Pakitęs pelių, neturinčių kctd12, pagalbinio gababo receptorių subvieneto, susijusio su nuotaikos sutrikimais, emocinis ir nervų jaudrumas | vertimo psichiatrija

Pakitęs pelių, neturinčių kctd12, pagalbinio gababo receptorių subvieneto, susijusio su nuotaikos sutrikimais, emocinis ir nervų jaudrumas | vertimo psichiatrija

Anonim

Dalykai

  • Molekulinis neuromokslas

Anotacija

Gamaamino sviesto rūgštis (GABA), pagrindinis smegenis slopinantis neuromediatorius, yra pagrindinė smegenų funkcijos dalis ir susijusi su kelių neuropsichiatrinių sutrikimų patofiziologija. GABA aktyvina su G-baltymais sujungtus GABA B receptorius, apimančius pagrindinius GABA B1 ir GABA B2 subvienetus, taip pat pagalbinius KCTD8, 12, 12b ir 16 subvienetus. KCTD12 genas buvo susijęs su bipoliniu sutrikimu, pagrindiniu depresijos sutrikimu ir šizofrenija. Norėdami palyginti, ar KCTD12 ekspresijos nebuvimas ar sumažėjęs KCTD12 ekspresija lemia fenotipus, kurie, ekstrapoliuodami žmogų, gali sudaryti endofenotipus, palyginame Kctd12 niekinius mutantus ( Kctd12 - / - ) ir heterozigotinius ( Kctd12 +/− ) su laukinio tipo (WT) pakratų pelėmis. dėl neuropsichinių sutrikimų, su kuriais susijęs KCTD12 . Kctd12 - / - pelėms buvo padidintas mokymasis bijoti, tačiau nepadidėjo atskiro klausos sąlygojamo dirgiklio atmintis. Kctd12 + / - pelių aktyvumas padidėjo per neaktyvią (lengvą) paros ciklo fazę, palyginti su WT ir Kctd12 - / - pelėmis. Elektrofiziologiniai įrašai iš hipokampo pjūvių - didelės Kctd12 ekspresijos srities - parodė padidėjusį piramidinių neuronų jaudrumą pelėms Kctd12 - / - ir Kctd12 +/− . Tai yra pirmas tiesioginis įrodymas, kad KCTD12 dalyvauja nustatant emocionalumo, elgesio aktyvumo ir neuronų jaudrumo fenotipus. Šis tyrimas pateikia empirinį polimorfizmo ir raiškos įrodymų, kad KCTD12 kelia neuropsichiatrinių sutrikimų riziką ir yra su jais susijęs.

Įvadas

Gama-aminosviesto rūgštis (GABA) yra pagrindinis žinduolių centrinę nervų sistemą slopinantis neuromediatorius, veikiantis jonotropinius GABA A ir metabolotropinius GABA B receptorius. 1 GABA B receptoriai kontroliuoja neuronų aktyvumą smegenyse, reguliuodami neurotransmiterio išsiskyrimą ir įtampai jautraus Ca 2+ ir Kir3 tipo K + kanalus. Pagrindiniai subvienetai GABA B1a, GABA B1b ir GABA B2 sudaro visiškai funkcionuojančius heteromerinius GABA B (1a, 2) ir GABA B (1b, 2) receptorius. 2 GABA B1a ir GABA B1b yra subvienetų izoformos, kurios atitinkamai nustato prieš- ir postsinapsinį receptorių lokalizaciją. Keturi KCTD šeimos citozoliniai baltymai (pavadinti jų K + kanalų tetramerizacijos domenu KCTD8, KCTD12, KCTD12b ir KCTD16) iš esmės asocijuojasi su GABA B2 ir veikia kaip pagalbiniai receptorių subvienetai. 3, 4 GABA B receptoriai pasižymi sumažėjusia ekspresija bipolinio sutrikimo, pagrindinio depresinio sutrikimo (MDD) ir šizofrenijos atvejais5 ir yra siūlomi kaip perspektyvūs gydymo tikslai šiems neuropsichiatriniams sutrikimams, taip pat nerimui ir priklausomybei gydyti. 6, 7, 8, 9 Pelėms buvo ištirtas GABA B1a ir GABA B1b išnirimo padermės, siekiant ištirti GABA B receptorių vaidmenį reguliuojant įvairius elgesio procesus, įskaitant aktyvumą ir įgimtą bei sąlygotą emocionalumą. Palyginti su laukinio tipo (WT) pelėmis, GABA B1a - / - pelės buvo šiek tiek aktyvesnės šviesos fazės metu, o GABA B1b - / - pelės buvo hiperaktyvios tamsiuoju etapu. 10 Nebuvo aiškių įrodymų, kad GABA B1a - / - arba GABA B1b - / - pelių fenotipai nebuvo tirti be nerimo, įskaitant padidėjusį pliusą labirintą ir šviesiai tamsią dėžę. 11 Tačiau sąlygotos baimės ir baimės paradigmose buvo ryškių ir specifinių fenotipų: Sąlyginio skonio vengimo atveju kitaip apdovanojančio dirgiklio (pvz., Sacharino tirpalo) savybės yra susietos su įpurkšto ličio chlorido negalavimą sukeliančiu poveikiu taip, kad dabar išvengta atlygio: GABA B1a - / - pelėms trūko sąlygojamo skonio norėjimo, o GABA B1b - / - pelėms trūko. 12 Svarbiausi šiam tyrimui taip pat buvo aiškus GABA B1 izoformų poveikis tono elektrošoko baimės sąlygojančioje paradigmoje: GABA B1a - / - pelėms buvo būdinga normali baimės išraiška iki sąlygoto tono, tačiau baimės išraiškos apibendrinimas buvo neutralus., ir GABA B1b - / - pelėms buvo būdinga maža baimės išraiška sąlygotu tonu, atitinkančiomis silpną baimės įgyjant ar stiprėjant. 13 Todėl GABA B receptoriai atrodo ypač svarbūs prisidedant prie sąlygotų neigiamų dirgiklių mokymosi ir (arba) atminties.

Genomo masto asociacijos tyrime, kuriame dalyvavo daugiau nei 1000 I tipo bipoliniu sutrikimu sergančių pacientų, nustatyta KCTD12 polimorfizmas, susijęs su padidėjusiu sutrikimo paplitimu. 14 Atliekant mikrotraumos tyrimą, kuriame buvo lyginamos juostos, pranešusios apie lėtinį stresą, su suderinta kontroline medžiaga, pirmoji parodė sumažėjusią KCTD12 raišką periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (PBMC). 15 Atliekant amigdalos, susijusios su MDD sergančiais pacientais ir pelėmis, patiriamomis nenuspėjamu lėtiniu lengvu stresu, KCTD12 / Kctd12 buvo vienas iš maždaug 30 genų, turinčių padidintą reguliavimą amigdala tiek MDD sergantiems pacientams, tiek nenuspėjamam lėtinio lengvo streso pelėms, palyginti su jų amžila. kontrolinės grupės. 16 „ Microarray“ tyrimai parodė sumažėjusią PBMC KCTD12 ekspresiją 17 ir padidėjusią šizofrenija sergančių pacientų KCTD12 18 ekspresiją hipokampo metu po mirties. Suaugusiųjų pelių smegenyse Kctd12 yra labai ekspresuojamas hipokampo ir amigdalos baltymuose. KCTD12 baltymas yra lokalizuotas pirmiausia postsinaptiniu būdu 4, 19 ir beveik išimtinai susijęs su GABA B receptoriais. 20 KCTD12 stabilizuoja GABA B receptorius ląstelės paviršiuje 3 ir reguliuoja receptorių reakcijos kinetines savybes. 4 KCTD12 skatina greitą GABA B aktyvuotų K + srovių jautrinimą, atjungiant aktyvuotus G baltymo βγ subvienetus nuo efektorinių Kir3 kanalų. Manoma, kad dėl išskirtinio asociacijos su GABA B receptoriais KCTD12 baltymo sumažėjęs reguliavimas gali selektyviai paveikti GABA B receptorių funkcijas. 20 Tačiau kai laisvas KCTD12 (nesusijęs su GABA B receptoriais), išreikštas virš GABA B receptorių, taip pat reguliuos kitų baltymų, sujungtų su G baltymu, signalus G-baltymais ir sukurs pleiotropinius fenotipus. 20

Šiame tyrime buvo tiriamos pelės WT, Kctd12 - / - ir Kctd12 +/− pelės, siekiant įvertinti, ar KCTD12 reguliuoja fenotipus, galinčius sudaryti neuropsichiatrinių sutrikimų, su kuriais siejamas KCTD12 žemutinis reguliavimas, rizikos veiksnius (endofenotipus). Kaip minėta aukščiau, KCTD12 yra susijęs su psichikos sutrikimais, įskaitant bipolinį sutrikimą, 14, kuris yra labai (50%) kartu su nerimo sutrikimais. 21, 22, bipolinio sutrikimo depresinėje fazėje, kaip ir sergant MDD, yra būdingas padidėjęs reaktyvumas į aversyvius dirgiklius ir sumažėjęs atlygis už susidomėjimą malonumu, tuo tarpu manijos fazėje padidėjęs atlygis už susidomėjimą ir malonumą yra įprastas, o dienos ir nakties ciklas sutrinka. dėl ko atsiranda naktinis hiperaktyvumas. 23 Remdamiesi šiomis psichopatologijomis, mes ištyrėme Kctd12 - / - ir Kctd12 +/− peles, kalbėdami apie baimės mokymąsi ir klausos sąlygojamo stimulo atmintį bei kontekstą, judėjimą ir įgimtą nerimą, motyvaciją už atlygį ir aktyvumo lygius. cirkadinis ciklas. Taip pat ištyrėme Kctd12 turinčių neuronų elektrofiziologines savybes. Mūsų rezultatai patvirtina KCTD12 vaidmenį reguliuojant emocinę atmintį, aktyvumą neaktyviojoje fazėje ir vidinį neuronų elektrinį jaudrumą.

Rezultatai

KCTD12 baltymo ekspresija pelėse, kuriose trūksta Kctd12

Norėdami ištirti KCTD12 baltymo trūkumo pasekmes elgesiui ir neuronų funkcijai, sukūrėme Kctd12 - / - peles (1a ir b pav.). Pelių, turinčių Kctd12 - / - pilno smegenų lizatų, trūko KCTD12 baltymo, o jų GABA B1a, GABA B1b ir GABA B2 baltymų lygis buvo normalus (1c paveikslas). Kctd12 +/− pelėms buvo sumažėjęs KCTD12 baltymų kiekis, tai rodo, kad paprastai abu Kctd12 aleliai yra perrašomi. Kctd12 +/− arba Kctd12 - / - pelių, turinčių visą smegenų lizatą, smegenų lizatose nenustatytas kompensacinis kito KCTD pagalbinio subvieneto (KCTD12b, KCTD8 ar KCTD16) reguliavimas (1c paveikslas). Kiekybinė KCTD12 baltymo analizė amygdaloje, ventraliniame hipokampyje ir prefrontalinėje žievėje parodė, kad Kctd12 +/− pelės ekspresuoja ~ 30–40% WT baltymo (1d pav.). Tai buvo pakartota PBMC, kurie suteikia KCTD12 baltymo ekspresijos smegenyse biomarkerį. Taigi Kctd12 +/− pelės yra naudingos norint ištirti dalinio KCTD12 baltymo reguliavimo smegenyse padarinius.

Image

Pelių, turinčių Kctd12, generavimas ir apibūdinimas. a ) WT ir mutavusių Kctd12 alelių schema. Kctd12 geno kodavimo seka (CDS) buvo pakeista „loxP-flanšuotu neomicino atsparumo kasete“ (PGKneo) homologine rekombinacija embriono kamieno (ES) ląstelėse. Teisingai nukreiptos ES ląstelės ( Kctd12 išmušimas + PGKneo alelis) buvo sušvirkštos į blastocistas. Pagrindinė pelė buvo sukryžminta su pele, kuri konstituciškai ekspresuoja Cre-rekombinazę, kad būtų pašalinta neomicino kasetė, paliekant vieną loxP vietą už nugaros ( Kctd12 išmušimo alelė ). Nurodyti PGR pradmenys genotipui nustatyti (P1, P2 ir P3). ( b ) genų DNR iš Kctd12 WT (+ / +), heterozigotinių (+/−) ir niekinių mutantų (- / -) pelių PGR. Amplifikuotų PGR produktų dydžiai nurodyti bazinėmis poromis (bp). ( c ) Western blot, parodantis, kad KCTD12 baltymo nėra Kctd12 - / - pelių lizatuose , kuriuose yra smegenys. Kctd12 +/− ir Kctd12 - / - pelės išreiškia normalų GABA B1 (GB1a, b), GABA B2 (GB2), KCTD12b, KCTD8 ir KCTD16 baltymų lygį. Lygus krovimas buvo kontroliuojamas anti-tubulino antikūnais. d ) KCTD12 baltymo ekspresijos kiekybinė analizė atrinktuose smegenų regionuose, atskirtuose nuo suaugusiųjų smegenų, ir periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (PBMC). Kctd12 +/− pelės išreiškia 30–40% WT KCTD12 baltymų. PBMC mėginiuose KCTD12 veikia kaip dviguba juosta, greičiausiai atspindinti posttransliacinių modifikacijų skirtumus. Žvaigždutės nurodo kryžmiškai judančias juostas. Brūkšninės diagramos apibendrina KCTD12 baltymo, normalizuoto tubulinu, kiekį tame pačiame tirpale (WT%). Duomenys yra vidutiniai ± sem, n = 4 pelės vienam genotipui. GABA, gama-aminosviesto rūgštis; KCTD, K + kanalų tetramerizacijos domenas.

Visas dydis

Kctd12 - / - pelės turi pakitusį klausos toną - elektrošoko baimės sąlytį ir atmintį

Informacijos, kad atskira CS (pvz., Garsinis tonas) yra susijusi su bauginanti JAV (pvz., Elektrošoko), išreikštos kaip baimės šaldančio elgesio forma, įgijimas ir sujungimas yra procesai, tarpininkaujantys pirmiausia amygdaloje. MDD sergantiems pacientams 27 ir streso sukeltos depresijos modeliams 28 toks baimės padidėjimas padidėja, o pelėms, kurioms trūksta GABA B1 subvienetų, ji sutrikusi. Remiantis šiais įrodymais ir atsižvelgiant į tai, kad Kctd12 yra stipriai ekspresuojamas amygdaloje, CS – USA baimės formavimas ir išraiška buvo įvertintos pelėms, kurioms trūko Kctd12 .

Pirmą dieną pelės buvo įtrauktos į romano areną (kontekste) be elektrošoko, kad būtų galima tyrinėti. Kiekvieno genotipo pelės buvo aktyvios ir panašiai, kaip rodo per mažas procentas, praleistas peršaldant (% WT 7, 3 ± 0, 9%, Kctd12 +/− 7, 5 ± 1, 1%, Kctd12 - / - 7, 8 ± 0, 9% ( P = 0, 95). ). Antrąją dieną buvo atliktas CS – JAV kondicionavimas ir išmatuotas% laiko, praleisto užšaldant CS – JAV tyrimų metu ir tarp CS intervalų. Procentinis šalčio procentas per CS – JAV bandymus (2a pav.) Turėjo pagrindinį bandymo skaičiaus poveikį (F (2, 138) = 85, 29, P <0, 001), rodantį, kad visos sesijos metu pasireiškė baimė. Taip pat įvyko genotipo ir bandymo sąveika (F (4, 138) = 4, 17, P = 0, 003): atlikus post hoc analizę paaiškėjo, kad Kctd12 - / - pelėse CS – JAV tyrimuose 3–4 padidėjo baimės šaldymas, palyginti su WT ( P < 0, 02) ir Kctd12 +/− ( P <0, 001) ir 5–6 bandymuose, palyginti su WT ir Kctd12 +/− (abu P <0, 001). Didesniam laiko užšalimui laiko tarp CS intervalais pagrindinis CS – USA intervalo skaičiaus poveikis buvo (F (2, 138) = 108, 00, P <0, 001; 2d paveikslas), rodantis, kad baimė užšąla per intervalus tarp CS – USA. poros. Taip pat buvo nustatytas pagrindinis genotipo (F (2, 69) = 5, 15, P <0, 008) poveikis: Kctd12 - / - pelėse padidėjo baimė užšalti 3–4 bandymuose, palyginti su WT ( P <0, 02) ir Kctd12 + / - ( P <0, 01), o 5–6 bandymuose, palyginti su WT ( P <0, 02) ir Kctd12 +/− ( P <0, 001). 3 dieną buvo atliktas baimės išraiškos testas. Kohorta, išbandyta tame pačiame kontekste, kaip ir 2-osios dienos CS ir JAV kondicionavimui, turėjo pagrindinį CS bandymų skaičiaus poveikį% užšalimo laiko% CS (F (4, 132) = 6, 56, P <0, 001; 2b paveikslas). Tai rodo, kad sumažėjo baimės procentas nuo užšalimo% tyrimų per visus bandymus, tačiau jokio genotipo poveikio nebuvo ( P 0, 43). % Užšalimo laiko tarp CS intervalais (2e pav.), CS tarp tyrimų skaičius neturėjo įtakos ( P = 0, 18) ir jokio genotipo efekto ( P 0, 55). Kohortoje, kurioje buvo išbandyta baimės išraiška kitokiame kontekste, nei ta, kuri buvo naudojama kondicionavimui CS – JAV 2 dieną, pagrindinis CS bandymo skaičiaus poveikis buvo procentinis įšalimo laikas CS metu (F (4, 132) = 5, 75, P <0, 001; 2c paveikslas), rodantis, kad sumažėjo procentinis baimės procentas nuo peršalimo per tyrimus ir jokio genotipo poveikio ( P 0.06). Norint% užšalti laiko tarpų tarp CS intervalų (2f pav.), Buvo nustatytas genotipo ir CS tarp tyrimų intervalas (F (8, 132) = 2, 30, P <0, 03): Kctd12 - / - pelėms padidėjo užšalimo baimė. CS ITI 1–3, palyginti su WT ( P <0, 02) ir Kctd12 +/− ( P <0, 001), ir tarp tyrimų intervalų 4–6, palyginti su WT ( P <0, 05) ir Kctd12 +/− ( P <0, 001). ). Todėl dėl KCTD12 trūkumo padidėjo baimės įšaldymas atliekant CS ir JAV tyrimus. Tai nepadidino kitos dienos baimės išreiškimo CS, tačiau pelėms Kctd12 - / - padidėjo baimės raiška intervalais tarp CS pristatymų, kai jos buvo įtrauktos į naują kontekstą.

Image

Kctd12 genotipo poveikis užšalimui , kurį sąlygoja baimė. CS – JAV baimės nustatymas: ( af ) Dvidešimt keturioms pelėms iš kiekvieno genotipo buvo atlikta CS – USA baimės kondicionavimas 2 ( a ir d ) dieną, o tada baimės išraiška buvo patikrinta tuo pačiu ( N = 12, b ir e ) arba naujas ( N = 12, c ir f ) kontekstas 3 dieną. Užšalimas CS metu: a ) CS – JAV kondicionavimas, b ) CS išraiškos testas tame pačiame kontekste, c ) CS išraiška testas naujame kontekste. Užšalimas tarp bandymų: d ) CS – JAV kondicionavimas, e ) ekspresijos testas tame pačiame kontekste, f ) ekspresijos testas naujame kontekste. Kontekstas ir JAV baimės nustatymas ( g ir h ): Dvylika pelių kiekvienam WT ir Kctd12 - / - genotipui buvo atliktos ( g ) konteksto baimės nustatymas 1 dieną ir ( h ) konteksto išraiškos testas 2 dieną. Duomenys yra vidurkis ± sem GT, genotipas. * P <0, 05 Kctd12 - / - palyginti su WT, *** P <0, 001 Kctd12 - / - palyginti su WT. # # P <0, 01 Kctd12 - / - palyginti su Kctd12 +/− , ### P <0, 001 Kctd12 - / - palyginti su Kctd12 +/− . CS, sąlyginis dirgiklis; KCTD, K + -kanalo tetramerizacijos domenas; JAV, besąlyginis stimulas; WT, laukinis tipas.

Visas dydis

Kctd12 - / - pelės pasižymi normaliu kontekstu - JAV baimės sąlygoja ir atmintis

Pelėms veikiant bauginančiai JAV arenoje, nesant CS, buvo leista ištirti KCTD12 genotipo poveikį emociniam mokymuisi ir atminčiai atsižvelgiant į kontekstą ar erdvę. Ši paradigma taip pat vertina hipokampo, kuris rodo pakitusį nuotaikos ir nerimo sutrikimų aktyvumą 30, funkcionavimą ir išreiškia Kctd12 aukštu lygiu. Šis eksperimentas buvo atliktas su Kctd12 - / - ( N = 12) ir WT ( N = 12) pelėmis. Kondicionavimo metu 1 dieną pagrindinis JAV bandymų skaičiaus (F (2, 44) = 71, 25, P <0, 001; 2g paveikslas) poveikis reiškė baimės užšalimo pasireiškimą visos sesijos metu, o genotipo ( P 0, 71). Atliekant baimės išraiškos testą 2 dieną, pagrindinis kontekstinio tyrimo poveikis buvo (F (5, 88) = 4, 51, P <0, 001; 2h paveikslas), rodantis, kad sumažėjo baimės įšaldymas per visus tyrimus, o poveikio genotipas ( P 0, 87). Todėl KCTD12 įsitraukimas į baimės reguliavimo ir atminties reguliavimą buvo būdingas CS ir JAV paradigmai, kuriai pirmiausia tarpininkaujama amygdaloje, ir neapima JAV konteksto, kur hipokampas taip pat yra svarbus.

Kctd12 - / - pelės jautriai reaguoja į skausmą

GABA B receptoriai dalyvauja kontroliuojant jautrumą skausmui; pavyzdžiui, agonistas baklofenas yra antinociceptyvusis 31, o GABA B1 - / - pelės pasižymi hiperalgezija. 32 Kadangi pakitęs skausmo jautrumas paveiktų elgesį atliekant baimės mažinimo testus, kai JAV buvo skausmingas somatosensorinis dirgiklis, buvo svarbu įvertinti pelių, kurioms trūksta KCTD12, jautrumą skausmui. Karštos plokštelės bandyme nebuvo jokio genotipo poveikio reakcijos laikui (sekundėmis): WT 24, 8 ± 5, 3, Kctd12 +/− 28, 2 ± 2, 5, Kctd12 - / - 35, 3 ± 4, 6 ( P = 0, 37, N = 6 vienam genotipui). Todėl nesitikima, kad KCTD12 nebuvimas turės įtakos jautrumui JAV atliekant baimės mažinimo testus, o skausmo jautrumo skirtumai nepaaiškina pastebėto KCTD12 poveikio CS – USA baimės nustatymui ir išraiškai.

Kctd12 - / - pelės pasižymi normaliu lokomotoriniu aktyvumu ir įgimtu nerimu

Atliekant atviro lauko testą, buvo ištirtas KCTD12 ( N = 10 vienam genotipui) poveikis bendram lokomotoriniam aktyvumui ir įgimtam nerimui naujoje, neutralioje aplinkoje. Visas perkeltas atstumas buvo naudojamas kaip aktyvumo rodyklė, o atstumas, perkeltas labiau veikiamame centre, buvo naudojamas kaip nerimo matas, tai yra, mažesnis atstumas, perkeltas centre, prilygsta didesniam nerimui. Ūmus klasikinių anksiolitinių GABA vaistų švirkštimas į hipokampą sumažina nerimą atliekant šį testą. 33 Visam nuvažiuotam atstumui pagrindinį poveikį turėjo 5 minučių laiko intervalai (F (5, 135) = 17, 78, P <0, 001), kai pelėms buvo nustatytas nuolatinis aktyvumo sumažėjimas per 30 minučių seansą, kaip buvo galima tikėtis. testas. Nebuvo jokio pagrindinio genotipo efekto ( P = 0, 20) ar laiko intervalų sąveikos ( P = 0, 32). Jei atstumas perkeltas centre, nebuvo jokio genotipo efekto ( P = 0, 20) ir laiko intervalo sąveikos ( P = 0, 21). Šie radiniai rodo, kad KCTD12 nebuvimas nedaro įtakos nei lokomotoriniam aktyvumui, nei įgimtam nerimui naujoje, neutralioje aplinkoje.

Kctd12 - / - pelės paprastai renkasi sacharozę

Interesų malonumo sutrikimai, kurie yra MDD ir bipolinio sutrikimo simptomai, rodo atlygio apdorojimo psichopatologiją. Graužikams atlygio jautrumas paprastai tiriamas pasitelkiant skonio stimulus, kai tiriamieji geria daugiau saldaus skonio sacharozės tirpalo nei vandens, kai atliekamas dviejų butelių parinkimo testas, 34 - šis pasirinkimas yra mažesnis streso sukeltos depresijos modeliuose. 35 Atlygio apdorojimas yra tarpininkaujamas grandine, apimančia GABA signalizaciją tarp akumuliacinių branduolių, ventralinio apatinio žandikaulio ir ventralinio pagrindinio paviršiaus - regionų, kuriuose Kctd12 ekspresija yra maža ir vidutinė. 19 Šiame tyrime pelėms buvo sacharozės teikiama pirmenybė ir tai buvo panašus genotipas: WT 77 ± 2%, Kctd12 +/− 76 ± 1%, Kctd12 - / - 79 ± 2% ( P = 0, 41, N = 10 per). genotipas). Todėl KCTD12 nebuvimas neturėjo įtakos išlaikymo atlygio perdirbimui.

Kctd12 +/− pelės pasižymi padidintu elgesio aktyvumu lengvosios (neaktyviosios) fazės metu

Skiriamasis cirkadinis ritmas, atsižvelgiant į aktyvumą tamsiosios ir šviesos fazėse, yra biologinė norma. MDD ir bipoliniam sutrikimui būdingas sutrikęs paros ritmas, įskaitant miego sutrikimą ar netipiškai didelį atipinį aktyvumą. 23 „IntelliCage“ sistema neteikia duomenų apie miegą, tačiau leidžia nuolat stebėti veiklą, susijusią su pelės kampelio lankymu, veikiančiais nosies kakleliais ir vandens suvartojimu, o tai savo ruožtu gali būti naudojama absoliutinio aktyvumo fenotipų ir gėrimo lygio, taip pat jų, tyrimui. cirkadinis paskirstymas. Aktyvumas buvo didesnis 12 valandų tamsiuoju laikotarpiu nei 12 valandų šviesos laikotarpis, ir taip buvo kiekvieno genotipo atveju kiekviename matavime (3 paveikslas). Pavyzdžiui, apsilankymų kampe metu pagrindinis periodo poveikis (F (1, 21) = 113, 00, P <0, 001; 3a paveikslas, palyginti su d), nesant genotipo poveikio. Tačiau konkrečiu šviesos periodu buvo KCTD12 priklausomi fenotipai. Bendram apsilankymų kampuose skaičiui buvo svarbiausias genotipo poveikis (F (2, 21) = 4, 71, P <0, 02): pelės Kctd12 +/− aplankė daugiau kampų nei WT arba Kctd12 - / - pelės (3a paveikslas). ). Taip pat pagrindinis genotipo poveikis bendram vandens laižų skaičiui šviesos laikotarpiu (F (2, 21) = 4, 18, P <0, 03): Kctd12 +/− pelės daugiau laižo nei WT ir Kctd12 - / - pelės ( 3c pav.). Šviesos laikotarpiu nosies žnyplėms nebuvo jokio genotipo poveikio (3b pav.), Taip pat tamsiuoju laikotarpiu nepastebėta jokio genotipo poveikio (3d ir f pav.). Taigi dėl sumažėjusio KCTD12 reguliavimo, bet ne visiško jo panaikinimo, padidėjo elgesio aktyvumas būtent neaktyvaus etapo metu.

Image

Kctd12 genotipo poveikis „ IntelliCage “ aktyvumui ir veikiančiam alkoholio vartojimui per 20 dienų. Šviesos periodas 1900–0700 h: a ) bendras apsilankymas operando kampuose, b ) bendras nosies raukšlių veikimas kampuose, c ) bendras vandens laižymas operuoto kampuose. Tamsusis periodas 0700–1900 h: d ) bendras apsilankymas operanto kampuose, e ) bendras nosies raukšlių veikimas kampuose, f ) bendras vandens laižymas operanto kampuose. Reikšmės yra 10 pelių kiekvieno genotipo bendras vidurkis ± sem. KCTD, K + -kanalo tetramerizacijos domenas; WT, laukinis tipas.

Visas dydis

KCTD12 suaktyvina toninį K + ramybės membranos laidumą ir sumažina hipokampo neuronų vidinį elektrinį jaudrumą

KCTD12 reguliuoja GABA B receptorių aktyvuotų Ca 2+ ir K + srovių kinetines savybes. 3, 4 sumažėjęs KCTD12 reguliavimas gali paveikti neuronų veiklą. Išanalizavome Kctd12 +/− ir Kctd12 - / - CA1 piramidinių neuronų elektrofiziologines savybes. Šie neuronai išreiškia vienodai aukštą KCTD12 nuorašų ir baltymo 4, 19 lygį ir yra lengvai atpažįstami atliekant elektrofiziologinius įrašus. Patch-clamp eksperimentai, naudojant ūmius hipokampo pjūvius, parodė, kad ramybės membranos potencialas ( V ramybė ) reikšmingai nesiskyrė tarp genotipų. Tačiau dabartiniame spaustuke užfiksuotas įėjimo pasipriešinimas ( R in ) Kctd12 +/− ir Kctd12 - / - pelėse buvo žymiai didesnis, palyginti su WT pelėmis (1 lentelė). Paprasčiausias šių dviejų stebėjimų paaiškinimas yra tas, kad KCTD12 trūkumas sumažina atvirų jonų kanalų skaičių ir kad šių kanalų pernešamas (-i) jonas (-ai) turi pusiausvyros potencialą esant ramybės potencialui arba šalia jo. Atsižvelgiant į tai, kad KCTD12 reguliuoja Kir3 tipo K + kanalų aktyvumą, 3 įėjimo įėjimo varžos padidėjimas greičiausiai susijęs su atvirų K + kanalų sumažėjimu. Tikimasi, kad padidėjęs įvesties pasipriešinimas turės įtakos vidiniam neuronų elektriniam jaudrumui. Todėl mes nustatėme reobazės srovę, reikalingą sužadinti veikimo potencialus (AP), o tai yra vidinis neuronų sužadinimo matas. Depolarizuodami dabartinio spaustuko neuronus iš V ramybės, mes nustatėme, kad Kctd12 +/− ir Kctd12 - / - pelėse srovės kiekis, reikalingas generuoti bent vieną AP, iš tikrųjų buvo žymiai sumažintas, palyginti su WT pelėmis (4a paveikslas ir 1 lentelė). . Be to, Kctd12 - / - ir WT pelių AP membranos generavimo slenkstinės membranos potencialas (AP slenkstis), taip pat laikas nuo stimuliacijos iki pirmosios AP smailės (AP vėlavimo) smarkiai skyrėsi (lentelė). 1). Šie duomenys kartu parodo, kad pelėms, kurių KCTD12 nėra ekspresuojamos arba jos nėra sumažintos, padidėja vidinis CA1 piramidinių neuronų elektrinis jaudrumas.

Pilno dydžio lentelė

Image

Padidėjęs elektrinis jaudrumas ir sumažintos Ba 2+ jautrios K + srovės Kctd12 - / - CA1 piramidiniuose neuronuose. a ) Kvadratinės impulsinės srovės įpurškimas retobazei nustatyti WT ir Kctd12 - / - neuronuose. Kctd12 - / - neuronuose buvo smarkiai sumažinta dabartinė amplitudė, reikalinga generuoti bent vieną veikimo potencialą (AP). Atkreipkite dėmesį, kad Kctd12 - / - neuronai išleido AP, esant didesniam poliporalizuotam membranos potencialui ir mažesniam vėlavimui, palyginti su WT neuronais (kiekybinis įvertinimas 1 lentelėje). Mastelio juostos, 200 ms, 20 mV. ( b ) Ramus laidumas WT ir Kctd12 - / - neuronuose prausiantis 200 μM Ba 2+ . Ramumo laidumas buvo stebimas vieną kartą per sekundę vienu įtampos žingsniu. c ) srovės pėdsakai, sukurti tam tikros įtampos pakopos WT ir Kctd12 - / - neuronuose, kad būtų galima tiksliai nustatyti laidumą miegant prieš (CTRL) ir po plovimo Ba 2+ taškuose, pavaizduotuose b punkte . Liekamasis laidumas buvo nustatytas kaip įtampos-srovės ( V - I ) brėžinių, sudarytų iš srovės pėdsakų, nuolydis. Mastelio juostos, 200 ms, 20 pA. d ) Santykinis ramybės laidumo juostos grafikas, nustatytas kaip c punkte . Duomenys yra vidurkis ± sd ** P <0, 01, *** P <0, 001. KCTD, K + -kanalo tetramerizacijos domenas; WT, laukinis tipas.

Visas dydis

Aukščiau pateiktus rezultatus galima paaiškinti toninių K + srovių sumažėjimu Kctd12 - / - ir Kctd12 +/− neuronuose. Dėl sumažėjusių toninių srovių sumažės ramybės membranos laidumas ( g ramybės ), kuris matuojamas nano Siemens (nS) ir yra atvirkščiai susijęs su įėjimo pasipriešinimu. Įrašai dėl įtampos gnybtų parodė, kad g ramybė Kctd12 - / - reikšmingai mažesnė nei WT neuronuose ( Kctd12 - / - : 5, 1 ± 0, 5 nS, n = 11; WT: 7, 2 ± 0, 5 nS, n = 12; P <0, 01) ). Keista, tačiau GABA B receptorių slopinimas antagonistu CGP54626 nesumažino ramybės membranos laidumo WT neuronuose iki Kctd12 - / - neuronų (WT: 6, 7 ± 0, 3 nS, n = 21, Kctd12 - / - : 5, 4 ±). 0, 4 nS, n = 15, P <0, 05). Šie rezultatai rodo, kad tonizuojantis GABA B receptorių aktyvumas neatsako už poilsio laidumo padidėjimą esant KCTD12. Todėl mes išsiaiškinome, ar K + kanalai iš tikrųjų lemia KCTD12 sukeltą poilsio laidumą. Pjūvių superfuzija su 200 μM Ba 2+, slopinanti Kir ir K2P tipo K + kanalus, 36, 37, žymiai sumažino WT neuronų ramybės membranos laidumą, palyginti su Kctd12 - / - neuronų laidumu (4b ir d paveikslai, P < 0, 01). Atsižvelgiant į tai, Ba 2+ jautrus poilsio režimas, nustatytas pagal 4d paveiksle nurodytas vertes (kontrolinis atėmus Ba 2+ ), buvo žymiai didesnis WT neuronuose, palyginti su Kctd12 - / - neuronais (WT: 2, 1 ± 0, 2 nS, Kctd12 - / - : 1, 2 ± 0, 1 nS, n = 16, P <0, 01). Todėl KCTD12 indukuoja toninę Ba 2+ jautrią K + srovę, nesant GABA B receptoriaus aktyvumo.

Diskusija

Atsižvelgiant į GABA B receptorių svarbą emociniame ir pažintiniame procesuose bei žmogaus KCTD12 ryšį su neuropsichiatriniais sutrikimais, 14, 17, 18, Kctd12 nokauto pelėms ieškojome elgesio ir elektrofiziologinių fenotipų. Mūsų tyrimas pateikia įrodymų apie KCTD12 dalyvavimą reguliuojant elgesio fenotipus ir vidinį neuronų elektrinį jaudrumą. Konkrečiai kalbant, homozigotinė Kctd12 abliacija paskatino mokymąsi bijoti ir atmintį dėl diskretinio klausos sąlygojamo dirgiklio. Heterozigotinė Kctd12 abliacija sumažino baltymų ekspresiją kraujyje ir smegenyse iki ~ 30–40%. Šis genotipas lėmė hiperaktyvumą neaktyviame Cirkadinio ciklo etape. Kctd12 +/− ir Kctd12 - / - pelėms buvo nustatytas mažesnis CA1 piramidinių neuronų ramybės membranos laidumas, todėl sumažėjo veikimo potencialo susidarymo slenkstis. Todėl pelėms homozigotinė ir heterozigotinė Kctd12 abliacija sukelia specifinius elgesio ir neuronų fenotipus, kurie, ekstrapoliuojant žmogų, gali sudaryti neuropsichiatrinių sutrikimų, susijusių su sumažinta KCTD12 transkripcija / transliacija, endofenotipus .

Kctd12 + / - pelėms didžiausias radinys buvo hiperaktyvumas per parą ciklo šviesos fazėje. GABA B1 subvienetui būdingos nokauto pelės, palyginti su WT pelėmis, GABA B1a / / pelės taip pat buvo šiek tiek aktyvesnės šviesos fazės metu, tuo tarpu GABA B1b - / - pelės tamsiosios fazės metu buvo hiperaktyvios. 10 Įrodyta, kad padidėjęs aktyvumas Kctd12 + / - pelių įprastai neaktyvios fazės metu, gali parodyti procesų, kurie paprastai slopina aktyvumą šioje Cirkadinio ciklo stadijoje, deficitą. Iš tiesų yra įrodymų, kad GABA B receptoriai gali dalyvauti cirkadinio laiko planavime; pavyzdžiui, GABA B receptorių aktyvacija suprachiasmatiniame branduolyje lemia cirkadinės fazės poslinkį. 38 GABA B receptoriai taip pat reguliuoja miegą, nes GABA B receptorių praradimas atideda neveiklumą šviesos fazėje. 39 Postsinapsiniai GABA B receptoriai taip pat svarbūs nutraukiant smegenų žievės neuronų virpesių nuolatinio aktyvumo („UP“) būsenas miego metu. 40 Pažymėtina, kad ramybės būsenos virpesiai vyksta dažniau ir yra siūlomi prisidėti prie tinklo anomalijų, pastebimų bipolinio sutrikimo metu. 41, 42 Belieka suprasti, kodėl dalinis KCTD12 sumažėjimas sąlygojo šį fenotipą, o visiškas KCTD12 praradimas to nepadarė. Kaip parodyta, taip nebuvo, kad kompensaciniai kitų KCTD subvienetų išraiškos pokyčiai įvyko pelėms Kctd12 - / - arba Kctd12 + / - .

Kctd1 2 - / - pelėms, išbandytoms dėl to, ar nepavyko sukontroliuoti JAV baimės dėl CS-elektrošoko, pasireiškė suboptimalių bauginančio mokymosi ir atminties fenotipai. Jie demonstravo padidėjusį baimės šalčio įgijimą CS ir intervalais tarp CS. Tačiau kitą dieną tai nebuvo pakartota kaip padidėjęs baimės reiškinys įgytam CS. Pelėms Kctd1 2 - / - būdingos padidėjusios baimės raiškos intervalais tarp CS intervalų, kai jos buvo dedamos į naują kontekstą. Todėl atrodo, kad KCTD12 slopina CS – JAV asociacijų mokymosi, kuris vyksta, moduliavimą. Neįprasta, kad padidėjęs CS baimė neįtakoja padidėjusios baimės išraiškos toje pačioje CS, tai rodo, kad KCTD12 taip pat prisideda prie CS ir JAV mokymosi įsitvirtinimo atmintyje. Šie duomenys papildo ankstesnes ataskaitas, kad GABA B receptoriai yra svarbūs reguliuojančių neigiamų dirgiklių mokymosi ir (arba) formavimo prisiminimai. Padidėjęs nerimastingas CS ir JAV susirūpinimas baime taip pat pasireiškia MDD 27, o KCTD12 raiška padidėjo MDG amygdala. 16 Kartu išvados rodo, kad KCTD12 lygio bruožų ar būsenos pokyčiai gali prisidėti prie perdėto dėmesio sutelkimo į dirgiklius ir įvykius, kurie yra bendras nuotaikos sutrikimo požymis. 43

Kalbant apie baimės susiformavimo nervų grandinę, CS – JAV mokymasis ir atmintis pirmiausia vyksta baziniame ir šoniniame amygdalos (BLA) branduoliuose, o kontekstinis – JAV mokymasis ir atmintis daugiausia hipokampo srityje, tačiau priklauso nuo dvikryptės signalizacijos su BLA. 26, 44, 45, 46, 47 GABA signalizavimas turi didelę reikšmę vietinėse slopinamosiose grandinėse, kurios yra adaptacinio CS – JAV kondicionavimo metu, 48 su GABA interneturonais BLA, neatsiejamais nuo perdavimo ir grįžtamojo ryšio slopinimo grandinių, kontroliuojančių LTP išėjimą. baimės projekcijos neuronai. Prie to prisideda tiek pre-, tiek postsinapsiniai GABA B receptoriai. Tyrimai su GABA B1a - / - pelėmis parodė, kad presinapsiniai GABA B receptoriai slopina postsinapsinį LTP BLA ir tokiu būdu užkerta kelią generalizacijos baimėms. Pelėms, neturinčioms postsinapsinio GABA B1b subvieneto, 13, 29, 48 yra sutrikęs baimės pasireiškimo įgijimas ar sustiprėjimas. 13 Atsižvelgiant į tai, kad Kctd12 yra labai išreikštas pelių amygdala ir hipokampu, 19, o ląstelių lygyje yra daugiausia ekspresuojamas postsinapsiniu būdu, 19 yra įdomu, kad pelių, kurios sąlygoja baimę, Kctd12 - / - pelių fenotipai ryškiai skiriasi nuo GABA B1b− / - pelės. 2 Tai atitinka KCTD12 sumažėjusį reguliavimą ar nebuvimą, turintį įtakos subtilioms postinanapinių GABA B reakcijų 3 kinetinėms savybėms, užuot visiškai užkertant kelią postsinapsiniams GABA B atsakams. Taip pat svarbu palyginti teigiamus įrodymus apie GABA B signalizacijos svarbą adaptaciniam baimės mokymuisi ir atminčiai, gautus naudojant genetinius pelių modelius, su naujausiais įrodymais, kad GABA B agonistai ir antagonistai neturi įtakos pelių baimės mokymuisi ir atminčiai., naudojant BALB / c arba C57BL / 6 padermes: GABA B teigiami moduliatoriai (GS39783, BHF177), GABA B agonistas baklofenas ir GABA B antagonistas (CGP52432) - visi jie neturėjo įtakos CS – USA baimės įgijimui, atšaukimui ar išnykimui. . 49, 50 Žiurkėms baklofenas sutrikdė CS išnykimą. 51 Norint suderinti šiuos neatitikimus, reikia atlikti papildomus eksperimentus.

Tikimasi, kad sumažėjęs KCTD12 turės tikslų GABA B receptorių įtakos sinapsių perdavimui laiką ir sukels per didelį K + kanalų aktyvumą, kuris gali sukelti ląstelių K + išeikvojimą ir taip padidinti neuronų jaudrumą. 3, 52, 53 Čia parodyta, kad sumažėjusi KCTD12 ekspresija taip pat padidina neuronų jaudrumą, sumažindama toninę K + srovę. Keista, bet KCTD12 sukelta toninė srovė nepriklauso nuo GABA B receptoriaus aktyvacijos. Kadangi KCTD12 tiesiogiai reguliuoja heterotrimerinio G-baltymo subvienetų aktyvumą, 3 jis gali sukelti tonines K + sroves, suaktyvindamas G-baltymą, jei nėra receptoriaus aktyvumo. Kaip alternatyva, KCTD12 gali tiesiogiai surišti ir suaktyvinti efektorinius K + kanalus. Dėl to, kad trūksta KCTD12, padidėja neuronų jaudrumas per sinapsinius ir vidinius mechanizmus, kurie gali prisidėti prie suboptiminio CS baimės mokymosi ir atminties, stebimos Kctd12 - / - pelėse.

Atsižvelgiant į žmonių įrodymus apie KCTD12 ryšį su bipoliniu sutrikimu, MDD ir šizofrenija, dabartinės išvados rodo, kad pelėms Kctd12 + / - ir Kctd12 - / - būdingi pakitusio emocinio ir homeostatinio elgesio fenotipai ir kad jie kartu atsiranda padidėjus hipokampo jaudrumui. Neuronai, yra priežasties ir pasekmės KCTD12 svarbą neuro-elgesio srityje. Žinoma, pakitusi KCTD12 raiška bus vienas iš specifinių veiksnių sudėtingai genų ir aplinkos sąveikai, kuria grindžiami šių neuropsichiatrinių sutrikimų etiopatofiziologija. Šis tyrimas svariai prisideda prie gyvūnų modelio įrodymų, kurie yra būtini, kad būtų galima tiksliai įvertinti GABA B receptorius kaip galimą taikinį gydant neuropsichiatrinius domenus tiek kai kurių pagrindinių sutrikimų viduje, tiek tarp jų.