Su adeno susijęs viruso serotipas rh.10 pasireiškia stipriu raumenų tropizmu po gimdymo į pilvaplėvės ertmę mokslinės ataskaitos

Su adeno susijęs viruso serotipas rh.10 pasireiškia stipriu raumenų tropizmu po gimdymo į pilvaplėvės ertmę mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Taikomoji mikrobiologija
  • Genų terapija
  • Genetinis transdukcija
  • Transliaciniai tyrimai

Anotacija

Rekombinantinis su adeno susijęs virusas (rAAV) yra patraukli priemonė pagrindiniam mokslui ir transliacinei medicinai, įskaitant genų terapiją, dėl jo ląstelių ir organų keitimo universalumo. Ankstesnis darbas rodo, kad rAAV transdukcijos modeliai labai priklauso nuo vartojimo būdo. Remdamiesi šiuo ryšiu, mes iškėlėme hipotezę, kad intraperitoninis (IP) rAAV vartojimas sukuria unikalius audinių tropizmo modelius. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes ištyrėme 12 rAAV serotipų, turinčių sustiprinto žaliai fluorescencinio baltymo (EGFP) reporterio geną, transdukcijos efektyvumą 12 organų skydelyje po IP injekcijos. Mūsų duomenys rodo, kad IP administravimas pabrėžia transdukcijos modelius, kurie skiriasi nuo anksčiau praneštų intravaskulinių gimdymo būdų. Taikydamas šį metodą, rAAV efektyviai perduoda kepenis, kasą, skeleto raumenis, širdį ir diafragmą, nesukeldamas reikšmingų histopatologinių pokyčių. Pažymėtina, kad rAAVrh.10 parodė puikų raumenų transdukciją po IP vartojimo, pabrėždamas jo, kaip naujo į raumenis nukreipiančio vektoriaus, galimybes.

Įvadas

Per pastarąjį dešimtmetį rekombinantinis su adeno susijęs virusas (rAAV) buvo išplėtotas kaip galinga genų perdavimo priemonė, skirta naudoti tiek pagrindiniuose mokslinių tyrimų taikymuose, tiek klinikiniuose tyrimuose 1, 2 . Palyginti su kitais virusais, rAAV turi daug genų pristatymo pranašumų, įskaitant žemą imunogeniškumą ir genotoksiškumą, ilgalaikę genų ekspresiją, plataus audinio tropizmą ir aukštą transdukcijos efektyvumą in vivo 3, 4 .

rAAV gali veiksmingai perduoti daugelį organų, įskaitant kepenis, širdį, akis ir raumenis, o jo audinių pernešimo galimybės priklauso ir nuo vartojimo būdo, ir nuo nurodyto AAV kapsiido savybių. Kelios grupės parodė, kad vartojimo būdas yra antrinis AAV tropizmo veiksnys. Pavyzdžiui, po injekcijos į pilvaplėvės ertmę (IP), rAAV8 efektyviai persodina griaučių raumenis ir širdį, tuo tarpu pirmiausia kepenys perduoda kepenis po intraveninio (IV) vartojimo. Įdomu tai, kad Guo ir kt . parodė, kad intratekaliai rAAVrh.10 injekcija į juosmens cisterną sukelia transgeno išraišką 60–90% stuburo smegenų ląstelių 8 . Apskritai šie tyrimai rodo, kad po sisteminės ar vietinės injekcijos rAAV perduoda specifinius ir skirtingus organus. IP injekcija yra mažiau invazinė nei daugelio tipų vietinė injekcija ir gali sukelti mažiau humorinės imuninės reakcijos, palyginti su kitais vartojimo būdais, tokiais kaip intraveninė injekcija 9, 10, 11, 12 . Be to, naujausi tyrimai parodė, kad administruojant tam tikrus rAAV serotipus IP, transdukcijos efektyvumas yra palyginamas su kitais vartojimo būdais 9, 13, 14 .

Be vartojimo būdo, AAV kapsido savybės yra pagrindinis audinių tropizmo veiksnys. Tai yra naudinga, nes pastaraisiais dešimtmečiais buvo rasta daugybė AAV kapsidų, turinčių skirtingą transdukcijos modelį. Iš tų kapsidų pagrindiniams tyrimams ir klinikiniams tyrimams paprastai naudojami bent 12 rAAV serotipų: rAAV2, rAAV3b, rAAV5, rAAV6, rAAV6.2, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV rhesus (rh.) 8, rAAVrh.10., rAAVrh.39 ir rAAVrh.43 15 . Dar nebuvo pranešta apie išsamų šių serotipų transdukcijos modelių palyginimą po IP administravimo. Šiame tyrime mes palyginome visus 12 serotipų po IP injekcijos nuosekliomis sąlygomis. Tai leido identifikuoti saugius ir tinkamus rAAV serotipus, kurie bus naudojami ateityje atliekant pagrindinius ir klinikinius tyrimus, susijusius su IP administravimu.

Šis tyrimas yra pirmasis paskelbtas tropizmo modelių, kuriuos parodė 12 dažniausiai naudojamų AAV serotipų, tyrimas po IP injekcijos. Norėdami tai pasiekti, buvo įvertinti transdukcijos efektyvumo skirtingi rAAV kapididai, turintys sustiprintą žaliai fluorescencinio baltymo (EGFP) reporterio geną, ir palyginti jų saugumo profiliai. Šie atradimai sukuria naujas galimybes rAAV pagrįstų genų terapijos vektorių klinikinei plėtrai ir pateikia naujas strategijas, kaip gydyti ligas, susijusias su organais, kurie yra nustatomi kaip tam tikrų AAV kapsidų pirminiai taikiniai.

Rezultatai

po IP perdavimo rAAV tvirtai kerta kepenis, kasą, skeleto raumenis, širdį ir diafragmą.

Apskritai, rAAV 2, 3b, 5, 6 ir 6.2 serotipai visuose 12 tirtų organų (kepenys, kasa, skeleto raumenys, širdis, diafragma, plaučiai, inkstai, blužnis, skrandis) nuolat rodė silpną EGFP ekspresiją ir mažas vektoriaus genomo kopijas vienoje ląstelėje. žarnynas, šlapimo pūslė ir smegenys; 1–12 pav.).

Priešingai nei ankstesnėse publikacijose, tiriančiose IV rAAV vartojimą, rAAV9 ir rAAV7 parodė stipriausią EGFP ekspresiją kepenyse; stebėtinai, rAAV8 pernešė šį organą silpnesniu nei bet kurio iš šių serotipų lygiu, ir tai rodo, kad IP administracija daro įtaką tropizmui 16 . Iš tikrųjų rAAV8 buvo vienas silpniausių kepenų keitiklių iš visų tirtų serotipų, remiantis EGFP intensyvumu (1A pav., 1 pav., 1 pav.). Priešingai, rAAV8 parodė stipriausią kasos transdukciją, sukurdamas maždaug 30% didesnį EGFP intensyvumą, palyginti su kitu stipriausiu serotipu rAAVrh.39. Šie rezultatai rodo, kad į IP perduodamas rAAV8 gali būti patrauklus pasirinkimas kuriant į kasą nukreiptus genų pernešimo vektorius, kurie gali būti naudingi gydant tokias ligas kaip I tipo diabetas (1B pav., 2 pav., 2 pav.). RAAV8 veikimas kasoje atitiko ankstesnes publikacijas 17 .

Image

PBS ir rAAV gydytų pelių kepenų ( A ), kasos ( B ), skeleto raumenų ( C ), širdies ( D ) ir diafragmos ( E ) fluorescenciniai vaizdai, EGFP intensyvumas ir vektoriaus genomo kopijų kiekybinis įvertinimas.

Visas dydis

Toliau išanalizavome skeleto raumenų transdukciją. rAAVrh.10 parodė patikimiausią skeleto raumenų transdukciją, atidžiai stebėdamas rAAVrh.8 ir rAAV8 (1 pav. C, 1 pav., 3 pav.). „rAAVrh.10“ taip pat parodė stipriausią EGFP išraišką širdyje ir diafragmoje (1D ir E pav., 4 ir 5 pav.), kas rodo, kad rAAVrh.10 rodo puikų raumenų taikymą po IP vartojimo. rAAVrh.10 parodė santykinai silpną kitų audinių, tokių kaip smegenys, transdukciją (11 pav., 11 pav.), kuris, atrodo, prieštarauja šio serotipo transdukcijos modeliams po IV vartojimo 18 .

rAAV rodo puikų saugos profilį

Vienas rūpesčių, susijusių su virusų sukeltu genų tiekimu, yra saugumas, ypač susijęs su ląstelių sukeltu imuniniu atsaku. Virusiniai vektoriai gali sukelti į kepenis nukreiptą imuninį atsaką, dėl kurio gali būti pažeistos ląstelės. Tačiau tai taip pat gali paveikti visą organizmą bendresniu būdu.

Pakaitiniai žymekliai alanino aminotransferazė (ALT) ir aspartato aminotransferazė (AST) išsiskiria iš pažeistų kepenų ląstelių, daugiausia dėl T ląstelių atsako indukcijos 19 . Todėl mes išmatuojome ALT ir AST lygį pelių, apdorotų skirtingais rAAV serotipais, serumuose. Nė vienas iš šiame tyrime išbandytų rAAV serotipų, apibūdintų naudojant vektoriaus dozę, neparodė jokių reikšmingų transaminazių lygio pokyčių (2 pav. F). Kadangi šis pirminis patikrinimas rodo tik toksiškumą kepenims, neatsižvelgiant į priežastinį veiksnį, tada saugos įvertinimui taikėme antrą, išsamesnį metodą. Konkrečiai, kelių organų, įskaitant širdį, diafragmą, skeleto raumenis, kasą ir kepenis, audinių mėginiai buvo dažomi, kad būtų galima vizualizuoti CD4 + ir CD8 + ląsteles, siekiant nustatyti, ar rAAV transdukcija po IP injekcijos yra susijusi su imuninių ląstelių infiltracija. Panašiai kaip su PBS apdorotomis pelėmis, pelėms, gaunančioms rAAV, nebuvo aptikta jokių CD4 + ar CD8 + ląstelių (2A – E pav.), Kas rodo, kad rAAV IP administravimas turi puikų saugumo profilį.

Image

Pelių kepenų ( A ), kasos ( B ), griaučių raumenų ( C ), širdies ( D ) ir diafragmos ( E ) dažymas HE, CD4 ir CD8. Visų 12 rAAV serotipų ( F ) serumo transaminazių kiekis. Skelbimas: adenovirusas. Balta rodyklė rodo teigiamą imuninių ląstelių infiltraciją.

Visas dydis

Diskusija

Viruso tarpininkaujamas genų perdavimas sulaukė didelio dėmesio tiek pagrindinių tyrimų, tiek transliacinės medicinos tyrėjų 20 . Tarp iki šiol sukurtų virusinių vektorių, rAAV pasižymi keletu patraukliausių genų pristatymo bruožų, įskaitant žemą imunogeniškumą, ilgalaikę transgeno ekspresiją ir mažą genotoksiškumą 3, 4 . Pastaraisiais dešimtmečiais buvo nustatyta dešimtys AAV serotipų, o kai kurie iš jų buvo sukurti kaip viruso vektoriai efektyviam genų tiekimui į skirtingus organus. Serotipai, rodantys viruso vektorių pažadą, yra rAAV2, rAAV3b, rAAV5, rAAV6, rAAV6.2, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAVrh.8, rAAVrh.10, rAAVrh.39 ir rAAVrh.43 15 . Šie serotipai rodo skirtingus transdukcijos efektyvumo ir audinių tropizmo modelius. Pavyzdžiui, rAAV8 ir rAAV9 efektyviai perneša kasą ir kepenis po intraveninės 5, 6 injekcijos, tuo tarpu rAAV6.2 ir rAAV7 rodo tvirtą pelės prostatos ląstelių transdukciją in vivo po intraprostatinės injekcijos 15 .

Palyginti su kitais pristatymo būdais, IP administravimas turi keletą privalumų, įskaitant techninį paprastumą, minimalų humoralinio imuninio atsako indukciją ir galimybę pasiekti ilgalaikę transgeno ekspresiją 9, 11, 12 . Lei Xu ir kt . panaudoti IP švirkščiami virusiniai vektoriai, skirti FKRP genų terapijai, siekiant atkurti α-distroglikano funkcinį glikozilinimą ir pagerinti raumenų funkciją esant FKRP susijusiai raumenų distrofijai 21 . Kitame ikiklinikiniame tyrime Kok ir kt . išgelbėjo naujagimių argininosukcinatų sintetazės deficito pelių mirtingumą 14 . Klinikoje kiaušidžių vėžiu sergantiems pacientams gydyti buvo pateiktas modifikuotas adenoviruso vektorius su E1B 55-kd geno delecija.

Įdomu tai, kad Wang ir kt . įvertino rAAV transdukcijos efektyvumą atlikus rAAV 1, 2, 5, 6, 7 ir 8 injekciją per IP ir nustatė, kad rAAV8 rodo stipriausią širdies ir griaučių raumenų 6 transdukciją. Tačiau mūsų išvados rodo, kad rAAVrh.10 yra pranašesnis už rAAV8 perduodant širdies, diafragmos ir griaučių raumenis. Tiesą sakant, mūsų rankose rAAV8 užima trečią vietą perkeliant raumenis, kas rodo, kad rAAVrh.10 gali būti naujas pagrindinis rAAV kandidatas, nukreipiantis raumenis pacientams, turintiems su raumenimis susijusių sutrikimų.

Be serotipo, vartojimo būdas yra svarbus veiksnys nustatant transdukcijos charakteristikas. Zincarelli ir kt . įvertino 1–9 serotipų rAAV transdukcijos efektyvumą ir tropizmą, pagrįstą luciferazės reporterio geno ekspresija po IV injekcijos, ir nustatė, kad rAAV9 yra pagrindinis raumenų transdukcijos vektorius 23 . Nors sąlygos skyrėsi nuo mūsų tyrimo, mes parodėme, kad rh.10 gali būti naujas pagrindinis raumenų transdukcijos vektorius taikomoms programoms, naudojančioms IP administravimą, nes šiame kontekste jis pranoko rAAV9. Be to, Gao ir kt . pranešė, kad rAAV8 transdukcijos efektyvumas buvo žymiai didesnis nei rAAV7 po intraportalinės injekcijos 24 . Vėlgi, sąlygos skyrėsi nuo mūsų tyrimo. Tačiau mūsų tyrimas parodė, kad po IP injekcijos rAAV7 kepenis pernešė efektyviau nei rAAV8 (1 pav. Ir 1 pav.). Visi šie duomenys rodo, kad vartojimo būdas daro įtaką rAAV transdukcijos efektyvumui ir tropizmui kepenyse.

Taip pat gavome fluorescencinius organų kolekcijos vaizdus su vienoda ekspozicijos trukme per visus serotipus, kad būtų išvengta paklaidų. Kai kurie serotipai esant tokioms sąlygoms mūsų vaizduose neparodė akivaizdaus EGFP signalo, net jei šie organai iš tikrųjų buvo perduoti rAAV vektoriais: kepenis keitė rAAV8, griaučių raumenis keitė rAAV9, o kasą - rAAV7.

Rezultatai, gauti naudojant pagrindinius rAAV serotipus IP, patvirtina rAAV8 pranašumą perduodant kasą (1B pav. Ir 2 pav., 2 pav.) 17 . Svarbiausia, kad mūsų tyrimas rodo, kad po IP vartojimo rAAVrh.10 yra efektyviausias serotipas, nukreipiantis į raumenų audinius, įskaitant griaučių raumenis, širdį ir diafragmą (1 pav. C, D, E ir reikmenys. 3, 4 pav.). ir 5). Šios išvados rodo, kad rAAVrh.10 yra pagrindinis vektorius kandidatas, skirtas naudoti su šiais audiniais. Iš tiesų, rh.10 polinkis perduoti raumenis yra labai svarbus su raumenimis susijusiems sutrikimams. Tai leidžia nukreipti raumenis ir efektyviai atlikti transdukciją, nereikia daugkartinių injekcijų į raumenis, kuri diafragmos atveju būtų labai invazinė; taip pat išvengiama intravaskulinės injekcijos, kad būtų galima išduoti rAAV, dėl ko tuo pačiu metu nukreipiami įvairūs nepageidaujami organai, tokie kaip smegenys, kepenys ir žarnos (1 pav., 9 ir 11 pav., 18 pav.). Nepaisant to, norint nustatyti optimalias rAAV dozes, reikalingas skirtingiems tiksliniams audiniams, norint gydyti tokius sutrikimus kaip Duchenne raumenų distrofija, reikalingi konkretūs taikymo tyrimai. Be to, norint įvertinti šio požiūrio pritaikomumą, būtina atlikti tyrimus su dideliais gyvūnais. Tokių tyrimų rezultatai pateiks papildomas rekomendacijas renkantis rAAV serotipus su specifiniais audinių taikymo modeliais naudoti in vivo .

Šiame tyrime mes įvedėme rAAV 1 × 10 12 GC doze per IP injekciją. Remiantis vidutiniu 8 savaičių amžiaus pelės svoriu (23 g), ši dozė yra lygi 4, 35 × 10 13 GC / kg. Nors atrodo, kad ši dozė yra didelė, ikiklinikinių tyrimų su šunimis, naudojant pusiau sisteminį intraportalinį rAAV8 vartojimą, duomenimis, saugus 4, 95 × 10 13 GC / kg švirkštimas patvirtina mūsų dozės saugumą ir pagrįstumą 26 . Įdomu tai, kad Chuhong Hu ir kt . pranešė, kad mažesnė rAAVrh.10 dozė (2 x 10 10 naujagimio pelėms) sukėlė stiprią griaučių raumenų transdukciją; tačiau šiame tyrime buvo naudojamas IV gydymas ir pelės buvo tiriamos jaunesniame amžiuje, nei čia naudojamos 27 .

Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad rAAV administravimas IP suteikia pusiau sisteminį vartojimo būdą, sukuriantį unikalius rAAV tropizmo modelius, kai transdukcija yra tvirta tam tikruose tiksliniuose audiniuose ir tuo pačiu metu ribojama kituose, kurie nėra terapinės svarbos. Be to, IP skiriant rAAV, gaunamas puikus saugumo profilis, be aptinkamo ląstelinio imuninio atsako. Galiausiai mes parodėme, kad rAAVrh.10 yra pranašesnis už visus anksčiau praneštus skeleto, diafragmos ir širdies raumens pernešimo vektorius, kai jie skiriami per IP injekciją.

Medžiagos ir metodai

RAAV vektorių gamyba

rAAV vektoriai buvo gauti naudojant standartinį trigubo transfekcijos metodą, kaip aprašyta anksčiau 28 . Gamyboje naudota cis plazmidė užkodavo EGFP ekspresijos kasetę, kurią varo visur išreikštas vištienos β-aktino (CBA) promotorius.

AAV titravimas

Virusai buvo išgryninti ultracentrifuguojant cezio chlorido (CsCl) gradientu. Išgryninti virusai buvo titruojami tiek kiekybine polimerazės grandinine reakcija (qPCR), tiek dažant sidabru. Norint išmatuoti sidabro dažymą, išgrynintų virusų kapsidiniai baltymai buvo palyginti su standartiniais kapsidų mėginiais, kad būtų nustatytas baltymų dažymo tankis. QPCR atveju EGFP nešanti plazmidė buvo praskiesta, kad būtų sukurta standartinė kreivė, o virusai titruojami naudojant Ct reikšmes. Kiekvienam serotipui buvo tiriami du skirtingi viruso preparatai.

Tyrimai su gyvūnais

Aštuonių savaičių C57BL / 6 pelės buvo gautos veisiant namie. Iš viso 1 × 10 12 genomo kopijų (GC), praskiestos 100 μL fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) arba tokio paties tūrio PBS be viruso dalelių, buvo pristatytos per IP (n = 4). Visi eksperimentiniai metodai buvo atlikti laikantis atitinkamų gairių. Visus tyrimų su gyvūnais protokolus patvirtino Masačusetso universiteto medicinos mokyklos institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

EGFP signalo analizė

Pelės organai buvo surinkti praėjus 3 savaitėms po IP injekcijos ir fiksuoti 10% buferiniame formaline per naktį 4 ° C temperatūroje. Tada jie iš eilės buvo dehidratuojami 10%, 20% ir 30% sacharozėje per naktį 4 ° C temperatūroje. Mėginiai buvo įterpti į optimalios pjovimo temperatūros (OCT) junginį (Sakura Finetek, Torrance, CA, JAV) ir laikomi –80 ° C temperatūroje. Tada 8 μm storio krio-sekcijos buvo sumontuotos su buferiu, turinčiu DAPI, ir EGFP signalai buvo stebimi fluorescenciniu mikroskopu. EGFP intensyvumai buvo gauti naudojant „Image J“ programinę įrangą ir normalizuoti atsižvelgiant į DAPI intensyvumą. Buvo nustatytas 100% didžiausias kiekvieno organo EGFP intensyvumas.

rAAV biologinio pasiskirstymo tyrimas

Audiniai buvo surinkti kambario temperatūroje (RT), greitai užšaldyti skystame azote ir laikomi –80 ° C temperatūroje. Bendra DNR buvo išgauta naudojant „QIAamp DNA Mini Kit“ (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Iš viso TaqMan qPCR buvo atliktas 100 nanogramų (ng) visos DNR, nukreiptas į EGFP koduojantį geną. rAAV genomo kopijos buvo apskaičiuotos palyginant su standartine kreive, sukurta naudojant linearizuotą plazmidę, koduojančią EGFP, ir normalizuota iki ląstelių skaičiaus, remiantis prielaida, kad kiekvienoje ląstelėje yra 2, 75 pikogramo (pg) visos DNR.

Histologinė analizė

Audiniai buvo fiksuojami 10% buferiniu formalinu per naktį kambario temperatūroje, įterpiami į parafiną ir pjaustomi iki 4 mikronų storio. Skyriai buvo dažyti hematoksilinu ir eozinu (HE) ir pavaizduoti naudojant šviesaus lauko mikroskopą (Leica, Buffalo Grove, IL, JAV).

Imunofluorescencinis dažymas

Pelės audiniai buvo fiksuojami 10% buferiniu formalinu per naktį 4 ° C temperatūroje, o po to iš eilės dehidratuojami 10%, 20% ir 30% sacharozėje per naktį 4 ° C temperatūroje. Mėginiai buvo įterpti į UŠT junginį (Sakura Finetek, Torrance CA, JAV) ir laikomi –80 ° C temperatūroje. Aštuonių mikronų storio kriografinės dalys buvo permeabiliuotos ir dvi valandas 37 ° C temperatūroje užblokuotos 5% galvijų serumo albuminu (BSA) ir 1% Triton X-100 1 × PBS. Skyriai buvo inkubuojami su pirminiais antikūnais prieš CD4 (praskiestas santykiu 1: 100, kat. Nr. 14-0041-82, eBioscience, San Diegas, CA, JAV) ir CD8a (praskiestu santykiu 1: 100, kat. Nr. 14-0081-82, eBioscience, San Diege, CA, JAV) per naktį 4 ° C temperatūroje ir toliau inkubuojamas su antriniais antikūnais (Life Technologies) 1 valandą kambario temperatūroje tamsoje. Galiausiai skyriai buvo sumontuoti su VECTASHIELD montavimo terpe, kurioje yra DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, JAV).

Serumo ALT ir AST tyrimai

Kraujas buvo surinktas iš kraujavimo iš veido venų prieš injekciją į pilvaplėvės ertmę ir po jos 1, 2 ir 3 savaites, o serumas buvo atskirtas iš BD (Franklin Lakes, NJ, JAV) naudojant Microtainer mėgintuvėlį su serumo separatoriumi (katė Nr. Alanino aminotransferazės (ALT) ir aspartato aminotransferazės (AST) lygiai buvo analizuojami naudojant atitinkamai ALT kolorimetrinio baigties rinkinį (kat. Nr. A526) ir AST kolorimetrinio baigties rinkinį (kat. Nr. A561) iš TECO Diagnostics (Anaheim, CA, JAV). gamintojo instrukcijos.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį: Ai, J. et al . Adeno-viruso serotipas rh.10 pasireiškia stipriu raumenų tropizmu po gimdymo į pilvaplėvės ertmę. Mokslas. Rep. 7, 40336; „doi“: 10.1038 / srep40336 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomos figūros ir legendų lentelės

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.