Adiponektinas slopina į insuliną panašaus augimo faktoriaus-1 sukeltą ląstelių migraciją slopindamas tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės 1/2 aktyvaciją, bet nedalyvauja kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse | hipertenzijos tyrimai

Adiponektinas slopina į insuliną panašaus augimo faktoriaus-1 sukeltą ląstelių migraciją slopindamas tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės 1/2 aktyvaciją, bet nedalyvauja kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse | hipertenzijos tyrimai

Anonim

Anotacija

Siūloma, kad adiponektinas, iš adipocitų gaunamas hormonas, turėtų antiaterogeniškas savybes, nes slopina įvairius augimo faktorius. Į insuliną panašus augimo faktorius-1 (IGF-1) yra vienas iš stiprių mitogenų, kuris, kaip manoma, vaidina svarbų vaidmenį tiek aterogenezėje, tiek stabilizuojant apnašas, atsižvelgiant į aterosklerozės fazę. Šio tyrimo tikslas yra išaiškinti adiponektino poveikį IGF-1 sukeltai ląstelių migracijai ir jo tarpląsteliniams signalų keliams kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse (VSMC). Šiame tyrime mes įvertinome ląstelių migraciją ir keletą kinazės aktyvumų auginamose žiurkių aortos lygiųjų raumenų ląstelėse (RASMC). Išankstinis gydymas adiponektinu slopino IGF-1 sukeltą ląstelių migraciją ir tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) 1/2 aktyvaciją, kuri yra viena iš pagrindinių IGF-1 sukeltų ląstelių migracijos tarpininkų. RASMC adiponektinas ir 5-aminoimidazol-4-karboksamido ribosidas (AICAR), 5'-AMP aktyvuotos baltymų kinazės (AMPK) aktyvatorius, stimuliavo AMPK aktyvaciją. AMPK aktyvavimas AICAR slopino IGF-1 sukeltą ERK1 / 2 aktyvaciją ir ląstelių migraciją RASMC. Kita vertus, Akt ir Bad, proapoptotinių Bcl-2 šeimos molekulių fosforilinimas, kurį padidino IGF-1 stimuliacija, nesumažino išankstinio apdorojimo adiponektinu. Parodyta, kad adiponektinas slopina IGF-1 sukeltą VSMC migraciją slopindamas ERK1 / 2 aktyvaciją, kuri gali būti susijusi su AMPK aktyvinimu. Be to, adiponektinas selektyviai slopina IGF-1 stimuliuojamą ERK1 / 2 kelią, o ne Akt – Bad kelią. Iš šių išvadų buvo numanoma, kad adiponektinas slopino IGF-1 sukeltą VSMC migraciją ir jo signalinį selektyvumą.

Įvadas

Adiponektinas yra naujas iš adipocitų pagamintas hormonas, kuris, kaip teigiama, vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant energijos homeostazę ir jautrumą insulinui. 1 Adiponektinas formuoja homomultimerus nuo trimerių ir heksamerų iki didelės molekulinės masės (HMW) multimerų. Keliuose epidemiologiniuose tyrimuose buvo pranešta, kad adiponektinas, ypač HMW, turi savybių prieš širdies ir kraujagyslių ligas. Japonijos atvejo ir kontrolės tyrimas parodė, kad hipoadiponektinemija sergantys pacientai parodė padidėjusią vainikinių arterijų ligų riziką ir įvairius metabolinius rizikos veiksnius. 3 Be to, perspektyvinis tyrimas patvirtino, kad didelė adiponektino koncentracija serume yra susijusi su sumažėjusia ūminio miokardo infarkto rizika vyrams. Manoma, kad pagrindinė daugelio mirtinų širdies ir kraujagyslių ligų priežastis yra aterosklerozė, todėl svarbu išsiaiškinti adiponektino antiaterogeniškas savybes. Adiponektino poveikis kovojant su ateroskleroze iš tikrųjų pateikiamas in vivo tyrimais, kuriuose dalyvavo adiponektino neturinčios pelės. 5, 6 Buvo pranešta, kad reaguojant į mechaninius kraujagyslių pažeidimus, adiponektino išstūmimo pelėms pasireiškė didelis neoimalinis sustorėjimas ir padidėjęs kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių (VSMC) proliferacija. 5, 6 Tyrimais in vitro nustatyta, kad adiponektinas slopina aukštos gliukozės sukeltas reaktyviąsias deguonies rūšis kraujagyslių endotelio ląstelėse suaktyvindamas 5′-AMP aktyvuotą baltymų kinazę (AMPK), kuri yra žinoma kaip pagrindinė molekulė. stimuliuojamas adiponektino. 7 Kitas tyrimas parodė, kad adiponektinas slopino kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus sukeltą žmogaus vainikinių arterijų endotelio ląstelių migraciją per AMPK kelią. Šie tyrimai patvirtino antiaterogeniškas adiponektino savybes.

Manoma, kad ankstyvajame aterogenezės etape VSMC migracija vaidina lemiamą vaidmenį. VSMC migraciją skatina įvairūs uždegiminiai citokinai ir chemokinai. Į insuliną panašus augimo faktorius-1 (IGF-1) yra žinomas kaip stiprus mitogenas, sukeliantis VSMC migraciją ir proliferaciją. 9 Kelios ataskaitos nurodė, kad IGF-1 sukelta VSMC migracija yra susijusi su aterosklerozės patogeneze. Įrodyta, kad IGF-1 lygis serume yra didesnis hipertenzija sergantiems pacientams, kuriems yra miego arterijos apnašos, nei hipertenzija sergantiems pacientams, kuriems nėra plokštelių ar normatyvinio kontrolės. Dominuojančio-neigiamo IGF-1 receptoriaus ekspresija žiurkės miego arterijose slopino neoimalinį formavimąsi po baliono angioplastikos, slopinant VSMC migraciją ir proliferaciją. Šios ataskaitos atskleidė, kad IGF-1 skatino aterogenezę, sukeldamas VSMC migraciją. Atrodo, kad IGF-1 sukeltos VSMC migracijos reguliavimas ar kontrolė yra veiksminga aterosklerozės progresavimo prevencijai. Todėl yra daug pranešimų apie tarpląstelinius signalų perdavimo būdus, susijusius su IGF-1 sukeltomis ląstelių migracijomis, pavyzdžiui, baltymų kinazės C, Nox4 ir Rac1. 9, 12, 13, 14 pranešama, kad IGF-1 sukeltai ląstelių migracijai reikėjo tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) 1/2 aktyvacijos ir p38 mitogeno aktyvuoto baltymo (MAP) kinazės kaip vienos iš pagrindinių mediatorių. 9, 15 ERK1 / 2 aktyvacijos pasibaigimas naudojant antisense oligonukleotidą slopino IGF-1 sukeltą VSMC migraciją ir proliferaciją. 9 Jis pasiūlė, kad ERK1 / 2 žemas reguliavimas buvo efektyvus norint kontroliuoti VSMC migraciją. Tuo tarpu IGF-1 receptorių aktyvacija slopino oksiduotos mažo tankio lipoproteinų sukeltą apoptozę per fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) / Akt signalizacijos kelią VSMC. Taip pat buvo pranešta, kad IGF-1 fosforilina Badą, proapoptotinę Bcl-2 šeimos molekulę, aktyvindamas PI3K / Akt kelią. Taigi laikoma, kad IGF-1 sukelia keletą ląstelių funkcijų VSMC.

Buvo pranešta, kad adiponektinas slopina trombocitų sukeliamą augimo faktorių (PDGF) arba hepariną surišantį į epidermio augimo faktorių panašų augimo faktorių (HB-EGF) sukeliamą VSMC migraciją. 18 Šiame tyrime buvo pasiūlyta, kad adiponektinas iš dalies slopina šių augimo veiksnių signalą, gautą po ERK1 / 2, po receptorių. 18 Tačiau dar nėra išsiaiškinta, ar adiponektinas silpnina IGF-1 sukeltą VSMC migraciją, ar turi įtakos jo tarpląsteliniams signalizacijos keliams. Šiame tyrime mes ištyrėme adiponektino poveikį IGF-1 sukeltai ląstelių migracijai ir tarpląsteliniam signalizacijos keliui išaugintose žiurkių aortos lygiųjų raumenų ląstelėse (RASMC).

Metodai

Ląstelės ir medžiagos

RASMC buvo išskirti iš 200–250 g sveriančių „Sprague – Dawley“ žiurkių patinų ir palaikomi 10% vaisiaus galvijų serumo ir Dulbecco modifikuotos Eagle terpės (DMEM), kaip aprašyta anksčiau. 19 ląstelių buvo pasėtos (1–2 × 104 ląstelių / cm 2 ) ir išaugintos iki subkonfluencijos 60 mm kultūriniuose induose (IWAKI, Chiba, Japonija) DMEM – 10% FBS. Eksperimentams buvo naudojamos ląstelės iš 3–8 pasalų po 24–48 val. Žmogaus rekombinantinis IGF-1 buvo įsigytas iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO, JAV). Pelių pilno ilgio adiponektinas, rekombinantinis baltymas, buvo įsigytas iš bendrovės „Biovendor Laboratory Medicine Inc.“ (Modrice, Čekija). Fosfo-ERK1 / 2 antikūnas (Thr 202 / Tyr 204 ), fosfo-p38 MAP kinazės antikūnas (Thr 180 / Tyr 182 ), fosfo-Akt antikūnas (Ser 473 ), fosfo-Bad antikūnas (Ser 136 ), fosfo-AMPKα ( Antras antikūnas, Akt antikūnas ir AMPKα antikūnas buvo įsigyti iš „Cell Signaling Technology Inc.“ (Beverlis, MA, JAV). ERK1 / 2 antikūnas ir buvo įsigytas iš „Santa Cruz Biotechnology Inc.“ (Santa Krusas, Kalifornija, JAV). Blogas antikūnas buvo įsigytas iš „BD Biosciences“ (San Chosė, CA, JAV). AMPK aktyvatorius, 5-aminoimidazol-4-karboksamido ribozidas (AICAR), buvo įsigytas iš Calbiochem (San Diegas, CA, JAV). MEK1 / 2 inhibitorius, PD98059, buvo iš Wako Pure Chemical Industries Ltd (Osaka, Japonija). Visos kitos cheminės medžiagos buvo reagento kokybės, gautos iš komercinių šaltinių ir buvo naudojamos be papildomo valymo.

Ląstelių migracija

Ląstelių migracijai įvertinti modifikuotas Boydeno kameros tyrimas buvo atliktas šiek tiek modifikuojant anksčiau aprašytą metodą. 19 Tyrimas atliktas naudojant Transwello kameras (6, 5 mm, modelis 3422; Costar, Kembridžas, MA, JAV) su 8 μm polikarbonato membrana. Polikarbonato membranos apatinė dalis buvo padengta 5 μg ml −1 kolageno I žiurkės uodega (3, 78 mg ml −1, modelis 35-4236; Bendradarbiavimo biocheminiai produktai, Bedfordas, MA, JAV) per naktį 4 ° C temperatūroje. Vėliau apatinė kamera 30 min. Kambario temperatūroje užblokuota DMEM / 0, 1% galvijų serumo albumino. Augimo sustabdytos ląstelės buvo surinktos, nuplautos ir suspenduotos DMEM serume, kuriame nėra serumo. Ląstelės buvo dedamos į viršutinę Transvelio kamerą 5 x 105 ląstelėmis po 100 μl / duobutėje. Iš viso į apatinę kamerą buvo įpilta 600 μl serumo neturinčio DMEM, po to 30 min. 37 ° C temperatūroje iš anksto apdorotą su adiponektinu, PD98059, SB203580 arba AICAR arba be jo, po to apdorojant IGF-1 arba be jo. apatinėje kameroje, ir ląstelėms buvo leista migruoti 37 ° C temperatūroje. Po 6 valandų inkubacijos, nemigracinės ląstelės buvo pašalintos iš viršutinio membranos paviršiaus, iškasant medvilniniais tamponais. Membrana pritvirtinta metanoliu, nudažyta Diff-Quik tirpalu (Baxter, McGaw Park, IL, JAV) ir leista išdžiūti kambario temperatūroje. Vėliau membrana buvo iškirpta iš plastikinių atramų aštriu skalpeliu ir pritvirtinta ant stiklo stiklelio naudojant „Permount“ („Sigma Chemical“, Sent Luisas, MO, JAV). Migruotos ląstelės buvo suskaičiuotos padidinant x 400 kartų po 10 mikroskopo laukų kiekviename filtre.

Ląstelių lizato paruošimas imunoblotui ir Western blot analizei

Raminančios ląstelės buvo apdorotos IGF-1, adiponektinu, PD98059 ir AICAR arba be jų nurodytu laiku ir koncentracijomis. Vėliau inkubacinės terpės buvo išmetamos, o ląstelės lizuojamos ląstelių lizės buferiu (20 mmol l −1 Tris-HCl, pH 7, 4, 150 mmol l −1 NaCl, 1 mmol l −1 EDTA, 1 mmol l −1 EGTA ( etilenglikolio bis (β-aminoetileteris) - N, N, N ′, N ′, -tetraacto rūgštis), 1% Triton X-100, 2, 5 mmol l −1 natrio pirofosfatas, 1 mmol l −1 β-glicerofosfatas, 1 mmol 1 −1 natrio ortovanadatas, 1 μg ml −1 leupeptino ir 1 mmol l −1 fenilmetilsulfonilo fluoridas). Atšildžius, lizuotos ląstelės buvo perkeltos į mikrocentrifugos mėgintuvėlius, ultragarsu apdorotos („Handy Sonic UR-20 P; Tomy Seiko Co., Ltd“, Tokijas, Japonija) ant ledo ir centrifuguojamos 20 000 g 20 minučių 4 ° C temperatūroje. Supernatantų baltymų koncentracijos buvo išmatuotos naudojant baltymų analizės rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV) ir laikomos –80 ° C temperatūroje, kol bus atliktas imunoblotavimas.

Western blot analizei ląstelių lizatai buvo tiriami natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze, o baltymai buvo perkelti į nitroceliuliozės membranas (Hybond-ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglija, JK), kaip aprašyta anksčiau. Membranos buvo blokuojamos 1 val. Kambario temperatūroje su 5% galvijų serumo albuminu. Tada blotai buvo inkubuojami 12 valandų su anti-fosfo-specifišku ERK1 / 2, anti-fosfo-specifiniu AMPK, anti-fosfo-specifiniu Akt (Ser 473 ) ir anti-fosfo-specifiniu Bad antikūnu, po to inkubuojami 1 valandą. su antriniu antikūnu (konjuguota krienų peroksidaze). Imunoreaktyvios juostos buvo vizualizuotos naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham Pharmacia Biotech) ir buvo kiekybiškai įvertintos densitometrijos būdu tiesiniame filmo ekspozicijos diapazone, naudojant skaitytuvą UMAX Astra 2200 (UMAX Technologies, Fremontas, CA, JAV) ir ImageJ 1.31v programinę įrangą.

Statistinė analizė

Vertės pateikiamos kaip vidurkis ± sd iš eksperimentų, atliktų penkiais skirtingais atvejais. Reikšmingumui tarp grupių nustatyti buvo naudojama dvipusė dispersijos analizė, po kurios atskiroms grupėms palyginti buvo naudojamas modifikuotas t- testas su Bonferroni post hoc testu. Vertė P <0, 05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.

Rezultatai

Adiponektinas slopina IGF-1 sukeltą RASMC migraciją

Mes patvirtinome, kad IGF-1 padidino RASMC migraciją priklausomai nuo koncentracijos (1, 10 ir 100 ng ml −1 ) (1a pav.) Modifikuotu Boydeno kameros tyrimu, kaip aprašyta skyriuje „Metodai“. Pirminis gydymas PD98059 (10 μmol l −1, 30 min.), MEK1 / 2 inhibitoriumi arba SB203580 (10 μmol l −1, 30 min.), P38 MAP kinazės inhibitoriumi, slopino IGF-1 sukeltą RASMC migraciją į kontrolinę lygis (1a pav.). Norint ištirti, ar adiponektinas veikia IGF-1 sukeltą VSMC migraciją, augimo sustabdyti RASMC 30 min. Buvo gydomi adiponektinu (1 ir 10 μg ml −1 ) arba be jo, prieš stimuliavimą IGF-1 (100 ng ml −1, 6). h). Šiame tyrime mes panaudojome viso ilgio rekombinantą adiponektiną, kuris daugiausia egzistuoja kaip plazmoje. 20 Kaip parodyta 1b paveiksle, IGF-1 (100 ng ml −1 ) padidino RASMC migraciją (padidėjimas 1, 4 karto, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis), o išankstinis gydymas adiponektinu slopino IGF-1 sukeltą RASMC migraciją priklausomai nuo koncentracijos ( 1 ir 10 μg ml −1 ). Kaip buvo patvirtinta, kad IGF-1 sukeltą ląstelių migraciją, bent iš dalies, skatina ERK1 / 2 ir p38 MAP kinazės aktyvacija, kaip parodyta 1a paveiksle, mes atkreipėme dėmesį į adiponektino poveikį IGF-1 sukeltai ERK1 / 2 ir p38 MAP kinazės aktyvacija RASMC. Kaip parodyta 2 paveiksle, IGF-1 (100 ng ml −1, 10 min.) Stimuliuota ERK1 / 2 aktyvacija buvo smarkiai slopinama prieš pradedant gydymą adiponektinu (10 ir 30 μg ml −1 ). Tačiau IGF-1 sukeltas p38 MAP kinazės aktyvacija nebuvo slopinamas prieš tai gydant adiponektinu. Remiantis šiais rezultatais buvo teigiama, kad slopinantis adiponektino poveikis IGF-1 sukeltai RASMC migracijai buvo susijęs su ERK1 / 2 aktyvacijos slopinimu.

Image

IGF-1 sukelta RASMC migracija. a ) Nuo koncentracijos priklausomas IGF-1 sukeltos RASMC migracijos padidėjimas ir PD98059, MEK1 / 2 inhibitoriaus, arba SB203580, p38 MAP kinazės inhibitoriaus, poveikis. Ląstelės 6 valandas buvo apdorotos nurodyta PDGF koncentracija, iš anksto apdorojant PD98059 (10 μmol l −1, 30 min.) Arba SB203580 (10 μmol l −1, 30 min.). Ir vėliau buvo atliktas modifikuotas Boydeno kameros tyrimas, kaip aprašyta skyriuje „Metodai“. Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių migracijos padidėjimą (be gydymo IGF-1) iki 1, 0 (vertės yra vidurkiai ± sd, n = 5, * P <0, 05 vs. kontrolinės ląstelės, P <0, 05 vs IGF-1 100 ng ml −1 be adiponektino). ( b ) nuo adiponektino priklausomas IGF-1 sukeltos RASMC migracijos slopinimas. Ląstelės buvo apdorotos nurodyta adiponektino koncentracija 30 minučių prieš gydymą IGF-1 (100 ng ml −1 ) 6 valandas. Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių migracijos padidėjimą (be gydymo IGF-1) iki 1, 0 (vertės yra vidurkiai ± sd, n = 5, * P <0, 05, palyginti su IGF-1 100 ng ml −1). be adiponektino).

Visas dydis

Image

Adiponektino poveikis IGF-1 sukeltai ERK1 / 2 ir p38 MAP kinazės aktyvacijai RASMC. Ląstelės buvo apdorotos nurodyta adiponektino koncentracija 30 minučių prieš gydymą IGF-1 (100 ng ml −1 ) 10 minučių. Atliekant Western blot analizę su anti-ERK1 / 2 antikūnais arba anti-p38 MAP kinazės antikūnais, reikšmingų bendro ERK1 / 2 ir p38 MAP kinazės kiekių skirtumų nepastebėta. Viršutiniame skydelyje rodomas reprezentacinis taškas. Apatiniame grafike parodytas densitometrinės analizės rezultatas. Atidaryti stulpeliai rodo ERK1 / 2 aktyvaciją, o uždaryti stulpeliai rodo p38 MAP kinazės aktyvaciją. Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių densitometriją (laikas = 0, be IGF-1) iki 1, 0 (vertės yra vidurkiai ± sd, n = 5, * P <0, 05, palyginti su IGF-1 100 ng ml −1). adiponektinas).

Visas dydis

AMPK aktyvavimas slopina IGF-1 sukeltą ERK1 / 2 aktyvaciją ir ląstelių migraciją RASMC

Buvo pranešta, kad adiponektinas suaktyvina AMPK, kai keliose ląstelėse suaktyvinamas adiponektino receptorius. 21 Taigi, mes iškėlėme hipotezę, kad AMPK yra pagrindinė molekulė, sukelianti kryžminimą tarp adiponektino ir IGF-1 sukeltų tarpląstelinių signalų perdavimo kelių. RASMC, adiponektinas (10 μg ml −1 ) ir AICAR (1 mmol l − 1 ), AMPK aktyvatorius, AMPK aktyvuoja greitai, atitinkamai, 2, 3 ir 2, 5 karto, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis. C junginys (20 μmol l −1 ) reikšmingai slopino adiponektino sukeltą AMPK aktyvaciją. Tačiau IGF-1 neturėjo įtakos AMPK aktyvavimui RASMC (3a pav.). Kaip parodyta 3b paveiksle, IGF-1 sukelta ERK1 / 2 aktyvacija buvo slopinama prieš pradedant gydymą AICAR. Parodyta, kad AMPK aktyvacija susilpnino IGF-1 sukeltą ERK1 / 2 aktyvaciją RASMC. Be to, gydymas C junginiu atstatė IGF-1 adiponektino sutrikusią ERK1 / 2 aktyvaciją. Buvo pasiūlyta, kad slopinantį adiponektino poveikį IGF-1 sukeltai ERK1 / 2 aktyvacijai sąlygojo AMPK aktyvinimas. Kaip parodyta 3c paveiksle, buvo patvirtinta, kad AICAR slopina IGF-1 sukeltą RASMC migraciją. Šie rezultatai leido manyti, kad slopinantį adiponektino poveikį IGF-1 sukeltai ERK1 / 2 aktyvacijai sąlygojo AMPK aktyvinimas adiponektinu, sukeldamas RASMC migracijos slopinimą.

Image

AICAR, AMPK aktyvatoriaus, poveikis. a ) IGF-1 (100 ng ml −1, 10 min.), adiponektino (10 μg ml −1, 30 min.) arba AICAR (1 mmol l −1, 30 min.) sukeltų AMPK aktyvumų rezultatai ir Parodytas junginio C poveikis (20 μmol l −1, 30 min.). Atliekant Western blot analizę su anti-AMPK antikūnais, reikšmingų bendro AMPK kiekio skirtumų nepastebėta. Viršutiniame skydelyje rodomas reprezentacinis taškas. Apatiniame grafike parodytas densitometrinės analizės rezultatas. Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių absorbcijos padidėjimą kartų lygiu iki 1, 0 (reikšmės yra vidurkiai ± sd, n = 5, * P <0, 05, palyginti su kontrole, P <0, 05, palyginti su vien adiponektinu). ( b ) Buvo parodyti AICAR arba junginio C poveikio IGF-1 sukeltai ERK1 / 2 aktyvacijai rezultatai. Po apdorojimo adiponektinu (10 μg ml −1, 30 min.) Ir (arba) IGF ląstelės buvo iš anksto apdorotos AICAR (1 mmol l −1, 30 min.) Arba junginiu C (20 μmol l − 1, 30 min.) Arba be jo. -1 (100 ng ml −1, 10 min.). Atliekant Western blot analizę su anti-ERK1 / 2 antikūnais, reikšmingų bendro ERK1 / 2 kiekio skirtumų nepastebėta. Viršutiniame skydelyje rodomas reprezentacinis taškas. Apatiniame grafike parodytas densitometrinės analizės rezultatas. Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių densitometriją ties 1, 0 (reikšmės yra vidurkiai ± sd, n = 5, * P <0, 05, palyginti su IGF-1 100 ng ml −1 ). c ) Parodomi AICAR poveikio IGF-1 sukeltai RASMC migracijai rezultatai. Ląstelės buvo iš anksto apdorotos AICAR arba be jo (1 mmol l- 1 ) 30 min. Po inkubacijos su IGF-1 6 val. Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių densitometriją ties 1, 0 (reikšmės yra vidurkiai ± sd, n = 5, * P <0, 05, palyginti su IGF-1 100 ng ml −1 be AICAR).

Visas dydis

Adiponektinas neturėjo įtakos IGF-1 sukeltam Akt ir blogam fosforilinimui RASMC

Taip pat buvo pranešta, kad IGF-1 suaktyvina Akt – Bad kelią ir turi antiapoptotinį poveikį. 17 Norint patvirtinti adiponektino poveikį šiam keliui RASMC, buvo tiriamas IGF-1 sukeltas Akt ir Bad fosforilinimas. IGF-1 stimuliacijos padidėjęs Akt ir Bad fosforilinimas nesumažėjo prieš tai apdorojant adiponektinu (3, 10 ir 30 μg ml −1 ) (4 paveikslas). Iš šių rezultatų buvo numanoma, kad IGF-1 stimuliuojamas ERK1 / 2 kelias buvo slopinamas selektyviai, o ne Akt – Bad kelias adiponektinu.

Image

Adiponektino poveikis IGF-1 sukeltam Akt ir Bad fosforilinimui. Ląstelės buvo apdorotos nurodyta adiponektino koncentracija 30 minučių prieš gydymą IGF-1 (100 ng ml −1 ) 10 minučių. Atliekant Western blot analizę su anti-Akt arba anti-Bad antikūnais, reikšmingų bendro Akt ir Bad kiekio skirtumų nepastebėta. Viršutiniame skydelyje rodomos tipiškos dėmės. Apatiniame grafike parodyti densitometrinės analizės rezultatai (atviras stulpelis: fosforilintas Akt; uždaras stulpelis: fosforilintas blogas). Vertės buvo normalizuotos, savavališkai nustatant kontrolinių ląstelių densitometriją ties 1, 0 (reikšmės yra vidurkis ± sd, n = 5).

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme, kad adiponektinas slopino IGF-1 sukeltą RASMC migraciją slopindamas ERK1 / 2 aktyvaciją. AICAR, AMPK aktyvatorius, taip pat slopino IGF-1 sukeltą ERK1 / 2 aktyvaciją ir RASMC migraciją. Be to, adiponektinas selektyviai slopina ERK1 / 2 kelią, o ne Akt – Bad kelią, kurį stimuliuoja IGF-1 RASMC. Remiantis šiais rezultatais buvo pasiūlyta, kad adiponektinas gali susilpninti aterogenezę slopindamas IGF-1 sukeltą VSMC migraciją per AMPK aktyvaciją.

Daugeliu atvejų ir įvairių tipų ląstelėse antiaferogeninės adiponektino savybės pasireiškia slopinant kenksmingą stimuliaciją, tokią kaip angiotenzinas II, naviko nekrozės faktorius α (TNF-α), didelė gliukozės koncentracija, keli augimo faktoriai ir kt. 7, 8, 22 Buvo parodyta, kad adiponektinas apsaugo nuo angiotenzino II arba TNF-α sukeltų endotelio ląstelių monosluoksnio hiperpermeabiliteto. 22 Kito tyrimo metu buvo nustatyta, kad adiponektinas slopina TNF-α sukeltą VSMC kalcifikaciją. 23 Pridėję šiuos stebėjimus, mes parodėme, kad adiponektinas slopina IGF-1 sukeltą ląstelių migraciją RASMC (1b pav.). Kaip jau buvo pranešta, kad PDGF arba HB-EGF sukeltą VSMC migraciją slopina adiponektinas 18, buvo įrodyta, kad adiponektinas yra stiprus VSMC migracijos inhibitorius, reaguodamas į įvairius augimo faktorius. Kai kuriais tyrimais buvo pranešta, kad slopinantis adiponektino poveikis atsirado dėl prisijungimo prie augimo faktorių, o adiponektinas blokavo ryšį tarp augimo faktorių ir jų receptorių. 18 Tačiau, kaip parodėme šiame tyrime, adiponektinas slopino ERK1 / 2 kelią ir nepaveikė alternatyvių būdų, p38 MAP kinazės aktyvacijos ar Akt – Bad fosforilinimo. Šie rezultatai parodė, kad tarp adiponektino ir IGF-1 stimuliuotų tarpląstelinių signalų perdavimo būdų yra tam tikrų kliūčių. Neseniai adiponektino stimuliuojami signalizacijos keliai paaiškėjo palaipsniui. Buvo pranešta, kad adiponektinas perduoda signalizaciją jungdamasis prie 1 arba 2 adiponektino receptorių, o tai lemia AMPK ir cAMP-baltymo kinazės A signalų aktyvavimą. 1 AMPK vaidmuo adiponektinui (darantis teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių funkcijai) buvo labai svarbus naujausiuose tyrimuose. Adiponektino sukeltas endotelio azoto oksido sintazės (eNOS) fosforilinimas reikalavo AMPK aktyvacijos endotelio ląstelėse. 24 Adiponektinas slopina angiotenzino II, α-adrenerginių receptorių stimuliavimą arba slėgio perkrovos sukeltą hipertrofinę signalizaciją miokardą per AMPK. 21

Iš tikrųjų mes parodėme, kad AMPK aktyvinimas AICAR slopino IGF-1 sukeltą ERK1 / 2 aktyvaciją ir VSMC migraciją (3 paveikslas). Remiantis mūsų rezultatais, neseniai buvo paskelbtas slopinamasis kryžminis ryšys tarp ERK1 / 2 ir AMPK. 25, 26 AMPK aktyvinimas adiponektinu slopino angiotenzino II sukeltą širdies fibrozę, slopindamas ERK1 / 2 ir aktyvavęs peroksisomų proliferatorių suaktyvintą receptorių α (PPAR-α). NIH-3T3 ląstelėse AICAR stimuliuota AMPK aktyvacija sumažino IGF-1- arba epidermio augimo faktoriaus priklausomą ERK1 / 2 kelią ir ląstelių proliferaciją. Kaip parodyta 3a paveiksle, mes patvirtinome, kad adiponektinas suaktyvino AMPK RASMC. Buvo manoma, kad slopinantis adiponektino poveikis VSMC migracijai atsirado ir dėl AMPK aktyvacijos.

Kita vertus, IGF-1 vaidmuo aterosklerozės patogenezėje vis dar ginčijamas. Kaip parodyta 4 paveiksle, mes patvirtinome, kad IGF-1 stimuliavo Akt – Bad kelią. Manoma, kad IGF-1 stimuliuojamas blogas fosforilinimas tarpininkauja antiapoptoziniam signalų perdavimui. 17 IGF-1 slopindamas VSMC apoptozę, jis apsaugo nuo apnašų nestabilumo ir plyšimo, ypač vėlyvoje aterosklerozės fazėje. 27, 28 Remiantis tyrimu, naudojant miego arterijos pavyzdžius iš pacientų, sergančių ateroskleroze, IGF-1 ir IGF-1 receptorių ekspresija plokšteliniuose VSMC buvo žymiai didesnė besimptomiams asmenims, palyginti su simptominiais. Be to, buvo pranešta, kad žemas IGF-1 lygis serume buvo susijęs su padidinta išeminės širdies ligos rizika. 28 Surinkus šiuos įrodymus, teigiama, kad IGF-1 turi dvejopą poveikį - ir už, ir prieš aterosklerozę. Todėl pageidautina sumažinti IGF-1 sukeltą mitogeninį poveikį ankstyvojoje aterosklerozės fazėje, taip pat palaikyti IGF-1 sukeltą antiapopotinį signalą vėlyvajame apnašų formavimosi etape. Tačiau nebuvo nei eksperimentinio, nei klinikinio tyrimo, rodančio sėkmę reguliuojant IGF-1 poveikį kraujagyslėms. Tikslių adiponektino poveikio IGF-1 signalizacijos mechanizmų atskleidimas galėtų būti nauja širdies ir kraujagyslių ligų įveikimo strategija.