Iš žmogaus žarnos aktyvios ir sekretuojamos kiekviena padengtos bakterijų frakcijos atskleidžia nepakankamai atstovaujamą mikrobiotos šerdį mokslinės ataskaitos

Iš žmogaus žarnos aktyvios ir sekretuojamos kiekviena padengtos bakterijų frakcijos atskleidžia nepakankamai atstovaujamą mikrobiotos šerdį mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Antimikrobiniai atsakai
  • Bakterijų imuninis vengimas
  • Mikrobų ekologija
  • Mikrobiomas

Anotacija

Su šeimininkais susijusios mikrobiotos pasiskirstymas skiriasi, atsižvelgiant į apgyvendintą kūno plotą. Yra žinoma, kad žarnų mikrobai sąveikauja su žmogaus imunine sistema, palaikydami žarnos homoeostazę. Taigi mes ištyrėme, ar išskiriami IgA (S-IgA) padengia specifinius mikrobų taksonus, nesukeldami stiprios imuninės reakcijos. Norėdami tai padaryti, mes suskaidėme žarnos mikrobiotas srauto citometrijos metodu. Mes nustatėme, kad aktyvios ir S-IgA dengtos bakterijų frakcijos pasižymi didesne įvairove nei tos, kurios stebimos neapdorotų išmatų suspensijose. Pasiskirstant šeimoje, buvo pastebėtas ilgosios uodegos poveikis, kuris atskleidė, kad retos bakterijos sudaro iki 20% visos įvairovės. Nors Firmicutes buvo gausiausias sambūris, didžioji jo sekų dalis nebuvo paskirta genties lygiu. Galiausiai vienaląstelinis metodas leido mums sutelkti dėmesį į aktyvias ir S-IgA dengtas bakterijas. Taigi mes atskleidėme mikrobiotos branduolį, bendrą tyrime dalyvavusiems sveikiems savanoriams. Įdomu tai, kad šį branduolį daugiausia sudarė žemo dažnio taksai (pvz., Sphingomonadaceae ).

Įvadas

Žmogaus virškinimo trakte (GIT) gyvena sudėtinga bakterijų bendruomenė, kuri dešimtmečius buvo plačiai tiriama naudojant 1, 2, 3, 4 ir nuo kultūros priklausomus, ir nuo jų nepriklausomus metodus. GIT mikrobiota įgyjama labai anksti, maždaug per mėnesį nuo kūdikio gimimo 5 . Kartu su šia labai trumpa laiko skalę, „inokulumą“, be kita ko, lemia pristatymo būdas (makšties arba C formos pjūvis), maitinimo būdas (motinos pienas arba receptai) ir aplinkos veiksniai pristatymo metu. 6, 7, 8 .

Greičiausiai labai nedaug motinos kilmės organizmų bus išlaikyta naujagimyje po pirmojo gyvenimo mėnesio 9, 10 ; po šio trumpo laiko žarnyne jau yra savo mikrobiota, kurioje vyksta bakterijų apykaita, kol pasiekiama stabili kompozicija, kuri yra gana pastovi visą gyvenimą 11 . Norint pasiekti šį homoeostazę, įgimtos ir adaptyvios imuninės reakcijos veikia kartu. Vis daugiau įrodymų rodo lygiagrečią imuninės sistemos evoliuciją su virškinimo trakto mikrobiotos nariais 12, 13, 14 . Taigi nuo pirmosios gyvenimo dienos į Toll panašūs receptoriai (nuo TLR1 iki TLR9) yra pritaikyti ir gali atpažinti specifines mikrobų struktūras, tokias kaip lipopolisaharidas (LPS) 15 . Lotzas ir bendradarbiai aprašė, kaip naujai gimusioms pelėms per valandą nuo gimdymo iškyla tolerancija LPS ekspresuojančioms bakterijoms; šis procesas prisideda prie mikrobiotos šeimininko homoeostazės nustatymo anksti po gimdymo 16 . Labai gerai suplanuotame tyrime „Giraud“ ir bendradarbiai parodė, kad Escherichia coli MG1655, pasėtas 8–12 savaičių amžiaus gnotobiotinėmis pelėmis, greitai vystosi kūno rengybos proceso metu, pagrįsto mutacijomis ir prisitaikymu prie naujos aplinkos, pakeisdamas „EnvZ / OmpR“ operoną 90 proc. bakterijų, surinktų iš nepriklausomų pelių išmatų po laukinio tipo „inokulumo“ 17 . Kita vertus, imuninė sistema turi prisitaikyti prie mikrobų invazijos, vengdama visiško įsibrovėlių sunaikinimo, kurie turi būti pripažinti antrąja tarpusavio santykių dalimi. Šios sąveikos palaikomos visą gyvenimą. Pagal šį scenarijų imuninė sistema yra nuolat stimuliuojama, nors ir kontroliuojama, vengiant nenormalios reakcijos į kommensalinius ar galimus patogenus, kurie praeina per GIT. Pavyzdžiui, kai kurios bakterijos, tokios kaip „ Sphingomonas“ nariai, buvo identifikuotos kaip žaidėjos, palaikančios imuninį atsaką ir gaminančios antigeninius glikozingingolipidus, kurie buvo koreliuojami su invariantinių natūralių žudikių T ląstelių išsiplėtimu 18 .

Jau 1987 m. „Conley & Delacroix“ apskaičiavo, kad kasdien žmogaus žarnyne susidaro apie 40 mg / kg kūno svorio 19 . Apskaičiuota, kad sveikomis sąlygomis IgA apima 36% GIT mikrobiotos ir kad uždegiminių procesų metu šis skaičius gali padidėti iki 69% 20 .

Karšta tyrimų tema apima supratimą apie dominuojančių bakterijų vaidmenį ir jų ryšį su retomis. Ankstesniame darbe mes pabrėžėme, kad yra žemo dažnio taksonų, kuriuos daugiausia sudaro aktyvios bakterijos, kurių įvairovę statistiškai slepia dominuojanti dauguma 21 . Virškinimo traktas yra turtingiausias kūno plotas pagal mikrobų grupes. Labiausiai atstovaujami taksonai taip pat dažniausiai pasiskirsto tarp skirtingų imčių. Tačiau dauguma dar nežinomų taksonų priklauso mažai atstovaujamai žarnyno mikrobiotos daliai 22, 23 .

Naujos kartos DNR sekos nustatymo metodika atskleidžia didžiulę bakterijų, gyvenančių žmogaus organizme, įvairovę, tiesioginis ląstelių supratimas apie tai, kurie aktyvūs žaidėjai yra ir kurie iš jų sąveikauja su imunine sistema, tebėra tyrimo iššūkis. Anksčiau Van Der Waaij ir bendradarbiai (1994) aprašė žmogaus išmatų mikrobiotos rūšiavimo metodą, pagrįstą fluorescenciniu anti-žmogaus IgA 24 žymėjimu. Mes panaudojome tarpdisciplininį vienos ląstelės metodą, apimantį RNR ląstelių dažymą kaip 25, 26 aktyvumo rodiklį, anti-žmogaus IgA fluorescencinę hibridizaciją, srauto citometriją ir ląstelių rūšiavimą, 16S rDNR amplifikaciją ir gilų pirosequencing, kad būtų atskleisti skirtingi žarnos mikrobiotos segmentai, tokie kaip kaip galimas nepakankamai atstovaujamų bakterijų aktyvumas. Mes pastebėjome, kad žemo dažnio taksonų ilgio uodega (turtingumas mažesnis kaip 1%) gali sudaryti iki 20% aktyvių gyventojų. Mes taip pat išanalizavome sveikų savanorių, kurie nebuvo gydyti antibiotikais ir kurie buvo akivaizdžiai sveiki, aktyvias ir S-IgA dengtas bakterijas. Mūsų tikslas buvo nustatyti, ar IgA dengia specifinius taksonus. Mes nustatėme keletą grupių, tokių kaip Actinobacteria ar Sphingobacteria , kurioms jau yra hipotezės dėl jų vaidmens ir aktyvumo, kurios buvo patvirtintos pelių modeliuose kaip aktyvios žarnos mikrobiotos dalyvės ir (arba) kaip S-IgA dengtos frakcijos dalis.

Rezultatai

Sekavimo ir įvairovės apžvalga

Iš kiekvieno mėginio ir frakcijos gavome vidutiniškai 6 980 sekų per 200 bp (min .: 727; max: 14 359 perskaityta). Vidutinis skaitymo ilgis buvo 422 bp (+/− 89 bp). 1 mėginyje / frakcijoje esančių parodymų skaičius, taip pat dalelių (ląstelių) skaičius, surūšiuotas pagal srauto citometriją, ir santykis su visu skaičiumi pateikiami 1 lentelėje. Kaip galima pastebėti, aktyviųjų ląstelių frakcija svyravo nuo 34% (V2 mėginys) iki 66% (V4) visos bendruomenės atžvilgiu, o S-IgA dengtų bakterijų dalis svyravo nuo 21% (V4) iki 98% (V3).

Pilno dydžio lentelė

Įvairovės analizė genties lygyje parodė, kad FS frakcijos yra mažesnio lygumo beveik su visais Act mėginiais (V2, V3, V4, V5 ir V6) ir visomis IgA frakcijomis, kaip parodyta naudojant Šenono indeksą. Turtingumo vertintojas Chao1 nustatė skirtingą FS elgesį Akto ir IgA atžvilgiu, būdamas mažesnis V1, V2, V3, V5 ir V6 mėginiuose ir didesnis V4 (žr. 1 lentelę).

Retosios fazės kreivės išlygintos šeimos lygiu, o visos FS frakcijos išlygintos anksčiau nei „Act“ ir IgA frakcijos (žr. 1 paveikslą). Išanalizavus šeimos pasiskirstymą, paaiškėjo, kad Akto ir IgA frakcijos linkusios susilieti (2 pav., A skydelis). Be to, Actas arba S-IgA dengtos bakterijų frakcijos neatspindi visos bendruomenės; jie taip pat negalėjo būti laikomi jo pogrupiu dėl didelio rastų rūšių turtingumo ir tolygumo. V1 mėginys parodė kitokį mikrobų pasiskirstymą kitų mėginių atžvilgiu, kaip parodyta klasterio analizėje, kur V1 frakcijos kitų mėginių / frakcijų atžvilgiu elgiasi kaip pėdsakai (2 paveikslas, A skydelis). Generų lygmenyje visų surinktų mėginių kanoninė atitikimo analizė parodė, kad du pagrindiniai komponentai suteikia 43, 62% ir 17, 60% stebimos įvairovės (3 paveikslas). Kaip ir tikėtasi, V1 mėginys yra labiausiai išsiskyręs, taip pat pastebimas aiškus trijų frakcijų atskyrimas. Šiuos rezultatus statistiškai patvirtina dispersijos analizė, naudojant atstumo matricą pagal „Adonis“ (daugialypę variacijų analizę, naudojant atstumo matricas), taip pat žinomą kaip „Permutational Manova“ 28, 27, ir taikant Bray-Curtis atstumo skaičiavimą genties taksonominiame reitinge. . Analizė parodė reikšmingas p reikšmes tiek frakcijoms, tiek mėginių grupavimo kriterijams (3 paveikslas ir papildoma informacija, 1 lentelė).

Image

FS: išmatų suspensija. Veiksmas: aktyviosios frakcijos. IgA: S-IgA dengtos bakterijų frakcijos. Kiekvienas sklypas atitinka savanorį. X ašis žymi sekų skaičių, o Y ašis žymi šeimų, su kuriomis susidūrė, skaičių.

Visas dydis

Image

Skydelyje (A) parodytas mėginių / frakcijų grupavimas šeimos lygmeniu, naudojant Bray-Curtis atstumo matricą ir visą jungčių grupavimo metodą. Skydelyje (B) parodytas visų dažnių verčių, apskaičiuotų šeimos lygiu, pasiskirstymas, Y ašis pavaizduota logaritminėje skalėje. (C) skyriuje pateiktas dominuojančių ir retų šeimų, kurių gausa yra lygi arba didesnė kaip 1% arba mažesnė nei 1%, visuma. Juostelės apibūdina pavyzdžius, o juostų grupės apibrėžia frakcijas (žr. Legendą virš skydelio).

Visas dydis

Image

Pasiskirstymas gautas iš Bray Curtis atstumo matricos, apskaičiuotos pagal genties nenumatytų atvejų lentelę. Ašys žymi atstumo vertes 1 ir 2 koordinatėse. Raudonos linijos ir etiketės atskiria pavyzdžius, šviesiai mėlynos linijos atskiria frakcijas. Pilkos etiketės su „Ssample.Fraction“ nuorodomis apibūdina kiekvieno eksperimento pasiskirstymą. Rožinės etiketės rodo genčių pasiskirstymą.

Visas dydis

Norėdami klasifikuoti žemo ir aukšto dažnio šeimas, taikėme metodą, pagrįstą vidutiniu posūkio tašku, kaip aprašyta anksčiau 21 . Dažnių pasiskirstymas tarp šeimų, atsižvelgiant į visą duomenų rinkinį, buvo atitinkamai 1, 60% ir 0, 1% (žr. 2 pav. B skiltį), o tai patvirtina skaitmeninę retų šeimų svarbą. Bendrosios frakcijos vidutinės vertės parodė, kad dominuojančios šeimos sudarė atitinkamai 97, 11% (standartinis nuokrypis: 1, 1), 36, 37% (sd: 20, 39) ir 43, 46% (sd: 33, 54) šeimų FS, Act ir IgA frakcijose, o retos šeimos ( dažnis mažesnis kaip 1%) tarp visų mėginių, vidutiniškai sudariusių 2, 89% (sd: 1, 1), 5, 81% (sd: 2, 41) ir 6, 21% (sd: 2, 08) šeimų FS, Act ir IgA frakcijose (žr. 2 paveikslą, skydelis C). Taigi žemo dažnio taksai buvo nepaprastai įvairūs, o įvairovei, kaip ir tikėtasi, būdingas „ilgosios uodegos“ efektas.

OTUs 97 pasiskirstymas ir pagrindinė mikrobiota

Naudodamiesi analogija su pan-genomo koncepcija 29, 30, mes galime apibrėžti „pan-mikrobiotą“ identifikuodami sekų grupes, dalijamas tarp mėginių („pagrindinį“ bakterijų rinkinį), taip pat kiekvienam mėginiui būdingus klasterius.

Lyginant rūšių lygmens operacinių taksonominių vienetų analizę (sekos yra panašios į 97%, 80% sutampa, toliau OTUs 97 ) paaiškėjo, kad tarp visų mėginių 28, 21 ir 69 OTUs 97 buvo pasiskirstę atitinkamai tarp IgA, Act ir FS frakcijų. (žr. 4 paveikslą). Bendra FS branduolio įvairovė apėmė tik labai gausių Firmicutes ir Bacteriodetes šeimų narius, o Act ir IgA frakcijose taip pat buvo rasta Proteobakterijų narių, tokių kaip alfaproteobakterijos, daugiausia priklausančios Sphingomonadales, Gammaproteobakterijos, priklausančios Pseudomonadales , ir Betaproteobakterijos, priklausančios. Burkholderiales ; IgA šerdyje mes taip pat nustatėme Actinobacteria narių, kurių FS nebuvo (žr. 2 lentelę).

Image

Grafikai rodo unikalius ir bendrus OTU atitinkamai FS, Act ir IgA frakcijose. Imties kodas pateikiamas arti kiekvienos srities. Skaičiai centrinėse sutampančiose vietose nurodo bendrąjį OTU 97 pagrindinėje mikrobiotoje.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Mažiau ribojanti analizė, apibūdinanti branduolių bakterijas, kurias sudarė klasteriai, atstovaujami mažiausiai 5 iš 6 mėginių, parodė, kad FS šerdis buvo beveik nekintama, pridedant tik Streptococcaceae narius. Į Akto frakciją taip pat buvo įtraukti Xanthomonadaceae nariai iš gamaproteobakterijų ; Aktobakterijų mikrobakterijos ir N ocardiaceae (žr. 2 lentelę).

Taksonomijos analizė

Nepriskirtos gentys

GTV buvo laikomos nepriskiriamomis, kai jas komentavo KPP klasifikatorius, kai pasitikėjimo vertės balas buvo mažesnis nei 0, 8. Jie buvo komentuojami naudojant viršutinius taksonominius rango lygius. Visuose mėginiuose buvo rastas labai didelis nepaskirtų genčių skaičius. FS nustatėme, kad nepriskirtos gentys svyravo nuo 24, 77% rodmenų V6 mėginyje iki 44, 56% V4 mėginių. Act frakcijoje neidentifikuotų genčių procentinė dalis buvo paskirstyta tolygiau - nuo 8, 27% (V3) iki 18, 83% (V4), išskyrus V1 pavyzdį (0, 46%). S-IgA dengtose frakcijose nenustatytos gentys svyravo nuo 2, 45% V1 iki 35, 01% V2.

OTU 97, priklausančių nepriskirtoms gentims, buvo 9122 iš 14 558. Šie duomenys yra sugrupuoti pagal pagrindines klases papildomos informacijos 1 paveiksle.

Firminės firmos

Kaip ir buvo galima tikėtis, Clostridiales buvo labiausiai apgyvendinta tvarka ne tik Firmicutes, bet ir atsižvelgiant į likusią Phyla dalį. Apskritai iš taksonų, kurių dažnis yra lygus arba didesnis kaip 1%, mes nustatėme: Lachnospiraceae (įskaitant: Lachnospira , Roseoburia, Incertae Sedis XIV, Blautia ); Ruminococcaceae ( Faecalibacterium ) ir kiti nenustatyti Clostridiales (žr. Papildomos informacijos 2 pav. - Firmicutes ). „ Bacilli“ klasėje aptikome keletą žemo dažnio (mažiau nei 1%) šeimų ir genčių, priklausančių tik Act arba IgA frakcijoms. Lactobacillales , Enterococcus nariai, kai kurie neidentifikuoti Enterococcaceae ir Lactobacillus buvo aptikti visiems mėginiams, bent jau Act ir IgA frakcijose. Streptococcaceae serume Streptococcus yra tas pats, kuris dalijamasi su visais mėginiais (žr. Papildomos informacijos 2 pav. - Firmicutes ).

Bakteroidai

Bacteroidetes buvo antras labiausiai įdarbintas vilnietis, kuriame Bacteroides gentis buvo rastas tarp visų, išskyrus V1 pavyzdį. Jis buvo labai įdarbintas iš FS frakcijos ir sudarė iki 38, 86% visų V6 pavyzdžio parodymų (atitinkamai 19, 81%, 15, 21%, 13, 93%, 7, 80% V5, V3, V4 ir V2). Kelios bakteroiditų grupės daugiausia buvo verbuojamos iš FS frakcijų, pavyzdžiui, neidentifikuotos porfiromonadaceae buvo unikaliai rastos FS frakcijose iš visų, išskyrus V5, mėginių. Prevotella taip pat buvo viena iš visuotinai įdarbintų grupių Act (visi mėginiai), IgA (V1, V2, V3 ir V5) ir FS (V1, V2, V3, V4) frakcijose. Parabacteroides buvo panašus į Prevotella ; jis rastas FS (visi, išskyrus V6), Act (visi mėginiai) ir IgA (visi, išskyrus V5) frakcijose (žr. papildomos informacijos 2 pav. - Bacteroidetes ).

Proteobakterijos

Beveik visos proteobakterijos buvo rasta kaip aktyvios ir (arba) S-IgA opsonizuotos mikrobiotos dalis.

Tik Sphingomonas , priklausantis alfaproteobakterijoms , buvo rastas daugiau kaip 1%, bent jau V1, V2, V3 ir V4 IgA frakcijose; nors jų taip pat buvo mažiau nei 1% V6 (aktas ir IgA). Pseudomonas taip pat buvo gausiai įtrauktas į V3, V4 ir V6 mėginių Akto ir IgA frakcijas. V5 pavyzdyje nerasta daugiau nei 1% baltymų. Buvo nustatyta, kad kelios Sphingomonadales šeimos yra bendros visiems mėginiams, pavyzdžiui, Porphyrobacter ir nepriskirtos Erythrobacteraceae (visos, išskyrus V4 ir V5), Novosphingobium (visi mėginiai), Sphingomonas (visos, išskyrus V5) ir kitos nenustatytos šeimos (žr. Papildomą informaciją, 2 paveikslas). - proteobakterijos ).

Betaproteobakterijose iš visų frakcijų dažniausiai buvo išrenkamos Burkholderiales , Sutturellaceae šeimos, Parasutterella šeimos. Taip pat iš visos V4 ir V5 mėginių buvo rasta tos pačios šeimos varnalėša . Comamonadaceae pelomonas buvo rastas visuose mėginiuose, bet niekada nebuvo FS frakcijose.

Buvo rasti kai kurie deltaproteobakterijų , daugiausia susijusių su desulfovibrionales, nariai, bet neturintys jokio modelio ir daugiausia esantys FS frakcijose.

Gamaproteobakterijos, tokios kaip Escherichia / Shigella, buvo aptiktos nedažnai iš visų mėginių: FS (V5 ir V6 mėginiuose), Act (visi mėginiai) ir IgA (V1, V2, V5 ir V6). Kitų enterobakterijų, tokių kaip Morganella, rasta visų mėginių IgA frakcijoje. Įdomu tai, kad nariai, susiję su „ Alcanivorax“ iš Oceanospirillales , buvo rasti visuose mėginiuose, išskyrus V4, bent jau IgA frakcijoje. Pseudomonadales'e Acinetobacter buvo rastas visuose mėginiuose, išskyrus V2, Act ir / arba IgA frakcijose. Pseudomonas taip pat buvo viena iš bendrų genčių, gautų iš visų Act ir IgA frakcijų, bet ne iš FS. Taip pat Stenotrophomonas iš Xanthomonadales buvo rastas visuose, išskyrus V2, mėginius iš Act arba IgA (arba abiejų) frakcijų.

Aktobakterijos

Nebuvo nustatyta jokių Actinobacteria priklausančių genčių, kurių dažnis būtų didesnis nei 1%. Aktinomycetales mikrobakterijų iš Microbacteriaceae rasta paprastai visuose Akto mėginiuose (išskyrus V1) ir (arba) IgA, bet niekada FS frakcijoje. Tokia pati tendencija pastebėta ir Rhodococcus iš Nocardiaceae, ir Propionibacterium iš Propionibacteriaceae . Coriobacteriales viduje Collinsella buvo paimta iš visų, išskyrus V5, mėginių, tuo tarpu V2 ir V4 mėginiuose ji taip pat buvo atgauta iš FS frakcijos (žr. Papildomos informacijos 2 paveikslą - aktinobakterijos ).

Diskusija

Dabar plačiai pripažįstama, kad didžioji dalis mikroorganizmų ir aukštesniųjų organizmų (pvz., Augalų, gyvūnų ir kitų) ryšių greičiausiai yra kommeniniai arba tarpusavio santykiai 31 . Šiame kontekste yra vis daugiau įrodymų, kad imuninė sistema vystėsi prisitaikydama prie bakterijų kolonizacijos augančio sudėtingumo, moduliuodama jos reaktyvumą 18, 32, 33 . Šiame darbe parodyta, kad taksonominis pasiskirstymas, gautas iš aktyvių ir S-IgA dengtų bakterijų frakcijų, išskirtų iš sveikų žmonių savanorių išmatų mėginių, labai skiriasi nuo tų, kurie gaunami iš DNR, ekstrahuotos tiesiogiai iš išmatų. Apskritai, tai, ką mes pastebėjome FS, atitinka rezultatus, gautus keliuose kituose tyrimuose dėl žarnyno mikrobiotos pasiskirstymo, kai naudojami išmatų mėginiai 34 . Pavyzdžiui, yra ankstesnių pranešimų, kad dominuojantys OTU yra labiau paplitę tarp imčių 23 . Firmicutai ir bakteroidatai yra pagrindiniai taksai, dažniausiai gaunami iš visų žmogaus išmatų mėginių, ir jų santykį dažnai įtakoja dieta 35 . Kaip pastebėjo „Tap“ ir bendradarbiai 34, keletas dominuojančių taksonų, priklausančių Lachnospiraceae , Clostridiaceae ar Bacteroidaceae , dažniausiai buvo rasti visų mėginių FS frakcijų pagrindinėje mikrobiotoje, kaip ir šiame darbe. Be to, rūšiavimas srauto citometrijos metodu, naudojant frakcijas, su vėlesne pirosekvencija, leido mums pasiekti aktyvias ir S-IgA dengtas bakterijų frakcijas.

Gali atrodyti, kad daug bakterijų, rastų aktyviosiose ir S-IgA dengtose frakcijose, nebuvo aptikta išmatų kontrolėje. Šio aptikimo trūkumo priežastis greičiausiai yra susijusi su retų bakterijų amplifikacijos stoka, nes PGR yra šališkas, kad būtų galima amplifikuoti dažniausiai imtyje esančius DNR šablonus 36 . Taigi kai kurių bakterijų taksonų dominavimas išmatų mėginiuose užmaskuoja svarbią įvairovės dalį, į kurią įeina aktyvios ir IgA opsonizuotos bakterijos.

Mes nustatėme, kad bendras bakterioidų / firmicutų įdarbinimo santykis išlieka FS, Act ir IgA mikrobiotose, tačiau pastarosiose dviejose frakcijose jų buvimas sumažėjo kitų fitų, tokių kaip proteobakterijos ir aktinobakterijos , naudai. Taigi, panaudodami RNR / ląstelių kiekį kaip bakterijų aktyvumo rodiklį 25, 26, parodome, kad keli dar nenustatyti arba labai reti taksai iš tikrųjų yra aktyvūs žmogaus mikrobiotos žaidėjai ir griežtai sąveikauja su imunine sistema. Šiame kontekste, kai buvo apibūdintos aktyvios ir S-IgA dengtos bakterijų frakcijos, mes sugebėjome išplėsti mikrobiotos branduolį proteobakterijų nariams, įskaitant Sphingomonadaceae ir Pseudomonadaceae , tuo tarpu mažiau apribotoje šerdyje (penkiuose iš šešių mėginių), mes taip pat radome Actinobacteria narius. Pagrindinės S-IgA dengtos bakterijos yra suderintos su stebėjimais, kad imuninę sistemą nuolat stimuliuoja kommensalinės bakterijos 37, 38 .

Firmicutes metu mes nustatėme, kad aktyvios šerdies mikrobiota apima Blautia narius, kurių B. productia rūšis buvo išbandyta kaip aktyvusis fermentatorius supaprastintuose žmogaus žarnyno mikrobiotos eksperimentuose, naudojant žiurkes, kuriose nėra gemalų 39 . Kiti Firmicutes nariai, tokie kaip Lactobacillus ar Enterococcus , kurie yra svarbūs dėl savo vaidmens kaip imuninės sistemos moduliatoriai arba padeda įsisavinti žarnyną 40, dažniausiai yra laikomi aktyviųjų ir IgA frakcijų dalimi.

Kalbant apie Bacteroides , griežti anaerobai, tokie kaip „ Prevotella“ genties nariai, vadinami celiuliozės ir ksilano skaidikliais, jau buvo rasti kaip pagrindinė vaikų, kurių racione yra daug skaidulų, mikrobiota 35 . Savo eksperimente atradome „ Prevotella“ kaip pagrindines bakterijas tik tada, kai sutelkėme dėmesį į aktyvias ar S-IgA dengtas bakterijas. Taigi, nors šios grupės nariai laikomi retais, dažniausiai jie būna aktyvūs.

Labai įdomus atradimas yra frobakterijų , kurių nariai beveik nematomi, kai DNR ekstrahavimas iš išmatų mėginiuose atliekamas netaikant jokio atrankos ar rūšiavimo protokolo. Savo darbe atkreipėme dėmesį, kad proteobakterijos yra pasikartojantys aktyvūs žarnyno mikrobiotos nariai, taip pat griežtai sąveikaudami su imunine sistema. Sphingomonadales nariai (iš alfaproteobakterijų ) yra svarbūs žaidėjai, formuojantys imuninę sistemą. Sphingomonas sp. buvo labai gautas keturiuose iš šešių mėginių, tuo tarpu kituose dviejuose mėginiuose jo buvo nustatyta mažiau kaip 1%. Pelių, kuriose nėra gemalų, papildytų įprastiniais arba ribotais žarnyno mikroorganizmais, tyrimai rodo, kad glikozilceramidai, kurie yra Sphingomonas ląstelės sienelės komponentas, yra identifikuojami kaip CD1d ligadai, stimuliuojantys invariantines natūralias žudiko T ląsteles 18, 41, 42 . Pastebėjome, kad pagrindinėje mikrobiotoje yra keletas kitų Sphingomonadales šeimų, įskaitant Porphyrobacter , Novosphingobium , Sphingomonas genus ir kitus, kurie dar nėra gerai apibūdinami, bet priklauso Sphingomonadaceae šeimai.

Kitos dažniausiai iš visų frakcijų išgaunamos proteobakterijos buvo Beta klasės nariai, priklausantys Burkholderiales kategorijai . Atliekant liesų ir nutukusių pelių tyrimus, „ Parasutturella“ ir „ Sutturella“ buvo susijusios su sveika flora 43 . Burkholderia taip pat dažniausiai buvo gaunama iš aktyvių ir S-IgA dengtų mikrobų frakcijų, bet niekada nebuvo FS frakcijoje, tikriausiai dėl jų retesnio dažnio, kurį užvaldo dominuojančios bakterijos, kai taikomas standartinis išmatų metodas. Burkholderia dažnai laikoma oportunistinėmis patogeninėmis bakterijomis, tačiau dėl nepaprasto jos vaidmens ji gali išgyventi žarnyne nesukeldama infekcijos procesų. Hutchinsonas ir bendradarbiai pranešė, kad Burkholderia yra griežtos aerobinės bakterijos, nors pranešta, kad po anaerobinio inkubavimo dienų gyvybingos kolonijos atsirado ir 44 . Tai galėtų paaiškinti jo nedaug buvimą ir pritraukimą iš virškinimo trakto aktyviose ir S-IgA dengtose frakcijose.

Escherichia / Shigella giminingos enterobakterijos buvo aptiktos beveik visuose mėginiuose ir frakcijose. Taip pat radome su „ Alcanivorax“ susijusių narių, kurie, kaip žinoma, daugiausia yra jūrinės, aktyvios, naftą ardančios bakterijos45. Nors jo 16S rDNR homologija su artimiausiu „GenBank“ nariu yra maždaug 96% (duomenys nepateikti), stebėtina, kad ji randama beveik visų mėginių aktyviosiose arba S-IgA dengtose frakcijose. Kita nustatyta gamaproteobakterija buvo Acinetobacter (šeima Moraxellaceae ), nors jos 16S panašumas toli gražu nėra A. baumani (97% panašumas) ir artimesnis (99%) su kitais nenustatytais ar nekultūringais Acinetobacter bakterijomis (duomenys nepateikti). Neseniai atliktame tyrime su pelėmis buvo teigiama, kad Acinetobacter , Stenotrophomonas ir Comamonas yra vadinamosios „kriptams būdingos šerdies mikrobiotos“ dalis 46 . Čia mes nustatėme, kad šios bakterijų grupės beveik visada yra išgaunamos iš žmogaus aktyvios mikrobiotos arba iš žmogaus S-IgA dengtos mikrobiotos. Kai kurios gentys dažniausiai buvo randamos Act ir IgA frakcijose, tačiau atrodo, kad svarstant FS frakcijas jie yra paslėpti.

Be to, aktinobakterijos dažniausiai buvo verbuojamos rečiau nei 1%. Savo apžvalgoje Turroni ir bendradarbiai 47 apibūdino, kad Actinobakterijos dažniausiai buvo paimamos iš išmatų mėginių, naudojant klasikinius nuo kultūros priklausomus metodus, tačiau jos retai aptinkamos metagenomikos tyrimais 2, 48, 49 . Panašiai, mūsų mėginiuose, aktinobakterijų beveik nebuvo FS frakcijose, tuo tarpu jos buvo retaktyvios aktyviose ir (arba) S-IgA dengtose bakterijų frakcijose. Taigi jų nebuvimas FS frakcijoje negali būti priskirtas prie kai kurių DNR ekstrahavimo metodo paklaidų (paprastai taikomų visoms frakcijoms) ar pradmenų, naudojamų PGR amplifikacijai, o dėl sekos optimizavimo, kai konkreti frakcija atrenkama naudojant srauto citometrija pagrįstas rūšiavimo metodas.

Apibendrinant, pasiūlytas metodas leido mums iš aktyviųjų bakterijų ląstelių genominės DNR gauti 16S rDNR amplikonus, parinktus ir surūšiuotus pagal srauto citometriją. Palyginti su kitomis metodikomis, kai aktyvios bakterijos atpažįstamos pakartotinai transkriptuojant ribosominę RNR, šiame darbe stebimi taksonominiai pasiskirstymai nėra šališki kiekvienoje ląstelėje esančio rRNR kopijos skaičiaus, tuo tarpu ją galbūt šališkai veikia tik chromosominės 16S rDNR kopijos (chromosominės). 16S rDNR). Kaip jau buvo pabrėžta mūsų ankstesniame darbe 21, aktyvioji žarnyno mikrobiotos dalis rodo kitokį požiūrį tiriant žmogaus mikrobiotą. Šio metodo derinimas su skirtingų žmogaus imunoglobulinų oponizuotų bakterijų apibūdinimu ateityje leis ištirti aktyvias bakterijas, kurių nepaiso imuninė sistema, taip pat tas, kurios aktyviai auga, bet oponizuoja skirtingi Ig tipai. Mes tikime, kad tai suteiks svarbių įžvalgų apie šeimininko ir mikrobiotos sąveiką tiek sveikomis, tiek su ligomis susijusiomis sąlygomis.

Galiausiai aprašome mikrobiotos šerdies buvimą šešių sveikų savanorių mėginių išmatose. Šiame branduolyje yra taksonų nariai, jau aprašyti ankstesniuose darbuose; tačiau, analizuojant aktyviųjų ar S-IgA padengtų bakterijų dalis, paaiškėja, kad yra kitų „svarbių“ taksonų, kurie anksčiau nebuvo matomi. Pavyzdžiui, mes nustatėme, kad be jau žinomų žarnyno mikrobiotos branduolio narių, tokių kaip firmicutai ir bakteroidatai , svarbų vaidmenį gali vaidinti ir kitos aktyvios bakterijos, tokios kaip Actinobacteria ir Proteobacteria (įskaitant Sphingomonadaceae ir Moraxellaceae šeimų gentis). žarnyno homeostazėje, kuri dar turi būti išsiaiškinta.

Metodai

Mėginiai ir frakcijos

Mėginiai buvo paimti iš šešių sveikų savanorių (nuo 20 iki 36 metų, trijų vyrų ir trijų moterų), kurie buvo identifikuoti kaip V1, V2, V3, V4, V5 ir V6. Visi dalyviai išreiškė susidomėjimą dalyvauti šiame tyrime pasirašydami informuoto sutikimo formą, patvirtintą Valensijos (Ispanija) Visuomenės sveikatos tyrimų centro (CSISP) Etikos ir tyrimų komiteto. Viena iš pagrindinių pašalinimo sąlygų buvo ta, kad per pastaruosius du mėnesius prieš mėginių ėmimą nebuvo skiriama jokių antibiotikų. Nė vienas iš savanorių neturėjo organinių žarnyno sutrikimų. Visi savanoriai laikosi Viduržemio jūros dietos.

Kiekviename išmatų mėginyje mes ištyrėme išmatų suspensijos (FS), aktyviųjų bakterijų (Act) ir S-IgA dengtų bakterijų frakcijų (IgA) taksonominį pasiskirstymą.

Norėdami išsaugoti RNR, savanoriai išmatų medžiagas rinko steriliose 30 ml talpyklėse su užsukamu dangteliu (25690 mm; PP SPOON; DELTALAB), kuriose yra 8 ml RNAlater (Ambion # AM7020). Mėginiai buvo laikomi –25 ° C temperatūroje, per artimiausias 24 valandas buvo pristatyti į laboratoriją ir nedelsiant apdoroti. Iš kiekvieno mėginio išmatų medžiaga buvo pakartotinai suspenduota sukant (2 min.). Jis du kartus buvo plaunamas fiziologiniu tirpalu (NaCl 0, 9%). Išmatų suspensija buvo centrifuguota (800 g) 2 minutes, kad susikauptų dideli agregatai. Tada supernatantas buvo centrifuguotas 7500 g 7 minutes, kad būtų galima surinkti mikrobų ląsteles iš išmatų suspensijos. Granulės du kartus plaunamos fiziologiniu tirpalu (NaCl 0, 9%). Ląstelės buvo nedelsiant fiksuotos, pridedant 1/10 tūrio 37% formaldehido (galutinė koncentracija: 3, 7%) ir inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje. Fiksuotos ląstelės buvo plaunamos du kartus, kad būtų pašalintas likęs formaldehidas, ir vėl suspenduotos 0, 1 ml fiziologinio tirpalo. Įlašinus 1 tūrio procentą absoliutaus etanolio, mėginiai buvo laikomi –20 ° C temperatūroje. Iš kiekvieno ankstesniame etape laikomo mėginio buvo gautos trys frakcijos. Pirmame alikvote esanti DNR buvo ekstrahuota prieš srauto citometrijos veiksmus (FS frakcija). Antroji ir trečioji frakcijos buvo gautos rūšiuojant srauto citometriją. Taigi gavome: aktyviąją populiaciją pagal RNR kiekį ir S-IgA padengtą populiaciją, naudodami anti-žmogaus IgA imunoglobuliną. Norėdami dažyti ir tekėti citometrijos protokolams, fiksuotos ankstesnių pakopų ląstelės buvo plaunamos ir praskiedžiamos, kad būtų gautas optinis tankis (OD 600) maždaug 0, 2, naudojant fiziologinį tirpalą.

Dažymas

Ląstelių ženklinimas ir srauto citometrinis rūšiavimas

Prieš rūšiuojant, ląstelių suspensijos buvo suskaidytos ultragarsu ir filtruojant, todėl ląstelės laisvai bėgo į mikrofluidinę sistemą (žr. SI 3 paveikslą). Dešimt mikrolitrų Y-pironino (Sigma-Aldrich, # P9172, 10 mg / ml), praskiesto iki 100 μM, į mėginius (1 ml tūrio) buvo dedama visam RNR dažymui ir inkubuojama 1 valandą 4 ° C temperatūroje. Mėginiai buvo nudažyti SYTO62 (Invitrogen, # S11344) pagal gamintojo instrukcijas (galutinė koncentracija 0, 5 μM), kad būtų galima atskirti bakterijas nuo triukšmo srauto citometrijos metu pagal jų DNR kiekį. S-IgA padengtas bakterinis dažymas buvo atliktas naudojant anti-žmogaus IgA, pažymėtą FITC (Invitrogen, # 62-7411). Izotipo kontrolei buvo naudojamas anti-pelės IgA, paženklintas FITC (Invitrogen, # M31001) (žr. Papildomą informaciją, 3 ir 4 paveikslai).

Srauto citometrinis rūšiavimas buvo atliktas naudojant „MoFlo ™ XDP Cell Sorter“. Šviesos šaltiniai buvo argono 488 nm (mėlynas) lazeris (200 mW galia) ir 635 nm (raudonas) diodų lazeris (25 mW galia). Lazeriai buvo išlyginti naudojant „ Flow-Check ™“ (10 μm) ir „ Flow-Set ™“ (3 μm). Citometro emisijos filtras buvo 520/30 (FL1), 580/30 (FL2) ir 680/30 (FL4), gaunantys atitinkamai FITC, Pyronin Y ir SYTO62. Trigeris buvo nustatytas ant šoninio pasklidimo.

DNR ekstrahavimas ir sekos nustatymas

DNR ekstrahavimas iš visų frakcijų buvo atliktas naudojant CTAB metodą 50 . Bendras 16S rDNR buvo amplifikuotas iš kiekvienos frakcijos, naudojant 8F ir 530R universaliuosius bakterijų 51 pradmenis, naudojant multipleksinius identifikatorius (MID, Papildoma informacija, 2 lentelė). Iš kiekvienos frakcijos / mėginio gauti PGR produktai buvo išgryninti „Nucleofast 96“ PGR filtrų plokštelėmis (Macherey Nagel # 74310050), o koncentracijos buvo išmatuotos PicoGreen tyrimu. Produktai buvo sujungti, gaunant subalansuotas galutines koncentracijas, ir padalijami naudojant 454 GS-FLX pirosequencerį (Titanium chemija, Roche).

Bioinformatika

Obtained sequences were trimmed from the end in sliding windows of 10 nucleotides when the average quality value was lower than 20, using Prinseq (v0.19.4) software 52 . This considerably improved the quality of the reads, as the quality of pyrosequencing reads has been shown to dramatically decrease towards the end of the sequences 53 . All sequences shorter than 200 nucleotides were not considered. Taxonomic assignations were carried out using the RDP_classifier 54, and phylogenetic ranks were assigned when scores exceeded 0.8. Clustering was performed by the use of CD-HIT software 55 .

Percentage distributions of fractions coming from flow cytometry sorting (Act and IgA) were multiplied by the cell abundance rate of the sorted fraction with respect to the total amount of cells counted during the whole sorting (see Table 1 column “Fraction rate”). Percentage values of FS fractions remained unaltered.

Descriptive and statistical analyses were carried out with the R statistic environment using Vegan R package 56, 57 . Venn diagrams for pan-microbiota analysis were obtained using Vennerable R package 58 . Flow cytometry data were analysed using R package flowCore and flowViz from Bioconductor 59, 60, 61 .

Prisijungimo numeriai

Sequences were deposited in EMBL-EBI Sequence Read Archive (SRA) under study number ERP002046.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.