Dėl adrenerginio blužnies ribinės b zonos ląstelių praradimo padidėja jautrumas infekcijai po insulto | gamtos komunikacijos

Dėl adrenerginio blužnies ribinės b zonos ląstelių praradimo padidėja jautrumas infekcijai po insulto | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Bakterinė infekcija
  • Ribinės B zonos ląstelės
  • Insultas
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2017 m. Rugpjūčio 18 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Infekcija yra pagrindinė ūminio insulto komplikacija ir sukelia padidėjusį mirštamumą bei sergamumą; tačiau dabartinės intervencijos neužkerta kelio infekcijai ir nepagerina klinikinių rezultatų pacientams, patyrusiems insultą. Šių pacientų jautrumo infekcijai mechanizmai nėra aiškūs. Blužninės ribinės zonos (MZ) B ląstelės yra įgimtos formos limfocitai, užtikrinantys ankstyvą apsaugą nuo bakterinės infekcijos. Čia parodytas eksperimentinis pelių insultas, sukeliantis ryškų MZ B ląstelių praradimą, nepakankamas kraujo fiksavimo antigeno fiksavimas ir cirkuliuojančio IgM slopinimas. Šiuos trūkumus lydi savaiminė bakterinė plaučių infekcija. IgM lygis panašiai slopinamas pacientams, patyrusiems insultą. β-adrenerginių receptorių antagonizmas po eksperimentinio insulto užkerta kelią blužninių MZ B ląstelių praradimui, išsaugo IgM lygį ir sumažina bakterijų naštą. Šie duomenys rodo, kad adrenerginis MZ B ląstelių praradimas prisideda prie infekcijos linkusios būsenos po insulto ir nustato sisteminį B ląstelių pažeidimą kaip terapinių manipuliacijų taikinį.

Įvadas

Klinikinei insulto baigčiai įtakos turi ne tik pirminė smegenų trauma, bet ir neurologinės bei medicininės komplikacijos. Infekcija yra dažniausia insulto komplikacija, pasireiškianti iki trečdalio pacientų ir nepriklausomai susijusi su padidėjusiu trumpalaikiu ir ilgalaikiu mirštamumu bei sergamumu 1, 2 . Dažniausiai pasitaiko bakterijų sukeliamos infekcijos, darančios įtaką kvėpavimo takų ar šlapimo takams, o pati pneumonija yra susijusi su tris kartus padidėjusiu mirštamumu ir prastesniu funkciniu išgyvenimu 1, 3, 4 . Manoma, kad ne tik disfagija ir nejudrumas, kai kurie sisteminio imuniteto aspektai sukelia insultą ir gali sukelti infekcijos riziką po insulto 2, 5, 6, 7 . Bendras sisteminio limfoidinio audinio ir kraujo ląstelių sumažėjimas buvo aprašytas eksperimentiniuose insulto modeliuose ir pacientų 2, 8 . Po eksperimentinio pelių insultų taip pat buvo pranešta apie sutrikusią įvairių T-ląstelių pogrupių funkciją, kuri yra susijusi su savaimine 2, 8, 9, 10 pneumonija. Atrodo, kad autonominis nervų sistemos suaktyvinimas yra pagrindinis šių sisteminių imuninių pokyčių 2, 11, 12 .

Infekcija dažniausiai pasireiškia per pirmąsias kelias dienas po insulto; todėl mažai tikėtina, kad įprastų adaptacinio imuniteto mechanizmų, kurie lėtai suaktyvėja, trūkumai atspindi pradinį jautrumą infekcijai 1, 3, 4 . Vis daugiau suprantama apie limfocitų, turinčių įgimtas funkcijas, svarbą audinių homeostazei, imuninės sistemos reguliavimui ir infekcijų kontrolei. Ribinės zonos (MZ) B ląstelės yra įgimto tipo limfocitų, esančių blužnies MZ, pogrupis, svarbi sąsaja tarp kraujotakos ir imuninės sistemos. MZ B ląstelės greitai ir greitai reaguoja į bakterinę infekciją per 1–3 dienas po patogeno atsiradimo, greitai gamindamos polioreaktyvius imunoglobulino M (IgM) antikūnus, atpažįstančius labai konservuotus mikrobų molekulių modelius. Šis atsakas yra labai svarbus ankstyvasis antibakterinis gynybos mechanizmas, kuris, kaip manoma, užpildo laiko tarpą, kol įprastos folikulų B ląstelės gali reaguoti priklausomai nuo T ląstelių 14, 15, 16, 17, 18, 19 . Asmenys, kuriems trūksta blužnies dėl įgimtos disfunkcijos ar chirurginės operacijos arba kurių blužnies MZ yra sutrikę, yra jautrūs panašioms kapsuliuotų bakterijų padermėms, kurios paprastai sukelia plaučių infekcijas pacientams, patyrusiems insultą 20 . Aspleniškų asmenų jautrumas šioms infekcijoms paprastai priskiriamas iš MZ B ląstelių gautų, nuo T ląstelių nepriklausomų, IgM ir IgG antikūnų, būdingų bakteriniams kapsuliniams polisacharidams, trūkumui . MZ B ląstelės yra vienas iš pagrindinių IgM šaltinių, pagamintų anksti po infekcijos, o asmenims, turintiems IgM trūkumą, taip pat gresia ypatinga bakterinės kvėpavimo takų infekcijos rizika . Taigi egzistuoja svarbus funkcinis ryšys tarp įgimtų blužnies MZ B ląstelių, IgM ir plaučių funkcijų, būtinų antibakterinei gynybai. Todėl tikslinga nustatyti, ar insultas paveikė įgimtas B ląstelių antibakterines savybes. Tai reiškinys, kuris anksčiau nebuvo ištirtas atsižvelgiant į bet kokią centrinės nervų sistemos (CNS) žalą. Eksperimentiniais stuburo smegenų modeliais buvo parodyta, kad sisteminės B ląstelių populiacijos gali būti jautrios CNS pažeidimui, B ląstelių populiacijų praradimas ir sumažėjęs B folikulų ląstelių antikūnų susidarymas reaguojant į imunizaciją nuo T ląstelių priklausomu antigenu. trauma, nors vertinimas buvo praėjus kelioms savaitėms po sužalojimo 27, 28, 29 . Todėl, atsižvelgiant į tai, kad dauguma infekcijų įvyksta per pirmąsias dienas po insulto, ir įgimtas įgimtų B ląstelių vaidmuo užtikrinant greitą antibakterinę gynybą nuo pacientams būdingų padermių, mes siekėme išsiaiškinti, ar sisteminės įgimto tipo B ląstelių funkcijos yra išeminio insulto paveikti ir padidina jautrumą infekcijai.

Mes parodėme, kad eksperimentinis pelių insultas sukelia greitą MZ B ląstelių praradimą, susijusį su sutrikusia IgM gamyba ir savaimine bakterine infekcija. Taip pat parodėme mažesnę cirkuliuojančio IgM koncentraciją pacientams, sergantiems ūminiu išeminiu insultu, ir kad IgM koncentracija yra labiausiai slopinama pacientams, kuriems išsivysto infekcija. Adrenerginis signalas tarpininkauja šiems trūkumams, ir tai rodo, kad smegenų ir imuninės sistemos komunikacijos autonominiai keliai daro įtaką B ląstelių funkcijai po insulto. Adrenerginių signalų blokada po eksperimentinio insulto, naudojant propranololį, apsaugo nuo MZ B ląstelių praradimo, atstato cirkuliuojančio IgM lygį ir sumažina infekciją. Šie duomenys atskleidžia įgimtų B ląstelių populiacijų ir su jomis susijusių funkcijų, kaip svarbaus mechanizmo, padedančio jautriai reaguoti į infekcijas po insulto, praradimą, ir pabrėžia šį kelią kaip galimą intervencijos tikslą.

Rezultatai

Bluso B-ląstelių funkcijos sutrikimas po eksperimentinio insulto

Blužnies antimikrobinių funkcijų atlikimui labai svarbus blužninių imuninių ląstelių mikroanatominis organizavimas, pavyzdžiui, užtikrinant tinkamą antigeno ekspoziciją ir sąveiką su kitais ląstelių tipais optimaliose vietose 30, 31, 32 . Pirmiausia mes ištyrėme didelius blužnies B-ląstelių populiacijų pokyčius, susijusius su bendromis struktūrinėmis ir ląstelinėmis pakitimais po pelių eksperimentinio insulto, kurį sukėlė pereinamasis (40 min.) Vidurinės smegenų arterijos okliuzijos (MCAO) okliuzija. Šis MCAO modelis sukelia vidutiniškai didelius smegenų infarktus, paveikiančius žievės ir subkortikinius audinius (žr. Papildomą 1 pav.). MCAO smarkiai sutrikdė blužnies mikroarchitektūrą, sumažėjo limfocitų segregacija ir B ląstelių folikulų struktūros, kurios buvo vienodos blužnyje (1a pav.). Didelis subrendusių (B220 + ) B ląstelių praradimas baltojoje minkštimo dalyje (WP) įvyko jau praėjus 1 dienai po MCAO ir buvo išgyventas iki 7 dienos (1b, c pav.). Taip pat buvo aptiktas CD3 + T-ląstelių imunoreaktyvumo sumažėjimas (1b, d pav.). CD21 + folikulinių dendritinių ląstelių (FDC) tinklai, kurie paprastai būna B ląstelių folikuluose ir yra priklausomi nuo B ląstelių gaunamų brandos ir palaikymo signalų, buvo kondensuoti ir sumažinti srityje (1c pav., F). Priešingai, F4 / 80 + makrofagų skaičius WP padidėjo pelėms praėjus 1–7 dienoms po MCAO, palyginti su naiviais ir fiktyviais kontroliniais preparatais (1 pav., G). Kaip tikėtasi ir atsižvelgiant į koreliaciją tarp insulto sunkumo ir imuninės sistemos slopinimo pacientams, smegenų pažeidimo masto modifikavimas turėjo įtakos blužnies B ląstelių pažeidimui. 20 min. MCAO sukūrė mažus infarktus, apribotus strijaus audiniu (papildomas 1 pav.) Ir sukėlė nedidelį blužnies sutrikimą, tuo tarpu 40 min. (Kaip aprašyta aukščiau) arba 60 min. blužnies sutrikimas. Remiantis ankstesniais tyrimais, blužnies svoris sumažėjo po MCAO ir atvirkščiai koreliavo su infarkto tūriu (1h pav.). Imuninis B ląstelių žymėjimas, siekiant atskirti WP, parodė, kad didesni infarktai buvo susiję su sumažėjusiu WP plotu (1i pav.). Šie duomenys rodo ryškius B ląstelių populiacijos dydžio ir padėties po MCAO sutrikimus, įvykstančius dėl viso blužnies WP dezorganizacijos.

Image

( a ) Blužnies B (raudonos, B220) ir T-ląstelių (žalios, CD3) imuninio žymėjimo briaunoti konfokaliniai vaizdai rodo WP ploto sumažėjimą ir likusių ląstelių lokalizacijos sutrikimą. ( b ) Blužnies B (raudonos, B220) ir T ląstelių (žalios, CD3) imunofluorescencinis žymėjimas anksčiau negydytoms pelėms, pelėms pasveikus praėjus 1–7 dienoms po MCAO arba fiktyviai operuotoms pelėms. c ) B220 + imuninio žymėjimo procentinio ploto nustatymas 846, 28 μm 2 atvaizduose naivių pelių arba pelių, gautų iš šampūno ar MCAO operacijos, blužniuose, patvirtina, kad B ląstelių žymėjimo plotas žymiai sumažėja praėjus 1–7 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyvūs valdikliai. d ) Taip pat sumažėja CD3 + T ląstelių ženklinimo plotas. g ) CD21 / 35 + MZ B ląstelių ir FDC (raudonos) bei F4 / 80 + makrofagų (žalios spalvos) imuninis žymėjimas naivių pelių blužniuose, pelėms pasveikus praėjus 1–7 dienoms po MCAO arba fiktyviai operuotų pelių, padidėjo makrofagų ir sumažintas FDC tinklų plotas praėjus 1–7 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviai valdoma kontrole. e ) CD21 / 35 + FDC ir B ląstelių imuninio ženklinimo kiekybinis įvertinimas patvirtina sumažėjusį ženklinimo plotą praėjus 1–7 dienoms po MCAO, tuo tarpu f ) padidėja F4 / 80 + makrofagų ženklinimas (naivu n = 4)., fiktyvus n = 4, 1d n = 4, 2d n = 9, 5d n = 5, 7d n = 7). h ) blužnies svoris, pataisytas atsižvelgiant į bendrą kūno svorį, atvirkščiai koreliuoja su infarkto tūriu (n = 9). i ) Imuninis B ląstelių (raudonos, B220 + ) žymėjimas blužniuose, atsigavusiuose 2 dienas po 20 min., 40 min., 60 min. okliuzijų ar fiktyvios chirurgijos, rodo, kad blužnies limfoidinio audinio pažeidimo laipsnis priklauso nuo sužalojimo masto. smegenys. WP sritis ir B ląstelių folikulų struktūra išsaugoma pelėms atlikus fiktyvią operaciją arba 20 min. MCAO. Tačiau per 40 ar 60 min. MCAO prarandamas WP ir WP formuojasi B ląstelių žiedai. (Sham n = 4, 20 min n = 7, 40 min n = 7, 60 min n = 7). Mastelio juostos ( a, b ) 200 μm; ( g ) 100 μm; i ) 500 μm. Duomenys rodo vidurkį + sd; * P < 0, 05; ** P < 0, 01; *** P < 0, 001; ( c - f ) vienpusis ANOVA su „Bonferroni“ pataisa, lyginant visus MCAO atkūrimo laiko taškus iki apgaulingo.

Visas dydis

Eksperimentinis insultas sukelia ribinių B zonos ląstelių praradimą

Nors mes įrodėme, kad daugybė blužninių imuninių ląstelių populiacijų yra paveiktos eksperimentinio insulto, įgimtos blužnies MZ B ląstelės buvo ypač įdomios, nes jų kritinė svarba imuninės sistemos stebėjimui ir greitam antibakteriniam atsakui yra labai reikšminga infekcijos dažniui pirmaisiais. kelios dienos po 30 insulto. MZ B ląstelės ekspresuoja aukštą CD1d, IgM ir CD21 / 35 lygį (taip pat ekspresuojamas FDC B ląstelės folikuluose). Ryškus visų šių žymenų imunoreaktyvumo praradimas patvirtino didelį MZ B ląstelių praradimą jau 1 dieną po MCAO ir išliko reikšmingai sumažėjęs iki 5 dienų vėliau (2a – c pav.). Pelių MZ B ląstelės nerecikliuojasi kraujyje, bet gali persikelti į B ląstelės folikulą ir iš jo. Folikule buvo galima aptikti nereikšmingą MZ B ląstelių imuninį žymėjimą ir dažniausiai tai buvo susiję su makrofagais (2a pav., E). Kiekybinė analizė, naudojant srauto citometriją, parodė, kad praėjus 2 dienoms po MCAO, bendras splenocitų skaičius sumažėjo 65%, palyginti su fiktyviai operuojamais gyvūnais (papildomas 2a pav.). Remiantis aukščiau pateiktais duomenimis, tik 13% B220 + CD23 - CD21 / 35 hi MZ B ląstelių ir 25% B220 + CD23 + CD21 / 35 + folikulinių B ląstelių išliko praėjus 2 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviomis operacijomis (pav. 2d, vartymo strategija, pateikta papildomame 2b pav.

Image

a ) MZM makrofagų (žaliųjų, MOMA-1) imuninis žymėjimas MZ B ląstelių žymekliais (raudonais, CD1d ir CD21 / 35) rodo, kad MZ B ląstelių (baltos rodyklės) nėra MZ praėjus 2 dienoms po MCAO į apgaulingai valdomus valdiklius. Imunologinis žymėjimas MZ (raudonos, IgM) atskyrimui nuo B folikulų ląstelių (žalios, IgD) tai patvirtina. Kiekybiškai įvertinus MZ B ląstelių imuninį ženklinimą už MOMA-1 + MZM makrofagų ribų, naudojant CD1d ( b ) arba CD21 / 35 ( c ), patvirtinamas reikšmingas MZ B ląstelių žymėjimo sumažėjimas po MCAO, palyginti su fiktyviomis operacijomis (naivu n = 4, apgaulingas n = 4, 1d n = 4, 2d n = 9, 5d n = 5, 7d n = 7). MZ (B220 + CD23 - CD21 / 35 hi ) ir folikulinių (B220 + CD23 + CD21 / 35 int ) B ląstelių M23 (B220 + CD23 - CD21 / 35 hi ) atskyrimas ląstelėse, kuriose buvo pažymėtas CD45R + žymėjimas, nuo pastovaus visų įvykių skaičiaus, buvo naudojamas CD23 ir CD21 / 35 ekspresijai. (Papildomas 1e pav.) ( d ) Absoliutus blužnies MZ ir B folikulų ląstelių skaičius, naudojant srauto citometriją, rodo, kad abu po 2 dienų po MCAO žymiai sumažėja, palyginti su fiktyviai valdomomis kontrolinėmis medžiagomis (naivus n = 4, fiktyvus n = 4, MCAO n = 6). ( e ) MZ B ląstelių imuninį ženklinimą (CD1d; raudonas) galima pamatyti per MZ metalofilinius makrofagus (žalius, MOMA-1) praėjus 2 dienoms po MCAO. f ) TUNEL (žalias) dažymas, ląstelių mirties žymeklis kartu su B ląstelėmis (mėlyna, B220) ir MZ B ląstelėmis (raudona, CD1d) rodo padidėjusią folikulų ir MZ B ląstelių mirtį praėjus 1–7 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyvūs valdikliai. g ) Kiekybinė CD1d + ženklinimo procentinė analizė, aptinkama kartu su TUNEL, kaip apoptozinių MZ B ląstelių matas, rodo TUNEL + CD1d MZ B ląstelių padidėjimą praėjus 1–5 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviomis operacijomis. ( h ) Panaši CD1d - B220 + ženklinimo, kuris lokalizuojamas kartu su TUNEL, analizė, kaip apoptozinių B folikulų B ląstelių matas, rodo, kad 2–5 dienas po MCAO žymiai padidėja TUNEL + B folikulų B ląstelių kiekis, palyginti su fiktyviomis operacijomis. (naivus n = 4, apgaulingas n = 4, 1d n = 4, 2d n = 9, 5d n = 5, 7d n = 7). Mastelio juostos ( a, f ) 200 μm ( e ) kairiajame skydelyje 100 μm, dešiniajame skydelyje 10 μm. Duomenys rodo vidurkį + sd; * P < 0, 05; ** P < 0, 01; *** P < 0, 001; ( b, c, g, h ) vienpusė ANOVA su Bonferroni korekcija, lyginant visus MCAO atkūrimo laiko taškus su fiktyviu, ( d ) neporuotas t- testas.

Visas dydis

Prie MZ B ląstelių praradimo gali prisidėti keli mechanizmai, įskaitant mirtį, migraciją ar pakartotinio populiacijos nebuvimą (taip pat žr. Žemiau). Padidėjęs TUNEL žymėjimas blužnyje buvo praėjus 1–7 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviomis ir naiviomis kontrolėmis (2e pav.). Be to, didelis procentas MZ B ląstelių (2f pav.) Ir B folikulų ląstelių (2 g pav.), Kurių imunologinis žymėjimas atliekamas kartu su TUNEL, buvo akivaizdus po MCAO net tada, kai buvo nedaug MZ B ląstelių. MOM B-ląstelių žymens (CD1d) žymėjimas buvo aptiktas MOMA-1 (CD169) + MZ makrofaguose (2h pav.). Šie duomenys kartu rodo, kad insultas smarkiai praranda blužnies B ląsteles, ypač MZ B ląsteles, greičiausiai dėl mirties ir pašalinimo iš vietinių fagocitų, o ne persikėlimo į B ląstelės folikulą.

Blužniniai transkripto pokyčiai po eksperimentinio insulto

Norėdami sužinoti apie molekulinius kelius, galinčius prisidėti prie MCAO sukeltos blužnies B ląstelių praradimo ir paveikti, mes atlikome blužnies transkriptominę analizę limfoidinio audinio mikroarchitektūros pažeidimo piko metu (5 dienos po MCAO, žr. 1b pav.). Palyginus blužnies transkriptus MCAO ir fiktyviai operuotose pelėse, nustatyta skirtinga 4 396 nuorašų išraiška, įskaitant 1 818 nuorašų, reguliuojamų žemyn, ir 2578 nuorašų, reguliuojamų padidinus MCAO ( P <0, 05, kartų pokytis ≥ 1, 5, 3a pav.). Ryškiai žemai sureguliuoti genai apėmė tuos, kuriuos labai ekspresuoja B ląstelės ir kurie yra būtini B ląstelių funkcijai, įskaitant Cr2, dalyvaujančius MZ B ląstelių Opsonizuoto antigeno surinkime, Cxcr5 , svarbų palaikant B ląsteles folikuluose ir Cd40 , svarbius B-ląstelių aktyvacija (3b pav.). Mikro matricų duomenų patvirtinimas RNR ir baltymų lygiu buvo atliktas atrinktų tarpininkų kiekybine PGR (qPCR) ir imunohistochemija (papildomas 3a – c pav.). Genų ontologijos biologiniai procesai B-ląstelių aktyvacija, limfocitų aktyvacija ir imuninės sistemos vystymasis buvo žymiai didesni nei MCAO žemai sureguliuotų genų rinkinyje (3c pav.), Kaip ir Kioto genų ir genomų enciklopedija (KEGG), vykstant kraujodaros ląstelėms. linijos, pirminio imunodeficito ir B ląstelių receptorių signalizacijos (papildomas 3d pav.). KEGG kraujodaros ląstelių linijoje ypač akivaizdu, kad sumažėjo daugelio genų, dalyvaujančių subrendusių B ląstelių vystymesi, raiška (3d pav.). B ląstelės, norėdamos išlaikyti, subrandinti ir išlaikyti MZ ar folikulus, priklauso nuo veiksnių, kuriuos sukuria stromos ir imuninės ląstelės. Priešingai, kai prarandami B ląstelių vidiniai receptoriai, kurie yra gyvybiškai svarbūs jų išlikimui (pvz., BAFFR ( Tnfrsf13c ); 3e pav.) Arba padėties nustatymas (pavyzdžiui, LFA-1 ( Itgal ir Itgb2 )); Papildomas 3e pav. ), liko iš stromos ląstelių gautų ligandų, skatinančių B ląstelių išgyvenimą (pvz., BAFF ( Tnfsf13b ); 3e pav.), ir ląstelių adhezijos molekulių, tarpininkaujančių B ląstelių lokalizaciją (pvz., Vcam1 ; papildomas 3f pav.), ekspresija . nepakitęs ar padidėjęs. Šie duomenys rodo, kad MCAO poveikis yra pakankamas norint įveikti homeostatinius mechanizmus, kurie reguliuoja B ląstelių išgyvenimą, palaikymą ir padėtį blužnyje.

Image

a ) Šilumos žemėlapis, parodantis 4396 nuorašų, išreikštų diferencijuotai pelių blužniuose, raiškos profilį praėjus 5 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviomis operacijomis. Kiekvienas zondo rinkinys pavaizduotas mėlynai raudonos spalvos Z balo eilutėje su mėlyna spalva, rodančia žemą išraišką, ir raudona, nurodančia aukštą zondo raišką (fiktyvus n = 2, MCAO n = 3). b ) Kai kurie iš labiausiai nereglamentuojamų nuorašų, identifikuotų praėjus 5 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviomis operacijomis, paprastai yra labai išreikšti B ląstelių populiacijose ir yra būtini normaliam vystymuisi ir (arba) funkcijai. ( c ) Transkriptai, diferencijuoti blužniuose po MCAO, buvo analizuojami siekiant praturtinti (P ​​<0, 05 su Benjamini pataisa) genų ontologijos (GO) biologiniame procese DAVID, kuris nustatė GO terminus, susijusius su imuninės sistemos vystymusi ir aktyvinimu. ( d ) KEGG transkriptų, analizuojamų po to, kai MCAO nustatė genus, dalyvaujančius keliuose subrendusio B ląstelės vystymosi kelio etapuose, kelio analizė. ( e ) Mikro matricų ekspresijos lygiai rodo receptorių, svarbių B ląstelėse ( Tnfsfr13c, Tnfsfr13b ir Cd40 ) išreikštų išgyvenimo signalų transkriptams, po MCAO, sumažėjimą. Šių ligandų ( Tnfsf13b ir Tnfsf13 ), kuriuos ekspresuoja stromos ląstelių populiacijos, ekspresija išlieka nepakitusi / padidėjusi. Duomenys rodo vidurkį + sd; NS, nereikšmingas; * P < 0, 05; ** P < 0, 01; *** P < 0, 001; nesuporuotas t- testas.

Visas dydis

Eksperimentinis insultas sutrikdo MZ antibakterinę funkciją

Blužnies MZ yra optimizuotas kraujo pernešamų patogenų, kurie sukelia įgimtus panašius greitus MZ B ląstelių antikūnų atsakus, patikrinimui ir gavimui, ir antigeno gabenimas į B ląstelės folikulą, kur vyksta lėtesnės adaptacinės imuninės reakcijos. Atsižvelgdami į pastebimą MZ B ląstelių praradimą, kurį sukėlė MCAO, mes nustatėme, ar šie pokyčiai pakenkė pagrindinėms nuo MZ B ląstelių priklausomoms funkcijoms. Praėjus 2 dienoms po MCAO, mes įvertinome MZ B ląstelių sugebėjimą iš apyvartos paimti modelio antigeną PE-anti-CD21. Naiviai ar fiktyviai operuotų gyvūnų blužnyje PE-anti-CD21 buvo aptiktas per MZ 1 valandą po intraveninio (iv) vartojimo ir buvo lokalizuotas kartu su MZ B ląstelių žymeniu CD21 / 35, rodančiu efektyvų gaudymą. Priešingai, beveik visiškai nebuvo PE-anti-CD21, aptikto MZ po MCAO (4a, c pav.).

Image

a ) Fluorescenciniu ženklu pažymėtas antigenas (raudonas, PE-anti-CD21) įstrigęs MZ B ląstelėse naivių ir fiktyviai operuotų gyvūnų blužniuose praėjus 1 valandai po injekcijos į veną, tačiau pelių, atsigavusių po 2 dienų, MZ aptinkama mažai. MCAO. ( b ) Imuninis žymėjimas rodo, kad praradus MZ B ląsteles (kaip aprašyta 2 pav.) praėjus 2 dienoms po MCAO, MZ makrofagai (žali, žalios spalvos) netenka C tipo lektino SIGN-R1 (raudonos) ekspresijos. MARCO). c ) PE-anti-CD21 procentinio ploto, išreikšto 846, 28 μm 2 atvaizdu, kiekybinis įvertinimas patvirtina, kad pelėms praėjus 2 dienoms po MCAO labai sumažėjo PE-anti-CD21 gaudymo spąstai, palyginti su fiktyviai operuojamais gyvūnais. d ) MZ makrofagų antigenas (žalias, Dextran FITC) yra įstrigęs pagal MARCO + MZ makrofagus gyvūnų, gautų atlikus MCAO ir fiktyvią operaciją, blužniuose ir naivioje kontrolėje per 1 valandą po injekcijos (papildomas 4 pav.). Dekstranas-FITC išlieka susijęs su MZ makrofagais (raudona, MARCO) 24 valandas po injekcijos ir efektyviai pernešamas į folikulą, kur jis visose lokalizacijos vietose susideda iš FDC tinklų (raudonas, CD21 / 35) visose eksperimentinėse grupėse. e ) Dekstrano-FITC procentinio ploto, išreikšto 846, 28 μm 2 atvaizdu, kiekybinis įvertinimas patvirtina, kad praėjus 2 dienoms po MCAO, dekstrano-FITC spąstų spąstų spąstuose reikšmingo skirtumo nėra, palyginti su fiktyviai valdomomis kontrolėmis (naivus n = 3, fiktyvus) n = 3, MCAO n = 6). f ) Sumažėjusi cirkuliuojančio IgM koncentracija praėjus 2 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviai valdomomis kontrolinėmis medžiagomis (naivus n = 4, fiktyvus n = 4, MCAO n = 9). Spontaninė bakterinė infekcija pasireiškia pelių plaučiuose ( g ) ir kraujyje ( h ) nuo vienos dienos po MCAO, tačiau jos negalima rasti fiktyviai valdomuose narvuose (apgamas n = 4, 1d n = 4, 2d n = 9, 5d n = 5, 7d n = 7). Infekcijos dažnis pelių plaučiuose ( i ) ir kraujyje ( j ) kiekvienu pasveikimo laiko momentu. Mastelio juostos ( a, d ; viršutinė plokštė) 200 μm; ( b, d ; apatinis skydelis) 50 μm. Duomenys rodo ( f ) mediana nuo ± min iki maksimalios vertės + sd, * P < 0, 05 Manno – Whitney testas; ( c, e, g, h ) reiškia + sd, vienpusė ANOVA su Bonferroni korekcija, lyginant visas grupes su fiktyviais * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001.

Visas dydis

MZ B ląstelės gali reguliuoti kitas MZ ląstelių populiacijas, įskaitant MZ makrofagus, kurie taip pat fiksuoja kraujyje perduodamą antigeną. Anksčiau buvo įrodyta, kad MZ B ląstelės yra būtinos C tipo lektino SIGN-R1 MZ makrofagų ekspresijai (nuoroda 33). SIGN-R1 atpažįsta bakterinį kapsulinį polisacharidą, o jo išraiška yra svarbi apsaugai nuo pneumokokinės infekcijos 34, 35 . Nepaisant aukščiau aprašytų MZ B ląstelių išeikvojimo (nepaisant aukščiau aprašytų MZ B ląstelių išeikvojimo), nepaisant MZ B ląstelių išeikvojimo, nebuvo pastebėta jokių MARCO + MZ makrofagų SIGN-R1 raiškos trūkumų (4b pav.). Be to, MZ makrofagų modelio antigenas, dekstranas-FITC, buvo veiksmingai užfiksuotas MARCO + MZ makrofaguose naiviems, fiktyviems ir MCAO valdomiems gyvūnams 1 valandą po injekcijos (papildomas 4 pav.) Ir efektyviai gabenamas į FDC tinklą per 24 metus. h po iv vartojimo (4d pav., e). Šie duomenys rodo blužninio MZ antigeno surinkimo praradimą, selektyviai veikiantį MZ B ląsteles po MCAO.

Nestimuliuojamos MZ B ląstelės veikia sinergijoje su blužninėmis B1 B ląstelėmis, kad normaliomis fiziologinėmis sąlygomis įneštų į apyvartą natūralų IgM ir per 24 valandas nuo stimuliacijos sudarytų plazmoje esančias MZ B ląsteles, išskiriančias didelį IgM kiekį. Šis ankstyvas nuo T-nepriklausomų antikūnų atsakas yra labai svarbus ankstyvajai gynybai nuo daugelio bakterinių ir virusinių patogenų 16 . Cirkuliacinė IgM koncentracija buvo žymiai mažesnė po MCAO, palyginti su fiktyviai valdomomis kontrolėmis (4f pav.). Ankstesni tyrimai pranešė, kad eksperimentinis insultas gali sukelti savaiminę pneumoniją ir bakteriemiją 2 . Sutikdami, mes nustatėme didelį bakterijų kiekį plaučiuose (4g pav., I) ir kraujyje (4h pav., J) gyvūnams, praėjus 1–7 dienoms po MCAO, kurių nebuvo fiktyviai kontroliuojamose kontrolėse, o tai rodo, kad oportunistiniai kommensai yra daugiausiai tikėtina kilmė. Visi šie duomenys rodo, kad MZ B ląstelių praradimas po MCAO sukelia imuninės funkcijos sutrikimus, ypač svarbius ankstyvajai antibakterinei gynybai, ypač antigeno surinkimą ir IgM gamybą, ir kad jie yra susiję su savaimine bakterine infekcija.

Sumažėjusi cirkuliuojančios IgM koncentracija pacientams, patyrusiems insultą

Norint nustatyti, ar įgimtos B ląstelių funkcijos gali būti paveiktos pacientams po ūminio išeminio insulto, buvo išmatuota IgM koncentracija pacientų plazmos mėginiuose ir poros kontrolinės grupės, suderintos pagal amžių, lytį ir aterosklerozės laipsnį 36 . IgM koncentracija plazmoje buvo žymiai mažesnė pacientams, patyrusiems insultą, priėmimo metu (iki 12 val. Po simptomų atsiradimo), praėjus 24 val. Ir 5–7 dienoms po insulto, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (5a pav.). Šis profilis koreliuoja su dideliu MZ B ląstelių praradimu ir cirkuliuojančio IgM sumažėjimu, stebėtu panašiais laiko momentais po aukščiau esančio eksperimentinio insulto. Infekcija pacientams buvo diagnozuota remiantis turimais klinikiniais, radiologiniais ir laboratoriniais duomenimis 36 . Trys pacientai (3/37) pranešė apie infekciją prieš insultą ir nebuvo įtraukti į vėlesnes analizes. Maždaug trečdaliui (12/34) pacientų buvo diagnozuota infekcija per 14 dienų po insulto, įskaitant septynis pacientus, sergančius pneumonija, panašų į anksčiau aprašytą dažnį 1, 37 . Didžioji dalis šių infekcijų (8/12) pasireiškė per pirmąsias 6 dienas nuo insulto pradžios. Mažiausia IgM koncentracija plazmoje, išmatuota iki 7 dienų po insulto, buvo žymiai mažesnė pacientams, kuriems infekcija išsivystė per pirmąsias 2 savaites, palyginti su tais, kurie to nepadarė (5b pav.). Pradinės pacientų, sergančių infekcijomis ar be jų, charakteristikos ir suderintos kontrolinės vertės pateiktos 1 papildomoje lentelėje. Sutinkant su ankstesniais tyrimais, rodančiais ryšį tarp pradinio insulto sunkumo ir infekcijos rizikos, insulto sunkumas (NIHSS), pasireiškus pacientams, buvo žymiai didesnis pacientams, kuriems infekcija išsivystė per pirmąsias 2 savaites po insulto (5c pav.). Mes atlikome tiriamąją analizę, norėdami toliau įvertinti galimą ryšį tarp insulto sunkumo, IgM koncentracijos ir infekcijos po insulto. Tai parodė tendenciją, rodančią, kad dauguma infekcijų pasireiškė pacientams, kuriems būdingas didelis insulto sunkumas ir maža IgM koncentracija (5d pav.). Taigi mūsų abiejų pacientų, sergančių ūmiu insultu, duomenys ir eksperimentinis insulto modelis rodo bendrą poveikį IgM, nurodantį insulto sukeltus sisteminių įgimtų, nuo B ląstelių priklausomų kelių, linkusių į infekciją, pažeidimus.

Image

( a ) Palyginus log-transformuotas IgM koncentracijas plazmoje, nustatyta, kad, palyginti su suplanuotosiomis kontrolinėmis grupėmis, pacientų priėmimo vidurkis (iki 12 val. po insulto simptomų atsiradimo), praėjus 24 val. ir 5–7 d. po insulto, vidutiniškai sumažina IgM koncentraciją. Norint kontroliuoti cirkadinį svyravimą, insulto mėginiai, paimti priėmimo metu ir 24 valandas, buvo lyginami su porinėmis priėmimo kontrolėmis, o insulto mėginiai, paimti 5–7 dienomis, buvo palyginti su 09:00 valandos poromis ( n = 38). b ) Minimali IgM koncentracija, išmatuota per pirmąsias 7 dienas po insulto, buvo žymiai mažesnė pacientams, patyrusiems insultą, kuriems infekcija išsivystė per 14 dienų nuo insulto pradžios, nei tiems, kuriems nebuvo ( + infekcija n = 12, - infekcija n = 23). c ) Vidutinis insulto sunkumas pateikimo metu, išmatuotas Nacionalinio sveikatos instituto insulto skalės (NIHSS), buvo žymiai didesnis pacientams, kuriems infekcija išsivystė per 14 dienų po insulto, palyginti su tais, kuriems nebuvo ( + infekcija n = 12, - infekcija). n = 23). d ) Ryšio tarp mažiausios IgM koncentracijos, išmatuotos per pirmąsias 7 dienas po insulto, ir insulto sunkumo (NIHSS balas) analizė išryškino tendenciją, kad pacientai, kuriems infekcija išsivysto per 14 dienų po insulto, būna aukštesnio insulto sunkumo ir žemo minimumo. IgM koncentracija. Duomenys rodo vidurkį ± sd, a ) suporuotas vienpusis ANOVA su Bonferroni korekcija; ( b, c ) nesuporuotas t- testas; * P <0, 05, ** P <0, 01.

Visas dydis

Subrendusių ir MZ B ląstelių jautrumas β-adrenerginei stimuliacijai

Ankstesni tyrimai atskleidė nervų kelių vaidmenį imuninės sistemos slopinimo metu po insulto. Visų pirma, autonominės grandinės, apimančios adrenerginį signalizavimą, yra susijusios su sutrikusia T ląstelių funkcija ir bakterine infekcija po eksperimentinio insulto, o pakitęs sisteminis katecholamino metabolito lygis buvo susijęs su infekcija ir mirštamumu nuo insultų sergančių pacientų 2, 38 . Adrenerginio signalizacijos poveikis B ląstelėms po insulto nežinomas, tačiau greitas MCAO poveikis B ląstelių sudėčiai ir funkcijai šiame tyrime parodė, kad nervų signalų perdavimas yra patikimas pagrindinis mechanizmas. Blužnies noradrenalino koncentracija žymiai padidėjo 1 dieną po MCAO ir išliko padidėjusi iki 5 dienų, palyginti su fiktyviai valdomomis kontrolinėmis medžiagomis (6a pav.), Tuo tarpu adrenalino koncentracija nepakito (6b pav.). β2-adrenerginio receptoriaus (β2-AR) paviršiaus baltymų ekspresija buvo nustatyta tiek MZ, tiek folikulų B ląstelėse, kur žymiai didesnė MZ B ląstelių, išreiškiančių receptorius, dalis (6c pav.). Tai buvo nepaisant nedidelės, bet žymiai mažesnės Adrb2 ekspresijos MZ B ląstelėse (papildomas 5 pav.), Atitinkančią Immgen raiškos duomenis (//www.immgen.org/), nors skirtumai tarp genų ir paviršiaus baltymų gausos nėra neįprasti. po transkripcijos ir posttransliacijos modifikacija, įskaitant prekybos baltymais ir skilimo reguliavimą 39 . Stimuliuojant izoliuotų splenocitų kultūras in vitro su noradrenalinu, sumažėjo B-ląstelių gyvybingumas nuo koncentracijos ir labiau sumažėjo MZ B ląstelių gyvybingumas (37%) nei B folikulinių ląstelių (13%; 6d pav.). Šie duomenys atitinka mūsų in vivo stebimus limfoidinio audinio pokyčius po MCAO, kai tiek MZ, tiek folikulų B ląstelių skaičius yra sumažėjęs, tačiau MZ B ląstelės yra paveiktos didesne apimtimi. Dažniau vyraujantis paviršiaus baltymų β 2 -AR ekspresija MZ B ląstelėse gali sąlygoti šį santykinai didesnį jautrumą.

Image

Homogenatas iš vienodo svorio blužnies audinio buvo paruoštas katecholamino lygiui išmatuoti. a ) blužnies noradrenalino koncentracija žymiai padidėja praėjus 1–5 dienoms po MCAO, palyginti su fiktyviomis operacijomis. b ) blužnies adrenalino koncentracijos skirtumų nenustatyta (fiktyvus n = 4, 1d n = 4, 2d n = 9, 5d n = 5, 7d n = 7). c ) Iš naivių C57BL / 6 pelių buvo paruoštos splennocitų suspensijos ir pažymėtos, kad būtų galima atskirti B ląstelių pogrupius (papildomas 2b pav.), ir β2-AR ekspresija srauto citometrija, siekiant nustatyti β 2 -AR + MZ ir B folikulo procentinę dalį. ląstelės ( n = 12, 4 biologiniai pakartojimai, po 3 techninius pakartojimus). ( d ) Mišrus splenocitai buvo kultivuojami didėjančiomis noradrenalino koncentracijomis 4 valandas, o B ląstelių gyvybingumas buvo nustatomas srauto citometrija, naudojant B ląstelių žymenis, aprašytus anksčiau (papildomas 2b pav.), ir Alexa Fluor-488-Annexin V negyvų ląstelių apoptozės rinkinį. . Noradrenalinas reikšmingai sumažino MZ ir B folikulų ląstelių gyvybingumą priklausomai nuo dozės ( n = 3 biologiniai pakartojimai). ( e ) Kaulų čiulpų ląstelės buvo paruoštos iš anksčiau negyvų C57BL / 6 pelių ir pažymėtos etiketėmis, kad būtų galima nustatyti B2 ląstelių pogrupio β2-AR raišką (papildomas 2c pav.). Β 2 -AR lygis buvo aukštesnis subrendusiose recirkuliacinėse dar negyvose B220 + CD23 + CD21 + ir CD138 + B220 + CD21 - / lo plazmos B ląstelėse. Nedidelė β2-AR raiška buvo nustatyta B220 + CD23 - CD21 + nesubrendusiose ir CD138 + B220 - CD21 - / lo ilgaamžiškose B atminties ląstelėse ( n = 12, 4 biologiniai pakartojimai su 3 techniniais pakartojimais kiekvienoje). f ) Kaulų čiulpų ląstelės buvo surinktos ant B220 ir nubraižytos prieš CD23 ir CD21 / 35, kad būtų galima atskirti naivias ir nesubrendusias B ląsteles. Ląstelės taip pat buvo surinktos, kad būtų galima atskirti plazmą nuo B atminties ląstelių (papildomas 2c pav.). ( g ) MCAO sukeltas reikšmingas B220 + CD23 + CD21 + neveiktų ir CD138 + B220 + CD21 - / lo plazmos B ląstelių sumažėjimas ( fiktyvus n = 4, MCAO n = 6). B2020 + CD23 - CD21 + nesubrendusios ir CD138 + B220 - CD21 - / lo atminties B ląstelės reikšmingai nepakito. ( h ) Sveiko žmogaus donoro kraujas buvo paženklintas β2-AR raiškos tėkmės citometrijos analizei CD19 + B ląstelėse. i ) 80% CD19 + B ląstelių žmogaus kraujyje ekspresuoja β2-AR ( n = 12 , 4 biologiniai pakartojimai su 3 techniniais pakartojimais). Duomenys rodo vidurkį + sd ( b, c, e ) vienpusė ANOVA su Bonferroni korekcija, f ) vienpusė ANOVA su TUKEY korekcija ( d, h ), be suporuotų t- testų * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001.

Visas dydis

Β 2 -AR taip pat buvo išreikštas kaulų čiulpų B ląstelių populiacijose specifiniam pogrupiui priklausančiame profilyje (vartojimo strategija pateikta papildomame 2c pav.). Β2-AR ekspresuojančių B20 + CD23 + CD21 + subrendusių naivios recirkuliacijos ir CD138 + B220 + CD21 - / lo plazmos B ląstelių dalis buvo žymiai didesnė nei B220 + CD23 - CD21 + nesubrendusių ir CD138 + B220 - CD21 - / B atminties ląstelės, kuriose buvo akivaizdi išraiška (6e pav.). Analizuojant β 2 -AR raišką diskretesniuose kaulų čiulpų B ląstelių pogrupiuose, naudojant išsamesnį antikūnų kokteilį ir alternatyvią atrankos strategiją, paaiškėjo tas pats išraiškos modelis (papildomas 6 pav.). Tai leidžia manyti, kad β 2 -AR raiška gali būti reguliuojama ekspresija, sukelta B ląstelių brendimo, ir žemai sureguliuojama diferencijuojant į ilgalaikį atminties fenotipą. Ryšys su insultu susijusioms B ląstelių disfunkcijoms buvo akivaizdus kaulų čiulpų B ląstelių subpopuliacijų pokyčiuose po MCAO. Subrendusios subrendusios subpopuliacijos, apimančios naivias ir plazmos B ląsteles, buvo žymiai sumažintos, tuo tarpu nesubrendusios B ląstelės, neseniai atskirtos nuo kraujodaros pirmtakų ir ilgaamžių B atminties ląstelių, liko palyginti nepakitusios (6f pav., G). Taigi kaulų čiulpų, taip pat blužnies B ląstelių jautrumas MCAO sukeltiems nuostoliams atitinka β2-AR raiškos modelį skirtinguose pogrupiuose. Šie duomenys taip pat rodo, kad ilgalaikis blužnies B ląstelių praradimas iki 5 dienų po MCAO yra mažai tikėtinas dėl limfoidinių audinių ląstelių pakartotinio atsinaujinimo stokos, nes kaulų čiulpuose nesikeitė nesubrendusių B progenitorių ląstelių skaičius. Atsižvelgiant į panašų insulto poveikį IgM pacientams ir pelėms, mes įvertinome, ar žmogaus B ląstelės ekspresuoja β 2 -AR. β2-AR raiška buvo nustatyta 85% CD19 + B ląstelių sveikų savanorių kraujyje (6h pav., i), kas rodo, kad žmogaus B ląstelės gali būti panašiai jautrios padidėjusiam katecholamino lygiui po insulto.

Β-adrenerginių signalų blokada apsaugo nuo MZ B ląstelių praradimo

Toliau mes nustatėme, ar blokuodamas β-AR signalizaciją in vivo galėtų užkirsti kelią MZ B ląstelių praradimui, kurį sukėlė MCAO, naudodamas pan-β-AR blokatorių propranololį. Po gydymo propranololiu buvo išsaugota blužnies struktūra ir MZ, ir folikulų B ląstelės sulaikytos po MCAO, palyginti su pelėmis, gydomomis PBS (7a pav.). Imunologinio žymėjimo kiekybinis įvertinimas patvirtino žymiai didesnį MZ B ląstelių žymėjimo plotą, naudojant kelis MZ B ląstelių žymenis (CD21 / 35, CD1d ir IgM (7b pav.).) Taip pat reikšmingai padidėjo ir bendras B220 + B ląstelių žymėjimo plotas WP. Propanranololiu gydytų gyvūnų, palyginti su kontroliniais, kurių metu buvo tiriama PBS, koncentracija buvo didesnė (7c pav.) Kartu su MZ B ląstelių konservavimu, IgM koncentracija plazmoje po MCAO buvo žymiai didesnė pelėse, gydomose propranololiu, palyginti su PBS paveiktomis kontrolinėmis medžiagomis (7 pav. 7d) ir lygiai, kurie buvo panašūs į tuos, kurie buvo stebimi auginant operacijas pelėms, aprašytoms aukščiau (4f pav.). Propranololio vartojimas žymiai sumažino bakterijų naštą, palyginti su PBS apdorotomis kontrolinėmis medžiagomis (7 e pav.). buvo tarpininkaujama užkertant kelią MZ ir folikulų B ląstelių mirčiai, kaip nustatyta sumažinus MZ (7f pav., g) ir folikulų (7f pav., h) B-ląstelių imunologinį žymėjimą kartu su TUNEL, palyginti su PBS valdikliai.Nėra reikšmingas propranololio poveikis infarkto tūriui, nors mes pastebėjome mažesnių infarktų tendenciją pelėse, gydomose propranololiu (papildomas 7a pav.). Tačiau smegenų sužalojimo mastas buvo panašus į aukščiau aprašytą (papildomas 1a pav.), Kuris sukėlė stiprų blužnies sutrikimą, kurio nebuvo propranololiu gydytoms pelėms. Be to, nebuvo ryšys tarp infarkto tūrio ir IgM koncentracijos plazmoje (papildomas 7a, b pav.), Tačiau plaučių bakterijų našta atvirkščiai koreliuoja su IgM koncentracija plazmoje. Tai patvirtina, kad gelbėjimas nuo stipriai slopinto IgM lygio pelėse, gydomose propranololiu, yra susijęs su mažesniu jautrumu infekcijai (papildomas 7c pav.). Šie duomenys kartu rodo, kad propranololis gali paveikti IgM koncentraciją plazmoje nepriklausomai nuo pirminio smegenų pažeidimo masto ir greičiausiai išsaugodamas blužnies B ląstelių populiacijas po MCAO, ypač MZ B ląsteles, kurios yra pagrindinis greitai indukuojamo IgM šaltinis. Kartu su aukščiau pateiktais in vitro radiniais šie duomenys rodo, kad β-AR signalizacija sukelia MZ B ląstelių ir įgimtų jų funkcijų praradimą anksti po MCAO. Svarbu tai, kad šių MCAO sukeltų sutrikimų panaikinimas dėl β-AR blokados yra susijęs su sumažėjusiu jautrumu insultų sukeltai infekcijai.

Image

Norėdami blokuoti β-adrenerginį signalizavimą, gyvūnai buvo gydomi 30 mg kg – 1 propranololio arba PBS nešiklio kontrole prieš pat MCAO ir vėl po 4 valandų, o prieš analizę buvo išgaunami 2 dienas. a ) Blužnies imuninis žymėjimas rodo gydymą propranololiu po to, kai MCAO išsaugo blužnies struktūrą su organizuotomis B ląstelių folikulais (mėlyna, B220) ir T ląstelių zonomis (žalia, CD3). MZ B ląstelių išsaugojimą po gydymo propranololiu taip pat galima nustatyti CD1d (raudona), IgM (žalia) ir CD21 / 35 (raudona) imuninis ženklinimas. PBS apdorotos kontrolinės medžiagos rodo MZ ir folikulinių B ląstelių praradimą ir sutrikusią mikroarchitektūrą po MCAO, kaip aprašyta anksčiau (1 ir 2 pav.; PBS n = 4, Propranololis n = 6). ( b ) MZ B ląstelių imuninio ženklinimo procentinio ploto, išreikšto 846, 28 μm 2 atvaizdu, kiekybinis įvertinimas naudojant MZ B ląstelių žymenis (CD21 / 35, CD1d ir IgM) patvirtino, kad žymiai padidėjo MZ B ląstelių žymėjimo plotas po gydymo propranololiu palyginimas su PBS apdorotomis kontrolinėmis medžiagomis. ( c ) Panašus kiekybinis įvertinimas parodė, kad žymiai padidėjo procentinis B220 + B ląstelių žymėjimo plotas pelėse, apdorotose propranololiu, palyginti su kontrolinėmis PBS, bet nebuvo reikšmingo poveikio T ląstelių žymėjimo plotui. ( d ) Igranų koncentracija plazmoje buvo žymiai didesnė pelėse, gydomose propranololiu, palyginti su kontrolinėmis, naudotomis PBS. e ) Plaučių bakterijų našta praėjus 2 dienoms po MCAO žymiai sumažėja gyvūnams, gydytiems propranololiu, palyginti su PBS gydytais. f ) Propranololiu gydomų gyvūnų, gavusių MCAO, šepečiai sumažino folikulų (mėlynos, B220) ir MZ B ląstelių (raudonos, CD1d) mirtį (žalią, TUNEL) WP, palyginti su tais, kurie buvo gydomi propranololiu. Kiekybinė ( g ) CD1d + B220 + MZ B ląstelių procentinės dalies arba ( h ) CD1d - B220 + folikulų B ląstelių imunologinio žymėjimo, kuris kartu lokalizuojasi su TUNEL, kaip MZ B arba folikulų B ląstelių mirties rodiklio analizė, parodytas CD1d + B220 + TUNEL + ir CD1d - B220 + TUNEL + ląstelių sumažėjimas gyvūnams, gydytiems propranololiu po MCAO, palyginti su gyvūnais, gydytais PBS. (PBS n = 4, propranololis n = 6). Mastelio juosta ( a, f ) 200 μm. Duomenys rodo ( b, c, e, g, h ) vidurkį + sd; nesuporuotas t- testas, ( d ) ± ± min iki maksimalios vertės mediana, Manno – Whitney testas. * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001.

Visas dydis

Diskusija

Pateikti duomenys pateikia įtikinamų įrodymų, kad po insulto yra įgimtų įgimtų B ląstelių neuroimuninis, ir šie pokyčiai rodo, kad šie pokyčiai yra naujas mechanizmas, prisidedantis prie išeminio insulto sukeltos infekcijos būsenos, be anksčiau aprašytų kitų imuninių ląstelių populiacijų pažeidimų. Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis įrodymas, kad insultas daro įtaką įgimtų B ląstelių antimikrobinėms funkcijoms. Key findings include that (1) stroke induces marked loss of splenic MZ B cells along with gross disruption to splenic microarchitecture, (2) MZ B-cell capture of antigen is deficient after stroke, (3) circulating IgM levels are suppressed after stroke in mice and humans and lower IgM levels are evident in stroke patients with infection and (4) β 2 -AR-mediated signalling drives stroke-induced MZ B-cell loss and susceptibility to infection.

MZ B cells are one of several types of lymphocytes that display innate-like attributes as reflected by their innate activation via pattern recognition receptors, speed of responsiveness and antigen polyreactivity, making them vital immune sentinels that mediate rapid systemic anti-microbial immunity 17, 19 . The depletion of MZ B cells as early as 24 h after MCAO results in deficits in the ability to capture MZ B-cell-targeted antigen and a high bacterial burden accumulates in the lungs over a similar time-frame. This rapid loss of a cell population which is critical for early anti-bacterial defence is highly relevant because of the timing of infections after stroke. Indeed, almost all cases of pneumonia occur within the first week, and half of these within 2 days 1, 4 . Such an immediate window of susceptibility suggests that deficiencies in innate or innate-like functions are important. Previous studies have reported altered macrophage responses early after stroke, however these have largely focussed on markers of immunoregulatory phenotype or antigen presentation rather than direct effector and microbicidal functions 5, 40, 41, 42 . In addition to their speed of response, MZ B cells are specialised to respond to T-independent antigens that include polysaccharides of encapsulated bacteria 17 . The bacterial strains causing early onset pneumonia in stroke patients most frequently include the encapsulated Streptococcus pneumoniae , Haemophilus influenzae , Klebsiella pneumoniae and Staphyloccocus aureus 43, 44, 45 . Loss of splenic MZ B cells early after MCAO is therefore of particular relevance to both the types of bacterial infection and when they occur in stroke patients.

Splenic MZ B cells are a major source of IgM, particularly during the early stages of infection 16, 46, 47, 48, 49 . Despite a high bacterial burden in the lungs and blood after MCAO and hence strong stimulus for antibody secretion, we found significantly lower levels of circulating IgM. IgM is also produced constitutively as 'natural' antibody by MZ B cells and B1 B cells 50 . Lower IgM levels after MCAO may reflect a loss of constitutive natural antibody production as well as impaired infection-triggered production due to a lack of MZ B cells. IgM has a short half-life ( ∼ 12 h) thus the early reduction in IgM we observed after MCAO is consistent with this rate of turnover 51 . In agreement with the mouse data, which showed rapid and sustained splenic MZ disruption, plasma IgM concentration was also significantly reduced in patients as early as 24 h after stroke and this was maintained up to the 5–7 days time point. Although it is possible that individuals who subsequently have stroke could have lower pre-existing IgM levels than those who do not, this is an unlikely explanation given that paired controls were well matched for age, sex and degree of atherosclerosis. A significantly greater reduction in IgM concentration during the first week after stroke was associated with infection, which was observed in one third of patients. As described in previous studies, infection was also associated with greater initial stroke severity 4, 12, 52 . Our data are consistent with a recent study showing lower IgG levels in stroke patients which was associated with bacterial infection, however, these deficits were not associated with a B-cell-dependent mechanism 53 . In conjunction with our mouse MCAO data, it is reasonable to speculate that deficits in innate-like B-cell function, including IgM production, could mediate the effects of greater stroke severity on infection risk in patients. However the precise mechanisms of reduced circulating IgM concentrations leading to susceptibility to bacterial lung infection still remain to be fully elucidated in the context of stroke. Our exploratory analysis indicated a combination of greater stroke severity and lower IgM may identify those individuals at particularly high risk of infection although further studies are warranted to address these links more definitively.

The loss of MZ B cells and suppression of circulating IgM levels after MCAO were reversed by blockade of β-AR signalling and this was accompanied by a significantly lower bacterial lung burden. The spleen is directly innervated and our data showing elevated splenic noradrenaline levels after MCAO are consistent with previous studies reporting activation of sympathetic neural circuits after MCAO and increased circulating catecholamines (or metabolites of these) in stroke patients 2, 54 . The expression of the β 2 -AR across different B-cell subsets was previously unknown and our data provide a rational explanation for the relatively greater sensitivity of MZ B cells to depletion after MCAO. Expression of the β 2 -AR on human B cells further supports their sensitivity to similar neural signals as observed in mice. Of particular note is that few immature B cells expressed the β 2 -AR and this correlated with stable numbers in the bone marrow after MCAO. Loss of specific splenic B-cell populationsis therefore unlikely to be the result of impaired B-cell differentiation in bone marrow and moreover highlights selective sensitivity of B cells at different stages of development to neural signalling activated after stroke. However we do not exclude that noradrenaline could also act indirectly via an intermediate cell to affect B cells after experimental stroke and the precise mechanisms of how brain ischaemia results in increased splenic noradrenaline remain to be determined. We used propranolol simply as an experimental tool to antagonise β 2 -AR signalling and it is likely that therapeutic targeting of B cells themselves would provide a superior approach clinically to target infection susceptibility given the potential adverse effects of general β 2 -AR blockade. Nonetheless it is relevant to note recent interest in re-evaluating the role of β-blocker treatment in stroke patients 55 .

As noted above, our data implicate B-cell death as the terminal mechanism responsible for their depletion after MCAO. β 2 -AR activation on B cells has thus far only been studied in vitro and reported effects vary dependent on other exogenous stimuli included in culture 56 . Atrophy of lymphoid organs including the spleen occurs after experimental stroke and is thought to reflect general apoptosis of lymphocytes although effects on MZ B cells specifically were unknown 40 . Previous studies have suggested that surgical and/or anaesthetic stress could contribute to transient immune alterations after MCAO 57, 58 . However effects on MZ B cells after MCAO were maintained out to 7 day and we observed no alterations in cell death or splenic microarchitecture and did not detect any bacterial growth in sham-operated mice. Thus, the effects we describe are specific to the stroke-induced brain injury.

The disruption to systemic anti-microbial B-cell function after stroke we describe here raises the possibility that interventions directed at preventing these changes could be a novel strategy to reduce infection risk and associated mortality/morbidity after stroke. Currently, there are no treatments proven to reduce rates of infection after stroke that improve clinical outcome, including preventative antibiotic therapy. A recent study suggests this may in part be due to ineffective prevention of pneumonia 59, 60, 61 . Transiently augmenting systemic B-cell function, in particular innate-like responses in the first few days after stroke, may offer potential advantages to other approaches. Effects of B cells in the brain during the acute phase of experimental stroke are neuroprotective and limit tissue-damaging inflammation suggesting the risk of exacerbating brain damage may be relatively low for B-cell-targeted approaches 62, 63 . The recent discovery that auto-antibody production by B cells may promote dementia long-term after experimental stroke, and have pathological effects in models of CNS trauma must be considered, however, these effects are likely greatly separated in time and space from the role of anti-microbial innate-like B-cell function relevant to infection control during the acute phase of stroke 64, 65 . Although increased risk of autoimmunity must also be considered, a recent study showed that generally attenuating stroke-induced immunosuppression increased levels of CNS-specific autoantibodies but had no detrimental effect on long-term outcome in mice 66 .

In conclusion, we propose that studies examining the effects of B-cell-targeted approaches to preventing infection after stroke are warranted and suggest that markers of systemic B-cell function, as an adjunct to existing indicators, may have potential utility in identifying stroke patients at particularly high risk of infection.

Metodai

Gyvūnai

Male 8–10-week-old C57BL/6 J mice were purchased (Charles River Laboratories, UK) and used in all experiments unless otherwise stated (Fig. 1h, i and Supplementary Fig. 1 batch numbers 4, 551, 4, 848, 4, 947; Figs 1a–g, 2a–c, e–g, 3a–e, 4f–j and 6a, b, Supplementary Fig. 3 batch number 5, 461; Fig. 4a–e and Supplementary Fig. 4 batch numbers 9, 224, 9, 225, 9, 777, 9, 778; Fig. 7 and Supplementary Fig. 7 batch number 6, 593 and Fig. 6c–e and Supplementary Figs 5 and 6, batch number unavailable). Ccr2 RFP/+ transgenic mice were used for flow cytometric analysis of B-cell subsets after stroke (Figs 2d and 6f, g and Supplementary Fig. 2) and have been previously described 67 . Breeding pairs of Ccr2 RFP/+ reporter mice on a C57BL/6 J background were purchased from Jackson Laboratories (ME, USA) and a colony was established in house. Mice were maintained under specific pathogen free (SPF) conditions and a standard 12 h light/dark cycle with unrestricted access to food and water. Mice were housed in individually ventilated cages in groups of up to 5 mice and were acclimatized for a minimum of 1 week before procedures. All animal experiments were carried out under the authority of a UK Home Office Project Licence in accordance with the 'Animals (Scientific procedures) Act 1986' and Directive 2010/63/EU and were approved by both The Roslin Institute's and the University of Edinburgh's Animal Welfare and Ethics Review Board. Experimental design, analysis and reporting followed the ARRIVE guidelines (//www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

Experimental stroke model

MCAO was performed under isoflourane anaesthesia (with O 2 and N 2 O) by insertion of a 6-0 nylon monofilament with a 2-mm coated tip (210 μm diameter; Doccol, USA) through the external carotid artery and advanced through the internal carotid artery to occlude the MCA. The filament was withdrawn after 40 min to allow reperfusion, the neck wound sutured and the animals recovered. Topical local anaesthetic (lidocaine/prilocaine) was applied to the wound. For sham surgery, the filament was advanced to the MCA and immediately retracted. Sham-operated animals remained anaesthetized for 40 min and recovered as above. Core body temperature was maintained at 37±0.5 °C throughout the procedure with a feedback controlled heating blanket (Harvard Aparatus). Animals were recovered for 1–7 days then anaesthetized and anti-coagulated (3.8% w/v tri-sodium citrate) cardiac blood samples were taken followed by transcardiac perfusion with saline.

Assessment of infarct volume

Coronal cryosections (20 μm in thickness) were cut at 400 μm intervals and stained with cresyl violet. Images were captured and infarct area on each coronal section was measured using ImageJ (//rsb.info.nih.gov/ij/). Infarct volume was calculated by the sum of all areas multiplied by the distance between each section. The volume of damage was corrected for oedema, as calculated by subtracting the volume of the contralateral hemisphere from the ipsilateral hemisphere and expressing the difference as a percentage of the contralateral hemisphere, as previously described 68 .

Immunohistochemistry and analysis of spleens

Serial frozen sections of spleen (6 μm in thickness) were cut on a cryostat, fixed in ice-cold acetone for 10 min, washed in 0.05% BSA in PBS and blocked using species-specific normal serum (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., PA, USA) according to secondary antibody used. Primary antibodies were incubated for 1 h at room temperature. Follicular B cells were detected using monoclonal antibody (mAb) B220 (2.5 μg ml −1 ) to detect CD45R (Caltag, Towcester, UK), or mAB 11-26c.2a (5 μg ml −1 ) to detect IgD (Biolegend, London, UK). MZ B cells were detected using mAb 1B1 (10 μg ml −1 ) to detect CD1d (BD Biosciences, PharMingen, Oxford, UK), or mAb Il/41 (2.5 μg ml −1 ) to detect IgM (affymetrix eBioscience, Hatfield, UK). MZ B cells and FDCs were visualised using mAb 7G6 (2.5 μg ml −1 ) to detect CR2/CR1 (CD21/CD35; BD Biosciences PharMingen). T cells were detected using mAb 145-2C11 (5 μg ml −1 ) conjugated to biotin to detect CD3 (affymetrix eBioscience). Splenic macrophage populations were visualised by staining with F4/80 (1 μg ml −1 ; clone BM8, Biolegend), MOMA-1 (5 μg ml −1 ) to detect CD169 (Siglec 1; clone 3D6.112, Biolegend), MARCO (5 μg ml −1 ; clone ED31, AbD Serotec, Kidlington, UK), or SIGN R1 (5 μg ml −1 ; CD209, clone 22D1; eBioscience). Splenic proteins BAFFR (Tnfsfr13c; 5 μg ml −1 ) and CD40 (5 μg ml −1 ) were detected using clone 7H22-E16 (Biolegend) and clone 3/23 (Thermo Fisher) respectively. Following the addition of primary antibody, sections were washed in PBS–BSA and 2.5 μg ml −1 of species-specific secondary antibody coupled to Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 dyes or Alexa Fluor 647 fluorochromes (Life Technologies Ltd, Paisley, UK) were incubated for 1 h at room temperature. Sections were washed in PBS–BSA and mounted in fluorescent mounting medium (Dako, Cambridgeshire, UK) and images captured using a Zeiss LSM5 confocal microscope (Zeiss, Welwyn Garden City, UK).

Digital images were analysed using ImageJ software. All spleens from each experimental group were analysed. From each spleen, two sections, 100 μm apart were studied and on each section data from 4 individual areas of WP collected. Fluorescent intensity thresholds were applied and the number of pixels of each colour (black, red, green and yellow) were automatically counted as previously described 69 and used to determine the area of immunolabelling for each cell type. To analyse MZ specific immunolabelling, a border was firstly drawn to separate the MZ from the follicle using MZ macrophage or follicular B-cell immunolabelling as a guide. The area of the WP was excluded and area of MZ zone specific immunolabelling was determined as previous.

TUNEL labelling of cell death

Apoptotic TUNEL + cells were measured using the ApopTag Fluorescein Direct In Situ Apoptosis Detection Kit (Merck Millipore, Hertfordshire, UK) to detect DNA fragmentation according to the manufacturers protocol along with B220 + immunolabelling to distinguish the WP. In brief, immunolabelling for B220 was performed as described above. Sections were then fixed in 1% paraformaldehyde in PBS, washed in PBS and post-fixed in ice-cold ethanol: acetic acid (2:1). Sections were incubated in reaction mix containing DIG-labelled dUTP and terminal deoxynucleotidyl transferase for 60 min. After washing, fluorescein-conjugated anti-DIG was applied to sample, which was then incubated in the dark for 30 min. Sections were washed and mounted in fluorescent mounting media (Dako) and images captured using a Zeiss LSM5 confocal microscope (Zeiss).

Srauto citometrija

Mouse spleens were mechanically dissociated and bone marrow obtained by flushing the femur and tibia from the left side in 5 ml PBS containing 0.1% BSA. Anti-coagulated venous blood was collected by venipuncture from healthy human donors. Red blood cells were lysed and resulting single-cell suspensions were used for flow cytometric analysis of B-cell populations and β 2 -AR expression. Briefly, cell surface staining to allow the detection of B-cell subpopulations was carried out using antibodies against CD45R (clone RA3-6B2; Biolegend; 2.5 μg ml −1 ), CD21/35 (CR1/2, clone 4E3; affymetrix eBioscience 1 μg ml −1 ), CD23 (FceRII, clone B3B4; Bioloegend, 1.25 μg ml −1 ), CD138 (syndecan-1, clone DL-101; Biolegend 5 μg ml −1 ), CD43 (clone S11; Biolegend 1 μg ml −1 ), CD93 (clone AA4.1; Biolegend 1 μg ml −1 ), IgD (clone 11-26c.2a; Biolegend 2.5 μg ml −1 ), IgM (clone RMM1; Biolegend, 1 μg ml −1 ) directly conjugated to fluorochromes and purified antibody against β 2 -AR (clone R11E1; Santa Cruz Biotechnology Inc, Heidelberg, Germany, 1 μg ml −1 ). Mouse cells were incubated in anti-mouse CD16/32 (clone 93; Affymetrix eBioscience, 0.4 μg ml −1 ) and human cells in Human TruStain FcX (Fc receptor blocking solution, Biolegend, 1/500) to block Fc receptors then primary antibody cocktails for 30 min at room temperature. For β 2 -AR labelling, anti-β 2 -AR antibody was added for 30 min, cells washed in PBS then incubated with goat-anti-mouse antibody conjugated to FITC (Poly 4053, Biolegend, 1 μg ml −1 ) for 30 min. Cells were washed again and then incubated in primary antibody cocktails. Flow cytometry was performed on a Becton Dickinson LSR Fortessa and analysed by Summit software (Dako). Lymphocytes were gated based on FSC and SSC and 20, 000 cells in this gate collected for each sample. Quantitative calibration with Countbright absolute counting beads (Life Technologies Ltd) was used according to the manufacturer's protocol to obtain absolute numbers of each cell population.

Cell sorting and subset-specific qPCR analysis

Mouse spleens were mechanically dissociated, red blood cells were lysed and resulting single-cell suspensions were labelled to allow distinction of MZ and follicular B-cell subsets using antibodies against CD45R (clone RA3-6B2; BD Biosciences) CD93 (clone AA4.1; Biolegend), CD23 (clone B3B4; Biolegend) and CD21/35 (clone ebio8D9; eBioscience) directly conjugated to fluorochromes. MZ and follicular B cells were sorted on a FACS Aria Illu and immediately processed for RNA extraction using the RNeasy Plus Micro kit (Qiagen) according to manufacturer's instruction. RNA quantity was determined by Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Renfrew, UK) and reverse-transcribed using Superscript III Reverse Transcriptase according to manufacturer's instructions (Life Technologies). qPCR was performed in a Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies) using Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) and primer pairs Adrb2- f 5′-TTGCCAAGTTCGAGCGACTA-3′ and Adrb 2-r 5′-GATCCACTGCAATCACGCAC-3′, Cd1d -f 5′-CCAGAGCCTTTGTGTACCAGT-3′ and Cd1d -r 5′-TTTTGCTGGGCTTCAGATTGTC-3′, and Actb primer kit from geNorm Reference Gene Selection Kit (Primerdesign, Eastleigh, UK). qPCR cycles were performed as follows: hot-start denaturation cycle 95 °C for 1 min, 40 cycles of amplification with 95 °C for 15 s, 60 °C for 30 s and 72 °C for 1 min. ΔCt (Ct of housekeeping gene, Actb , minus Ct of gene of interest) was calculated for each B-cell subset. Data are expressed as a reciprocal of this value.

Mikro matrica

RNA was isolated from ¼ spleens from sham-operated animals or animals recovered from MCAO for 5 days using the Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen, Manchester, UK). RNA integrity and quality were verified using Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). RNA was reverse-transcribed to cDNA, amplified and labelled using the Affymetrix terminal labelling kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), according to the manufacturer's instructions. Samples were hybridized to MoGene 1.0 ST chips (Affymetrix) using GeneTitan Hybridisation, Wash and Stain kit for WT array plates (Affymetrix), stained, and scanned by Edinburgh Genomics (Edinburgh, UK). Raw data (.cel) files were normalized directly during import for analysis in Partek Genomics Suite (Partek Inc, MO, USA.). Probesets were annotated using MoGene-1_0-st-v1 Probeset Annotations, Release 35. To determine which transcripts were changed due to experimental stroke, normalized datasets were compared in Partek by ANOVA. Enrichment analysis for Gene Ontology terms was performed in DAVID (//david.abcc.ncifcrf.gov/) by uploading lists of differentially expressed transcripts and selecting the GOTERM_BP_FAT annotation category. Enrichment was assessed using default settings. Pathway analysis was also performed in DAVID using the KEGG tool. Microarray data are deposited in the NCBI GeoDatasets database with the accession number GSE70841.

Kiekybinis PGR

Total RNA of 500 ng prepared for microarray (as above) was reverse-transcribed using superscript III Reverse transcriptase (Life technologies) according to manufacturer's instructions. qPCR was carried out on a Stratagene Mx3005P instrument (Agilent Technologies) using Qiagen RT 2 SYBR Green Mastermix (Qiagen) and RT 2 qPCR primer kits for Cr2 , Cd40 , Tnfsfr13c and Gappdh (Qiagen) according to manufacturer's instructions. qPCR cycles were performed as follows: hot-start denaturation cycle 95 °C for 10 min, 40 cycles of amplification of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min ΔCt (Ct of housekeeping gene, Gapdh , minus Ct of gene of interest) was calculated for each sample. Data are expressed as the normalised expression ratio (2 (−ΔΔCt) ) in comparison to sham samples.

Bacteriological analysis

Lungs were rinsed in sterile PBS and transferred to a gentleMACS C Tube containing 1 ml sterile PBS and homogenized on a gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotech, Surrey, UK). Lung homogenates and blood, collected and prepared as described above, were serially diluted, plated onto Columbia agar and horse blood (EOLabs, Bonnybridge, Scotland), incubated at 37 °C for 48 h and bacterial colonies counted.

Splenic marginal zone antigen capture

To assess the capture and transport of antigen by MZ cells in vivo , naïve mice or mice recovered 48 h after sham or MCAO, were administered either 20 μg of 3, 000 kDa Dextran conjugated to FITC (Sigma, Dorset, UK) or 1 μg antibody against CD21/35 conjugated to PE (eBioscience) by intravenous injection. Spleens were removed either 1 h or 24 h after injection and the presence of MZ cell-associated or FDC-associated fluorescent antigen was identified by immunohistochemistry as described above.

ELISA measurement of mouse plasma IgM and catecholamines

Plasma samples prepared from mice recovered for 48 h after sham-operation or MCAO were assayed using mouse Ready-Set-Go ELISA kits to detect IgM (affymetrix eBioscience) and 2-Cat (AN) research ELISA kits to measure noradrenaline and adrenaline (LDN laboratory diagnostics, Nordhorn, Germany). Blood samples obtained by cardiac puncture were incubated at room temperature for 30 min and centrifuged at 1, 000 g and supernatant plasma was collected. For measurement of IgM, plasma was diluted 1/10, 000 and ELISA carried out according to manufacturer's instructions. For detection of noradrenaline and adrenaline, 50 μl of spleen homogenate prepared from equal weights of spleen tissue was acylated, enzymatically converted and catecholamines measured by ELISA according to manufacturer's instructions.

Recruitment of stroke patients and plasma IgM measurement

Blood from healthy volunteers was collected for the analysis of β-adrenergic receptor expression under ethical approval obtained from the Lothian Research Ethics Committee (11/AL/0168). The current analysis of stored samples from the stroke patient and control cohort previously described 9, 36 was approved by the Health Research Authority National Research and Ethics Service Committee (14/EM/1117). Clinical evaluation of patients was as described previously and baseline characteristics of patients and controls are described in Supplementary Table 1 (ref. 36). Briefly, patients over 18 years presenting at Salford Royal Hospital, Salford, UK within 12 h of symptom onset of acute ischaemic stroke were eligible. Patients were excluded if there was any improvement in symptoms since onset, the time of onset of symptoms could not be reliably determined, or there was evidence of active malignancy. Control subjects with no history of stroke or transient ischaemic attack, without clinically evident infection necessitating medical treatment, and without a history of cognitive impairment sufficient to interfere with daily life were matched for age (± 5 years), sex and degree of atherosclerosis. Written informed consent (or assent from a relative) was obtained for all patients and control subjects. The National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) score 70 was used to measure stroke severity at presentation. Infections occurring in the 14 day after stroke onset were recorded prospectively during the study period using all available clinical information and original investigation results. Patients with infections preceding stroke onset were excluded from analysis. Venous blood samples were collected from patients at admission (up to 12 h after the onset of stroke symptoms), the next 09:00 hours time point where admission was before 07:00 or after 11:00 hours, 24 hours after admission, and 5–7 days at 09:00 hours. Blood was also drawn from resting control subjects at 09:00 hours and at a time matched to the patient's time of admission if this was before 07:00 or after 11:00 hours. To control for circadian variations stroke patient samples taken at admission and at 24 h were compared to admission-matched, paired controls, whereas stroke patient samples taken at 5–7 days were compared to 09:00 hours paired controls. Blood was collected into heparin-coated tubes and at 1 h after collection centrifuged at 2, 000 g for 30 min, at 4 °C. Plasma was separated, frozen and stored at −70 °C until analysis. IgM concentration was measured using human Ready-Set-Go ELISA kits to detect IgM (Affymetrix eBioscience) according to manufacturer's instructions.

In vitro splenocyte stimulation with noradrenaline

Single-cell suspensions were prepared from spleens from naïve C57Bl/6 J mice as above. Cells were cultured in 96-well plates (5 × 10 6 cells per ml) in media optimized for B-cell survival (RPMI, 1% L -Glutamate, 10% heat-inactivated foetal calf serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% sodium pyruvate, 1% non-essential amino acids and 0.1% β-mercaptoethanol) and incubated with 1, 10 or 100 nM of noradrenaline for 4 h (Sigma Aldrich). Cells were collected for flow cytometry labelling as above using CD45R + to identify B cells. Cell viability/ death was measured using an Alexa Fluor 488-Annexin-V dead cell apoptosis kit (Life Technology Ltd.) based on labelling with propidium iodide (PI) and annexin V. Viable cells were negative for both propidium iodide and annexin V labelling. At least three independent experiments each comprising triplicate samples were performed for all in vitro experiments.

In vivo blockade of β-adrenergic receptors

Treatment regimen was chosen according to the literature 2 to block β-adrenergic signalling pathways and not to perform a pre-clinical study on the effect of β-blockers in stroke. ( S )-(−)-Propranolol hydrochloride (propranolol; Sigma Aldrich) (30 mg kg −1 ) was administered by ip injection immediately before and 4 h after MCAO. An equivalent volume of PBS was administered in vehicle-treated animals. Animals were recovered for 2 d after MCAO and tissues collected as described above.

Experimental design and statistical analysis

Sample sizes were estimated from pilot studies and previous data using power analysis or the resource equation method. Animals were randomised to experimental groups (for example, time point after MCAO, drug treatment) using a computer-based random number generator (//www.randomizer.org/) and drug treatments were administered in a blinded manner. The assessor was unaware of allocation to experimental group during analysis of outcome measures although no formal blinding procedures were in place. Data are presented as mean±sd unless otherwise indicated. For normally distributed data differences were tested using unpaired Student's t -test or analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni or Tukey correction unless otherwise stated. For non-normally distributed data, equivalent non-parametric tests were used and results displayed as median±minimum and maximum values. Data analysis for bacterial colonies after MCAO and IgM concentration in patient samples was on log 10 -transformed values. For comparison of IgM concentration in stroke patients with and without infection, minimum IgM concentration was defined as the lowest value up to 7 day after stroke. Analysis of the relationship among stroke severity (NIHSS score), IgM concentration and infection in stroke patients is observational and for exploratory purposes only. Data were analysed using GraphPad Prism. In all experiments values of P≤ 0.05 were accepted as statistically significant.

Duomenų prieinamumas

Microarray data that support findings of this study are deposited in the NCBI GeoDatasets database with the accession number GSE70841. All other data supporting the findings of this study are available from the authors.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi skaičiai ir papildoma lentelė

  2. 2.

    Tarpusavio apžvalgos byla

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.