Su amžiumi susijęs humorinio atsako į gripą susilpnėjimas susijęs su antigeno specifinių t folikulų pagalbininkų ląstelių reakcijų pokyčiais | mokslinės ataskaitos

Su amžiumi susijęs humorinio atsako į gripą susilpnėjimas susijęs su antigeno specifinių t folikulų pagalbininkų ląstelių reakcijų pokyčiais | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Gripo virusas
  • Limfocitai

Anotacija

T folikulų pagalbininkų (T FH ) ląstelių reakcijos yra būtinos norint sukurti apsauginį humoralinį imunitetą gripo infekcijos metu. Senėjimas daro didelę įtaką CD4 + T ląstelių funkcijai ir humoraliniam imunitetui, tačiau senėjimo poveikis antigeno specifiniams T FH atsakams vis dar nėra aiškus. Gripo specifinės T FH ląstelės susidaro panašiu skaičiumi jaunų ir pagyvenusių gyvūnų infekcijos metu, tačiau T FH ląstelės iš senų pelių pasižymi reikšmingais skirtumais, įskaitant sumažintą ICOS ekspresiją ir padidėjusią IL-10 bei IFNγ gamybą, o tai gali pakenkti sąveikai su giminingomis medžiagomis. B ląstelės. Be to, daugiau gripo specifinių T ląstelių pagyvenusiose pelėse turi norminį fenotipą, kuris gali prisidėti prie sutrikusios T FH funkcijos. Priimami jaunų T ląstelių pernašos tyrimai parodė, kad TGF-β1 pagyvenusioje aplinkoje gali paskatinti padidėjusią reguliuojamų T ląstelių kaupimąsi. Senėjimas ir sena aplinka daro įtaką specifinėms antigenų T FH ląstelių funkcijoms ir formavimuisi, kurie prisideda prie sumažėjusio apsauginio humoralinio atsako.

Įvadas

Senėjimas yra susijęs su dramatišku imuniteto sumažėjimu, įskaitant didelio afiniteto neutralizuojančių antikūnų 1 susidarymą, dėl kurio padidėja jautrumas kliniškai reikšmingiems patogenams, tokiems kaip gripas. Didelio afiniškumo antikūnus sukuria B ląstelės, atrinktos gemalo centruose (GC), o GC susidarymas priklauso nuo tinkamos T folikulų pagalbininkų (T FH ) ląstelių funkcijos, 2, 3, 4, 5 . Po pradinio aktyvavimo naivios CD4 + T ląstelės progresuoja keliais tiksliai apibrėžtais etapais ir tampa funkcinėmis T FH ląstelėmis GC 6, 7 . Pirmiausia pre-T FH ląstelės aukščiau sureguliuoja B ląstelių folikulus primenančius chemokinų receptorius CXCR5 ir 6 transkripcijos represorinės B ląstelės limfomą (Bcl6). Šios ląstelės taip pat gamina IL-4 ir IL-21, pagrindinius B ląstelių aktyvavimo citokinus. Šis pirmasis etapas yra T-dendritinių ląstelių (DC) sąveikos rezultatas ir nepriklauso nuo B ląstelių 8 . Tada aktyvuotos T ląstelės pereina prie visiškai diferencijuotos T FH ląstelių būklės, kuriai būdinga daugybė žymenų, įskaitant slopinamojo receptoriaus užprogramuotą mirtį (PD) -1, kartu stimuliuojančių molekulių indukuojamą T ląstelių kostimuliatorių (ICOS) ir OX40, ekspresiją. su adapteriu baltymo signalizuojančios limfocitinės aktyvacijos molekulės (SLAM) asocijuoto baltymo (SAP) 9 . Šios molekulės palengvina efektyvią TB sąveiką, kuri yra būtina formuojant GC. Dėl ICOS 8, 10 arba SAP 11, 12 trūkumų sumažėja TFH ląstelių susidarymas ir (arba) sumažėja GC susidarymas. Ši sąveika su B ląstelėmis skatina tolesnį T FH ląstelių diferenciaciją į GC T FH ląsteles, kurios yra atpažįstamos per nuolatinę GL7 Akiba et al. 10, 13, 14, 15 . Svarbu dar nustatyti, kaip senėjimas veikia TFH ląstelių generavimo ir diferenciacijos stadijas.

Senų CD4 + T ląstelių funkciniai defektai jau yra gerai nustatyti 16 . Mes įrodėme, kad senėjusios CD4 + T ląstelės pasižymi sutrikusiu CD154 17 reguliavimu, o tai rodo, kad dėl netinkamos TB sąveikos gali sumažėti B ląstelių aktyvacija ir humoraliniai atsakai, pastebėti senyvo amžiaus pelėms. Jaunų CD4 + T ląstelių diferenciacija į T FH efektorines ląsteles taip pat reikšmingai sumažėjo, kai šios ląstelės buvo perkeltos į senyvus šeimininkus 18, kas rodo, kad sena aplinka nepajėgi išlaikyti T FH ląstelių diferenciacijos. Šie stebėjimai buvo atlikti priimant perdavimo modelius, naudojant T ląstelių receptorių (TCR) transgenines CD4 + T ląsteles. Lieka neaišku, ar endogeninės antigeno specifinės senatvės CD4 + T ląstelės turi galimybę įgyti T FH ląstelių fenotipą ir (ar) endogeninės T FH ląstelės turi funkcinius defektus infekcijos metu. Neseniai atliktas tyrimas, naudojant OVA imunizacijos modelį, parodė, kad senyvo amžiaus pelėse yra daugiau T FH nei jaunų pelių, tačiau amžiaus T FH buvo mažiau funkcinės, naudojant in vitro tyrimus 19 . Šis tyrimas nenustatė specifinių antigeno reakcijų in vivo ir tiksliai neapibrėžė TFH brendimo būklės. Be to, dar reikia ištirti senų pelių gebėjimą nustatyti antigenui specifinį CD4 + T ląstelių atsaką, lygų jaunų pelių reakcijai, ir tai, ar jis koreliuoja su antigenui specifišku B ląstelių atsakymu. Iš tikrųjų tai yra svarbūs dalykai ir tik tada, kai jie bus išsamiai išspręsti, galime pradėti suprasti su amžiumi susijusius humorinio imuniteto trūkumus ir, dar svarbiau, kaip juos galima pašalinti.

Čia mes panaudojome reagentus, leidžiančius sekti endogeninio gripo nukleoproteinų (NP) specifinių CD4 + T ir B ląstelių reakcijas jaunose ir senosiose pelėse. Ištirti endogeninių antigenų specifinius atsakus į infekciją yra labai svarbu norint suprasti visą imunologinių defektų, atsirandančių su amžiumi, apimtį. Tai leido mums nustatyti specifinius reaguojančių T FH ląstelių defektus senosiose pelėse ir jų įtaką humoralinėms reakcijoms.

Rezultatai

Sumažėjęs humoralinis atsakas pagyvenusioms pelėms po gripo infekcijos

Vienas iš senėjimo požymių yra nesugebėjimas sureaguoti į stiprią humorinę reakciją. Pagyvenusios pelės, užkrėstos subletalia (600 PFU) gripo A H1N1 PR8 doze, palyginti su jaunomis, sukūrė žymiai mažesnius gripui būdingo IgG (1 pav. A) ir neutralizuojančių antikūnų (1 pav. B) titrus. Didelio afiniškumo antikūnų generavimas priklauso nuo GC susidarymo, kurį gali paveikti su amžiumi susijęs funkcinis sumažėjimas 20 . Taigi, šiame modelyje mes siekėme ištirti GC indėlį į sumažėjusį gripo specifinių antikūnų titrų susidarymą pagyvenusiose pelėse.

Image

( A ) gripo specifiniai IgG titrai ir ( B ) gripą neutralizuojančių antikūnų titrai jaunose ir senyvo amžiaus pelėse, užkrėstose 600 PFU PR8, esant 0, 7, 14 ir 21 dpi. Duomenys yra 4–5 pelių / grupės vidutinis ± SEM iš 4 nepriklausomų eksperimentų reprezentacinio eksperimento. ( C ) CD38 / PNR raiškos kinetika po gripo infekcijos po gyvų CD19 + limfocitų atskyrimo. Vartai nubraižo GC B ląstelių populiaciją (PNA hi CD38 lo ), gretimais skaičiais parodydami GC B ląstelių dažnį. Duomenys yra 5 pelės / grupė iš reprezentatyvaus 3 eksperimento, atlikto nepriklausomai. ( D ) Bendras blužnies GC B ląstelių skaičius, nustatytas naudojant ( C ) parodytoje vartojimo strategijoje. Duomenys yra vidutinis ± SEM 8–13 pelių / grupėje iš trijų nepriklausomų eksperimentų. ( E ) Tipiški jaunų ir senų pelių blužnies atvaizdai 14 dpi, GL7 (žalia) B220 (rausvai raudona) su skalės juosta 500 μm. GC skaičiai per pusę blužnies ( F ) ir GC plotas ( G ) kiekybiškai įvertinti konfokaline mikroskopija. ( H ) Blužnies GC skaičiaus ir svorio atkūrimas esant 14 dpi. Duomenys yra vidutinis ± SEM iš 3 kombinuotų eksperimentų su 3–4 pelėmis kiekvienoje grupėje. ( I ) NP specifinių GC B ląstelių dažnis (sukibęs kaip ( C ) punkte). Histogramose pateikiami 4–5 pelių / grupės duomenys iš vieno reprezentatyvaus eksperimento, atlikto iš dviejų, atliktų nepriklausomai. ( J ) Bendros blužnies NP-specifinių GC B ląstelių, nustatytų naudojant ( C, I ) parodytas kombinuotas atjungimo strategijas. Duomenys yra vidutinis ± SEM 8–13 pelių / grupėje iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Bendras ( K ) arba NP specifinių ( L ) GC B ląstelių skaičius, esant 14 dpi, jaunoms ar senyvo amžiaus pelėms, kurios vieną dieną prieš užsikrėtimą PR8 gavo / negavo 3, 6 × 107 jaunų CD45.1 + CD4 + T ląstelių., suklijuotas ant CD45.1-GC B ląstelių, kaip ( C, I ). Duomenys yra 4–7 pelių kiekvienoje grupėje vidutinis ± SEM, gaunamas iš reprezentatyvaus 2 eksperimento, atlikto nepriklausomai. Statistinį reikšmingumą nustatė ( A, B, D, J ) dvipusė ANOVA (Bonferronni post hoc), ( F, G ), Studento t testas, ( H ) Pearsono koreliacija ir ( K, L ) vienpusė ANOVA ( Tukey HSD post hoc). * p <0, 05, ** p <0, 01; *** p <0, 001; **** p <0, 0001.

Visas dydis

GC B ląstelės buvo identifikuotos kaip CD19 + PNA hi CD38 lo ląstelės (dėžutės 1C pav.). Bendros (1C, D pav.) Ir NP-specifinių (1I, J pav.) GC B ląstelių generavimo kinetika buvo panaši tiek jaunoms, tiek pagyvenusioms pelėms, o proporcija ir skaičius buvo didžiausias per 14 dienų nuo užkrėtimo (dpi). . Vis dėlto, palyginti su jaunomis pelėmis, atsako amplitudė buvo žymiai mažesnė. Esant 14 dpi, maždaug 1% visų B ląstelių įgijo GC B ląstelių fenotipą vyresnėms pelėms, palyginti su daugiau kaip 7% jaunoms pelėms (1 pav. C). Tai sąlygojo žymiai mažesnį visų GC B ląstelių, pagamintų senuose blužniuose, skaičių, palyginti su jaunomis pelėmis (1 pav. D).

Ištyrus blužnies GC naudojant konfokalinę mikroskopiją, buvo akivaizdžių morfologinių skirtumų tarp jaunų ir pagyvenusių pelių (1 pav. E). Didžiausio GC atsako (14 dpi) pikių metu, palyginti su jaunomis pelėmis, pagyvenusių pelių parodoma žymiai mažiau (1F pav.) Ir mažesnių GC (1 G pav.). Svarbu tai, kad buvo stiprus ryšys tarp blužnies GC skaičiaus ir svorio atkūrimo esant 14 dpi (1H pav.). Jaunos ir senos pelės, kurios sukūrė daugiau blužnies gemalo centrų, padidino svorio atkūrimą po gripo infekcijos (1 pav. H), tai rodo, kad greitas pasveikimas nuo gripo infekcijos yra susijęs su tvirtu GC formavimu. GC B ląstelių, būdingų NP, procentas buvo šiek tiek, bet ne ženkliai mažesnis vyresniame amžiuje (22, 7 ± 7, 2%), palyginti su jaunomis pelėmis (37, 7 ± 3, 9%, p = 0, 104) (1 pav. I), esant 14 dpi, bet bendras NP + GC B ląstelių skaičius senosiose pelėse buvo maždaug dešimt kartų mažesnis nei jaunose pelėse (1 pav. J).

Nepaisant su amžiumi susijusių B ląstelių funkcijos sumažėjimo 21, jaunos polikloninės CD4 + T ląstelės, perkeltos į senyvus šeimininkus, gali pašalinti GC B ląstelių skaičiaus defektus, kurie paprastai būna senyvo amžiaus pelėms esant 14 dpi. Kai senosios pelės prieš užkrėtimą buvo papildytos jaunomis CD4 + T ląstelėmis (+ CD4 grupei), GC B ląstelių skaičius (1 pav. K) ir specifinių NP (1 L pav.) Skaičius pasiekia jaunų pelių endogeninio atsako skaičių. (jauna grupė) esant 14 dpi, pabrėžiant veiksmingos CD4 + T ląstelių pagalbos svarbą vystant tvirtą B ląstelių atsaką. Šie rezultatai atitinka mūsų ankstesnį atradimą, kad jaunos TCR transgeninės CD4 + T ląstelės gali įveikti B ląstelių defektus pagyvenusiose CD4 KO pelėse 17 . Taigi, likusia šio tyrimo dalimi buvo siekiama išsiaiškinti, kaip su amžiumi susiję CD4 + T ląstelių atsako defektai prisideda prie susilpnėjusios humoralinės reakcijos pagyvenusioms pelėms.

Pagyvenusios gripo specifinės CD4 + T ląstelės diferencijuojasi į pre-T FH ląsteles

Norėdami nustatyti, kaip antigenui būdingas CD4 + T ląstelių atsakas veikia senėjimą, mes panaudojome MHC II klasės gripo nukleoproteinų (NP) specifinį tetramerą, norėdami sekti jaunų ir pagyvenusių pelių ląsteles po infekcijos. 2A paveiksle pavaizduota reprezentacinė jaunų (viršutinė eilutė) ir pagyvenusių (apatinė eilė) NP4 specifinių CD4 + T ląstelių fenotipų nustatymo strategija 14 dpi. Po gripo užkrėstų jaunų ir senyvų pelių blužnyje besikaupiančių NP-CD4 + T ląstelių kinetika ir skaičius buvo lygiaverčiai (2B pav.). Analizuojant NP-specifines CD4 + T ląsteles, paaiškėjo, kad daugumoje (~ 70%) T FH ląstelių fenotipas (CXCR5 ir PD-1 hi ) buvo ne 14 dpi (2A pav., Raudonos dėžutės), bet taip pat 7 ir 21 dpi. (duomenys nepateikti). NP-specifinių T FH ląstelių skaičius taip pat buvo lygus tiek jaunoms, tiek pagyvenusioms pelėms visais tirtais laiko momentais (2 pav. C). Taip pat atkreipkite dėmesį, kad didesnis NP-Tet neg CD44 lo CD4 + T ląstelių procentas pagyvenusiose pelėse išreiškia PD-1, palyginti su jaunomis pelėmis (2A pav., Mėlyna dėžutė) - bruožas, būdingas senstančioms ląstelėms 22, 23 . Bendri T FH atsakymai neatitiko antigeno specifinio atsako tendencijos: senstančioms pelėms buvo didesnis T FH dažnis ir skaičius nei jaunoms pelėms prieš užkrėtimą, 7 dpi ir 21 dpi (papildomas 1 pav.). Jaunos pelės reagavo į gripo infekciją išplitusiu T FH, kuris pasiekė aukščiausią tašką 14 dieną po užsikrėtimo (papildomas 1 pav.). Pagyvenusių pelių TFH skaičius ir dažnis per infekciją buvo santykinai stabilus (1 pav.), Parodydamas, kad bendras atsakas neatspindi antigeno specifinio atsako, vykstančio pagyvenusioms pelėms.

Image

( A ) CXCR5 / PD-1 jaunų (viršutinė eilutė) ir pagyvenusių (apatinė eilutė) „Tet + CD44 hi“ (raudonos dėžės) ir „Tet neg CD44 lo“ (mėlynos dėžės) ląstelių CXCR5 / PD-1 išraiška po to, kai jie buvo pažymėti gyvuose CD4 + T limfocituose, esant 14 dpi . Sklypai rodo sujungtų 5 pelių / grupės duomenis iš vieno reprezentatyvaus eksperimento iš trijų, atliktų nepriklausomai. ( B ) Bendras blužnies NP-specifinių CD4 + T ląstelių skaičius, nustatytas srauto citometrijos metodu, naudojant ( A ) parodytą ribojimo strategiją. Duomenys yra 8–13 pelių / grupės, gautos iš trijų nepriklausomų eksperimentų, vidutinis ± SEM. ( C ) Bendras blužnies Tet + CXCR5 hi -PD-1 hi skaičius jaunoms ir senyvo amžiaus pelėms, nustatytas srauto citometrijos metodu, naudojant ( A ) parodytą taškymo strategiją. Duomenys yra 8–13 pelių / grupės, gautos iš trijų nepriklausomų eksperimentų, vidutinis ± SEM. ( D ) Bcl6 ekspresija jaunoms ir pagyvenusioms specifinėms CXCR5 hi -PD-1 hi CD4 + T ląstelėms, turinčioms specifines NPX, esant 14 dpi. Neigiama išraiška (punktyrinė linija) buvo nustatyta naudojant jaunas CXCR5 lo PD-1 lo CD4 T ląsteles. Histograma rodo sujungtų 5 pelių / grupės duomenis iš vieno reprezentatyvaus eksperimento iš trijų, atliktų nepriklausomai. ( E ) Bcl6 PFI, parodyta ( D ). Jaunų ir pagyvenusių NP Tet + CD4 + T ląstelių, gaminančių ( F ) IL-4 ir ( G ) IL-21, dažnis po PMA ir jonomicino stimuliavimo 7 dpi. Duomenys rodo 5 pelių / grupės vidurkį ± SEM iš vieno reprezentatyvaus eksperimento iš dviejų, atliktų nepriklausomai. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas Studento t testu.

Visas dydis

Norėdami patvirtinti CXCR5 hi -PD-1 hi -NP-specifinių CD4 + T ląstelių tapatumą kaip T FH ląsteles, įvertinome jų Bcl6, centrinio T FH ląstelių diferenciacijos variklio, raišką 24 . Bcl6 išraiška tiek jaunose, tiek pagyvenusiose NP-specifinėse T FH ląstelėse buvo palyginta su CXCR5 lo PD-1 lo CD4 + populiacija (2 pav. D). Jaunų ir pagyvenusių NP-specifinių T FH ląstelių Bcl6 vidutinis fluorescencijos intensyvumas (MFI) reikšmingai nesiskyrė (2 pav. E). Norėdami dar labiau patvirtinti, kad tiek jaunos, tiek pagyvenusios NP-specifinės CD4 + T ląstelės diferencijuojasi į T FH ląsteles, įvertinome jų gebėjimą gaminti IL-4 ir IL-21, citokinus, kuriuos gamina T FH ląstelės, svarbūs GC kartai. Dėl riboto žymeklių, kurie galėtų būti naudojami vienu metu srauto citometrijos analizei, skaičiaus ir kadangi didžioji dauguma NP specifinių CD4 + T ląstelių turėjo T FH charakteristikas (1 pav. A), mes manėme, kad blužnies NP Specifinės CD4 + T ląstelės buvo „TFH jungiamos“ ląstelės likusiam šių tyrimų laikotarpiui. Sutikdami su CD4 + T ląstelių diferenciacija į T FH ląstelių fenotipą, tiek jaunos, tiek pagyvenusios NP-specifinės CD4 + T ląstelės gamino IL-4 (2F pav.) Ir IL-21 (2 G pav.) Panašiomis proporcijomis. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad amžius nepakenkia CD4 + T ląstelių gebėjimui diferencijuotis į pre-T FH ląsteles (CXCR5 + Bcl6 + CD4 + T ląstelės) 6 . Kadangi mūsų ankstesni duomenys, naudojant senas TCR transgenines ląsteles, parodė, kad senyvo amžiaus CD4 + T ląstelės turi nepakankamą pagalbinę funkciją 17, mes hipotezavome, kad vėlesniuose T FH ląstelių diferenciacijos etapuose defektai gali būti sutrikę senyvo amžiaus NP-specifinėse CD4 + T ląstelėse.

Pagyvenusios gripo specifinės CD4 + T ląstelės sutriko diferenciacija į subrendusį T FH ląstelių fenotipą

Pasibaigus pre-T FH stadijai, ląstelės padidina paviršiaus ląstelių, dalyvaujančių TB ląstelių sąveikoje, raišką ir migruoja į TB ląstelių sieną, kur vyksta pirminė jų sąveika su B ląstelėmis. Norėdami nustatyti, ar sendintos NP specifinės T ląstelės ekspresuoja tinkamas ląstelių paviršiaus molekules, kad galėtų efektyviai sąveikauti su B ląstelėmis, įvertinome ICOS, Ly108, OX40 ir CD150 raišką jaunose ir senyvo amžiaus NP specifinėse T ląstelėse (3 pav.). ICOS ir Ly108 paviršiaus ekspresija senyvo amžiaus NP4 specifinėse CD4 + T ląstelėse buvo žymiai mažesnė nei jaunose CD4 + T ląstelėse. Ir atvirkščiai, OX40 ekspresija senyvo amžiaus NP-specifinėse CD4 + T ląstelėse buvo žymiai didesnė. CD150 ekspresija buvo panaši tiek jaunose, tiek pagyvenusiose ląstelėse.

Image

(Kairėje) Histogramos, parodančios jaunų ir pagyvenusių NP Tet + CD4 + T ląstelių ICOS, Ly108, OX40 ir CD150 ekspresiją 7 dpi taške. Neigiama arba pradinė išraiška (punktyrinė linija) buvo nustatyta naudojant jauną Tet neg CD44 lo CD4 T ląstelių populiaciją. (Dešinėje) histogramų PFI, rodomos kairėje. Histogramose (kairėje) pateikiami susieti duomenys, o grafikuose (dešinėje) pateiktas 5 pelių / grupės vidurkis ± SEM iš vieno reprezentatyvaus eksperimento iš dviejų, atliktų nepriklausomai. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas Studento t testu. ** p <0, 01 **** p <0, 0001.

Visas dydis

Šie duomenys leidžia manyti, kad sensta NP4 specifinės CD4 + T ląstelės gali susilpninti gebėjimą sąveikauti su B ląstelėmis dėl jų nesugebėjimo tinkamai sureguliuoti ICOS ir Ly108. Kadangi ICOS ir Ly108 vaidina svarbų vaidmenį sąveikoje su TB ir formuojant GC 10, 25, mažesnė šių molekulių ekspresija gali prisidėti prie senų CD4 + T ląstelių funkcinių trūkumų, o tai savo ruožtu gali prisidėti prie sumažėjusių humoralinių reakcijų, stebimų senyvo amžiaus pelėms.

Paskutinis T FH ląstelių diferenciacijos etapas atitinka patekimą į GC. Tai apibūdina GL7, žymens, kurį ekspresuoja TFH perduodamos CD4 + T ląstelės 13 ir susijęs su subrendusiu GC T FH ląstelės fenotipu 14, ekspresija. Atsižvelgiant į tai, kad NP-specifinis pre-T FH pakeitė receptorių ekspresiją, kuri gali pabloginti jų sąveiką su giminingomis B ląstelėmis, mes tikėjomės, kad pagyvenusių NP-specifinių CD4 + T ląstelių progresija į galutinį GC T FH ląstelių fenotipą taip pat gali būti sutrikusi. Todėl, įvertinę GL7 ekspresiją šiose ląstelėse, mes įvertinome, ar sendintos T FH ląstelės normaliai progresuoja į GC T FH ląstelių fenotipą. Nors 34, 5% jaunų NP-specifinių CD4 + T ląstelių GL7 reguliavo 7 dpi, tuo metu tik 19, 7% senų ląstelių buvo GL7 teigiamos (4A pav.). Tai sąlygojo žymiai didesnį GC NP-specifinių CD4 + T FH ląstelių skaičių jaunose, palyginti su senyvo amžiaus pelėmis, kurių išlaikymas buvo 14 dpi (4 pav. B). Norėdami toliau ištirti nepilną sendintų antigenui specifinių T FH ląstelių diferenciaciją į GC T FH ląstelių fenotipą, mes išanalizavome CXCR5, svarbios molekulės pre-T FH ląstelių migracijai į GC 3, raišką. Pagyvenusių NP specifinių T FH ląstelių CXCR5 ekspresija buvo mažesnė, palyginti su jų jaunomis priešingomis dalimis (4 pav. C), ir tai atitinka pre-T FH ląstelių fenotipą 14 .

Image

Sumažėjęs gemalo centro T FH ląstelių atsakas į gripo infekciją pagyvenusioms pelėms ( A ) GL7 ekspresija jaunose ir pagyvenusiose NP Tet + CD4 + T ląstelėse. Neigiama išraiška (punktyrinė linija) buvo nustatyta naudojant jaunas NP Tet neg CD44 lo CD4 + ląsteles. Histogramose pateikiami sujungtų 4–5 pelių / grupės duomenys iš vieno reprezentatyvaus eksperimento iš 3, atlikto nepriklausomai. Skaičiai viršutiniame dešiniajame kampe yra jaunų (juodų) ir sendintų (pilkų) ląstelių dažnis GL7 + vartuose. ( B ) Bendras blužnies „NP Tet + GL7 +“ ląstelių skaičius, nustatytas srauto citometrijos metodu, naudojant ( A ) parodytą ribojimo strategiją. Duomenys rodo 14–18 pelių / grupės vidurkį ± SEM iš 3 nepriklausomų eksperimentų. ( C ) CXCR5 MFI iš NP Tet + T FH ląstelių, gautų iš jaunų ir pagyvenusių pelių, esant 7 ir 14 dpi (naudojant atjungimo strategiją iš 2A pav.). Duomenys rodo 3–7 pelių / grupės vidurkį ± SEM iš 3 nepriklausomų eksperimentų. ( D ) Reprezentatyvūs jaunų (viršutinė eilutė) ir senų (apatinės eilės) pelių, turinčių 14 dpi taškų, blužnies atvaizdai, dažyti GL7 (žalia), kad būtų pažymėti GC, CD4 (geltona), Bcl6 (raudona) ir B220 (magenta) su mastelio juostomis 80μm. Įdėklai viduriniame skydelyje yra išdidinti paveikslėlyje ( E ). ( E ) T FH ląstelėms buvo būdinga Bcl6 ir CD4 (baltųjų) lokalizacija. ( F ) T FH ląstelės vienam GC buvo suskaičiuotos, suskaičiavus T FH ląsteles GL7 srityje, naudojant „Imaris“ programinę įrangą. ( G ) T FH ląstelės 1000 μm 2 GC plote buvo apskaičiuotos naudojant GC plotą (nustatomą sukuriant GL7 izosuropinį paviršių su Imaris) ir T FH ląstelių skaičių viename GC. Duomenys yra vidurkis ± SEM, surinkti iš trijų nepriklausomų eksperimentų su atvaizdais iš 17 pelių, kurių vienas vaizdas turi 1–4 GC ( D – F ). Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas Studento t testu. * p <0, 05; ** p <0, 01, *** p <0, 001.

Visas dydis

Iki šiol turimi duomenys rodo, kad pagyvenusiems gripui būdingos CD4 + T ląstelės paprastai diferencijuojasi į pre-T FH ląstelių fenotipą, tačiau mažiau progresuoja iki subrendusio GC fenotipo, palyginti su jaunomis pelėmis. Norėdami vizualizuoti šią imunologinę reakciją in situ , panaudojome daugiaspalvę konfokalinę mikroskopiją. Atsižvelgiant į ribotus vaizdus naudojant MHC II klasės tetramerus, mes sutelkėme dėmesį į bendrą reakciją į gripo infekciją jaunuose ir senuose blužniuose. Buvo padidėjęs GC dezorganizavimas, kurį pastebėjo išsibarstę GL7 + plotai (4D pav., Kairiosios plokštės). Sujungti vaizdai parodo, kad senėjusios pelės pastebimai sutrikdė blužnies baltųjų minkštimų struktūrą, palyginti su jaunomis, tai reiškia T ir B ląstelių sričių susiliejimą (4 pav. D, dešinės plokštės). Didelis mikroarchitektūros sutrikimas, stebimas senėjusių pelių GC, taip pat galėtų prisidėti prie mažesnio apsauginio humoralinio atsako susidarymo. Toliau mes siekėme išsiaiškinti, ar TFH lokalizuojasi gemalo centre palyginus senstančioms ir jaunoms pelėms. T FH ląstelės buvo identifikuotos lokalizavus Bcl6 ir CD4 (4 pav. E, intarpas iš 4 pav. Vidurinio skydelio). Norint kiekybiškai įvertinti GC T FH ląsteles, buvo suskaičiuotos ląstelės, ekspresuojančios CD4 ir Bcl6 GL7 + srityse. Pagyvenusios pelės turėjo mažiau T FH ląstelių viename GC, palyginti su jaunomis pelėmis, esant 14 dpi (4F pav.), Pagal mūsų antigenui specifinius T FH srauto citometrijos duomenis (4 pav. B). Tačiau kadangi kiekvienos GC dydis yra mažesnis vyresnio amžiaus pelių plote, palyginti su jaunų pelių GC (1 pav. G), T FH skaičius 1000 μm 2 GC nesiskiria tarp jaunų ir senų pelių (1 pav. 4G). Iš šių duomenų galime daryti išvadą, kad sumažėjęs T FH skaičius gemalo centre yra sumažėjusio gemalo centro dydžio, o ne tankio, funkcija.

Visi šie duomenys patvirtina hipotezę, kad sutrinka senyvų NP-specifinių CD4 + T ląstelių aktyvacija ir diferenciacija reaguojant į gripo infekciją ir dėl to sumažėja GC T FH ląstelių skaičius, o tai gali prisidėti prie nepakankamo GC atsako. Tada mes tardėme PD-1 raišką jaunose ir senyvo amžiaus CD4 + T ląstelėse gripo infekcijos metu, nes Sage et al. Neseniai aprašė padidėjusią PD-1 raišką senatvėje T FH . 19, kuris pasiūlė, kad padidėjusi PD-1 ekspresija gali būti atsakinga už sumažėjusią pagyvenusio T FH funkciją . Bendra pagyvenusių CD4 + T ląstelių populiacija (papildomas 2A – C pav.), Taip pat bendra TFH populiacija (papildomas 2D pav., E) iš tikrųjų išreiškia aukštesnį PD-1 lygį, palyginti su jaunais. Svarbu ir priešingai nei Sage et al. , jaunų ir pagyvenusių pelių PD-1 raiškos NP-specifinio T FH skirtumu 7 dpi (2F papildomas pav.) ir 14 dpi nėra, o jaunų T FH išreiškia aukštesnį lygį, palyginti su senyvo amžiaus (papildomas 2G pav.) ). Taigi mūsų gripo modelyje padidėjusi PD-1 ekspresija pagyvenusiam Ag specifiniam T FH negali paaiškinti jų sumažėjusios funkcijos.

Pagyvenusių pelių NP-specifinės CD4 + T ląstelės turi norminį fenotipą

Kadangi senyvo amžiaus pelėms sutrinka CD4 + T ląstelių progresavimas į visiškai diferencijuotas GC T FH ląsteles, mes hipotezavome, kad bus paveiktas jų B ląstelių pagalbininkų aktyvumas. Kitoje eksperimento serijoje mes įvertinome IL-2, IL-10 ir IFNγ produkciją jaunų ir pagyvenusių NP-specifinių CD4 + T ląstelių srauto citometrijos metodu. Remiantis ankstesniais pranešimais 26, senstamų NP-CD4 + T ląstelių, gaminančių IL-2, dalis buvo žymiai mažesnė nei jaunų ląstelių (5 pav. A). Įdomu tai, kad vyresnio amžiaus ląstelės dažniau gamina IL-10 (5B pav.) Ir IFNγ (5C pav.) Nei jaunos ląstelės. Nereguliuojamas citokinų gaminimas pagyvenusioms NP-specifinėms CD4 + T ląstelėms gali parodyti netinkamą efektorių diferenciacijos programą, galinčią paveikti šių ląstelių pagalbinį aktyvumą, taigi ir GC susidarymą.

Image

Jaunų ir pagyvenusių NP Tet + CD4 + T ląstelių tarpląstelinis citokinų dažymas, surinktas 7 dpi ir stimuliuotas PMA / Ionomicinu. Grafikai rodo NP-specifinių CD4 + T ląstelių, gaminančių: ( A ) IL-2, ( B ) IL-10 ir ( C ) IFNy, dažnio vidurkį ± SEM. Duomenys gauti iš 5 pelių / vieno reprezentacinio eksperimento iš dviejų grupių, atliktų nepriklausomai. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas Studento t testu. *** p <0, 001; **** p <0, 0001.

Visas dydis

Sumažėjusi IL-2 gamyba kartu su padidėjusia IL-10 gamyba primena norminių T ląstelių fenotipą ir pranešama, kad senstant 27, 28, 29, 30 padidėja reguliuojamų T ląstelių dažnis. Ištyrus visas Foxp3 + CD4 + T ląsteles, mūsų duomenys taip pat parodė padidėjusį reguliuojamų T ląstelių dažnį pagyvenusioms pelėms visais laiko momentais (6 pav., B). Bendras reguliuojamų T ląstelių skaičius buvo tik žymiai didesnis senyvo amžiaus pelėms, esant pastoviai būsenai ir 7 dpi (6 pav. C). Norėdami nustatyti, ar vyresnio amžiaus NP-specifinės CD4 + T ląstelės pasižymi reguliuojančiomis T ląstelių savybėmis, įvertinome Foxp3 ekspresiją jaunose ir senyvo amžiaus gripo infekuotose pelėse. Esant 7 dpi, specifinių NP4 CD4 + T ląstelių, išreiškiančių Foxp3, skaičius reikšmingai nesiskyrė jaunų ir pagyvenusių asmenų grupėse (6A pav.). Tačiau 14 taškų skirtumu NP-specifinių CD4 + T ląstelių, išreiškiančių Foxp3, skaičius buvo žymiai didesnis senyvo amžiaus, palyginti su jaunomis pelėmis (6 pav. B). Neseniai buvo apibūdintas reguliuojančių T ląstelių, kurios specifiškai kontroliuoja GC B ląstelių ir GC T FH ląstelių atsakus, pogrupis, T folikulų reguliavimo (T FR ) ląstelės. T FR ląstelės identifikuojamos pagal CD4, PD-1, CXCR5, Foxp3 ir Bcl6 ekspresiją 31, 32, 33 . Esant 7 dpi, NP-specifinių T FR ląstelių susidarymas nesiskyrė (6F pav.), Tačiau esant didžiausio GC atsako (14 dpi) amžiaus pelėms, padidėjo NP specifinių T FR ląstelių skaičius (6 G pav.) . Bendras T FR ląstelių skaičius taip pat padidėjo amžiaus pelėms, palyginti su jaunomis pelėmis, visais laikotarpiais po infekcijos (papildomas 1 pav.). Padidėjęs NP-specifinių T FR ląstelių ir reguliuojančių T ląstelių kiekis gali prisidėti prie prasto GC T FH ląstelių ir humoralinio atsako, stebimo pagyvenusioms pelėms po gripo infekcijos. Norėdami dar labiau suprasti, kaip senėjimas veikia reguliuojančias ląsteles, toliau tyrėme senstančios aplinkos indėlį į jų formavimąsi.

Image

( A ) reprezentatyvios visų CD4 + T ląstelių, ekspresuojančių Foxp3, histogramos jaunose ir senyvo amžiaus pelėse. Visų CD4 + T ląstelių, išreiškiančių Foxp3 jaunų ir senų pelių blužniuose prieš gripo infekciją, dažnis ( B ) ir skaičius ( C ) (7dpi ir 14dpi). NP-specifinių CD4 + T ląstelių, ekspresuojančių Foxp3, skaičius jaunų ir pagyvenusių pelių blužnyje, kai ( D ) 7 dpi ir ( E ) 14 dpi. NP-specifinių CD4 + CXCR5 hi -PD-1 hi Bcl6 + Foxp3 + ląstelių skaičius jaunų ir senų pelių blužnyje ( F ) 7 dpi ir ( G ) 14 dpi. Duomenys yra 3–10 pelių kiekvienoje grupėje vidutinis ± SEM iš 3 reprezentatyvaus eksperimento, atlikto 3 nepriklausomai. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas naudojant dvipusį ANOVA, naudojant LSD post testą ( B, C ) arba Studento t testą ( D – G ). * p <0, 05, p <0, 001.

Visas dydis

Pagyvenusios aplinkos poveikis reguliuojamosioms T ląstelėms

Norėdami įvertinti, ar reguliuojamų T ląstelių kaupimasis pagyvenusiose pelėse buvo būdingas ląstelėms, ar senyvoji aplinka prisidėjo prie jų kaupimosi, atlikome įtėvio perkėlimo eksperimentą. Jaunos ir pagyvenusios pelės vieną dieną prieš gripo užkrėtimą gavo jaunas poliklonines CD45.1 + CD4 + T ląsteles. Šiam eksperimentui mes panaudojome polikloninį modelį, nes T FR ląstelės yra gautos iš timos ir nėra TCR transgeninėse populiacijose, tokiose kaip OT-II modelis 31 . Jaunų CD4 + perkeltų T ląstelių fenotipas buvo išanalizuotas naudojant srauto citometriją 14 dpi. Didesnis T donoro ląstelių dažnis pagyvenusiose pelėse išreiškė Foxp3, palyginti su donoro ląstelėmis jaunose pelėse (7A pav.). Tai papildė padidėjęs jaunų CD4 + perkeltų ląstelių, susijusių su senais šeimininkais, reguliavimo ir efektorių santykis (7 pav. B). Ištyrus donoro CD4 + T ląsteles, išreiškiančias T FR fenotipą (Bcl6 + ir Foxp3 + ), jaunų ar pagyvenusių šeimininkų dažnis nesiskyrė (7 pav. C). Nors T FR ląstelių vystymąsi skatinantys veiksniai vis dar aiškinami, TGF-β1 yra žinomas Foxp3 ekspresijos 34 induktorius / stabilizatorius. Senyvių pelių blužnyje buvo žymiai didesnis aktyvaus TGF-β1 lygis, palyginti su jaunomis pelėmis, esant 14 dpi (7 pav. D), o tai gali prisidėti prie reguliavimo T ląstelių kaupimosi vyresnio amžiaus šeimininkams. Norėdami nustatyti, ar aktyvaus TGF-β1 koncentracija senuose blužniuose yra pakankama norminių T ląstelių vystymuisi skatinti, mes atlikome in vitro tyrimą, kuriame jaunos CD4 + CD25 - T ląstelės buvo auginamos naudojant standartinę koncentraciją (5000 pg / ml). TGF-β1, kad T ląstelės būtų poliarizuotos į 35 reguliavimo ląsteles, TGF-β1 koncentracija senuose blužniuose (100 pg / ml) arba TGF-β1 nėra. TGF-β1, esant 100 pg / ml, pavertė CD4 + T ląsteles į reguliuojančias T ląsteles tokiu pat dažniu (7%) kaip in vivo perdavimo eksperimentai (7 pav. E), kas rodo, kad TGF-β1 senėjimo blužnies aplinkoje gali paskatinti formavimąsi reguliuojančių T ląstelių. Šie duomenys rodo, kad yra ir vidinių, ir išorinių CD4 + T ląstelių veiksnių, kurie prisideda prie pagyvenusių pelių reguliavimo aplinkos, o tai gali neigiamai prisidėti prie T FH ląstelių funkcijos ir, savo ruožtu, slopinti humoralinį atsaką pagyvenusioms pelėms gripo infekcijos metu.

Image

Išgrynintos jaunos CD45.1 + CD4 + polikloninės T ląstelės buvo perneštos į uodegos venų injekciją į jaunus ar pagyvenusius šeimininkus po 3, 6x107 ląstelių kiekvienoje pelėje. Vieną dieną po perkėlimo pelės gavėjos buvo užkrėstos 600PFU PR8 gripu ir vėliau buvo paaukotos analizei po 14 dienų. ( A ) CD4 + perkeltų ląstelių Foxp3 ekspresija jaunuose ar senuose šeiminiuose. ( B ) CD4 + perkeltų ląstelių, esančių jauname ar sename šeimininke, reguliavimo ir efektorių santykis, apskaičiuotas pagal Foxp3 + / Foxp3 - donoro CD4 + ląstelių procentą. ( C ) CD4 +, CXCR5 hi, PD-1 hi, Bcl6 + pernešė ląsteles, išreiškiančias Foxp3 jauname ar sename šeimininke. ( D ) Aktyvus TGFβ-1 lygis blužnies supernatantuose iš pelių, gavusių aukščiau aprašytas perkeltas ląsteles. Duomenys yra 4–7 pelių kiekvienoje grupėje vidutinis ± SEM iš 3 reprezentatyvaus eksperimento, atlikto 3 nepriklausomai. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas Studento t testu ( A – D ). * p <0, 05. *** p <0, 001. ( E ) CD4 + CD25 - T Jaunų pelių ląstelės buvo kultivuojamos 5000 pg / ml (standartinė koncentracija gaminant „iTregs 35“ ), 100 pg / ml (koncentracija senuose blužniuose) arba 0 pg / ml TGF-β1. Derinami trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatai. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas naudojant pakartotinius matavimus ANOVA su Sidak post hoc testu. * p <0, 05.

Visas dydis

Diskusija

Senėjimas yra susijęs su imuninės sistemos funkcijos sumažėjimu, įskaitant sumažėjusias humorines reakcijas. Čia parodyta, kad po gripo užkrėstų pelių, nustatytų senatvinėse pelėse, mažas specifinių gripo antikūnų titras yra susijęs su sumažėjusiu bendrųjų ir NP-specifinių GC B ląstelių skaičiumi bei sumažėjusiu GC dydžiu, skaičiumi ir reakcijomis, palyginti su jaunomis pelėmis. Mes taip pat parodėme, kad bendro ir NP specifinių GC B ląstelių skaičiaus trūkumus galima pašalinti pridedant jaunas CD4 + T ląsteles. Tai rodo, kad B ląstelių vidinių defektų greičiausiai nepakanka norint paaiškinti GC pažeidimo laipsnį ir kad prie šių defektų gali prisidėti kiti veiksniai, pavyzdžiui, su amžiumi susiję pokyčiai T FH ląstelėse.

Ankstesniuose tyrimuose mes parodėme, kad sensta CD4 + T ląstelės įgyja vidinius defektus, kurie pablogina jų pagalbininkų funkcijas 17, 36 . Šios išvados buvo padarytos atlikus pastebėjimą, kad senos TCR transgeninės CD4 + T ląstelės, perkeltos į jaunas CD4 KO peles, palaiko silpnesnį GC atsaką, palyginti su jaunomis CD4 + T ląstelėmis. Šis su amžiumi susijęs funkcinis defektas buvo susijęs su sutrikusia CD154 raiška. Be to, mes įrodėme, kad pasenusi mikroaplinka taip pat prisideda prie sumažėjusios CD4 + T ląstelių pagalbinės funkcijos, naudodama įtėvio perdavimo modelį 18 . Šių eksperimentų metu jaunoms CD4 + T ląstelėms buvo atidėtas aktyvavimas ir išsiplėtimas, taip pat sumažėjusi diferenciacija į T FH ląstelių fenotipą, kai jos buvo perkeltos į senyvus šeimininkus, palyginti su jaunais šeimininkais 18 . Tai koreliavo su sutrikusia jaunų donoro ląstelių sankaupa senų pelių blužnies T ląstelių vietose - reiškinys, greičiausiai susijęs su sumažėjusia CCL19 ir CCL21 ekspresija šiame organe 18 . Šie eksperimentai leido mums nustatyti su amžiumi susijusių vidinių ir išorinių defektų indėlį į CD4 + T ląstelių skyrių sutrikusio GC reakcijoje, stebimo senyvo amžiaus pelėms.

Čia pateikti rezultatai pateikia įrodymų, kad endogeninės, sendintos antigeno specifinės CD4 + T ląstelės turi savo gebėjimo visiškai diferencijuoti į GC T FH ląstelių fenotipą trūkumą reaguodamos į gripo infekciją. Nors toks pat skaičius NP-specifinių CD4 + T ląstelių įgijo pre-T FH charakteristikas (CXCR5 + PD-1 + Bcl6 + ) jaunose ir senyvo amžiaus pelėse, senyvo amžiaus T FH ląstelės išreiškia žemesnį ICOS ir Ly108 lygį ir mažiau išreikštą GL7, GC T FH ląstelių žymeklis. Svarbu tai, kad šis T FH ląstelių diferenciacijos trūkumas yra susijęs su sutrikusia NP-specifinių GC B ląstelių generacija. GL7 yra molekulė, kurią lengvai ekspresuoja aktyvuotos NP-specifinės CD4 + T ląstelės, ir jos ekspresijos palaikymas GC T FH ląstelėse priklauso nuo giminingos TB sąveikos 13 . Taigi, mes manome, kad žemas amžius brandintų NP-specifinių CD4 + T ląstelių, ekspresuojančių GL7, rodo netinkamą TB ląstelių sąveiką.

Kelios pastabos patvirtina hipotezę, kad senėjimas neigiamai veikia TB ląstelių sąveiką. Pirma, sumažėjęs NP-specifinių B ląstelių skaičius senų pelių blužnyje gali prisidėti prie sutrikusios GL7 ekspresijos. Antra, tai gali būti sutrikęs T ląstelių įdarbinimas B ląstelių folikuluose. Dabartiniai mūsų duomenys atitinka ankstesnį mūsų darbą, parodantį, kad B ląstelių folikulų architektūra senyvų pelių blužnyje buvo netvarkinga 18 . Be to, CCR7 ligandų CCL19 ir CCL21 kiekis buvo žymiai mažesnis 18, o CXCR5 ligando CXCL13 buvo daugiau 37 metų, palyginti su jaunų pelių blužniais. Šie signalai gali prisidėti prie mažesnių GC, aptinkamų pagyvenusiose pelėse, turinčiose mažiau T FH ląstelių nei jų jaunuose partneriuose. Dėl chemotaktinių signalų pusiausvyros ir blužnies baltųjų blužnies nesutvarkymo, senstančioms pelėms greičiausiai sumažėja pagyvenusių T FH ląstelių galimybė rasti ir sąveikauti su giminingomis B ląstelėmis.

Be to, mes pastebėjome, kad kartu stimuliuojančios molekulės ICOS ekspresija buvo žymiai sumažėjusi, palyginti su jaunomis NP-specifinėmis CD4 + T ląstelėmis. Neseniai atliktas Xu ir jo kolegų tyrimas parodė, kad ICOS dalyvauja CD4 + T ląstelių lokalizavime B ląstelių folikuluose nepriklausomai nuo ICOS ligando 15 . Mažesnė ICOS ekspresija T FH ląstelėse galėtų sumažinti jų gebėjimą migruoti folikuluose ir sąveikauti su B ląstelėmis. Sutapdami su šiais rezultatais mes taip pat parodėme, kad NP specifinėms T FH ląstelėms yra mažesnė CXCR5 ekspresija - kita svarbi molekulė, skirta T FH ląstelėms priderinti prie B ląstelių folikulų 3 . ICOS vaidina pagrindinį vaidmenį keliuose GC reakcijos etapuose, o ICOS trūkumas turinčios CD4 + T ląstelės negali atskirti TFH ląstelių fenotipo 10 . Lygiavertė NP-specifinių T FH ląstelių generacija tiek jaunose, tiek pagyvenusiose pelėse, nors ir mažesnė ICOS ekspresija senosiose ląstelėse rodo, kad šis ICOS ekspresijos lygis yra pakankamas pradinei T FH ląstelių diferenciacijai, bet ne visiškam diferenciacijai. į GC T FH ląstelių fenotipą. ICOS signalizacija taip pat prisideda prie GC atsako, indukuodama kitų kartu stimuliuojančių molekulių, tokių kaip CD40L 38, 39, 40, ekspresiją ir darydama įtaką citokinų gamybai T ląstelių 38, 39, 40 ir GC B ląstelių 41 . Ly108 taip pat buvo nustatytas kaip pagrindinis TB ląstelių sąveikos reguliatorius 25 tiek per teigiamus, tiek neigiamus signalus 42 . Dėl to sumažėjusi ICOS ir Ly108 ekspresija pagyvenusioms NP-specifinėms CD4 + T ląstelėms gali turėti didelę įtaką TB ląstelių sąveikos stabilumui ir vėlesniam GC vystymuisi.

Galiausiai, mes pastebėjome, kad daugiau NP-specifinių CD4 + T ląstelių išreiškia transkripcijos faktorių Foxp3 senyvo amžiaus, palyginti su jaunomis pelėmis, kai mažiau amžiaus ląstelių gamina IL-2 ir daugiau ląstelių, gaminančių IL-10. Padidėjęs reguliuojamų T ląstelių dažnis ir (arba) pagyvenusių pelių skaičius buvo praneštas kelioms grupėms 27, 28, 29, 30 ir šis padidėjimas taip pat buvo susijęs su sumažėjusia imunine funkcija 27, 30 . Įdomu tai, kad pelėms, kurioms trūksta reguliavimo T ląstelių, padidėja GL7 + GC T FH ląstelių dalis 43 . T FR ląstelės yra svarbūs GC B ląstelių ir T FH ląstelių atsakų slopintuvai, kurie gaunami iš užkrūčio liaukos reguliavimo ląstelių 31, 32, 33 . Padidėjęs Foxp3 + reguliuojančių T ląstelių kiekis, rastas senyvo amžiaus pelėse, galėtų prisidėti prie padidėjusio bendro ir antigenui būdingų T FR ląstelių skaičiaus senyvo amžiaus pelėse. Sage et al. naujausioje ataskaitoje parodė, kad jaunos ir pagyvenusios T FR ląstelės turi vienodą slopinamąjį poveikį. Todėl T FR ląstelės, gautos iš senų pelių, gali padėti sumažinti GC B ląstelių ir GC T FH ląstelių susidarymą po infekcijos. Mes taip pat parodėme, kad sendinta aplinka skatina reguliuojamą T ląstelių vystymąsi, iš dalies dėl padidėjusio aktyvaus TGF-β1, žinomo Foxp3 ekspresijos 34 induktoriaus. Future studies will address the cellular source of TGF-β in aged mice.

In conclusion, we show that an appropriate number of NP-specific CD4 + T cells develop to pre-T FH cell stage in aged mice. However, these cells are unable to fully progress to the GC T FH phenotype (GL7 + T FH cells) 14, and sustain the development of an efficient GC response when compared to the young NP-specific T FH cells. Thus, we propose that inadequate TB cell interactions, as well as increased regulatory T cell number in aged mice contribute to age-related impairments in humoral responses to influenza infection (Supplemental Fig. 3).

Medžiagos ir metodai

Pelės

Young (2–4 months) and aged (18–24 months) C57Bl/6 mice were bred and housed at the Trudeau Institute or University of Connecticut Health Center animal facilities. Alternatively, aged C57Bl/6 were obtained from the National Institute of Aging (NIA) aging colony bred and housed at Charles River Laboratories. Young mice were also obtained from Jackson Laboratories. All mice were kept in sterilized, individually ventilated, HEPA-filtered cages under specific pathogen-free conditions. The mice were anesthetized with isoflurane and infected intranasally with 600 PFU of the mouse-adapted influenza A H1N1 strain Puerto Rico/34/8 (PR8). The mice were sacrificed by CO 2 asphyxiation. Age-matched non-infected mice were used as controls. The Trudeau Institute Institutional or University of Connecticut Health Center Animal Care and Use Committees approved all experimental procedures using animals and all procedures were carried out in accordance with their guidelines.

Determination of antibody titers

Young and aged mice and were anesthetized with isoflurane and blood was harvested by cardiac puncture on days 0, 7, 14 and 21 post infection. The blood was allowed to coagulate for 2 hours at room temperature, centrifuged (×10, 000 rpm) 10 min at room temperature, and the serum was collected and kept at −20 °C until analysis was performed. PR8-specific IgG was determined by ELISA using HRP-labeled anti-isotype antibodies (Southern Biotech Inc.). Antibody titers were determined by the last serum dilution with an optical density above background. Neutralizing antibody titers were determined using an in vitro neutralization assay. In brief, serum dilutions were incubated with 400 PFU of PR8 for one hour at 37 °C. The mixtures were added on Madin-Darby Canine Kidney cell monolayers and centrifuged (×3, 000 rpm) 70 min at room temperature. The cells were next washed and incubated 20–24 hours at 33 °C in Zero-Serum Refeed Medium-PSGA (Diagnostic Hybrids) containing 4 μg/ml trypsin (Sigma). The virus was next detected using a biotin-labeled anti-influenza-A antibody (Millipore). The neutralizing antibody titers were determined as the last serum dilution with fewer viral plaques than the normal mouse serum control.

Srauto citometrija

To identify the NP-specific CD4 + T cells, single cell suspensions of splenocytes were first stained for one hour at room temperature with MHC class II NP Tetramer (PE/APC, Trudeau Institute Molecular Biology Core Facility). Further phenotyping was performed by staining with directly fluorochome conjugated antibodies (Supplemental Table 1). For intracellular transcription factor detection, cells were fixed and permeabilized using the Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) according to the manufacturer's instructions. NP-specific GC B cells were detected by staining with PE labeled B cell tetramer (Trudeau Institute Molecular Biology Core 44 ), for 30 min on ice. For intra-cellular cytokine staining, samples were enriched for CD4 cells by MACS ® using the CD4 enrichment kit II (Miltenyi Biotech) according to the manufacturer's instruction. The cells were then resuspended at 5–10 × 10 6 cells/ml in RPMI (Cellgro) containing 0.18 μM β-mercaptoethanol, 4 mM glutamine, antibiotic-antimycotic solution (Cellgro), 10 mM HEPES, 10% fetal bovine serum and 4 μl/6ml GolgiStop™ (BD). The cell suspensions were stimulated for 5 hours with 1 μg/ml phorbol 12-myristate 13-acetate and 1 μg/ml ionomycin at 37 °C. The cells were then washed, fixed, and permeabilized using the BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD) according to the manufacturer's instructions. Control samples containing the different “fluorescence minus one” antibody cocktails were used to determine the appropriate gating strategy for each cytokine. All flow cytometry samples were analyzed on a Canto II flow cytometer or on a LSR II flow cytometer using the FACSDiva software (BD). Data analyses were then performed using the FlowJo software (Tree Star).

Imunofluoresencija

Spleens were fixed overnight in medium containing 0.05 M phosphate buffer, 0.1 M l-lysine, pH 7.4, 2 mg/ml NaIO4, and 10 mg/ml paraformaldehyde and were dehydrated with 30% sucrose in phosphate buffer. Tissues were frozen in Tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetek) and sectioned using a CM1850 cryostat (Leica). 20-μm frozen sections were permeabilized with 1% Triton X-100 (Sigma) for ten minutes at room temperature, blocked for 30 minutes with Background Buster (Innovex Biosciences), stained over night at 4 °C in a humidified chamber with an antibody cocktail (Supplemental Table 2), then mounted with Immu-Mount (Thermo Sceintific). Immunofluorescence confocal microscopy was performed with the Zeiss 780 laser scanning microscope (Carl Zeiss; air objective 20× Plan-Apochromat with NA 0.5) using multichannel frame scans. The ZEN 2012 software (Carl Zeiss) was used for image acquisition. For half spleen images, the ZEN 2012 tile scan function was used to stitch individual 20x images together. Quantification of GC area, GC T FH cells and image processing was performed using Imaris 8.1 software (BITPLANE).

Priėmimas perkėlimas

The splenocytes were prepared from young non-infected CD45.1 + C57/Bl6 mice (Jackson Laboratories) and enriched for CD4 + cells by MACS ® enrichment kit II (Miltenyi Biotech) according to the manufacturer's instruction. Purity of this population was confirmed by flow cytometry (>85%). The isolated young CD45.1 + CD4 + T cells were tail vein injected into young or aged CD45.2 + C57/Bl6 hosts at 3.6 × 10 7 cells/200 μl/ mouse. One day later the mice were infected with 600 PFU PR8 influenza and subsequently sacrificed 14 days later for flow cytometric analysis.

Active TGF-β 1 ELISA

Prior to flow analysis, the spleens from young and aged mice that received adoptive transfer of young CD45.1 + CD4 + T cells, where crushed through 100μM wire mesh with 400μL of PBS. The suspension was then centrifuged (×300 rpm) for 2 minutes and supernatant was collected and stored at −80 °C until analysis was performed. TGF-β1 was measured in the spleen supernatants using the LEGEND MAX TM Free Active TGF-β1 ELISA kit (BioLegend). Samples were run in duplicate according to manufactures instructions. Spleen weights did not differ significantly in young and aged mice (data not shown).

In vitro generation of regulatory T cells

A sterile single cell suspension was prepared from spleens and lymph nodes pooled from four young mice. Erythrocytes were lysed using ACK lysis buffer (Gibco by Life Technologies). CD4 + T cells were isolated by negative selection using Miltenyi's CD4 cell isolation kit according to manufactures instructions. The CD4 + population was then stained with PE conjugated anti-CD25 (BD). After washing, the cells were then incubated with anti-PE microbeads (Miltenyi). CD25 + cells were removed by positive selection using the LS column (Miltenyi). Purity of the CD25 CD4 + T cells was confirmed by flow cytometry. The purified cells were suspended at 2 × 10 6 cells/ml in X-Vivo 15 serum free medium (Sartorius Stedim Biotech) and cultured in 24 well plates with Dynabeads ® Mouse T-Activator CD3/CD28 (Life Technologies) at a bead to cell ratio of 1:1. TGF-β1 (R&D Research Systems) was either added at 5000 pg/ml (recommended concentration for generation of regulatory T cells (Fantini et al. 35 ) 100 pg/ml (concentration found in aged spleens), or 0 pg/ml (negative control). All conditions were plated in triplicate and cultured for 5 days at 37 °C 5%CO 2 .

Statistinė analizė

All experiments were performed at least twice, and each group contained 3–7 animals. Statistical significance was determined by Student's t test, One-way or Two-way ANOVA, Repeated Measures ANOVA, or Pearson's correlation as specified in the figure legends. Statistical analyses were performed with Prism 5 or Prism 6 software (GraphPad Software inc.) or SPSS Software (IBM). Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, kai p <0, 05.

Papildoma informacija

How to cite this article : Lefebvre, JS et al. Age-related impairment of humoral response to influenza is associated with changes in antigen specific T follicular helper cell responses. Mokslas. Rep. 6, 25051; doi: 10.1038/srep25051 (2016).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.