvo stebimas naudojant „Cell Counting Kit-8kit“ (CCK8, Dojingdo, Kumamoto, Japonija) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 10 μl CCK8 tirpalo, tada 2 valandas inkubuota 37 ° C temperatūroje. Optinio tankio (OD) vertė buvo nuskaityta esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant mikro plokštelių skaitytuvą (Bio-Rad Laboratories, CA, JAV). Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

RNR trukdžiai

M3R sunaikinimui naudojamos mažos trukdančios RNR (siRNR) sekos buvo suprojektuotos ir gautos iš „GenePharma“ (Šanchajus, Kinija). Sekos buvo išvardytos taip: M3R siRNR, 5′-CGCCUUUGUUUCCAAACAU-3 ′, ChAT siRNR, CCAAUCGCUGGUACGACAAGU ir kontrolinė siRNR, 5′-CGTACGCGGAATACTTCGA-3 ′. Ląstelės buvo transfekuotos M3R siRNR arba Kontroline siRNR, naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Smūgio efektyvumas buvo patikrintas Western blot būdu.

Plokštelių klonų tyrimas

Ląstelės buvo pasodintos 1 × 104 ląstelių kiekvienoje duobutėje 6 duobučių plokštelėse ir kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10% FBS. Kai 48 valandas po padengimo susidarė matomos kolonijos, jos buvo plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) ir 15 minučių fiksuotos 4% paraformaldehide, po to 15 minučių dažomos krištolo violetiniu spinduliu.

Western blot analizė

Tiriamųjų baltymų, įskaitant suminį ir fosforilintą EGFR, EKR1 / 2 ir AKT, ir su apoptoze susijusių baltymų raiškos pokytis buvo tiriami Western blot metodu. Trumpai tariant, ląstelės buvo surinktos ir lizuotos naudojant RIPA lizės buferį, kuriame yra proteazės inhibitorius ir fosfatazės inhibitorius. Tada lygus baltymų ekstraktų kiekis buvo atskirtas 12% SDS-PAGE geliu ir perkeltas į nitroceliuliozės membranas naudojant „Bio-Rad“ pusiau sauso pernešimo sistemą, po to membranos 1 valandą užblokuotos 5% neriebiu sausu pienu ir inkubuojamos su pirminius antikūnus per naktį 4 ° C temperatūroje, membranos buvo inkubuojamos su antriniu DyLight 800 AffiniPure ožkos anti-triušio IgG arba DyLight 680 AffiniPure ožkos anti-pelės IgG (EarthOx, CA, JAV) antikūnu 2 valandas kambario temperatūroje. Imunoreaktyviosios juostos buvo vizualizuotos ir kiekybiškai įvertintos naudojant ODYSSEY infraraudonųjų spindulių vaizdo sistemą (LI-ORBiosciences, Linkolnas, NE, JAV).

LC-MS / MS analizė

Norint ištirti ACh koncentraciją, išsiskiriančią MNK45 ir BGC823 ląstelių auginimo terpėje, 5 x 106 ląstelių 10 ml buvo pasodintos į 60 cm 2 kultūrinius indus. Acetilcholinesterazės inhibitorius neostigminas buvo pridėtas 50 μM koncentracijos, kad būtų slopinamas ACh skilimas, o ChAT baltymas ląstelėse buvo numuštas, 48 ​​valandas transfekuojant siRNR. Po dar 24 valandų inkubacijos buvo gautos ląstelių suspensijos ir ekstrahuotos keturis kartus didesniu acetonitrilo tūriu, mišinys centrifuguotas esant 13000 aps./min. 15 min., Esant 4 ° C, ir išanalizuota 100 μl supernatantų. Itin efektyvus LC atskyrimas buvo atliktas naudojant ACQUITY UPLCTM BEH C18 kolonėlę (Waters Corporation, Milford, MA, JAV). Judriosios fazės buvo 0, 1% skruzdžių rūgšties (A) ir metanolio (B), o izokratinė eliuacija buvo atlikta naudojant 90% A ir 10% B. Vandenių analizėje buvo naudojamas Waters Quattro Premier XE masių spektrometras kartu su ESI šaltiniu. ir „Masslynx V 4.1“ programinė įranga buvo naudojama valdyti UPLC-MS / MS sistemą. Masės spektrometras veikė teigiamo jonų režimu, kai šaltinio temperatūra buvo nustatyta 110 ° C, kūgio įtampa buvo 20 V, o kapiliarinė įtampa - 2, 8 kV. ACh buvo išmatuoti selektyviu daugiareakcijų stebėjimu, naudojant teigiamą jonizacijos režimą.

ChAT imunocitochemija

Ląstelės MKN45 ir BGC823 buvo pasėtos ant stiklinės stiklelio 24 valandas ir po to 15 minučių buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu, po to permeabilizavus 1% TritonX-100 15 minučių ir užblokavus 1% BSA 30 minučių. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su pirminiu ChAT antikūnu (1: 100) per naktį 4 ° C temperatūroje. Po tris kartus nuplaunamo PBS, stikleliai buvo inkubuojami antrą antikūną, pažymintį biotiną, 20 minučių ir dažomi grandinės pelėsio avidino peroksidaze (Boster Biotech, Wuhan, Kinija). Galiausiai reakcijai spalvinti buvo naudojamas 3, 3′-diaminobenzidinas (DAB) ir optiniu mikroskopu buvo stebimi teigiami rudų granulių, pasiskirstytų citoplazmoje, signalai.

In vivo eksperimentai

Visi eksperimentai buvo atlikti laikantis atitinkamų gairių ir taisyklių. Tyrimą patvirtino Sičuano universiteto Kinijoje institucinis eksperimentinės gyvūnų etikos komitetas (patvirtinimo Nr. 20160017). Pelės buvo šeriamos kontroliuojamos temperatūros ir drėgmės Vakarų Kinijos ligoninės SPF klasės gyvūnų skyriuje. Poodiniams ksenografiniams navikų modeliams 1x106 MKN45 ir BGC823 ląstelės, suspenduotos 100 μL PBS, buvo įšvirkštos į 8 savaičių amžiaus BALB / c nuogų pelių dešiniajame ašies regione. Praėjus penkioms dienoms po injekcijos, 4-DAMP ir darifenacinas buvo sušvirkšti ip atitinkamai 1 mg / kg / d dozėmis. Kontrolinei grupei buvo įšvirkštas nešiklis (PBS, sumaišytas su DMSO santykiu 1: 1). Pelės buvo paaukotos po dvylikos dienų, augliai buvo atskirti nuo gyvūnų, išmatuoti navikų dydžiai, naviko tūris ir kiekvienos grupės naviko svoris.

Statistinė analizė

Statistinė analizė buvo atlikta naudojant „GraphPad Prism“ programinę įrangą, naudojant vienpusę ANOVA su Tukey potestu ir Studento t-testu. Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD. P reikšmės <0, 05 arba P vertės <0, 01 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Yu, H. et al . Acetilcholinas veikia per M3 muskarininius receptorius, kad suaktyvintų EGFR signalus ir skatintų skrandžio vėžio ląstelių dauginimąsi. Mokslas. Rep. 7, 40802; „doi“: 10.1038 / srep40802 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.