Alternatyvus cxcr4 poveikis jak2 / stat3 aktyvacijai mažų ląstelių plaučių vėžyje | britų žurnalas apie vėžį

Alternatyvus cxcr4 poveikis jak2 / stat3 aktyvacijai mažų ląstelių plaučių vėžyje | britų žurnalas apie vėžį

Anonim

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Smulkialąstelinis plaučių vėžys (SCLC) yra agresyvus, greitai metastazuojantis navikas. Anksčiau mes pademonstravome CXCL12 – CXCR4 sąveikos įtaką procesams, susijusiems su metastazavimu ir chemorezistencija SCLC. Čia parodyta, kad STAT3 yra ekspresuojamas tiek pirminiuose SCLC naviko audiniuose, tiek SCLC ląstelių linijose. Mes ištyrėme STAT3 funkciją stimuliuodami CXCL12 SCLC ląstelių linijose. Smulkių ląstelių plaučių vėžio ląstelių linijos sukelia konstitucinį STAT3 fosforilinimą, o pamatinėse ląstelių linijose NCI-H69 ir NCI-H82 konstitucinis fosforilinimas buvo dar labiau padidintas stimuliuojant CXCL12. Toliau ištyrę šią signalizacijos kaskadą, mes parodėme, kad ji apima CXCR4 ir JAK2 sąveiką abiejose ląstelių linijose. Tačiau JAK2 inhibitorius AG490 CXCL12 sukeltą sukibimą su VCAM-1 galėjo visiškai slopinti tik NCI-H82. Be to, CXCR4 antagonistas, bet ne AG490, slopino ląstelių adheziją, tuo tarpu buvo įrodyta, kad abu antagonizmai slopina ląstelių augimą minkštame agare, ir tai rodo šio signalo svarbų įsitraukimą į nepriklausomą SCLC ląstelių augimą. Įdomiausia, kad, naudodami pirminę naviko medžiagą, mes pastebėjome, kad, priešingai nei nesmulkialąstelinio plaučių vėžio mėginiai iš pirminių naviko audinių, visi analizuoti SCLC mėginiai buvo stipriai teigiami tirozino fosforilinto STAT3 atžvilgiu. Visi šie duomenys rodo, kad STAT3 yra konstituciškai fosforilinamas SCLC ir yra svarbus SCLC augimui ir plitimui, todėl yra įdomus terapijos tikslas.

Pagrindinis

Smulkių ląstelių plaučių vėžys (SCLC) yra labai mirtinas vėžys, atsirandantis dėl ankstyvos ir plačiai paplitusios metastazių bei atsparumo chemoterapijai išsivystymo (Hoffman ir kt., 2000). Nepaisant pradinio jautrumo chemoterapijai, SCLC beveik visada atsinaujina, o pacientų 5 metų išgyvenamumas yra mažesnis nei 5% (Chute, 2006). Remiantis vėžio nustatymo teorija, įvairių kietų navikų piktybinės ląstelės (pvz., Krūties ir prostatos vėžys) gali naudoti kraujodaros kamieninių ląstelių prekybos mechanizmus, kad pasiektų savo skirtingus taikinius audinius (Wang ir kt., 2006). Chemokino receptorius CXCR4 (CD184) ir jo ligadas CXCL12 (SDF-1 α ) yra būtini kraujodaros kamieninių ląstelių nustatymui ir kaulų čiulpų sąveikai (Peled et al, 1999, Peled et al, 2000; Ratajczak et al, 2006). Iš tiesų, SCLC ląstelių linijos ir pirminės navikinės ląstelės ekspresuoja aukštą CXCR4 kiekį (Kijima ir kt., 2002; Burger ir kt., 2003), o CXCR4 ligandą CXCL12 konstituciškai ekspresuoja kaulų čiulpų stromos ląstelės (Muller ir kt., 2001). Anksčiau mes parodėme, kad CXCR4 tarpininkauja svarbioms SCLC metastazių funkcijoms su stromos mikroaplinka, pavyzdžiui, SCLC ląstelių adhezija prie imobilizuotų tarpląstelinių matricos baltymų ir stromos ląstelių, aktyvinant β 1-integrinus, ir tai sukelia ląstelių adhezijos sąlygotą atsparumą vaistams, saugančius SCLC chemoterapinio gydymo ląstelės (Sethi ir kt., 1999; Burger ir kt., 2003; Hartmann ir kt., 2005).

Stimuliuojant CXCL12, suaktyvinami įvairūs keliai SCLC ląstelėse, ir pranešta, kad CXCR4 taip pat suaktyvina JAK / STAT3 kelią (Vila-Coro et al, 1999; Ahr et al, 2005). Signalų keitikliai ir transkripcijos (STAT) baltymų aktyvatoriai yra latentiniai transkripcijos veiksniai, kurie JAK šeimos kinazėse suaktyvinami fosforilinant specifinį tirozino liekaną (Darnell, 1997). Suaktyvinus citokinų receptorius, JAK fosforiluoja monomerinius STAT baltymus, kurie labai reguliuojamu būdu sumažėja ir persikelia į branduolį, sukeldami genų transkripciją (Reich ir Liu, 2006). Daugelio vėžio formų atvejais STAT3 yra suaktyvinamas, o abejotinas STAT3 signalizavimas yra svarbus piktybinės transformacijos (Bromberg ir kt., 1999) bei angiogenezės indukcijos procesas (Niu ir kt., 2002). Tvirtas STAT3 aktyvacijos ryšys su transformacija ir naviko progresavimu daro jį patraukliu molekuliniu taikiniu kuriant naujus vėžio terapijos metodus, be to, buvo išbandytas daugelio medžiagų poveikis STAT3 (Deng ir kt., 2007). Nors ryšys tarp CXCR4 ir STAT3 buvo rastas skirtingose ​​ląstelėse, tokiose kaip kraujodaros progenitorinės ląstelės (Zhang ir kt., 2001) ar fibrosarkomos ląstelių linija (Soriano ir kt., 2002), kol kas nėra pranešimų apie STAT3 signalizavimą SCLC. Dėl anksčiau praneštų sąsajų tarp CXCR4 ir JAK / STAT signalizacijos ir šio kelio galimybių pateikti narkotikų taikinius, mus domino, ar šis kelias yra susijęs su SCLC.

Šiame tyrime mes parodėme, kad, kaip parodyta daugeliui navikų, STAT3 stipriai fosforiluojasi navikinio audinio mėginiuose iš pacientų, sergančių SCLC, palyginti su mėginiais iš pacientų, sergančių NSCLC (nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu). Mes pranešame apie galimą padidėjusį CXCL12 sukeltą STAT3 fosforilinimą, taip pat apie CXCL12 poveikio STAT3 fosforilinimui nebuvimą priklausomai nuo ląstelių linijos. Toliau tirdami šį mechanizmą, mes parodėme, kad JAK2 / STAT3 aktyvacija gali būti susijusi su ląstelių augimu, priklausomu nuo tvirtinimo vietos, tačiau nedalyvauja SCLC ląstelių adhezijoje prie stromos ląstelių.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra, chemokinai, antikūnai ir inhibitoriai

Smulkių ląstelių plaučių vėžio ląstelių linijos (NCI-H69, NCI-H82, NCI-H146, NCI-H345, NCI-H446, NCI-H510A ir NCI-N592) ir pelių stromos ląstelių linija M2-10B4 buvo gautos iš Amerikos Tipo kultūros kolekcija (Manassas, VA, JAV). Ląstelės buvo palaikomos RPMI-1640 terpėje, turinčioje 10% FCS, 1% penicilino ir streptomicino (Gibco-BRL, Grand Island, NY, JAV). Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas dažant trypano mėlynąja spalva. Sintetiniai žmogaus CXCL12 ir JAK2 antikūnai buvo įsigyti iš „Upstate Biotechnology“ (Lake Placid, NY, JAV). Antikūnai prieš STAT3 ir fosfo-STAT3 (Y705) buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, JAV). Antikūnas prieš CXCR4 buvo nupirktas iš „R&D Systems“ (Vysbadenas, Vokietija). Antikūnas prieš CD56 buvo gautas iš bendrovės „AbD Serotec“ (Diuseldorfas, Vokietija). Antikūnai prieš integrino subvienetus buvo įsigyti iš „Chemicon“ (Schwalbach, Vokietija). Inhibitorių TN14003 sukūrė ir maloniai pateikė N Fujii (Kiotas, Japonija; originalus leidinys, MRT, Molecular Cancer Therapeutics , 2003). Pertuso toksinas buvo gautas iš „Merck Biosciences“ (Darmštatas, Vokietija). AG490 ir anti-integrino antikūnai buvo įsigyti iš Calbiochem (Bad Soden, Vokietija).

Branduoliniai ekstraktai ir vakarų blotinimas

Smulkios ląstelės plaučių vėžio ląstelės serumu bado 3 valandas prieš stimuliavimą CXCL12. Ląstelės buvo inkubuotos su AG490 60 minučių ir stimuliuotos CXCL12. Vieno mėginio ląstelės (5 × 106) buvo lizuotos hipotoninėmis sąlygomis, kad būtų išsaugota branduolinė membrana (10 mM HEPES (pH 8, 0), 5 mM KCl, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 mM EGTA, 1 mM Na 3 VO). 4, 1 mM DTT, 0, 5 mM PMSF, proteazės inhibitorių mišinys („pilnas“; „Roche Applied Science“, Penzbergas, Vokietija). Branduolinė frakcija buvo atskirta centrifuguojant ir vėliau lizuota (20 mM HEPES (pH 8, 0), 400 m M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m M EGTA, 2 m M Na 3 VO 4, 1 m M DTT, 0, 5 m M PMSF, proteazės inhibitorių mišinys).

Vienodi branduolinių frakcijų kiekiai buvo atskirti 10% SDS – poliakrilamido gelio elektroforeze (PAGE) ir pernešti į nitroceliuliozės membranas. Imuninis dažymas buvo atliktas naudojant antikūnus prieš STAT3 arba fosfo-STAT3 (Y705). Juostos buvo vizualizuotos naudojant krienų peroksidaze konjuguotą antrinį antikūną ir sustiprintą chemiliuminescencijos sistemą (Amersham Biosciences, Freiburg, Vokietija).

Bendras imuninis nusodinimas

Viename mėginyje esančios ląstelės (5 × 106) buvo serumu pašalintos, stimuliuotos CXCL12, centrifuguotos ir pakartotinai suspenduotos 400 μl lizės buferyje (20 mM Tris-HCl (pH 8, 0), 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 1). m M Na 3 VO 4, 1 m M PMSF, 1% Triton X-100, proteazės inhibitorių mišinys). CXCR4 antikūnas buvo dedamas per naktį. Imuniniai nusėdimai buvo surinkti 30 μl baltymo G sepharose granulių (Amersham Biosciences). Jie tris kartus buvo plaunami lizės buferiu ir vieną kartą su PBS, frakcionuojami SDS – PAGE ir imunoblotuojami JAK2 antikūnais.

SCLC adhezija prie imobilizuoto kolageno, fibronektino ir VCAM-1

Adresinės tarpląstelinės matricos baltymų tyrimai buvo atlikti taip, kaip aprašyta anksčiau (Hartmann ir kt., 2005). Trumpai tariant, 96 šulinėlių plokštelės per naktį buvo padengtos I tipo kolagenu (5 μg ml −1 ), fibronektinu (10 μ g ml −1 ) ir VCAM-1 (1, 3 μ g ml − 1 ). Po plovimo žingsnių CXCL12 30 min. Buvo imobilizuotas kambario temperatūroje (8 μg ml- 1 ), o šuliniai 60 min. Užblokuoti naudojant 1% audinių kultūros BSA (Sigma, Miunchenas, Vokietija) PBS. Smulkių ląstelių plaučių vėžio ląstelės buvo iš anksto apdorotos AG490 (100 μM ) arba DMSO (0, 2%) 60 min., Įpiltos į duobutes keturiais egzemplioriais ir leista 30 min. Prilipti 37 ° C temperatūroje adhezijos buferyje (HBSS, buferiu su HEPES ir papildyta 0, 5% BSA). Priklijuojamų ląstelių skaičius buvo nustatytas naudojant „CyQUANT“ ląstelių proliferacijos testą (Molecular Probes, Eugene, OR, JAV), o fluorescencija buvo išmatuota mikrotitriniame plokšteliniame fluorometru (Spectra Max Gemini XS; Molecular Devices, Miunchenas, Vokietija). Buvo atlikti penki nepriklausomi eksperimentai.

SCLC ląstelių adhezija stromos ląstelėms

Pelės stromos ląstelių linija M2-10B4 dieną prieš tyrimą buvo pasėta į 24 šulinėlių plokšteles, kurių koncentracija buvo 1, 5x105 ląstelių kiekvienoje duobutėje RPMI-1640, papildyta 10% FCS. Smulkių ląstelių plaučių vėžio ląstelės buvo iš anksto inkubuotos su TN14003 (100 μg ml −1 ; 30 min.), AG490 (100 μM ; 60 min.), DMSO (0, 2%; 60 min.), L ląstelių sluoksniu, kurio koncentracija 1 x 10. 6 ląstelės viename šulinyje. Po 3 val., Esant 37 ° C, 5% CO2, šulinėliai stipriai tris kartus plaunami iš keturių krypčių 1 ml RPMI, kad būtų pašalintos nelipnios ląstelės. Likusios ląstelės, įskaitant stromos ląsteles ir prilipusias SCLC ląsteles, buvo atskirtos tripsine / EDTA, po to trimis skalbimo etapais FACS terpėje (RPMI + 0, 5% BSA). Norėdami atskirti SCLC ląsteles nuo stromos ląstelių, 30 minučių 4 ° C temperatūroje jas pažymėjome anti-CD56-PE antikūnais ir išmatuojome srauto citometrijos metodu (FACSCalibur; Becton Dickinson, Heidelbergas, Vokietija). Taigi padidėjusi CD56 + ląstelių dalis bendroje ląstelių suspensijoje atsiranda dėl prieš-tripsino gydymui priskirtų ląstelių. Mėginiai buvo analizuojami dviem egzemplioriais ir kiekvienas eksperimentas buvo savarankiškai atliktas penkis kartus.

Integrino subvienetų ir VCAM-1 ekspresija

Integrinų subvienetų ekspresija buvo nustatyta naudojant monokloninius CD29, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d ir CD49e antikūnus ir atitinkamas izotipo kontrolines medžiagas (Becton Dickinson). Smulkių ląstelių plaučių vėžio ląstelės buvo sureguliuotos iki 106 ląstelių / ml koncentracijos PBS + 0, 5% BSA ir dažytos sočiųjų antikūnų koncentracijomis 20 minučių 4 ° C temperatūroje. Du kartus praplovus ląsteles, integrino ekspresija buvo analizuojama srauto citometrija.

Tirpiojo VCAM-1 ekspresija ląstelių kultūros supernatantuose buvo nustatyta ELISA metodu, kurį pateikė „R&D Systems“ („Quantikine Mouse sVCAM-1 Immunoassay“) pagal gamintojo instrukcijas.

Minkšto agaro tyrimas

Smulkių ląstelių plaučių vėžio ląstelės (1 × 104) buvo išskirtos 2 ml RPMI-1640, turinčios 10% FCS ir 0, 3% agarozės. Prieš pilant ląsteles ant apatinio 0, 6% minkšto agaro sluoksnio 12 šulinėlių plokštelėse, buvo pridėta TN14003 (100 μg ml −1 ) arba AG490 (100 μM ). Neapdorotos ląstelės ir DMSO apdorotos ląstelės (0, 2%) buvo naudojamos kaip kontroliniai. Ląstelės buvo šeriamos tris kartus per savaitę šviežia terpe, turinčia atitinkamų inhibitorių. Ląstelių kolonijos buvo fotografuojamos po 2 savaičių.

Imunohistochemija

Pacientų, sergančių SCLC ( n = 10) ir NSCLC ( n = 13), pirminių navikų audinių mėginiai buvo fiksuoti formaline ir įterpti į parafiną. Skyriai (3 μm ) buvo išdžiovinti, parafinuoti ksilene ir rehidratuoti per rūšinį alkoholį į vandenį. Antigenas buvo imamas verdant mėginius iki pH 6, 1. Antigenai buvo dažomi naudojant šarminės fosfatazės prieššarminę fosfatazės metodą (Dako, Hamburgas, Vokietija), kaip aprašė gamintojas. Antikūnai prieš STAT3 arba fosfo-STAT3 (Y705) buvo naudojami esant 1: 100 koncentracijai.

Statistinė analizė

Statistinei analizei buvo naudojamas suporuotas Studentų t- testas palyginant dvi grupes. Analizės buvo atliktos naudojant „Origin 7G“ („OriginLab Corporation“, Northampton, MA, JAV) statistikos įrankį.

Rezultatai

Konstitutyvusis ir indukuojamas STAT3 SCLC ląstelių linijose

Norėdami įvertinti fosforilinto STAT3 lygį SCLC, mes paruošėme ir ištyrėme branduolių ekstraktus iš septynių nestimuliuotų SCLC ląstelių linijų, naudodami Western blot analizę, naudodami anti-fospho-STAT3 antikūną. Kaip kontrolė, visas branduolinis STAT3 buvo nudažytas. Daugelyje tirtų ląstelių linijų radome konstitucinį STAT3 fosforilinimą, tačiau skirtingu lygiu. Ląstelių linija NCI-H510A pasižymėjo ypač stipriu konstituciniu STAT3 fosforilinimu, tuo tarpu NCI-H69 rodė žemiausią lygį su nedideliu ar neaptinkamu konstituciniu reiškiniu (1A pav.). Kadangi NCI-H69 ir NCI-H82 yra dažniausiai tiriamos SCLC ląstelių linijos ir joms būdingas gana silpnas konstitucinis aktyvinimas, mes toliau panaudojome šias dvi ląstelių linijas, norėdami nustatyti, ar CXCL12 gali tiesiogiai suaktyvinti JAK2 / STAT3 signalizacijos kelius SCLC ląstelėse. Norėdami tai padaryti, mes išmatuojome tirozino fosforilinto STAT3 lygį branduolių ekstraktuose po gydymo CXCL12. STAT3 egzistuoja skirtingose ​​izoformose; STAT3 α yra iki šiol dažniausiai apibūdinamas. STAT3 α fosforilinamas stimuliuojant CXCL12, priklausomai nuo laiko, ne ilgiau kaip po 10 min., Vis tiek parodant stiprų signalą po 30 min., Sumažėjęs citozolinis poveikis gali būti dėl mažo STAT3 vaizdavimo šiame baseine (1B pav.). CXCL12 sukeltą tirozino fosforilinimą STAT3 buvo galima pastebėti SCLC ląstelių linijose NCI-H69, NCI-H82, NCI-H119, NCI-H173 ir NCI-H446, bet ne NCI-N592 (1C pav.). Didelė CXCR4 ekspresija aprašyta NCI-N592 (Burger ir kt., 2003), pagrindžiančioje SCLC ląstelių linijų heterogeniškumą ir atspindinčioje pačių SCLC diagnozuotų navikų heterogeniškumą.

Image

JAK2 / STAT3 kelio apibūdinimas SCLC ląstelėse. Neapdorotų SCLC ląstelių branduolių ekstraktai buvo analizuojami atliekant Western blot analizę ir parodė STAT3 fosforilinimą skirtingais laipsniais. ( A ) CXCL12 sukeltas STAT3 fosforilinimas įvyko priklausomai nuo laiko, kaip pastebėta Western blot analizėje naudojant NCI-H69 branduolių ekstraktus, apdorotus 100 ng ml −1 CXCL12 ( B ). Visos tirtos ląstelių linijos, išskyrus NCI-N592, parodė STAT3 fosforilinimo indukciją CXCL12 stimuliacija ( C ). JAK2 buvo nudažytas atliekant „Western blot“ analizę, atlikus bendrą imunoprecipitaciją su CXCR4 antikūnu, stimuliavus NCI-H69 (kairiajame skydelyje) ir NCI-H82 (dešiniame skydelyje) su 100 ng ml −1 CXCL12 nurodytu laikotarpiu ( D ). Kiekvienas parodytas taškas yra reprezentatyvus mažiausiai trims nepriklausomiems eksperimentams.

Visas dydis

Norėdami tiesiogiai išanalizuoti JAK2 ryšį su CXCR4, stimuliuojant CXCL12, mes atlikome bendro imuniteto nusodinimo tyrimus su NCI-H69 ir NCI-H82. Abiejose ląstelių linijose pastebėtas esminis JAK2 ryšys su CXCR4, tačiau NCI-H69 buvo mažesnis. JAK2 ryšys su CXCR4 padidėjo stimuliuojant CXCL12, o maksimalus ryšys buvo pastebėtas po 15 min (1D paveikslas). Priešingai, NCI-H82 parodė stiprų JAK2 ryšį su CXCR4, kurio dar negalėjo padidinti stimuliacija CXCL12. Dviejų fosforilinto JAK-2 juostų stebėjimas buvo netikėtas ir greičiausiai dėl baltymų skaidymo.

Β1-integrinų ekspresija ir funkcijos SCLC ląstelių linijose NCI-H69 ir NCI-H82

Toliau ištyrėme skirtumus tarp NCI-H69 ir NCI-H82 aktyvacijos, sutelkdami dėmesį į kitą baltymų šeimą: integrinus. Integrinai sudaro heterodimerinių baltymų ( α ir β subvienetų) šeimą. Tai yra ląstelių adhezijos molekulės, tarpininkaujančios ląstelės ir tarpląstelinės matricos, taip pat ląstelės ir ląstelės sąveikai. Įrodyta, kad β1 -integrino signalai, sukeliantys piktybinį ląstelių adheziją, yra svarbūs SCLC ląstelių atsparumui chemoterapijai (Sethi ir kt., 1999). Abi ištirtos SCLC ląstelių linijos, NCI-H69 ir NCI-H82, buvo teigiamos β 1-integrino ir neigiamos α 1-, α 2- ir α 3-integrinų atžvilgiu, tačiau skyrėsi α 4- ir α 5- ekspresijoje. subvienetai. Priešingai nei NCI-H69, kuris neišreiškė jokio α 5, NCI-H82 buvo teigiamas šiam subvienetui. Integrino α 4 kiekis NCI-H82 buvo ekspresuojamas gausiau nei NCI-H69 (2 paveikslas). Įdomu tai, kad α- 4- β1 integrinas, dar vadinamas VLA4 (alfa4-beta1 integrinu), yra žinomas kaip navikų atsparumas vaistams su adhezija (Sanz-Rodríguez ir kt., 2001).

Image

Integralo subvienetų ekspresija SCLC ląstelių linijose. Fluorescencinės histogramos, vaizduojančios β1 -integrino (CD29) ir α 1-, α 2, α 3, α 4, α 5-integrino (CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e) subvienetų raišką SCLC ląstelių linijomis. NCI-H69 ir NCI-H82 parodytos juodomis linijomis. Atitinkamus izotipų valdiklius žymi pilkos spalvos atspalvio histogramos.

Visas dydis

NCI-H82 adhezija prie VCAM-1 priklauso nuo JAK2

Anksčiau mes parodėme, kad imobilizuotas CXCL12 indukuoja VLA-4 tarpininkaujantį SCLC ląstelių linijų su imobilizuotu VCAM-1 ir fibronektinu sukibimą, kurį gali slopinti kokliušo toksino ir ritokinazės inhibitoriai (Burger et al., 2003; Hartmann et al. 2005). Čia mes ištyrėme JAK2 / STAT3 kelio įtaką šiam procesui. Tarpląstelinės matricos ir CXCL12 baltymai buvo kartu imobilizuoti 96 šulinėlių plokštelėse ir nustatytas SCLC ląstelių adhezijos greitis.

Ląstelių linija NCI-H82 parodė stipriausią CXCL12 sąlygotą sukibimą su VCAM-1, kurį galima visiškai panaikinti iš anksto inkubuojant su JAK2 inhibitoriumi AG490 (3A pav.). Šios ląstelių linijos adhezija prie kolageno ir fibronektino buvo silpnesnė, o AG490 įtakos neturėjo. Žymus CXCL12 stimuliacijos padidėjimas buvo pasiektas tik esant VCAM-1 ( P = 0, 002). Po indukcijos AG490 ši indukcija reikšmingai sumažėjo. Priešingai, CXCL12 sukėlė NCI-H69 ląstelių adheziją prie kolageno ( P = 0, 065), tuo tarpu CXCL12 tarpininkaujamas sukibimas su VCAM-1 ir fibronektinu buvo mažesnis ( P = 0, 095) ir reikšmingai sumažėjo, palyginti su NCI-H82 ląstelių rezultatais ( P = 0, 002). Tai koreliuoja su skirtingų ląstelių linijų VLA-4 ekspresijos lygiais, o žemą NCI-H69 sukibimą galima paaiškinti maža šios ląstelės linijos VLA-4 ekspresija. Bazinis sukibimo lygis labai skiriasi abiejose ląstelių linijose. Neįmanoma nustatyti AG490 slopinamosios įtakos NCI-H69 ląstelių sukibimui CXCL12 pagrindu (3B pav.). Norėdami tiesiogiai palyginti gydymo poveikį abiejose ląstelių linijose, išreiškėme rezultatus, susijusius su bazinio adhezijos lygio, gauto naudojant kontrolinį BSA, funkcijomis. Rezultatai pateikiami 1 lentelėje ir iliustruoja anksčiau aprašytus stebėjimus, toliau parodydami skirtumus po apdorojimo AG490 kiekvienoje ląstelių linijoje (užtemti rezultatai).

Image

Sukibimas su tarpląsteliniais matricos baltymais. Neapdorotoms kontrolinėms medžiagoms parodyti santykiniai NCI-H82 ( A ) ir NCI-H69 ( B ) sukibimo su VCAM-1, fibronektinu ir kolagenu, išmatuoto po 30 min., Ląstelės, stimuliuotos kartu imobilizuotu CXCL12 (8 μg ml −1) ), ląstelės, iš anksto inkubuotos su AG490 (60 min., 100 μM ), ir ląstelės, kurios abi buvo inkubuotos su inhibitoriumi ir stimuliuotos CXCL12. Klaidų juostos žymi sem. Skirtumai buvo pripažinti reikšmingais, kai P <0, 05 ( * ), n = 5, kiekvienas eksperimentas keturiais egzemplioriais.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

SCLC ląstelių linijų adhezija prie stromos ląstelių linijos M2-10B4

Anksčiau mes parodėme, kad VLA-4 blokavimas anti- α 4 antikūnais ir CXCR4 blokavimas antagonisto TN14003 dėka slopino SCLC ląstelių adheziją stromos ląstelėms (Hartmann ir kt., 2005). TN14003 yra gautas iš T140, pasagos krabo savigynos peptidų gauto CXCR4 antagonisto; TN14003 yra stabilus serume ir specifiškesnis T140 variantas (Tamamura ir kt., 2004). Be CXCL12, tirpus VCAM-1 išsiskiria M2-10B4: ELISA metodu mes nustatėme, kad supernatantuose (keturi nepriklausomi tyrimai dublikatus) buvo bent 2, 38 ± 0, 66 ng ml −1 VCAM-1, kaip jau buvo pastebėta (Hartmann et al., 2005). Dėl stebimo AG490 sąlygojamo NCI-H82 adhezijos su VCAM-1 slopinimo ir aptikto stromos ląstelių VCAM-1 sekrecijos, mes ištyrėme, ar gydymas AG490 slopina NCI-H69 ir NCI-H82 adheziją stromos ląstelėse. Tačiau sudėtingesnėje stromos sąveikos aplinkoje vien JAK2 užsikimšimas nesugebėjo slopinti SCLC ląstelių adhezijos prie stromos, tuo tarpu CXCR4 slopinimas TN14003 buvo visiškai efektyvus (4 paveikslas), parodant suaktyvių kelių, suaktyvėjusių CXCL12 prisijungimo prie CXCR4.

Image

Sukibimas su stromos ląstelių linija M2-10B4. Po išankstinio apdorojimo AG490 (100 μM , 60 min.) Arba TN14003 (100 μg ml −1, 30 min.) NCI-H82 ( A ) ir NCI-H69 ( B ) buvo leidžiama lipti prie M2-10B4 ląstelių 3 valandas. atitinkamai, po to intensyviai plaunami, kad būtų pašalintos nelipnios ląstelės iš terpės, tada ląstelių kompleksas buvo tirpinamas, kad būtų galima suspenduoti, prieš įvertinant FACS kiekvienos rūšies ląstelę ( n = 3).

Visas dydis

CXCR4 ir JAK2 / STAT3 kelių svarba augime nuo tvirtinimo vietų nepriklausomai

Nepriklausomas SCLC ląstelių augimas nuo tvirtinimo buvo nustatytas minkštojo agaro tyrime (Missale et al, 1998). Nesant inhibitorių ir kontroliuojant DMSO, ląstelės sugebėjo sukaupti didelius agregatus minkštame agare per 2 savaičių stebėjimo laikotarpį. Priešingai, CXCR4 inhibitoriaus TN14003 proliferacija nepastebėta, o tai rodo šio chemokino receptoriaus indėlį šiame procese. Taip pat buvo visiškai slopinamas JAK2 inhibitorius AG490, o tai rodo šio kelio svarbą augimui nuo tvirtinimo vietos (5 paveikslas). Pirmą savaitę tiek slopintos ląstelės, tiek kontrolinės medžiagos mikroskopu atrodė gana panašiai, išskyrus tai, kad slopintos ląstelės neplinta. Tačiau po 7–10 dienų TN14003 ir AG490 slopintos ląstelės pradėjo keisti savo morfologiją. Jie tapo apvalesni, aštresni ir, pagaliau, tamsesni nei valdikliai.

Image

Nuo tvirtinimo vietos nepriklausantis minkšto agaro augimas. SCLC ląstelės NCI-H82 ( A, B ir E, F ) ir NCI-H69 ( C, D ir G, H ) buvo išskirtos, sudėtos į 0, 3% agarozės gelį ir stebimos, ar nėra ( A, C ) ar nėra TN14003 (100 μg / ml) ( E, G ) ir AG490 (100 μM ) ( F, H ). Atlikta tinkama kontrolė naudojant DMSO ( B, D ), kad būtų išvengta šio tirpiklio dalyvavimo stebėtuose rezultatuose. Būdingas ląstelių agregatas buvo nufotografuotas po 14 dienų ( n = 3).

Visas dydis

STAT3 fosforilinamas pirminiuose navikuose, sergantiems SCLC

Norėdami įvertinti šių stebėjimų tinkamumą patofiziologiniame kontekste, mes ištyrėme STAT3 fosforilinimą SCLC ir palygėme su NSCLC. Ligonių, sergančių SCLC ( n = 10) ir NSCLC ( n = 13), pirminių navikų audinių mėginiai buvo dažyti anti-fosfo-Tyr705 STAT3 ir anti-STAT3 antikūnais atliekant imunohistochemiją. Tyrimai, gauti iš pacientų, kenčiančių nuo SCLC (10 iš 10), buvo stipriai teigiami fosforilinto STAT3 atžvilgiu, tuo tarpu pacientų, kenčiančių nuo NSŠKL, mėginiai (13 iš 13) reikšmingai fosforilino STAT3 tik baziniuose kvėpavimo organų epitelio ir alveolinių makrofagų sluoksniuose., bet ne naviko audinyje. Norėdami nustatyti fosforilintą STAT3, mėginiai iš SCLC ir NSCLC buvo dažomi vienodai, naudojant anti-STAT3 antikūną (6 paveikslas).

Image

Reprezentatyvus imunohistocheminis pirminio naviko mėginių dažymas iš 10 pacientų, sergančių SCLC ( A ir C ) ir 13 pacientų, sergančių NSŠK ( B ir D ). Objektyvai buvo dažomi atitinkamai fosfo-Tyr705-STAT3 antikūnais (viršutinė eilutė: A ir B ) ir STAT3 antikūnais (žemesnės eilės: C ir D ).

Visas dydis

Diskusija

JAK2 / STAT3 kelias dalyvauja įvairiose signalizacijos kaskadose, įskaitant tirozino kinazių receptorių ir su G-baltymu sujungtų receptorių signalizavimą. JAK / STAT kelio aktyvinimas yra susijęs su proliferacija, ir aprašoma, kad tiek JAK2, tiek STAT3 aktyvus aktyvavimas yra piktybinė transformacija ir tumourigenesis (Bromberg ir kt., 1999; Levy ir Darnell, 2002). STAT3 vis daugiau dėmesio skiria vėžio terapijai, nes sergant vėžiu ji dažnai yra per daug aktyvuota. Iš esmės aktyvus JAK2 mutantas V617F randamas daugeliui pacientų, sergančių mieloproliferacinėmis ligomis (Levine ir Gilliland, 2007), ir konstituciškai fosforilintas STAT3 randamas daugelyje solidinių navikų ir kraujodaros piktybinių navikų (Lim ir Cao, 2006). Buvo aprašyta, kad chemokino receptorius CXCR4 aktyvuoja JAK2 / STAT3 kelią skirtingose ​​ląstelių linijose (Vila-Coro ir kt., 1999; Soriano ir kt., 2003; Opdam ir kt., 2004; Moriguchi ir kt., 2005) ir už ląstelių domenus, atsakingus už JAK2 surišimas buvo aptiktas atliekant mutacijų analizę (Ahr et al, 2005). Iki šiol nebuvo pranešimo apie JAK / STAT kelio aktyvavimą SCLC.

Šiame tyrime mes parodėme, kad STAT3 stipriai fosforiluojasi pirminiuose naviko audiniuose iš pacientų, sergančių SCLC, ir tai rodo, kad šis kelias gali būti svarbus patofiziologiniuose procesuose, susijusiuose su SCLC. Priešingai, pirminiai naviko audinio mėginiai iš pacientų, sergančių NSCLC, neparodė jokio stipraus STAT3 aktyvavimo naviko audinyje. NSCLC mėginiuose tik alveoliniai makrofagai ir baziniai kvėpavimo organų epitelio sluoksniai rodė stipriai fosforilintą STAT3 - ląstelių tipai, kaip jau žinoma, rodo STAT3 fosforilinimą dėl jų proliferacinio pajėgumo. Ataskaitos apie konstitucinį STAT3 fosforilinimą kai kuriose NSCLC ląstelių linijose (Song ir kt., 2003) ir plaučių adenokarcinomos (Gao ir kt., 2007) neprieštarauja mūsų stebėjimui, nes jie pranešė apie santykinai mažą stipraus fosforilinimo procentą, o STAT3 fosforilinimas buvo daugiausia. susijusios su mutacijomis EGFR kinazės srityje ir IL-6 gamyboje.

Nustatyta, kad mažų ląstelių plaučių vėžio navikas ir ląstelių modeliai in vitro tyrimams yra nevienalytiški (Carney ir kt., 1985); tačiau galima apibūdinti kai kuriuos bendrus bruožus: visose analizuotose SCLC ląstelių linijose buvo konstitucinis STAT3 fosforilinimas, tačiau skirtingais laipsniais. Be konstitucinio STAT3 aktyvavimo, mes sugebėjome parodyti, kad SCLC ląstelių linijų stimuliavimas CXCL12 padidino STAT3 fosforilinimą visose ląstelių linijose, išskyrus vieną. Įdomu tai, kad stimuliacijos metu fosforiluojasi tik STAT3 α- izoforma. Manoma, kad abi izoformos turi skirtingas funkcijas ir skatina skirtingų genų transkripciją (Chakraborty ir kt., 1996; Maritano ir kt., 2004), tačiau funkciniai skirtumai iki šiol menkai suprantami. Nepaisant to, išskirtinis STAT3 α fosforilinimas po IL-6 arba IL-10 stimuliacijos buvo parodytas skirtinguose ląstelių modeliuose (Maritano ir kt., 2004). Ankstesni tyrimai, apibūdinantys CXCR4 sąlygojamą STAT3 aktyvaciją, neišskiria izoformų, todėl mūsų rezultatai yra nauja užuomina, kad citokinų aktyvacija nukreipia α- izoforminį fosforilinimą. Norėdami sutelkti dėmesį į šį tašką, mes panaudojome dvi SCLC ląstelių linijas, kurios parodė tik mažą konstitucinį STAT3 fosforilinimą, bet aiškiai indukuojamą fosforilinimą reaguodamos į CXCL12: NCI-H82 ir NCI-H69. JAK2 ryšį su CXCR4 sukėlė CXCL12 NCI-H69. NCI-H82 ląstelių linijoje esminis JAK2 ir CXCR4 ryšys yra stipresnis, tačiau jo negalima toliau didinti. Panašu, kad tai vyksta kartu su stipresniu NCI-H82 aktyvavimu atliekant funkcinius tyrimus. Pavyzdžiui, NCI-H82 parodė aukštesnį bazinio sukibimo lygį, palyginti su NCI-H69, o NCI-H82 sukonstravo didesnius agregatus minkštojo agaro tyrimuose.

CXCR7 yra neseniai aprašytas antrasis CXCL12 receptorius ir buvo įrodyta, kad jis skatina plaučių vėžio augimą in vivo (Miao ir kt., 2007), tačiau šis receptorius veikiau gali moduliuoti CXCR4 sukeltas reakcijas, o ne veikti kaip nepriklausomas CXCL12 receptorius (Hartmann ir kt., 2008). . Norėdami įvertinti CXCR7 galimą įsitraukimą į čia pastebėtus rezultatus, mes ištyrėme CXCR7 raišką NCI-H69, NCI-H82 ir NCI-N592 paviršiuje, ypač domindami NCI-N592, kur STAT3 aktyvacija nėra CXCL12 stimuliacija gali būti paaiškinta CXCR7 sumažinant CXCL12. Buvo nustatyta, kad ekspresijos nėra arba jos yra labai žemos NCI-H82 ir NCI-N592, bet didelės, kai NCI-H69 (duomenys nepateikti); tačiau atrodo, kad TN14003 nuosekliai slopindamas CXCL12 aktyvavimą NCI-H69, atmeta bet kokį didesnį CXCR7 įsitraukimą į šį aktyvavimo mechanizmą.

Norėdami toliau įvertinti CXCL12 sukeltų JAK2 ir STAT3 aktyvavimo biocheminių įrodymų ir konstitucinio STAT3 fosforilinimo in vivo funkcinį svarbą, išanalizavome JAK2 inhibitoriaus AG490 poveikį adhezijai, kurią sukelia CXCR4 ir nuo tvirtinimo vietos nepriklausomas ląstelių augimas. Tik keli tyrimai rodo JAK2 įtaką citokinų stimuliuojamam adhezijai. Vienas tyrimas parodė, kad AG490 beveik visiškai panaikino CXCL12 sukeltą T ląstelių adheziją prie VCAM-1 (García-Bernal ir kt., 2005). Remdamiesi šiais duomenimis apie kraujodaros ląsteles, mes stebėjome, kad AG490 visiškai slopina CLCCL12 sukeltą SCLC ląstelių linijos NCI-H82 adheziją prie VCAM-1. Priešingai, CXCL12 sukeltas VCAM-1 NCI-H69 sukibimas buvo daug mažesnis dėl mažesnės α 4-integrino ekspresijos, todėl mes negalėjome įrodyti AG490 įtakos. Be to, nors kaulų čiulpų stromos ląstelių linija M2-10B4 ekspresuoja didelius CXCL12 ir VCAM-1 kiekius, mes negalėjome panaikinti SCLC sukibimo su M2-10B4 pagal AG490. Tai rodo kompensacinius mechanizmus ar kitus dominuojančius kelius šiame sudėtingame sukibimo modelyje. Be sukibimo, nuo tvirtinimo vietų nepriklausomas augimas yra pagrindinė funkcija, kuri skatina naviko augimą ir metastazes. Buvo pranešta, kad nuo grupių, kurios nepriklauso nuo tvirtinimo vietos, augimas priklausė nuo CXCR4 ir daugeliui piktybinių navikų (Ratajczak ir kt., 2006; Wang ir kt., 2006). Mes ištyrėme nuo tvirtinimo vietos nepriklausomą augimą minkštojo agaro tyrime (Missale ir kt., 1998), kai ląstelės dauginasi be ląstelių ar paviršiaus kontaktų ir turi įveikti kontaktų slopinimą. Remdamiesi pranešimais apie kitus piktybinius susirgimus (Sehgal ir kt., 1998; Huang ir kt., 2005), parodome visišką minkšto agaro proliferacijos slopinimą ląstelių linijose NCI-H69 ir NCI-H82, blokuodami JAK2 arba CXCR4 su inhibitoriais AG490 ir TN14003, atitinkamai.

Apibendrinant, pirminiuose navikų mėginiuose iš pacientų, sergančių SCLC, bet ne iš NSCLC, mes parodome aukštą konstitucinį STAT3 fosforilinimą ir nuo JAK2 / STAT3 kelio konstitucinį ir nuo CXCL12 priklausomą aktyvavimą SCLC ląstelių linijose. Be to, mes čia parodėme, kad nors STAT3 paprastai yra susijęs su SCLC biologija, jo fosforilinimas gali būti susijęs bent su dviem skirtingais aukščiau esančiais keliais, priklausomais ar nepriklausomais nuo CXCR4. Tai ypač domina vaistų kūrimo strategijos, nes CXCR4 ir STAT3 antagonizmai buvo pasiūlyti kaip plataus spektro taikiniai vėžio terapijoje (Wang ir kt., 2006; Germain ir Frank, 2007; Ruffini ir kt., 2007). Čia parodome, kad kuriant SCLC vaistus, reikia atsižvelgti į CXCR4 / STAT3 ryšį, kad būtų konkrečiau nukreiptos į piktybines ląsteles; although JAK2/STAT3 seems to have a dominant function in anchorage-independent cell proliferation, it has a minor function in adhesive processes of SCLC cells where CXCR4 antagonists should prove more efficient. Besides CXCR4 antagonists that are currently investigated in an in vivo model for SCLC, STAT3 inhibitors on its own or in combination with CXCR4 inhibitors will be very interesting to consider as therapeutic option for the treatment of patients with SCLC.

Pokyčių istorija