Pakeitus sfingolipidinės acilo grandinės sudėtį, užkertamas kelias pps / gln sukeltam pelių kepenų nepakankamumui, sutrikdant tnfr1 internalizaciją | ląstelių mirtis ir liga

Pakeitus sfingolipidinės acilo grandinės sudėtį, užkertamas kelias pps / gln sukeltam pelių kepenų nepakankamumui, sutrikdant tnfr1 internalizaciją | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Apoptozė
  • Ląstelių signalizavimas
  • Kepenų ligos

Anotacija

Keramido dalyvavimas mirties nuo receptorių sukeltoje apoptozėje buvo plačiai išnagrinėtas atliekant daugelį tyrimų, daugiausia dėmesio skiriant keramido vaidmeniui, susidarančiam dėl sfingomielino hidrolizės. Dabar mes analizuojame keramido acilo grandinės ilgio poveikį, tirdami naviko nekrozės faktoriaus α receptoriaus-1 (TNFR1) tarpininkaujamą apoptozę keramido 2 sintazės (CerS2) nulinėje pelėje, kuri negali sintetinti labai ilgos acilo grandinės keramidų. CerS2 nulinės pelės buvo atsparios lipopolisaharidų / galaktozamino tarpininkaujamam pilvo kepenų nepakankamumui, net jei tai neturėjo įtakos TNF α sekrecijai iš makrofagų. Auginami hepatocitai taip pat buvo nejautrūs TNF α tarpininkaujamai apoptozei. Be to, kepenyse ir kepenų ląstelėse kaspazės aktyvumas nebuvo padidėjęs - tai atitiko TNFR1 proapoptozės signalų slopinimą. Priešingai, suaktyvinus Fas receptorius, mirė CerS2 pelės, kurių nebuvo. Kaspazės aktyvacija buvo užblokuota dėl CerS2 nulinių pelių nesugebėjimo internalizuoti TNFR1; kadangi Fc-TNF α buvo įtrauktas į laukinio tipo pelių hepatocitų perinuklearinį regioną, CerS2 nulinių pelių internalizavimas nebuvo nustatytas. Mūsų rezultatai rodo, kad sfingolipidų acilinės grandinės sudėties pakeitimas slopina TNFR1 internalizaciją ir slopina selektyvų proapopotinį pasroviui nukreiptą signalą apie apoptozę.

Pagrindinis

Plačiai ištirtas naviko nekrozės faktoriaus α receptoriaus-1 (TNFR1) vaidmuo apoptozėje. 1, 2 TNFR1 įsitraukimas lemia TNFR1 komplekso I baltymų naviko nekrozės faktoriaus α receptorių, susijusių su mirties domenu (TRADD), naviko nekrozės faktoriaus α receptorių sąveikaujančiu baltymu (RIP1), naviko nekrozės faktoriaus α receptorių 2 faktorių. TRAF2), IAP ir cFLIP, sąlygojantys R631 ubikvitinaciją K63 ir aktyvinantys NF κ B išgyvenimo kelią. TNFR1 yra internalizuotas, o tai lemia K48 ubikvitinaciją ir RIP1 bei TRAF2 degradaciją, nutraukia išgyvenimo signalą 3 ir suaktyvina TNFR1 proapoptotinį signalizavimą įdarbinant FADD ir kaspazę 8, kad susidarytų „mirtį sukeliantis signalizacijos kompleksas“ arba kompleksas. II tarpląstelinėse TNF receptosomose. 4, 5, 6, 7 internalizuotos TNFR1 turinčios receptosomos susilieja su trans-Golgi pūslelėmis, sudarydamos daugialypius organelius, vėliau suaktyvindamos lizosomų fermentus, įskaitant rūgšties sfingomielinazę (aSMase) ir proapoptozinę proteazę, katepsiiną D. 4, 7, 8

Ceramidas, visų kompleksinių sfingolipidų (SL) stuburas, yra stiprus apoptozinis tarpininkas, reguliuojantis ir vidinius, ir išorinius apoptotinius trigerius, ir yra įtrauktas į naviko nekrozės faktoriaus α (TNF- α ) signalizacijos kelią. 9, 10, 11 yra sukaupta reikšmingų įrodymų apie tiek aSMase, tiek neutralios (nSMase) sfingomielinazės vaidmenį TNFR1 signalizacijoje. Taigi, slopindamas TNFR1 sąlygojamą aSMase aktyvaciją, susilpnėja apoptozinis atsakas, 12 pelių, kurioms trūksta aSMase (ASM - / - ), yra labai atsparios TNFR1 tarpininkaujamai apoptozei, 13 ir TNFR1 aktyvacija sukelia ilgą (C16 – C20) ir labai ilgos (C22 – C24) acilo grandinės (VLC) keramidai hepatocituose, 14 parodantys lemiamą vaidmenį SM turtinguose membranų domenuose TNFR1 komplekso I signalizacijoje. 3

Daug mažiau žinoma apie de novo sintezuotų keramidų vaidmenį TNFR1 tarpininkaujant apoptozėje. Neseniai mes sukūrėme pelę, kurioje nėra jokių VLC-keramidų ir VLC-sfingolipidų (SL), nes ablimavus keramido sintazei 2 (CerS2), 15, 16, fermentui, atsakingam už labai ilgų acilo grandinių pridėjimą prie ilgojo sfingoido. grandinės bazė. 17, 18 CerS2 nulinės pelės rodo padidėjusį hepatocitų žūtį ir proliferaciją, todėl susidaro daugybiniai kepenų mazgeliai ir kepenų ląstelių karcinoma. 16 Be to, „CerS2“ pelių, turinčių nulinę reikšmę, lėtinis oksidacinis stresas 19 ir kepenų atsparumas insulinui. 20 Be to, pelėms būdingi dideli membranų biofizinių savybių pokyčiai. 21

Šiame tyrime mes tiriame VLC keramidų vaidmenį TNFR1 tarpininkaujant apoptozėje ir parodome, kad CerS2 nulinės pelės yra visiškai atsparios fulminantiniam kepenų nepakankamumui (FHF), nes slopina TNFR1 komplekso II signalizaciją. Mūsų rezultatai rodo kritinį VLC-SL reikšmę paskesniam kaip TNFR1 I komplekso signalizavimui ir prieš TNFR1 II komplekso signalizavimui.

Rezultatai

„CerS2“ nulinės pelės yra atsparios FHF

Mes panaudojome FHF modelį, kuris apima lipopolisacharido (LPS) / D - (+) - galaktozamino hidrochlorido (GLN) injekciją. Sušvirkštus vienkartinę LPS / GLN dozę, 90% laukinio tipo (WT) pelių mirė per maždaug 6–8 valandas po injekcijos, tačiau CerS2 nulinės pelės buvo visiškai atsparios (1a pav.). WT pelėms buvo pastebėtas didžiulis parenchiminis pažeidimas, susijęs su audinių nekrozė ir hemoragija, tačiau CerS2 nulinės pelės visiškai jo nebuvo (1b pav.), Tai rodo, kad kepenų fermentų AST ir ALAT padidėjimas CerS2 nulinių pelių serume nėra padidėjęs. (1c pav.). Atsparumas FHF neatsirado dėl sutrikusios TNF α sekrecijos iš makrofagų, nes TNF α pasiekė panašų lygį tiek WT, tiek CerS2 nulinėse pelėse 90 minučių po LPS / GLN injekcijos ir išliko didesnis CerS2 nulinėse pelėse praėjus 4 val. (1d pav.).

Image

CerS2 nulinės pelės yra atsparios visiškam kepenų nepakankamumui. a ) WT ir CerS2 nulinių pelių išgyvenimo kreivė sušvirkštus 15 μg / kg LPS ir 800 mg / kg GLN. n = 14 WT, n = 7 CerS2 nulinėms pelėms. ( b ) H&E dažymas praėjus 6 valandoms po LPS / GLN injekcijos. Masto juosta = 100 μm . c ) ALT ir AST lygis serume praėjus 6 valandoms po LPS / GLN injekcijos. n = 3, * P <0, 005; ** P <0, 0005. d ) TNF α kiekis serume po LPS / GLN injekcijos. n = 3, * P <0, 05

Visas dydis

TNFR1 tarpininkaujamos kaspazės aktyvacijos slopinimas CerS2 nulinėms pelėms

Norėdami ištirti TNF α poveikį kepenų ląstelių iš WT ir CerS2 nulinėms pelėms, kultivuoti hepatocitai buvo inkubuoti su TNF α ir aktinomicinu D (ActD). 23 WT hepatocitai mirė 10–12 val. Po gydymo, tačiau hepatocitai, išskirti iš CerS2 nulinių pelių, buvo atsparūs (2a pav.). Įrišęs TNF α , TNFR1 trimerizuoja ir suaktyvina TNFR1 I kompleksą, kuris suaktyvina NF κ B išgyvenimo kelią. 3, 5 Vėliau TNFR1 internalizavimas sąlygoja FADD ir kaspazės-8 įdarbinimą, sukeldamas apoptozinio signalo aktyvaciją per TNFR1 surištą kompleksą II.

Image

Išaukimas TNFR1 komplekso I signalizacijos, bet ne kompleksinis II signalizavimas kultivuojamuose hepatocituose iš CerS2 nulinių pelių Iš WT ir CerS2 nulinių pelių išauginti hepatocitai buvo gydomi TNF α (100 ng / ml) ir ActD (500 ng / ml) nurodytą laiką. ( a ) Kairėje pusėje esančiose plokštėse yra reprezentatyvūs hepatocitų kontrasto vaizdai praėjus 12 valandų po apdorojimo (mastelio juosta = 100 μm ), o dešiniajame skydelyje parodytas ląstelių žūties laipsnis (matuojamas išskiriant LDH). n = 3, * P <0, 0005. ( b ) Kairėje pusėje esantis IKK α / β fosforilinimas ir I κ B α fosforilinimas ir skilimas rodo. Priemonės ± SEM rodomos dešiniajame skydelyje, n = 3. GAPDH ir β- aktinas parodomi kaip įkrovos kontrolė. c ) Pro-kaspazės 8 skilimas į aktyviąją p18 formą ir I κ B α skilimas. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto tris kartus. Ženklintuvai yra kairėje, o skilimo produktai - dešinėje. β- aktinas parodytas kaip įkrovos kontrolė

Visas dydis

Iš WT ir „CerS2“ pelių išskirti hepatocitai buvo gydomi TNF α / ActD, po kurio 5 min. Po gydymo buvo κ B kinazės (IKK α / β ) inhibitorius, o kartu su fosforilinimu ir κ B α ( I κ) inhibitoriaus suskaidymu. B α ) panašiu mastu tiek WT, tiek CerS2 nulinių pelių hepatocituose (2b paveikslas). Nors CerS2 nulinių pelių hepatocitai parodė užsitęsusį IKK α / β fosforilinimąsi ir lėtesnį I κB α skilimą, šie rezultatai rodo, kad TNFR1 komplekso I signalizacija CerS2 nulinėse pelėse yra aktyvuota panašiu mastu kaip ir WT hepatocituose. Atvirkščiai, aktyvioji suskaidyta kaspazė 8 buvo nustatyta WT, bet ne CerS2 nulinių pelių hepatocituose praėjus 8–10 val. Po gydymo TNF α / ActD (2c paveikslas), parodydama, kad CerS2 niekiniai hepatocitai yra labai atsparūs TNF α / ActD tarpininkaujamai apoptozei, nes trūksta TNFR1 II komplekso aktyvacijos. Be to, I κB α suskaidymas rodo, kad nėra proteasomų disfunkcijos (2c paveikslas).

Vėliau TNFR1 signalizavimas buvo tiriamas LPS / GLN gydytose pelėse, analizuojant IKK α / β fosforilinimą kepenų homogenatuose. IKK α / β buvo fosforilintas per 30–60 min. Tiek WT, tiek CerS2 nulinėse pelėse ir lydėjo panašų I κB α fosforilinimo ir skilimo laipsnį WT ir CerS2 nulinėse pelėse (3a paveikslas). Kaip ir tikėtasi, I κB α lygis sumažėjo po LPS / GLN injekcijos, tačiau stebėtinai, praėjus 6 valandoms po injekcijos CerS2 pelėms, padidėjusioms (3a pav.). Norėdami įvertinti transkripcijos slopinimo efektyvumą, įvertinome I κB α mRNR lygius prieš ir po gydymo LPS / GLN, palyginti su vien LPS. Po LPS / GLN injekcijos nenustatytas I κB α mRNR lygio padidėjimas, palyginti su pelių, į kurias buvo švirkščiama tik LPS, ir CerS2 nulinėmis pelėmis (0, 8 ± 0, 045 LPS / GLN, palyginti su 4, 7 ± 0, 17 vien tik LPS (WT) ir 1, 3 ± 0, 1, palyginti su 3, 7 ± 0, 5 (CerS2 null), n = 4), leidžiančius manyti, kad CerS2 nulinių pelių I κB α padidėjimas gali kilti dėl jo padidėjimo neparenchiminėse ląstelėse. Tai patvirtina stebimi išauginti hepatocitai, kuriuose I κB α lygis neatsigavo net po ilgo inkubavimo laiko (10 h) su TNF α / ActD (2c paveikslas).

Image

I tipo TNFR1 signalizavimas LPS / GLN apdorotomis „CerS2“ pelių pelėmis. WT arba CerS2 nulinėms pelėms buvo sušvirkšta 15 μg / kg LPS ir 800 mg / kg GLN ir įvairūs parametrai išmatuoti nurodytu laiku. ( a ) Kairėje pusėje esantis IKK α / β fosforilinimas ir I κB α fosforilinimas ir skaidymasis. Priemonės ± SEM parodytos dešiniajame skydelyje, n = 3, * P <0, 05. GAPDH rodomas kaip pakrovimo valdymas. b ) 8, 9 ir 3 kaspazių ir jų skilimo produktų Western blot analizė praėjus 6 val. po LPS / GLN injekcijos. Ženklintuvai yra kairėje, o skilimo produktai - dešinėje. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto penkis kartus, ir gauti panašūs rezultatai. c ) 8, 3/7 ir 9 kaspazių aktyvumai. Vertės yra vidurkis ± SD, n = 5, * P <0, 005; ** P <0, 0005

Visas dydis

Aktyvioji p18-kaspazė 8 buvo aptikta praėjus 6 valandoms po LPS / GLN injekcijos WT pelėms kartu su kaspazės 9 ir kaspazės 3 skaidymu, tačiau ji buvo vos aptinkama CerS2 nulinių pelių kepenyse (3b pav.). Panašiai kaspazės aktyvumas nebuvo padidėjęs CerS2 nulinės pelės kepenyse (3c pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad CerS2 nulinės pelės metu yra slopinamas proapoptozinis TNFR1 II komplekso signalizavimas, dėl kurio šio FHF modelio apoptozė panaikinama.

Priešingai nei LPS / GLN nesugebėjimas indukuoti FHF, pelių injekcija Fas agonisto antikūnu Jo-2 nulėmė panašų mirties lygį tiek WT, tiek CerS2 nulinėms pelėms (4a pav.), Kuri buvo susijusi su masyviu parenchiminiu pažeidimas, kurį lydi kraujavimas ir audinių nekrozė (4b paveikslas) ir 8 kaspazės suskaidymas (4c paveikslas). Šie rezultatai rodo specifinį VLC-SL įtaką TNFR1, bet ne Fas receptorių signalizavimui.

Image

CerS2 nulinės pelės nėra apsaugotos nuo Fas sukelto hepatito. WT ir CerS2 nulinėms pelėms nurodytą laiką buvo įšvirkšta 35 μg / kg Jo2 antikūno. a ) Pelių, išgyvenusių WT ir CerS2, išgyvenimo kreivė. n = 10 WT ir n = 12 Cers2 null pelėms. ( b ) H&E dažymas praėjus 6–8 valandoms po Jo2 antikūno injekcijos. Masto juosta = 100 μm . c ) Pro-kaspazės 8 skilimas į aktyviąją p18 formą susidaro praėjus 6 valandoms po injekcijos. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto keturis kartus. Ženklintuvai yra kairėje, o skilimo produktai - dešinėje. GAPDH rodomas kaip pakrovimo valdymas

Visas dydis

VLC-SL trūkumas blokuoja TNFR1 internalizaciją hepatocituose

Hepatocitai vėliau buvo inkubuojami su žmogaus IgG1 Fc konjuguotu TNF α . Hepatocitai buvo inkubuojami 4 ° C temperatūroje su Fc-TNF α , kad Fc-TNF α galėtų prisijungti prie TNFR1. Vėliau pašildžius iki 37 ° C, buvo galima sinchronizuoti TNFR1 internalizaciją. Kai reikšmingi Fc-TNF α kiekiai buvo internalizuoti WT kepenų ląstelėse, Fc-TNF α nebuvo įtrauktas į CerS2 nulinių pelių hepatocitus (5a pav.), Kuriuose skirtingas ląstelių paviršiaus žymėjimas buvo pastebimas net 30 minučių po pašildymo. iki 37 ° C. Fc-TNF α internalizacijos trūkumas buvo patvirtintas ištyrus RIP1 ir TRAF2 lygius, abu reikšmingai sumažėję WT hepatocitų kiekiuose po inkubacijos su TNF α įvairiais laikotarpiais, greičiausiai dėl skilimo, tačiau nepakitę CerS2 nulinių pelių hepatocituose (pav. 5b ir c). Tai atitinka tyrimus, rodančius, kad TNFR1 internalizacijos slopinimas blokuoja RIP1 ir TRAF2 skilimą. 24 Panašūs rezultatai buvo gauti su pelėmis, gydomomis LPS / GLN, kuriose ląstelių TNFR1 žymėjimą buvo galima aiškiai nustatyti WT, bet ne CerS2 nulinių pelių kepenyse, kur ženklinimas buvo stebimas ląstelės paviršiuje (6a pav.). Panašūs rezultatai buvo gauti po to, kai pelėms buvo sušvirkšta konkanavilino A, kuris tiesiogiai suaktyvina į kepenis įsiskverbiančias T ląsteles ir dėl to išskiria citokinus, įskaitant TNF α, ir TNFR1 suaktyvėjimą hepatocituose. TNFR1 buvo įtrauktas į WT, bet ne į CerS2 nulines pelių kepenis (6b pav.). Nebuvo pastebėta jokių pokyčių TNFR1 mRNR (WT pelė, 0, 78 ± 0, 53 savavališki vienetai; CerS2 null, 1, 2 ± 0, 4, n = 5) ar baltymų lygio membranose iš WT ir CerS2 nulinių pelių kepenų (6c paveikslas). Panašiai kaip ir pavienių hepatocitų, RIP1 ir TRAF2 lygis buvo žymiai sumažėjęs dėl TNFR1 aktyvavimo WT, bet ne dėl CerS2 nulinių pelių kepenų (6d pav.). CERS2 nulinių pelių RIP1 ir TRAF2 lygis buvo reikšmingai padidėjęs (RIP1 dvigubai padidėjo ir TRAF2 padidėjo keturis kartus, 6d pav.). Tai gali sukelti ilgalaikį NF κ aktyvavimą negydytose CerS2 pelėse. Todėl mes išanalizavome daugelio genų, esančių paskui NF κ B, mRNR lygius ir nė vienas iš jų nebuvo padidėjęs (mRNR lygiai savavališkuose vienetuose: Bcl XL : 1, 0 ± 0, 53 (WT), 0, 2 ± 0, 02 (CerS2 nulis); XIAP: 1, 0 ± 0, 2 (WT), 0, 6 ± 0, 1 (CerS2 nulis); cIAP2: 1 ± 0, 02 (WT), 0, 8 ± 0, 15 (CerS2 null); A20: 1, 0 ± 0, 6 (WT), 1, 2 ± 0, 3 (CerS2 null). CFLIP L lygis sumažėjo po LPS / GLN gydymo WT, bet ne CerS2 nulinėms pelėms (6e paveikslas).

Image

TNF α internalizavimas yra susilpnintas išaugintuose CerS2 pelių hepatocituose. ( a ) Hepatocitai, išskirti iš WT ir CerS2 nulinių pelių, buvo inkubuojami su Fc-TNF α 10 minučių ant ledo ir vėliau inkubuojami 37 ° C temperatūroje 15 ir 30 minučių prieš tiriant konfokaline mikroskopija. Mėlyna rodo DAPI, o raudona - Fc-TNF α . Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto penkis kartus, ir gauti panašūs rezultatai. Masto juosta = 20 μm . b ) Western blot analizė, rodanti RIP1 ir TRAF2 lygius išaugintose hepatocituose skirtingu metu po apdorojimo TNF α (100 ng / ml) ir aktinomicino D (500 ng / ml). GAPDH rodomas kaip pakrovimo valdymas. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto tris kartus, ir gauti panašūs rezultatai. ( c, d ) RIP1 ( c ) ir TRAF2 ( d ) lygių kiekybinis įvertinimas prieš ( juodos kolonėlės ) ir 40 minučių po ( atviros kolonėlės ) apdorojimo TNF α / aktinomicinu D; duomenys parodomi kaip RIP1 ir TRAF lygių kartų pokytis, normalizuotas iki GAPDH. n = 3, * P <0, 005

Visas dydis

Image

TNFR1 internalizavimas yra slopinamas CerS2 niekinių pelių kepenyse. ( a ) WT ir CerS2 nulinėms pelėms nurodytu laiku buvo sušvirkšta 15 μg / kg LPS ir 800 mg / kg GLN. Išskyrus kepenis, TNFR1 lokalizacija buvo nustatyta konfokaline mikroskopija. Mėlyna rodo DAPI, o raudona - TNFR1, kai kuriais atvejais paryškinta rodyklėmis. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto tris kartus. Masto juosta = 10 μm . ( b ) WT ir CerS2 nulinėms pelėms 8 valandas buvo sušvirkšta 25 mg / kg ConA, o TNFR1 lokalizacija nustatyta konfokaline mikroskopija. Rodyklės rodo internalizuotą TNFR1. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto tris kartus. Masto juosta = 20 μm . c ) TNFR1 Western blot analizė membranose ( mem ) ir citozolinėse frakcijose ( cyt ) iš CerS2 null ir WT kepenų. Rezultatai gauti iš tipinio eksperimento, pakartoto penkis kartus. Na + / K + ATPazė buvo naudojama kaip membranos frakcijų, * nespecifinės juostos, įkrovimo kontrolė. GAPDH buvo naudojamas kaip citoplazmos frakcijų įkrovimo kontrolė. d ) RIP1 ( kairiajame ) ir TRAF2 ( dešiniajame ) lygis praėjus 6 val. po LPS / GLN injekcijos. Viršutinėse plokštėse rodomi tipiški vakarietiški taškai, o apatinėse plokštėse RIP1 ( n = 8) ir TRAF2 ( n = 6) kiekybinis įvertinimas normalizuotas iki GAPDH. * P <0, 05. e ) cFLIP L lygis yra 6 valandos po LPS / GLN injekcijos. Viršutinėse plokštėse rodomi tipiški vakarietiški taškai, o apatinėse plokštėse kiekybinis įvertinimas normalizuotas iki GAPDH. n = 6, * P <0, 05. D ir e plokštėse juodos juostos nurodo neapdorotas ir atviras juostas, apdorotas pelėmis

Visas dydis

Galiausiai mes išanalizavome aSMazės aktyvumo lygius po LPS / GLN injekcijos, nes internalizuotas TNFR1 suformuoja receptosomas, kurios susilieja su trans-Golgi pūslelėmis, todėl suaktyvėja aSMase. 7, 25 aSMase aktyvumas buvo laikinai suaktyvintas WT, bet ne CerS2 nulinėse pelėse (7 pav.), Tai atitiko TNFR1 internalizacijos trūkumą.

Image

Trūksta ASMase aktyvacijos CerS2 nulinės pelės kepenyse. Pelėms WT ir CerS2 buvo įšvirkšta 15 μg / kg LPS ir 800 mg / kg GLN bei išmatuotas aSMase aktyvumas. Reikšmės yra vidurkis ± SD n = 3, * P <0, 05

Visas dydis

Diskusija

Pagrindinis šio tyrimo išvada yra tas, kad SL acilo grandinės kompozicija turi lemiamą vaidmenį reguliuojant TNFR1 internalizaciją ir vėlesnius signalus apie apoptozę hepatocituose. „CerS2“ niekinių pelių kepenyse nėra VLC-SL, greičiau yra padidėjęs ilgosios grandinės (C16) SL. Dėl šių pokyčių pastebimi reikšmingi kepenų membranų biofizinių savybių pokyčiai 21, pavyzdžiui, pakitęs membranų sklandumas ir morfologiniai pokyčiai. Svarbu tai, kad taip pat pasikeičia plazmos membranų receptorių lokalumas į plovikliams atsparias membranas. Pvz., CerS2 nulinės pelės kepenyse panaikinamas insulino receptorių perkėlimas į plovikliams atsparias membranas ir vėlesnis fosforilinimas, todėl kepenų atsparumas kepenyse yra toks. Dabartinis tyrimas dėl TNFR1 proapoptozės signalizacijos slopinimo yra dar vienas pavyzdys, kaip keičiant SL acilo grandinės kompoziciją veikia membranos receptorių funkcijos, tačiau tokiu atveju receptorių internalizacijos slopinimas atsirado dėl klarino sukelto moduliacijos. 6, 25, 26 kelias , o ne lipidų platinamas kelias. 20 Priešingai, TNFR1 komplekso I signalizacija priklauso nuo plausto 3, tačiau CerS2 nulinėje pelėje jos nepakeitė, o tai rodo, kad VLC ir LC-keramidų santykio pakeitimas konkrečiai veikia TNFR1 internalizaciją, bet ne jo trimerizaciją. Tačiau TNFR1 aktyvacija buvo susijusi su užsitęsusiu IKK α / β fosforilinimu ir šiek tiek uždelstu I κ B α skilimu, kuris gali būti susijęs su sutrumpintų receptorių internalizacijos susilpnėjimu, kuris gali būti gyvybiškai svarbus nutraukiant NF κ B išgyvenimo kelią. 6

Nežinomas mechanizmas, kaip klarino-tarpininkaujama 5, 27, keičiant SL acilo grandinės ilgio santykį, nežinomas, nors buvo pasiūlyta, kad klatrino dengtų duobių stabilumas priklauso nuo keramido platformų. 9, 28, 29 Taigi LC-keramidų įtraukimas į milžiniškas vienaląstes pūsleles sukelia spontanišką membranos kreivumą ir kanalėlių susidarymą, 30 sfingomielinazė sukelia spontanišką vektorinę membranos pumpurą 31, o keramidas sukelia egzozominį pumpurą ir palengvina egzosomų sekreciją. 32 Be to, B ląstelių membranos receptorius HM1.24 sąveikauja su α- adaptinu lipidų plaustuose, kad galėtų patekti į organizmą per klariną. 33, 34 Kartu TNFR1 įsiskverbimo slopinimas „CerS2 null“ pelėse atitinka supratimą, kad klarino tarpininkavimo kelius, be plausto tarpininkaujamus kelius, gali reguliuoti SL, galbūt pakeisdami adaptyvų baltymų, reikalingų clathrin, įdarbinimą. -padengtos duobės formavimas. 33 Priešingai, Fas receptorių internalizavimas nereikalingas hepatocituose (II tipo ląstelėse), kad būtų sukeltas Fas sukeltų ląstelių žūtis, parodant skirtingą SL acilo grandinės ilgio keitimo poveikį skirtingais receptorių sukeliamais keliais. 5

Įrodyta, kad keramido susidarymas naudojant aSMase ar nSMase 35, 36, 37 aktyvinimą sukelia tarp streso sukeltą apoptozę, apimančią ir nuo kaspazės priklausomus, ir nuo jų nepriklausomus kelius. 38, 39, 40, 41 Po apipjaustymo TNFR1 į ląstelės membraną įdarbina nSMazę, sukeliančią SM hidrolizę ir praturtinantį keramidą; 4, 5, 42, vėliau, internalizuotas TNFR1 aktyvuoja aSMazės ir de novo keramido sintezę, kartu kaupdamas C16-keramidą. 13, 43 Nors CerS2 nulinės pelės kaupia didelį C16-keramido kiekį, gydant LPS / GLN kepenų pažeidimo nepastebėta. Tai rodo, kad C16-keramido 14 apoptotinis poveikis yra susijęs su VLC-keramidų generavimu, laikantis nuomonės, kad TNF α- tarpininkaujamo toksiškumo CerS2 nulinėms pelėms trūkumas yra dėl pakitusių membranų savybių, turinčių įtakos TNFR1 endocitozei.

Svarbu tai, kad TNFR1 internalizacijos slopinimas CerS2 pelėms, negalinčioms užkirsti kelio 8, 9 ir 3 aSMase kasazių aktyvacijai, hepatocitų ląstelių žūčiai ir hepatitui. Šie rezultatai atspindi ankstesnius stebėjimus apie kritinį TNFR1 internalizacijos vaidmenį įdarbinant mirtį sukeliančius signalizacijos kompleksinius ar kompleksinius II baltymus, TRADD, FADD ir kaspazės 8, taip pat aSMase, ir apoptozės plitimą įvairiose ląstelių sistemose. 5, 25 TNFR1 internalizacijos slopinimas adenovirusinio E3 baltymo 14, 7K dėka yra svarbus adenovirusinių infekcijų imuninio pabėgimo mechanizmui. 25

TNFR1 internalizavimas panaikino RIP1 ir TRAF2 skilimą CerS2 nulinėms pelėms. RIP1 ir TRAF2 skilimo stoka atsirado ne dėl pakitusio proteasomų aktyvumo. Netikėtai CerS2 null pelėms buvo nustatytas didesnis bazinis TRAF2 ir RIP1 lygis, kuris gali būti susijęs su sumažėjusiu TNFR1 internalizacijos baziniu lygiu. Įrodyta, kad ubiquitino baltymo ligazė CARP-2, kuri yra RIP1 ubikvitino ligazė, TNFR1 internalizuojant, veikia kaip konstitucinis neigiamas TNF α sukeltos NF κ B aktyvacijos reguliatorius. 24 CARP-2 yra lokalizuotas endocitinėse pūslelėse, kur jis sąveikauja su internalizuotomis TNF receptosomomis ir kartu su A20 ubiquitino ligaze, ubikvitinuojančia ir TRAF2, ir RIP1, 44, 45, tarpininkauja RIP1 ubikvitinimo ir skilimo metu. Nors bazinis RIP1 ir TRAF2 lygis buvo didesnis CerS2 nulinių pelių kepenyse, genai, esantys pasroviui iki NF κ B, tokie kaip A20, cIAP2, xIAP, BCL XL ir I κ B α, CerS2 nulinėse pelėse nebuvo padidėję, tai rodo, kad padidėjęs RIP1 ir TRAF2 lygis neprisideda prie jautrumo FHF stokos.

Apibendrinant, šis tyrimas rodo VLC-SL reikšmę TNFR1 signalizavimui kepenų ląstelėse. Dėl VLC-SL abliacijos buvo visiškai slopinamas TNFR1 komplekso II signalo perdavimas dėl nekokybiškos TNFR1 internalizacijos. Kadangi skirtinguose audiniuose yra skirtingo lygio SL, kurių grandinės ilgis yra skirtingas, 46 mūsų duomenys rodo naujas priemones TNFR1 internalizacijos reguliavimui, kurios gali būti svarbios norint suprasti, kodėl kai kurie vėžiai pasižymi dideliu atsparumu TNF α tarpininkaujamai apoptozei. 47, 48, 49

Medžiagos ir metodai

Antikūnai ir reagentai

Antikūnai buvo įsigyti iš šių šaltinių: anti-fosfo-IKK α / β , anti-fosfo I κB α , anti-bendro I κB α , anti-suskaidytos kaspazės 3, anti-kaspazės 9, anti-RIP, anti- TRAF2 ir anti-FLIP (Cell Signaling, Bostonas, MA, JAV); anti-kaspazė 8 (Alexis, Shoham, Izraelis); anti-TNFR1 (Abcam, Kembridžas, JK); anti-Jo-2 agonistinis anti-Fas antikūnas (BD Biosciences, San Chosė, Kalifornija, JAV); anti-Na + / K + ATPazės antikūnas (hibridoma 6H) buvo profesoriaus Haimo Garty (Weizmanno institutas, Rehovotas, Izraelis) dovana. 50 LPS, konkanavalino A ir D - (+) - galaktozamino hidrochlorido buvo iš Sigma-Aldrich (Sent Luisas, MO, JAV).

Gyvūnai

CerS2 nulinės pelės buvo generuojamos ir prižiūrimos, kaip aprašyta. 15 pelių buvo gydomos vadovaujantis Veizmanno mokslinio instituto gyvūnų globos komiteto gyvūnų globos gairėmis ir Nacionalinio sveikatos instituto gyvūnų priežiūros gairėmis.

FHF indukcija

Pelėms (nuo 10 iki 12 savaičių) buvo įšvirkšta į pilvaplėvės ertmę 15 μg / kg LPS ir 800 mg / kg GLN arba į veną su 25 mg / kg konkanavalino A arba 35 μg / kg anti-Jo-2 agonistų. anti-Fas antikūnas. Kepenų audinio dalys buvo surinktos histologiniam tyrimui arba užšaldytos. Kraujas buvo paimtas per orbitos sinusą, o serumo ALT ir AST lygis buvo analizuotas naudojant „Spotchem Strips“ sistemą (Arkary, Edina, MN, JAV). Citokinų kiekis serume buvo išmatuotas naudojant ELISA rinkinį su pelėmis (BioLegend, San Diegas, CA, JAV). Kaspazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant kaspazės-Glo 3/7, kaspazės-Glo 8 ir kaspazės-Glo 9 aktyvumo rinkinius (Promega, Madison, WI, JAV), o aSMase aktyvumas buvo matuojamas, kaip aprašyta, 15, 51, su kai kuriomis modifikacijomis. Trumpai tariant, kepenų homogenatai, turintys 40 μg baltymų, buvo inkubuojami galutiniame 500 μl natrio acetato buferio tūryje (50 mM natrio acetato, pH 4, 5). Reakcijos buvo pradėtos pridedant 4 μM C6 –NBD-sfingomielino ir 15 minučių inkubuojamos tamsoje 37 ° C temperatūroje. Reakcijos buvo nutrauktos pridedant tris tūrius chloroformo / metanolio (1: 2; t / t). Lipidai buvo ekstrahuojami ir atskirti plonasluoksne chromatografija, naudojant kaip tirpiklį chloroformą / metanolį / 9, 8 mM vandeninio CaCl2 (60: 35: 8; t / t / t). NBD pažymėtos SL buvo identifikuotos naudojant „Fluor-S Max“ prietaisą naudojant autentiškus standartus (BioRad, Hercules, CA, JAV) ir kiekybiškai įvertintos naudojant Image Quant programą (BioRad).

Vakarų pūtimas

Ląstelių arba audinių lizatai buvo paruošti radioimuninio nusodinimo tyrimo buferyje (50 mM Tris HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0, 5% natrio deoksicholato, 0, 1% SDS), turinčiuose 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, proteazės ir fosfatazės inhibitoriai (Sigma). Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant BCA Protein Assay Kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, JAV). Įpilta penkiasdešimt μg baltymų, atskirti 8–15% SDS-PAGE ir perkelti į nitroceliuliozės arba PVDF membraną. Membrana buvo užblokuota naudojant 5% galvijų serumo albuminą (BSA) fosfatu buferiniame druskos tirpale, kuriame yra 0, 1% Tween-20 (PBST), 1 valandą kambario temperatūroje. Pirminis antikūnas praskiedžiamas PBST, turinčiame 1% BSA, ir inkubuojamas su membrana 4 ° C temperatūroje per naktį. Po trijų plovimų PBST membranos buvo inkubuotos su antriniu antikūnu PBST, turinčiame 1% BSA, kambario temperatūroje 1 valandą.

Hepatocitų išskyrimas

Hepatocitai buvo išskirti iš pelių po kepenų portalo venų perfuzijos, naudojant šiltą Ca ++ - ir Mg ++ neturintį Hank subalansuoto druskos tirpalą (Sigma-Aldrich), kuriame yra 5, 5 mM KCl, 5, 5 mM gliukozės, 25 mM NaHCO 3, 0, 7 mM EDTA 3. min., ir kepenų virškinimo terpė (GIBCO / BRL Life Technologies, Grand Island, NY, JAV) 8 min. Po perfuzijos kepenys buvo greitai pašalintos, o tulžies pūslė pašalinta. Hepatocitai buvo atskirti nuo jungiamojo audinio naudojant sterilius pincetus, po to praleidžiami per ląstelių kamštį (BD Falcon Labware) ir centrifuguojami esant 50 x g (4 ° C, 5 min.). Hepatocitai buvo suspenduoti DMEM, kuriame yra 10% vaisiaus vaisiaus serumo, 2 mM natrio piruvato, 2% penicilino / streptomicino ir 1 μM deksametazono.

Fc-TNF α internalizavimas

Fc-TNF koduojančią plazmidę pateikė H Wajant (Julius-Maximilians universitetas, Würzburg, Vokietija). Baltymas buvo laikinai ekspresuojamas HEK ląstelėse ir išvalytas iš supernatanto, naudojant HiTrap Protein G kolonėles („GE Healthcare“, Little Chalfont, JK). Hepatocitai buvo auginami ant kolageno dengtų 13 mm stiklinių dangtelių ir auginami per naktį. Ląstelės buvo apdorotos 5 μg / ml Fc-TNF α ant ledo 15 minučių ir po to du kartus plaunamos DMEM, turinčiu 1% BSA, 2 mM natrio piruvato, 2% penicilino / streptomicino ir 0, 01 μM deksametazono, kad būtų pašalintas nesusietas Fc-TNF α. ir po to perkeliama į 37 ° C. Norėdami nutraukti Fc-TNF α įsisavinimą, ląstelės tris kartus buvo plaunamos šaltu PBS ir nedelsiant pritvirtintos 2% formaldehidu. Prieš stebint konfokaline mikroskopu, Fc-TNF α buvo aptiktas naudojant Cy3 konjuguotą anti-žmogaus IgG antikūną.

Histologinė analizė

Kepenų segmentai buvo fiksuoti 4% formaldehidu ir įterpti į parafiną histologinei analizei atlikti. Skyriai (5 μm ) buvo dažyti hematoksilinu / eozinu. TNFR1 imunohistochemijai pjūviai buvo inkubuojami 4 ° C temperatūroje per naktį su pirminiu antikūnu, o po antigeno paėmimo inkubuojami su antriniu antikūnu 1 valandą kambario temperatūroje, prieš pradedant dažymą mėlynaisiais spinduliuojančiais Hoechst 33342 dažais.

qPCR

Visa RNR buvo išskirta naudojant „Rneasy“ mini rinkinį (Qiagen, Venlo, Nyderlandai) pagal gamintojo instrukcijas, į kurias buvo įtrauktas DNRzės etapas ir β- merkaptoetanolio pridėjimas. cDNR sintezė buvo atlikta naudojant „Reverse-iT“ pirmosios krypties sintezės rinkinį („Thermo Scientific“, Waltham, MA, JAV), naudojant atsitiktinius heksamerius. cDNR produktai buvo laikomi –20 ° C temperatūroje. qPCR buvo atliktas naudojant „SYBR Green PCR Master Mix“ („Finnzyme“, Vantaa, Suomija) ir „ABI Prism 7000“ sekos aptikimo sistemą („Applied Biosystems“, Grand Island, NY, JAV) su cDNR (atitinkančia 5 ng visos RNR). Buvo naudojami šie gruntai:

I κB α : Pirmyn: 5′-TTGGTCAGGTGAAGGGAGAC-3 ′; atvirkštinė dalis: 5′-ACAGCCAAGTGGAGTGGAGT-3 ′.

TNFR1: Pirmyn: 5′-GCCCCACCTCCGGCTTCAAC-3 ′; atvirkštinė: 5′-GTCAGGACGTTGCGGGTGGG-3 ′

A20: Pirmyn: 5′-GGTGATGGAAACTGCCTCAT-3 ′; atvirkštinė: 5′-CTTCCTCAGGACCAGGTCAG

BCL XL : pirmyn: GCTGGGACACTTTTGTGGAT-3 ′; atvirkštinė pusė: 5′-AACCACACCAGCCACAGTC-3 ′

cIAP2: Pirmyn: 5′-CGAGGAGGAGGAGTCAGATG-3 ′; atvirkštinė: 5′-GGAGGCAATACAGCATTGGT-3 ′.

XIAP: Pirmyn: 5′-TTGGAACATGGACATCCTCA-3 ′; atvirkštinė: 5′-TACCACTTCGCATGCTGTTC-3 ′.

Konfokalinė mikroskopija

Konfokalinė mikroskopija buvo atlikta naudojant „Olympus IX 81 Fluo-View 1000“ mikroskopą ir UPLSAPO × 60 objektyvą. Vaizdai buvo apdoroti ir analizuojami naudojant programinę įrangą FV-1000 („Olympus“, Tokijas, Japonija).

Statistinė analizė

Reikšmės išreikštos kaip vidurkiai ± SEM. Statistinis reikšmingumas buvo apskaičiuotas naudojant Studento t testą.

Žodynas

SL

sfingolipidas

SM

sfingomielinas

VLC

labai ilga acilo grandinė

GLN

D - (+) - galaktozamino hidrochloridas

„aSMase“

rūgštinė sfingomielinazė

„nSMase“

neutrali sfingomielinazė

TNFR1

naviko nekrozės faktoriaus α receptoriaus 1

RIP1

naviko nekrozės faktoriaus α receptorių sąveikaujantis baltymas

TRAF2

naviko nekrozės faktoriaus α receptorių susijęs 2 faktorius

PREKYBA

naviko nekrozės faktoriaus α receptorių, susijusių su mirties domenu

I κ B α

κ B α inhibitorius

IKK α / β

κ B kinazės inhibitorius

FHF

pilvinis kepenų nepakankamumas

CerS2

keramido 2 sintazė

LPS

lipopolisaharidas

WT

laukinis tipas

ActD

aktinomicinas D

BSA

galvijų serumo albuminas

PBST

fosfatiniu buferiniu tirpalu, kuriame yra 0, 1% Tween-20