Esminis transkripcijos faktoriaus runx1 vaidmuo t ląstelių brendime | mokslinės ataskaitos

Esminis transkripcijos faktoriaus runx1 vaidmuo t ląstelių brendime | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Limfocitai
  • Limfopiozė

Anotacija

Transkripcijos faktorius Runx1 vaidina svarbų vaidmenį visos kraujodaros metu. Čia mes parodome, kad Runx1 yra labai svarbus T ląstelių brendimui. Periferinės CD4 + T ląstelės, gautos iš CD4-cre Runx1 cKO pelių, yra fenotipiškai ir funkciškai nesubrendusios, kaip parodyta sumažėjus TNF-α gamybai po TCR stimuliacijos. Periferinių CD4 + T ląstelių praradimas CD4-cre Runx1 cKO pelėse nėra dėl homeostazės defektų ar sumažėjusios IL-7Rα ekspresijos, nes transgeninė IL-7Rα ekspresija neišgelbėja CD4 + T ląstelių praradimo. Neišbrėžtos CD4 + T ląstelės, turinčios Runx1 trūkumą, periferijoje pašalinamos aktyvavus ir fiksuojant klasikinį komplemento kelią. Dėl užkrūčio ląstos yra stiprus visų intrathiminio T ląstelių brendimo aspektas, nors ir teigiama, ir neigiama atranka nepakinta. Taigi, praradus Runx1, atsiranda ankstyviausias pobūdis po pozityvios atrankos intratiiminiame CD4 T ląstelių brendime.

Įvadas

Funkcinių subrendusių T ląstelių generavimas priklauso nuo pozityvaus T ląstelių brendimo 1 . Intratipinis brendimas įvyksta SP stadijoje, o po timio brendimo reikia kontakto su antriniais limfoidiniais organais, tokiais kaip blužnis ar limfmazgiai, prieš T ląstelėms patenkant į ilgaamžį naivų T ląstelių baseiną 2 . Pavienių teigiamų (SP) timocitus galima suskirstyti į tris populiacijas pagal jų brendimo būklę: pusiau subrendę (SM) SP timocitai yra CD24 + CD69 + MHCI - CCR7 - ir yra jautrūs mirties receptorių signalizuojamai apoptozei; subrendę 1 (M1) SP timocitai yra CD24 + CD69 + MHCI + CCR7 + ir yra atsparūs mirties receptorių sukeltai apoptozei ir gali daugintis po TCR stimuliacijos; subrendę 2 (M2) SP timocitai yra CD24 - CD69 - MHCI + CCR7 + ir įgyja galimybę iškrėsti iš užkrūčio šlaunies 3, 4, 5 . Kai T ląstelės išstumia iš užkrūčio ląstos, jauniausios T ląstelės periferijoje yra vadinamos naujausiais užkrūčio liaukos emigrantais (RTE). Prieš patekdami į ilgaamžį naivų T ląstelių telkinį, RTE ir toliau kartojasi po skydliaukės, todėl padidėja jų gebėjimas gaminti citokinus stimuliuojant. Brandinimo metu T ląstelės taip pat įgyja atsparumą komplemento sukeltam eliminavimui 6, 7 . Nors signalai ir molekuliniai mechanizmai, reguliuojantys T ląstelių brendimą, nėra gerai suprantami, naujausi tyrimai nustatė genus, kurie yra specialiai reikalingi po pozityvios atrankos T ląstelių brendimui. 8, 9, 10, 11 . Visų pirma, pelėms, turinčioms sąlyginę deleciją transkripcijos reguliatorius NKAP (NF-κB aktyvinantis baltymas) arba HDAC3 (histono deacetilazė 3), T ląstelių brendimo blokas yra 6, 7, todėl jų eliminacija periferijoje yra RTE. Kartu su brendimu, T ląstelės padidina sialinės rūgšties, ypač su α2, 8-sujungtos sialinės rūgšties, įsiskverbimą į ląstelių paviršiaus glikanus. Sializacijos praradimas, pavyzdžiui, eksperimentiškai per neuraminidazę, sąlygoja natūralų IgM prisijungimą ir 12, 13 komplemento aktyvaciją. CD4-cre NKAP cKO arba CD4-cre HDAC3 cKO pelių RTE turi α2, 8-sializacijos trūkumą ir sumažintą komplemento reguliuojančio baltymo CD55 ekspresiją, kurie prisideda prie jų pašalinimo iš komplemento. Pakeista α2, 8-sializacija, kai RTE nėra NKAP ar HDAC3, atsiranda dėl sumažėjusios s8 rūgšties transferazių, priklausančių ST8Sia šeimai, ypač ST8Sia6 6, 7, mRNR ekspresijos.

Transkripcijos faktorius Runx1 (dar vadinamas AML1 / CBFA2 / PEBP2αB) priklauso Runx transkripcijos veiksnių šeimai, turinčioms labai konservuotą DNR rišantį runx domeną 14 . Runx baltymai yra siejami su ne DNR jungiančiu kofaktoriu CBFβ, kuris leidžia stabiliai surišti Runx baltymus prie taikomų DNR sekų. Prijungdamas prie reguliuojančių elementų Cd4 , Foxp3 ir Gata3 , Runx1 vaidina daugybę vaidmenų T ląstelių vystymesi 15, 16, reguliuojančių T ląstelių generavimą ir slopinamąją funkciją, atitinkamai 17, 18, 19, 20 ir Th2 diferenciaciją 21 . Dėl CD4-cre medijuojamos Runx1 delecijos sumažėja CD4 SP timocitų skaičius ir procentas, ypač TCRβ hi CD24 lo populiacijoje ir keliose periferinėse CD4 + T ląstelėse 15 . CD4 + T ląstelės CD4-cre Runx1 cKO pelėms įtakos neturi. Dėl Runx3 ekspresijos 16, 22 . IL-7Rα ekspresija yra mažesnė TCRβ hi CD69 + CD4 SP timocituose ir periferinėse Foxp3 - CD4 + įprastose T ląstelėse 15 . Kadangi IL-7Rα signalizavimas reikalingas naiviai T ląstelių homeostazei ir išgyvenimui, buvo manoma, kad Runx1 reguliuoja periferinių CD4 + T ląstelių išgyvenimą ir homeostazę, reguliuodamas IL-7Rα. Tačiau IL-7Rα transgeno ekspresija neišgelbėjo periferinių CD4 + T ląstelių skaičiaus Runx1 cKO pelėse, nors buvo pranešta apie padidėjusią subrendusių CD4 SP timocitų proporcijas 15 . Taigi, kiti, nei IL-7, veiksniai taip pat turi būti svarbūs.

Čia parodome, kad CD4-cre Runx1 cKO pelių periferinių T ląstelių pagrindinis defektas yra T ląstelių brendimas. Nors Runx1 trūkumu pasižymintys CD4 SP timocitai ir CD4 + T ląstelės sumažina IL-7Rα ekspresiją, IL-7Rα transgenas negali išgelbėti CD4 + T ląstelių išgyvenimo ar ląstelių išlikimo CD4-cre Runx1 cKO pelėse. Įprasti CD4 SP timocitai negali būti subrendę nesant Runx1, nors teigiama selekcija vyksta paprastai ir nėra įrodymų, kad padidėtų neigiama selekcija. Periferinės Runx1 turinčios CD4 + T ląstelės yra fenotipiškai ir funkciškai nesubrendusios, o stimuliacija gali sukelti sunkų gebėjimą gaminti TNFα. Runx1 trūkumu pasižyminčios CD4 + T ląstelės suriša IgM, C1q, C4 ir C3 ir todėl periferijoje yra pašalinamos komplemento pavidalu. Taigi, nei T ląstelių homeostazės pokyčiai, nei teigiama atranka, nei neigiama atranka nėra atsakingi už CD4 + T ląstelių defektą CD4-cre Runx1 cKO pelėse, tačiau defektas atsirado dėl sunkaus T ląstelių brendimo bloko.

Rezultatai

Periferinių CD4 T ląstelių ląstelių defektas CD4-cre Runx1 cKO pelėms neišgelbėtas dėl IL-7Rα transgeno

Dėl sąlyginio Runx1 ištrynimo naudojant CD4-cre sumažėja CD4 SP timocitų ir periferinių CD4 + T ląstelių skaičius. Iš pradžių manyta, kad sumažėjusi ląstelė atsirado dėl T ląstelių homeostazės defekto 15 . Remiantis ankstesniais stebėjimais, IL-7Rα raiška CD4 SP timocituose žymiai sumažėja, jei nėra Runx1 (1a pav., Kairėje). Periferijoje IL-7Rα ekspresija sumažėjo maždaug dvigubai, palyginti su WT ląstelėmis, kuriai anksčiau trūko CD4 + T, su Runx1 trūkumu (1a pav., Dešinėje). Jei sumažėjęs CD4 + T ląstelių skaičius CD4-cre Runx1 cKO pelėse atsirado dėl IL-7 tarpininkaujamo T ląstelių homeostazės, ją bent jau iš dalies turėtų išgelbėti išreiškiant IL-7Rα transgeną. Tačiau mes pastebime, kad CD4 SP timocitų ir periferinių CD4 + T ląstelių procentas ir ląstelingumas tarp CD4-cre Runx1 cKO ir IL-7Rα tg / CD4-cre Runx1 cKO pelių yra panašūs (1b – d pav.). Priešingai nei ankstesniame darbe 15, IL-7Rα transgenas neišgelbėja užkrūčio CD4 + T ląstelių. Šie duomenys rodo, kad CD4 linijos T ląstelių CD4-cre Runx1 cKO pelių defektas atsirado dėl kitokio mechanizmo nei IL-7Rα tarpininkauta homeostazė.

Image

( a ) DP arba CD4 SP timocitai (kairėje) ir naivūs CD4 + splenocitai (dešinėje) iš WT ar CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo ištirti dėl IL-7Rα ekspresijos. DP timocitai yra apibrėžti kaip CD4 + CD8 + ; CD4 SP timocitai yra apibūdinami kaip CD4 + CD8-; naivūs CD4 + splenocitai yra apibūdinami kaip CD4 + CD8 - CD62L + CD44 - . Tipiškos histogramos parodytos iš penkių WT ir šešių CD4-cre Runx1 cKO pelių iš penkių nepriklausomų eksperimentų. ( b ) WT, CD4-cre Runx1 cKO, IL-7Ra tg ir IL-7Rα tg / CD4-cre Runx1 cKO timocitai ir splenocitai buvo nudažyti CD4 ir CD8, kad ištirtų T ląstelių vystymąsi. Duomenys yra reprezentatyvūs iš mažiausiai keturių pelių kiekvienoje grupėje iš penkių nepriklausomų eksperimentų. c ) Parodyti absoliutiniai DN, DP, CD4 SP, CD8 SP timocitų skaičiai ir ( d ) blužnies CD4 + ir CD8 + T ląstelės. Kiekis buvo gautas iš penkių WT, šešių CD4-cre Runx1 cKO, keturių IL-7Ra tg ir devynių IL-7Rα tg / CD4-cre Runx1 cKO pelių iš penkių nepriklausomų eksperimentų. Klaidų juostos žymi SEM.

Visas dydis

„Runx1“ reikalingas fenotipiniam ir funkciniam CD4 + T ląstelių brendimui

Naujausi timidiniai emigrantai (RTE) padidina IL-7Rα ekspresiją, kai T ląstelių brandinimo metu jie progresuoja į subrendusių vietinių T ląstelių (MNT) 1, 3 . Pelėms, turinčioms T ląstelių brendimo trūkumų, yra mažesnis IL-7Rα ekspresijos lygis 6, 7 . Taigi, pažeista IL-7Rα ekspresija CD4-cre Runx1 cKO pelėse gali atspindėti brendimo bloką, o ne homeostazės trūkumą. Norėdami ištirti T ląstelių brendimą CD4-cre Runx1 cKO pelėse, mes jas sukryžiavome su Rag1-GFP tranzitinėmis pelėmis 23 . Nors po teigiamo atrankos RAG1 transkripcija pasibaigia, ilgasis GFP pusinės eliminacijos periodas pažymi naujai išsiskyrusius RTE, kurių GFP yra 1, 5, 8 . Tačiau CD4 + RTE (CD4 + CD62L + CD44 - Rag1-GFP + ) procentas nėra praturtintas CD4-cre Runx1 cKO ir yra dar mažesnis, palyginti su WT pelėmis (2a pav., Viršuje). Kai RTE subręsta, jie atnaujina CD55, CD45RB ir Qa2 1, 7 . Runx1 trūkumu pasižyminčios CD4 + RTE ir MNT (CD4 + CD62L + CD44 - Rag1-GFP - ) ekspresuoja žemesnius CD55 ir CD45RB lygius, kas rodo, kad anksčiau negyvoms CD4 + T ląstelėms, turinčioms Runx1 trūkumų, yra T ląstelių brendimo trūkumas. Nors Qa2 lygis buvo normalus, anksčiau mes nustatėme normalią Qa2 raišką CD4-cre HDAC3 cKO pelėms, turinčioms T ląstelių brendimo defektą 6, parodydamos, kad vien Qa2 išraiška negali būti naudojama kaip brendimo matas. Mes ištyrėme Runx1 baltymų ekspresijos lygį per visą T ląstelių vystymąsi ir brendimą. CD4 SP timocitai ir naivios bei atminties turinčios CD4 + T ląstelės iš CD4-cre Runx1 cKO pelių turi žemą Runx1 baltymo ekspresijos lygį, tai rodo aukštą Cre-tarpininkaujamo Runx1 delecijos efektyvumą. Visų pirma, periferinėse CD4 + T ląstelėse, esančiose šiose pelėse, yra žemas Runx1 ekspresijos lygis, o T ląstelių, kurios išvengė cre-tarpinės delecijos, nebuvo arba jos buvo išplėstos (papildomas 1 pav.).

Image

( a ) CD4 + RTE arba MNT iš Rag1-GFP WT arba Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo ištirti, ar nėra brandos žymenų, CD55, CD45RB ir Qa2. CD4 + RTE buvo išlyginti ant CD62L + CD44 - Rag1-GFP +, o CD4 + MNT buvo išlyginti ant CD62L + CD44 - Rag1-GFP - . Duomenys atspindi septynių „Rag1-GFP WT“ ir aštuonių „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių duomenis iš penkių nepriklausomų eksperimentų. ( b ) Rag1-GFP WT arba Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO blužnies ląstelės buvo paliktos be stimuliavimo arba stimuliuojamos per naktį α-CD3ε ir α-CD28. Kitą dieną CD44 lo CD4 ir CD8 Rag1-GFP - MNT ir Rag1-GFP + RTE buvo tiriami ląstelių TNF-α gamybai srauto citometrijos būdu. Viršutinėje eilutėje parodyta RTE ir MNT atrankos strategija naiviuose CD4 T ląstelių telkiniuose. Norint ištirti TNF-α gamybą, užpildyta histograma žymi nesimuliuotas ląsteles, o tvirta linija - ląsteles, kurios buvo stimuliuotos α-CD3ε / α-CD28. Vartai nurodo procentą kiekviename stimuliuotame mėginyje, išreiškiančiame TNF-α. Duomenys atspindi keturių „Rag1-GFP WT“ ir keturių „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių duomenis iš trijų nepriklausomų eksperimentų.

Visas dydis

Kai T ląstelės subręsta periferijoje, jos įgyja funkcinę kompetenciją gaminti citokinus, tokius kaip TNF-α, vadinami 24, 25 . Norėdami nustatyti, ar Tx ląstelių funkciniam brendimui reikalingas Runx1, mes ištyrėme TNF-α gamybą RTE ir MNT iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių. Nors po fiksavimo ir permeabilizacijos GFP fluorescencija buvo sumažėjusi, Rag1-GFP + populiaciją buvo galima atskirti nuo Rag1-GFP ląstelių, naudojant WT peles, norint nustatyti vartus (2b pav.). Runx1 trūkumu pasižyminčios CD4 + RTE ir CD4 + MNT stimuliacijos metu beveik nesukuria TNF-α, palyginti su WT CD4 + RTE ir CD4 + MNT. Tai rodo, kad Runx1 yra būtinas CD4 + T ląstelių funkciniam brendimui. Periferinės CD8 + T ląstelės iš CD4-cre Runx1 cKO pelių gamina panašų kiekį TNF-α kaip WT CD8 + T ląstelės, ir tai rodo, kad Runx1 vaidmuo CD8 + T ląstelių brendime yra nepakeičiamas, greičiausiai dėl Runx3 ekspresijos, kuri yra pagrindinė. CD8 linijos diferenciacijos reguliatorius 16, 22 .

Periferinės CD4 + T ląstelės CD4-cre Runx1 cKO pelėse pašalinamos komplementais

Anksčiau mes parodėme, kad periferinės T ląstelės, kurios nesugeba subręsti, pašalinamos komplementu 6, 7 . Nesubrendusios T ląstelės iš CD4-cre NKAP cKO ir CD4-cre HDAC3 cKO pelių yra pašalinamos klasikinio komplemento keliu, kaip rodo padidėjęs IgM, C1q, C4 ir C3 surišimas. Kadangi CD4 + T ląstelės iš CD4-cre Runx1 cKO pelių yra nesubrendusios funkciškai ir fenotipiškai, mes ištyrėme periferines blužnies T ląsteles iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių IgM surišimui ir komplemento nusėdimui. Blyškiniai CD4 + RTE ir MNT iš Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių dramatiškai padidino IgM surišimą ir papildo C1q, C3 ir C4 nusėdimą, palyginti su CD4 + T ląstelėmis iš Rag1-GFP WT pelių (3a pav., Kiekybiškai įvertintas papildomai) 2 pav.). Taigi, periferinių CD4 + T ląstelių praradimas CD4-cre Runx1 cKO pelėse yra sukeliamas dėl komplemento pašalinimo. Norėdami nustatyti, kada prasideda komplemento nusėdimas, ištyrėme cirkuliuojančias CD4 + T ląsteles kraujyje. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad Runx1 trūkumu pasižymintys CD4 + RTE ir MNT iš kraujo turi daugiau IgM surišimo ir komplemento baltymų nusėdimo nei blužnyje (3b pav., Palyginti su 3a pav.). Didelė dalis WT CD4 + RTE iš kraujo taip pat padidino IgM ir komplemento baltymų nusėdimus, palyginti su WT blužnies CD4 + T ląstelėmis (papildomas 2 pav.). Tai rodo, kad kai SP timocitai išstumia kortikos-meduliarinę jungtį į kraujotaką 26, komplementas inicijuoja nesubrendusių T ląstelių pašalinimą iš WT pelių. Atsižvelgiant į normalų CD8 + T ląstelių vystymąsi ir brendimą CD4-cre Runx1 cKO pelėms, CD4 + cre Runx1 cKO pelių blužnies RTE CD8 + T ląstelių paviršiuje, palyginti su WT RTE, nebuvo padidėjęs IgM surišimo ir komplemento nusėdimas. (Papildomas 3 pav.).

Image

( a ) Blužnies ir ( b ) kraujo CD4 + RTE ir MNT iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo tiriamos IgM, C1q, C4 ir C3 nusėdimui, kaip pavaizduota paveiksle. Prieš dažymą nurodytu Abs. Ląstelės buvo inkubuotos GVB ++ buferyje. CD4 + RTEs ir MNTs buvo užrišti, kaip aprašyta 2a pav. Pateikti duomenys atspindi šešių „Rag1-GFP WT“ ir šešių „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių duomenis iš penkių atskirų eksperimentų.

Visas dydis

CD4 SP timocitai, gauti iš CD4-cre Runx1 cKO, blokuoja intrateminę subrendimą

SP timocitų brendimą galima suskirstyti į skirtingas stadijas įvairiais paviršiaus žymenimis (apžvelgta 3 skyriuje ). Mūsų duomenys rodo, kad CD4-cre Runx1 cKO pelės blokuoja T ląstelių brendimą. Norėdami nustatyti, kada prasideda ši blokada (vidinė-timinė ar postteminė), mes ištyrėme skirtingus žymenis, kurie keičiasi subręsta (Qa2, CD55 ir rec mSiglec-E). CD4-SP pelėms (4a pav.) Yra sumažėjęs „subrendusių“ CD4 SP timocitų (žymimų kaip Qa2 hi CD24 - arba CD55 + CD24 - arba rec mSiglec-E hi CD24 - ) procentas (4a pav.), Patvirtinantis, kad yra intrateminės subrandinimo defektas, kai trūksta CD4 SP tirmocitų, turinčių Runx1 trūkumą. Chemokino receptorių, dalyvaujančių intratemos migracijoje ir užkrūčio liaukos išsiskyrimas, raiška taip pat keičiasi subrendus 27, 28, 29 . Intra-timinė T ląstelių migracija iš žievės į medulą vyksta kartu su timos brendimu; Taigi chemokino receptorių, CCR7, CCR4 ir CCR9, ekspresija buvo tiriama CD4 SP timocituose iš WT ir CD4-cre Runx1 cKO pelių. Kaip parodyta 4b pav., Naudojant CCR7 ir CD24, CD4 SP timocitus galima suskirstyti į tris populiacijas: CD24 + CCR7 - pusiau subrendę (SM); CD24 + CCR7 +, subrendęs 1 (M1); CD24 - CCR7 +, subrendęs 2 (M2) 3 . CD4 SP timocitų perėjimas iš SM į M1 į M2 yra sunkiai pažeistas CD4-cre Runx1 cKO pelėms (4b pav., Kairė skiltis). Panašiai sumažintas CCR4 - CD24 arba CCR9 - CD24 subrendusių CD4 SP timocitų procentas taip pat buvo rastas CD4-cre Runx1 cKO pelėms. Taigi, su CD4-cre Runx1 cKO pelėmis, susijusių su brendimu, daug pokyčių neįvyksta, tai rodo blokavimą ankstyvose užkrūčio liaukos subrendimo stadijose.

Image

( a ) Brandos žymenų Qa2, CD55 ir mSiglec-E ligandų raiška, palyginti su CD24, buvo tiriama Rag1-GFP + CD4 SP timocituose iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių. Pateikti duomenys buvo tipiniai FACS grafikai iš penkių „Rag1-GFP WT“ ir penkių „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių iš penkių nepriklausomų eksperimentų. ( b ) Chemokino receptorių CCR7, CCR4 ir CCR9 raiška, palyginti su CD24, buvo tiriama Rag1-GFP + CD4 SP timocituose iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių. Pateikti duomenys buvo tipiniai FACS grafikai iš mažiausiai keturių „Rag1-GFP WT“ ir keturių „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių iš trijų nepriklausomų eksperimentų. ( c ) S1P1, CD69 ir CD62L raiška, palyginti su CD24, buvo tiriama Rag1-GFP + CD4 SP timocituose iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių. Pateikti duomenys buvo tipiniai FACS grafikai iš penkių „Rag1-GFP WT“ ir penkių „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių iš penkių nepriklausomų eksperimentų. ( d ) Rag1-GFP intensyvumas buvo tiriamas CD24 hi CCR7 lo (SM) CD4 SP timocituose, CD24 hi CCR7 hi (M1) CD4 SP timocituose ir CD24 lo CCR7 hi (M2) CD4 SP timocituose iš Rag1-GFP WT (pilkas) histograma) ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelės (vientisa linija). Parodyta reprezentatyvi FACS analizė iš mažiausiai šešių pelių kiekvienoje grupėje iš šešių nepriklausomų eksperimentų.

Visas dydis

Šlaunikaulio išvaržymo kompetencija įgyjama M2 stadijoje. Transkripcijos faktorius KLF2 yra ekspresuojamas vėlyvoje M1 stadijoje ir skatina CD62L ir S1P1 ekspresiją 30, 31 . Paviršinis CD69 jungiasi su S1P1 ir jį internalizuoja. Kai subrendę SP timocitai sumažina CD69 išraišką, S1P1 lieka ląstelės paviršiuje ir jaučia S1P, kurį išskiria nervinio apvalkalo gauti pericitai aplink kraujagysles 26, 32, inicijuodamas užkrūčio liaukos išsiskyrimą. S1P1 + CD69 - CD62L + M2 SP timocitai iš užkrūčio liauka patenka į kraują ir per CD62L ir CCR7 perduodami į antrinių limfoidinių organų T ląstelių zoną 33, 34. Kaip parodyta 4c pav., S1P1 hi CD69 - M2 populiacijos procentas sumažėja pelėms CD4-cre Runx1 cKO. Tačiau tarp WT ir CD4-cre Runx1 cKO pelių yra tik šiek tiek sumažėjęs M2 CD4 SP timocitų Rag1-GFP intensyvumas (4d pav.), Rodantis, kad užkrėstų timidų išsiskyrimas Runx1 trūkumu turinčiuose M2 CD4 SP timocituose yra tik šiek tiek atidėtas. Jei išstūmimas būtų sunkiai pažeistas CD4 SP turinčiuose Runx1 trūkumu sukeliančiuose timocituose, būtų pastebėtas didelis Rag1-GFP ekspresijos sumažėjimas, parodantis užkrūčio liaukos susilaikymą.

Pažeista CD4 + T ląstelių sializacija iš CD4-cre Runx1 cKO pelių

Anksčiau mes parodėme, kad sialio rūgšties įsiskverbimas į ląstelės paviršiaus glikanus padidėja T ląstelių brendimo metu. Timocitai ir RTE su brendimo blokais nesugeba tinkamai sureguliuoti sializacijos 6, 7 . Sializacijos praradimas, pavyzdžiui, eksperimentiškai per neuraminidazę, sąlygoja natūralų IgM prisijungimą ir 12, 13 komplemento aktyvaciją. Todėl CD4-cre Runx1 cKO pelėms buvo atlikta išsami sializacijos analizė užkrūčio liaukos vystymosi ir periferinių T ląstelių brendimo metu. Žemės riešutų agliutininas (PNA) atpažįsta galinius glikano likučius, kuriuose nėra sialio rūgščių. Kaip parodyta 5a pav., PNR surišimas sumažėjo su timos subrendimu tiek WT, tiek Runx1 turinčiuose CD4 timocituose - tai rodo, kad bendras ląstelių paviršiaus sialinės rūgšties lygis buvo panašus. Tačiau naudodami Maackia amurensis lektino II (MAL II), kuris specifiškai atpažįsta α2, 3-sialinės rūgšties ryšius, mes nustatėme, kad Runx1 trūkumu turintys subrendę CD4 SP timocitai turi mažiau α2, 3-sializacijos, palyginti su WT ląstelėmis, prasidedančiomis M2 CD4 SP. timocitai ir tęsiasi į periferinius RTE ir MNT. Kaip nustatyta jungimosi su Sambucus nigra žievės lektinu (SNBL), α2, 6-sializacijos pokyčių nepastebėta. Rekombinantinis (rec) mSiglec-E pirmiausia jungiasi su α2, 8-susietomis sialinėmis rūgštimis, taip pat mažiau stebimas Siglec-E jungimasis taip pat CD4-cre Runx1 cKO pelėse, pradedant M1 užkrūčio CD4 + SP brendimo etapu ir tęsiant iki periferiniai RTE ir MNT. Šie duomenys rodo, kad CD4 SP timocitai turi specifinius α2, 3- ir α2, 8-jungčių sializacijos trūkumus, jei periferiniuose RTE ir MNT nėra Runx1, o tai gali prisidėti prie natūralaus IgM surišimo ir komplemento nusėdimo. Santykinis sumažėjimas MalII ir rec Siglec-E jungimosi prie Rtx1 trūkumo RTE ir MNT yra kiekybiškai įvertintas 5b pav. CD4 + cre Runx1 cKO pelių CD8 + T ląstelių brendimo defekto trūkumas yra panašus α2, 3- ir α2, 8-sializacijos laipsnis (tai rodo atitinkamai MalII ir rec Siglec-E jungtys). tarp CD8 SP timocitų ir periferinių CD8 + T ląstelių iš WT ir CD4-cre Runx1 cKO pelių (papildomas 4 pav.).

Image

( a ) DP (CD4 + CD8 + ), SM CD4 SP (CD4 + CD24 hi CCR7 lo ), M1 CD4 SP (CD4 + CD24 hi CCR7 hi ), M2 CD4 SP (CD4 + CD24 lo CCR7 hi ) timocitai, blužninis CD4 + RTE (CD4 + CD62L + CD44 - Rag1-GFP + ), CD4 + MNT (CD4 + CD62L + CD44 - Rag1-GFP - ) iš „Rag1-GFP WT“ (pilka histograma) ir „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelių ( ištisinė linija) buvo tirti dėl sialyliavimo naudojant augalų lektinus PNA, SNBL, MAL II ir rekombinantinę mSiglec-E Fc chimerą (rec mSiglec-E). Pirmiausia, siekiant pašalinti Rag1-GFP ekspresiją, timocitai buvo pašalinti, kad būtų pašalintos recirkuliacinės subrendusios T ląstelės. Parodyta mažiausiai trijų pelių kiekvienoje grupėje reprezentatyvi FACS analizė iš trijų atskirų eksperimentų. PNA atpažįsta šerdies 1- O glikūnus, neturinčius galinės sialinės rūgšties; SNBL atpažįsta α2, 6-sujungtas sialines rūgštis; MAL II atpažįsta α2, 3-sujungtas sialines rūgštis; ir rec mSiglec-E, pirmiausia jungiasi su α2, 8-susietomis sialinėmis rūgštimis. ( b ) Reciglec-E ir MalII PFI santykinių pokyčių analizė CD4 + RTE ir MNT iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre NKAP cKO pelių. Pateikti duomenys yra iš 4 nepriklausomų eksperimentų su „Rag1-GFP WT“ ir „4 Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“. Kiekvieno eksperimento metu santykinis rec Siglec-E arba MalII MFI buvo normalizuotas pagal jungtį, esančią WT MNT (= 100). Klaidų juostos žymi SEM, o statistinė PFI skirtumų analizė buvo atlikta naudojant nesuporuotų Studentų testą „GraphPad Prism“. c ) Kiekybinė PGR analizė, lyginant α2, 8-sialyltransferazių (ST8Sia1, ST8Sia4 ir ST8Sia6) ir α2, 3-sialyltransferazių (ST3Gal1, ST3Gal2, ST3Gal6) mRNR lygius išrūšiuotoje blužnies CD4 + RTE1 iš GGT-GFP Parodytos CD4-cre Runx1 cKO pelės. Santykinė šių genų ekspresija buvo normalizuota iki 18S rRNR. Pateikti duomenys yra trijų pelių kiekvienoje grupėje vidurkis ± SEM, visi duomenys normalizuojami pagal vieną iš WT pelių kiekviename analizuojamame gene. Duomenų reikšmingumas buvo išanalizuotas nesusijusio Studento testu, naudojant „GraphPad Prism“.

Visas dydis

Anksčiau mes parodėme, kad sumažėjęs α2, 8-sujungtų sialinių rūgščių įsiskverbimas į ląstelių paviršiaus glikanus NKAP ir HDAC3 trūkumu sukeliančiuose RTE buvo dėl sumažėjusios sialiltransferazių, ypač ST8Sia6 6, 7, ekspresijos. Buvo tiriamos CD4 + RTE iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių, kad būtų nustatyti genų, atsakingų už α2, 3- arba α2, 8-sialiacijas (ST3Gal1, ST3Gal2, ST3Gal6; ST8Sia1, ST8Sia4, ST8Sia6). ). Tarp tirtų sialyltransferazių, palyginti su WT kontrolėmis, ST8Sia1, ST8Sia6 ir ST3Gal1 mRNR raiška buvo ženkliai sumažinta Runx1 trūkumu turinčių CD4 + RTE (5c pav.). Taigi sumažėjęs α2, 3- arba α2, 8-sujungtų sialio rūgščių ekspresija ląstelių paviršiuje Runx1 trūkumu turinčiose CD4 + T ląstelėse yra dėl mažesnio sialiltransferazių mRNR ekspresijos lygio.

Blužnies CD4 + T ląstelių nepakankamumas CD4-cre Runx1 cKO pelėse nėra dėl netinkamo skirtingo antrinio limfoidinio organo išsidėstymo

Kadangi stebėjome pakitusią CCR7 ir CD62L išraišką Runx1 turinčiuose CD4 SP timocituose, mes įvertinome, ar sumažėjęs periferinių CD4 + T ląstelių skaičius CD4-cre Runx1 cKO pelių blužnyje atsirado dėl pakitusio prigludimo prie kitų antrinių limfoidinių organų (pav. .6). Tačiau CD4 + cre Runx1 cKO pelėse CD4 + RTE nesikaupė nė viename konkrečiame organe, o tai rodo, kad sumažėjęs Runx1 trūkumų turinčių CD4 + T ląstelių skaičius nėra susijęs su pakitusia prigimtimi. CD4 + T ląstelių procentas CD4-cre Runx1 cKO pelėse, palyginti su WT pelėmis, yra smarkiai sumažėjęs kraujyje, periferiniuose limfmazgiuose, kepenyse ir Peyer pleistruose. Visų pirma, iš CD4-cre Runx1 cKO pelių kepenyse nebuvo naivių CD4 + T ląstelių. Visiškas naivių CD4 + T ląstelių praradimas kepenyse atitinka jų pašalinimą komplementais, nes kepenys yra pagrindinė komplemento gamybos vieta 35 . Taigi sumažėjęs CD4 + T ląstelių skaičius visame pasaulyje stebimas CD4-cre Runx1 cKO pelių periferijoje.

Image

Iš blužnies, kraujo, kepenų, periferinių limfmazgių (gimdos kaklelio, aksilinių, smegenų ir kirkšnies limfmazgių) išskirti periferiniai limfocitai ir Peyer pleistrai iš Rag1-GFP WT arba Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo ištirti CD4 + santykiu. T, CD8 + T, naivūs CD4 + T ir CD4 + RTE. Parodyti FACS grafikai yra iš skirtingų organų, gautų iš vienos „Rag1-GFP WT“ arba „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ pelės viename eksperimente. Pateikti duomenys atspindi keturias „Rag1-GFP WT“ ir keturias „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ peles iš keturių atskirų eksperimentų.

Visas dydis

Teigiamas ir neigiamas selekcija nepakinta CD4 SP timocituose iš CD4-cre Runx1 cKO pelių

Norėdami patvirtinti, kad užkrūčio liaukų CD4 SP fondo defektas dėl CD4-cre Runx1 cKO pelių atsirado dėl ankstyvo T ląstelių brendimo blokavimo, atlikome išsamią teigiamo ir neigiamo atrankos analizę. Po teigiamos atrankos signalizavimas per TCR sukelia paviršiaus TCRβ ir CD5 36 padidėjusį reguliavimą ir antiapoptozės molekulės Bcl-2 37 indukciją. Kitas antiapoptozinis šeimos narys Bcl-xL yra labai ekspresuojamas DP timocituose ir yra sumažinamas po teigiamo atrankos 38 . Mes ištyrėme, ar teigiamos atrankos pokyčiai turėjo įtakos pokyčiams, stebėtiems CD4 SP timocituose CD4-cre Runx1 cKO pelėse. Tačiau TCRβ, CD5 ir Bcl-2 reguliavimas bei Bcl-xl reguliavimas CD4 SP timocituose, palyginti su DP timocitais, buvo panašūs tarp WT ir CD4-cre Runx1 cKO pelių (7a pav.). Transkripcijos faktorius RORγt reikalingas Bcl-xL ekspresijai, kuris reguliuoja 38- ojo DP timocitų išgyvenimą, o C-Rel 39 indukcijai taip pat svarbus RORγt sureguliavimas teigiama atranka. Transkripcijos koeficientas „ThPOK“ reikalingas CD4 linijos įsipareigojimui 40, 41 . CXCR4 išraiška taip pat yra nepakankamai reguliuojama, kai pasirenkamas teigiamas pasirinkimas. Kaip parodyta 7b pav., Ir ThPOK, RORγ, c-Rel ir CXCR4 ekspresija yra normaliai moduliuojami Runx1 turinčiuose CD4 SP timocituose po teigiamo atrankos. Todėl CD4 SP timocitų, gautų iš CD4-cre Runx1 cKO pelių, defektas nėra susijęs su teigiamos atrankos pakitimais ar linijų įsipareigojimu.

Image

( a ) DP ir CD4 SP timocitai iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo ištirti siekiant nustatyti TCRβ, CD5 ir vidinių ląstelių Bcl-xL, Bcl-2 raišką. ( b ) DP ir CD4 SP timocitai iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo ištirti dėl ThPOK, c-Rel, RORγ intranuklearinės ekspresijos ir CXCR4 paviršiaus išraiškos. ( c ) DP ir CD4 SP timocitai iš Rag1-GFP WT ir Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių buvo ištirti dėl Nur77, Helios ir viduląstelinės Bim ekspresijos. Paviršinių ir ląstelinių FACS tyrimuose, pirmiausia, buvo pašalinti timocitai ant Rag1-GFP +, kad būtų išvengta recirkuliacinių subrendusių T ląstelių analizės. Tarpbranduoliniam FACS, kadangi Rag1-GFP baltymo fluorescencija yra sutrikdoma naudojant Foxp3 / transkripcijos faktoriaus buferį, timocitai nebuvo vertinami Rag1-GFP ekspresijai. Pilka histograma žymi DP timocitus, o tvirta linija žymi CD4 SP timocitus. Pateikti duomenys atspindi mažiausiai keturias „Rag1-GFP WT“ ir penkias „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“ peles iš keturių nepriklausomų eksperimentų.

Visas dydis

Taip pat yra įmanoma, kad sumažėjęs CD4 SP timocitų procentas ir skaičius CD4-cre Runx1 cKO pelėse gali būti dėl padidėjusios neigiamos atrankos. Pelėms, kurios per daug ekspresuoja proapoptotines molekules, tokias kaip Nur77 ir Bim, padidėja neigiamas atranka, dėl kurios sumažėja SP timocitų skaičius 42, 43, 44 . Be to, „Helios“ išraiškos lygis taip pat yra sustiprintos neigiamos atrankos 4 rodiklis. Taigi mes ištyrėme, ar nėra padidėjusios Nur77, Helios ir Bim išraiškos CD4 SP timocituose CD4-cre Runx1 cKO pelėse. Kaip parodyta 7c pav., Nur77, Helios ir Bim raiškos lygiai DP ir CD4 SP timocituose yra palyginami tarp WT ir CD4-cre Runx1 cKO pelių. Tai suderinta su ankstesniu darbu, parodytu, kad iš D011.10 TCR tg / CD4-cre Runx1 cKO pelių, stimuliuotų įvairiomis OVA peptidų 15 koncentracijomis, timocitai nebuvo padidėję. Taigi, CD4 SP timocitų CD4-cre Runx1 cKO pelėse trūkumas yra susijęs su intrateminės subrendimu, o ne teigiamos atrankos, neigiamos atrankos ar įsipareigojimo dėl CD4 trūkumais.

Ląstelėms būdingas „Runx1“ reikalavimas CD4 + T ląstelių brendimui

Norėdami nustatyti, ar CD4 + T ląstelių brendimo blokas CD4-cre Runx1 cKO yra būdingas ląstelėms, mes ištyrėme mišrias kaulų čiulpų chimerines (BMC) peles. Pelės buvo ištirpintos lygiu CD45.2 + Rag1-GFP WT arba CD45.2 + Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO mišiniu su CD45.1 + B6.SJL kaulų čiulpų ląstelėmis ir buvo analizuojamos po 10 savaičių. Stebėta nedaug subrendusių CD4 SP timocitų (CD24 lo Qa2 hi ), gautų iš Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių, palyginti su WT timocitais iš tos pačios chimeros arba kontrolinės (Rag1-GFP / WT) chimeros (8a pav. ). Nors visų Rag1-GFP WT kaulų čiulpų ląstelių chimerizmas visose populiacijose išlieka panašus, tačiau Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO pelių santykinis chimerizmas dramatiškai sumažėjo kartu su T ląstelių brendimu (kiekybiškai įvertintas 8b pav.). Periferijoje (8c pav.) CD4 + RTE ir MNTs T ląstelės, gautos iš Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO kaulų čiulpų, taip pat rodo sumažėjusią IL-7Rα ir CD55 raišką. Taigi mišraus BMC naudojimas patvirtina, kad CD4-cre Runx1 cKO T ląstelių brendimo trūkumas yra būdingas ląstelėms ir kad Runx1 yra būtinas CD4 + T ląstelių brendimui.

Image

Mišrios kaulų čiulpų chimeros buvo generuojamos naudojant 1: 1 kaulų čiulpų ląstelių mišinį iš arba „Rag1-GFP WT“ (CD45.2 + / + ) /B6.SJL (CD45.1 + / + ), arba „Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO“. (CD45.2 + / + ) /B6.SJL (CD45.1 + / + ) į mirtinai apšvitintus įgimtus B6.SJL (CD45.1 + / + ) gavėjus. T ląstelių vystymasis buvo analizuojamas praėjus 10 savaičių po transplantacijos. DP timocitai yra CD4 + CD8 + ; pusiau subrendę CD4 SP timocitai yra CD4 + CD8 - CD24 + Qa2-; subrendę CD4 SP timocitai yra CD4 + CD8 - CD24 - Qa2 + ; blužnies neturinčios CD4 + T ląstelės yra CD4 + CD8 - CD62L + CD44 - . ( a ) CD4 SP thymocytes from Rag1-GFP WT (CD45.2 +/+ )/B6.SJL (CD45.1 +/+ ) or Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO (CD45.2 +/+ )/B6.SJL (CD45.1 +/+ ) chimeras were analyzed by using CD45.1 and thymic maturation by using CD24 and Qa2. ( b ) The relative chimerism as compared to the granulocyte population was calculated. Error bars indicate SEM, and significances are determined by an unpaired Student's t test. Data shown are the average of four Rag1-GFP WT (CD45.2 +/+ )/B6.SJL (CD45.1 +/+ ) chimeras and four Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO (CD45.2 +/+ )/B6.SJL (CD45.1 +/+ ) chimeras from four independent experiments. ( c ) Splenic CD4 + CD62L + CD44 CD45.1 Rag1-GFP + RTEs and CD4 + CD62L + CD44 CD45.1 Rag1-GFP MNTs from bone marrow chimeras were examined for the expression of IL-7Rα, Qa2 and CD55. Grey histogram represents cells from CD45.1 Rag1-GFP WT cells while solid line represents cells from CD45.1 Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO cells from each bone marrow chimera.

Visas dydis

Diskusija

Although lack of peripheral CD4 + T cells in CD4-cre Runx1 cKO mice has been previously described 15, 16, 45, the mechanism responsible for this observation was not understood. Decreased expression of IL-7Rα was thought to contribute to a defect in T cell homeostasis in CD4-cre Runx1 cKO mice. In this report, we identified the lack of peripheral CD4 + T cells in CD4-cre Runx1 cKO mice is not due to decreased IL-7Rα expression, but is due to complement-mediated depletion resulted from a failure in T cell maturation. Runx1 is not required for positive selection or negative selection. The transition from SM to M1 in CD4 SP thymocytes is severely compromised in CD4-cre Runx1 cKO mice, and consequently, resulting functional competencies such as TNFα licensing and protection from complement in the periphery are defective. Runx1-deficient peripheral naïve CD4 + T cells fail to produce TNF-α in response to TCR stimulation. Defective sialylation and IgM/complement protein deposition were found on the cell surface of Runx1-deficient CD4 T cells, leading to elimination of Runx1-deficient naïve CD4 + T cells in the periphery.

Previously, the Satake group generated Bcl-2 tg/CD4-cre Runx1 cKO mice 45 . Bcl-2 is a downstream target of IL-7R signaling. Consequently, if the peripheral naïve CD4 + T cell defect in CD4-cre Runx1 cKO mice is due to the IL-7-Bcl-2-axis for T cell survival and homeostasis, there should be a phenotypic and cellular rescue of naïve CD4 + population in Bcl-2 tg/CD4-cre Runx1 cKO mice or IL-7Rα/tg CD4-cre Runx1 cKO. However, similar to what we observed in IL-7Rα/tg CD4-cre Runx1 cKO mice, the percentage and number of naïve CD4 + T cells in Bcl-2 tg/CD4-cre Runx1 cKO mice remained low 45, indicating that there is a different mechanism responsible for the paucity of peripheral naïve CD4 + T cells in CD4-cre Runx1 cKO mice. We identified complement-mediated elimination of Runx1-deficient CD4 + T cells as the major cause. Furthermore, when we examined blood CD4 + RTEs and MNTs from CD4-cre Runx1 cKO mice to identify when the complement-mediated elimination initiates, we found a substantial increase of IgM and complement deposition on blood CD4 + RTEs and MNTs as compared to splenic CD4 + RTEs and MNTs. We also found substantially increased IgM and complement deposition on RTEs from blood from Rag1-GFP WT mice. These data support the idea that immature T cells upon egress from the thymus the via cortico-medullary junctions are immediately tested for maturation by complement in the circulation. The thymus is a complement-privileged site that protects immature thymocytes from complement-mediated killing before they complete intra-thymic maturation 7, 46 .

Unlike CD4-cre NKAP cKO and CD4-cre HDAC3 cKO mice that have normal SP thymocytes numbers and a defect in post-thymic maturation 6, 7, CD4-cre Runx1 cKO mice have an earlier block in thymic T cell maturation at the M1 SP stage. We have previously demonstrated that increased sialylation occurs concurrently with T cell maturation. The exposure of terminal GluNAc/Gal of O -glycan or N -glycan on DP thymocytes is lost by sialylation once thymocytes pass positive selection. Specifically, α2, 3-sialic acid linkages and α2, 8-sialic acid linkages increase during SP thymocyte cell maturation from semi-mature to mature stage 7 . Runx1-deficient CD4 SP thymocytes have less MAL II and rec mSiglec-E binding, indicating decreased α2, 3- and α2, 8-linked sialic acids, respectively, as compared to WT cells. In contrast, NKAP-deficient and HDAC3-deficient T cells primarily have a defect in α2, 8-linked sialic acids. As incorporation of sialic acids onto surface glycoprotein is a crucial step during T cell maturation, the defect in both α2, 3 and α2, 8-linkage sialylation may explain why there is exacerbated natural IgM recognition and complement-mediated elimination in Runx1-deficient CD4 + T cells, leading to a decreased RTEs and MNTs in the periphery.

As Runx1-deficient CD4 SP thymocytes display a severe block in T cell maturation and have multiple alterations in cell surface proteins, including CCR7. Interestingly, CCR7 itself is not required for T cell maturation, as the Anderson group showed that CCR7/CCR4 double KO (dKO) mice have no defect in T cell maturation 29 . Indeed, both CCR7KO and CCR7/CCR4 dKO mice have similar number and percentage of mature CD4 SP (CD69 Qa2 + ) thymocytes as compared to WT mice. Therefore, decreased CCR7 expression is not the cause the defect in intra-thymic maturation in CD4-cre Runx1 cKO mice. Qa2, a member of nonclassical MHC class Ib molecule, is extensively used as a standard marker for T cell maturation in the thymus and periphery 47 . However, a functional role of Qa2 during T cell maturation has not been demonstrated. We previously showed that HDAC3-deficient CD4 + T cells have expression of Qa2 similar to WT cells, although HDAC3-deficient naïve T cells are both functionally immature and have decreased expression of other markers associated with T cell maturation such as CD55 and α2, 8 sialylation. Here, we show that CD4 + RTEs and MNTs from CD4-cre Runx1 cKO mice have normal expression of Qa2, but are similarly defective in maturation. Thus, our data from both CD4-cre Runx1 cKO mice and CD4-cre HDAC3 cKO mice demonstrate that normal Qa2 expression in the periphery cannot be used as a marker to indicate that maturation has occurred in the periphery. Rather, it is necessary to examine functional changes such as TNFα licensing, in addition to changes in the expression of multiple proteins on the cell surface, to determine whether T cell maturation has occurred, rather then relying solely on Qa2.

Metodai

Pelė

Floxed Runx1 mice were generated by Dr. Nancy Speck (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA) and purchased from The Jackson Laboratory (B6.129-Runx1 tm3.1Spe /J). Rag1-GFP knock-in mice were kindly provided by Dr. Nobuo Sakaguchi (Kumamoto University, Kumamoto, Japan) 23 . IL-7Rα transgenic mice were previously described and provided by Dr. Al Singer (National Cancer Institute, Bethesda, MD) 48 . C57BL/6 (B6) mice were purchased from The Jackson Laboratory, and the congenic B6.SJL mice were purchased from National Cancer Institute at Frederick. All mice were housed in a specific pathogen-free barrier facility at Mayo Clinic, and were analyzed at 8–12 weeks of age. All animal experiments were conducted with approval from the Institutional Animal Care and Use Committee at Mayo Clinic, following NIH guidelines. “WT” littermates used as controls in each experiment included Runx1 floxed/cre , Runx1 WT/cre +, or Runx1 WT/cre mice, as T cell maturation in these mice is indistinguishable from WT B6 mice. Littermates were used whenever possible as controls, and otherwise age-matched controls were used.

Srauto citometrija

Spleens and thymi from indicated mice were obtained and processed as single-cell suspensions before FACS analysis. The following antibodies were purchased from BD Bioscience, BioLegend, eBioscience, R&D Systems, Tonbo Bioscience, Cell Signaling Technology or Cedarlane: Bcl-2 (BCL/10C4), Bcl-xL (7B2.5), Bim (H-191), CCR4 (2G12), CCR7 (4B12), CCR9 (9B1), CD4 (RM4-5, GK1.5), CD45.1 (A20), CD5 (53-7.3), CD8α (53-6.7), CD24 (M1/69), CD44 (IM7), CD45RB (C363-16A), CD55 (RIKO-3), CD62L (MEL-14), CD69 (H1.2F3), complement C1q (RMC7H8), complement C3 (RMC11H9), complement C4 (RMC16D2), CXCR4 (2B11), Helios (22F6), IgM (RMM-1), IL-7Rα (A7R34), Nur77 (12.14), c-Rel (1RELAH5), RORγ (B2D), recombinant mSiglec-E-Fc chimera, Runx1 (RXDMC), S1P1 (713412), TCRβ (H57-597), ThPOK (2POK), TNF-α (MP6-XT22) and Qa2 (695H1-9-9). Biotinylated plant lectins (MAL II, PNA and SNBL) were purchased from Vector Laboratories. For intracellular FACS, cells were stained with fixable viability dye (FVD; eBioscience and Tonbo) before surface stain. Following the surface stain, cells were fixed and permeablized with IC Fixation Buffer (eBioscience) and stained for Bcl-2, Bcl-xL, or Bim. For intranuclear FACS, cells were stained with FVD before surface stain. After the surface stain, cells were fixed and permeablized with Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) and stained for Nur77, c-Rel, RORγ, Runx1 or ThPOK. All data were doublet excluded with forward light scatter width/height and side light scatter width/height, and dead cells were excluded with FVD before analysis. Samples were acquired using LSRII (BD Bioscience) or Attune NxT (Life Technologies) flow cytometers and analyzed with FlowJo software (FlowJo, LLC.)

Blood cell preparation and complement deposition assays

Whole blood was isolated from indicated mice and mixed with 20μM/ml heparin at a 50:50 ratio. The red blood cells were lysed by cold ACK buffer for 10 minutes on ice and then were washed twice with cold 1×PBS before complement deposition assays. For complement experiments, ACK buffer-treated blood cells or splenocytes were incubated in GVB ++ buffer (Complement Technology) for 1 hour at room temperature before staining with indicated Abs.

Cell stimulation and intracellular cytokine assays

Total splenocytes were cultured for 16 hours at 37 °C in 5% CO 2 in complete medium containing RPMI 1640 (Life Technologies), 10% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin-streptomycin (Life Technologies), and 2 mM L-glutamine (Life Technologies), and were stimulated accordingly. For TNF-α intracellular stain, 5 × 10 6 splenocytes were stimulated with or without plate-coated α-CD3ε (10μg/ml, 145-2C11; Bio-X-Cell) plus soluble α-CD28 (1μg/ml, 37.51; Bio-X-Cell) in the presence of Protein Transport Inhibitor Cocktail (eBioscience). The following day, cells were harvested and washed once with 1× PBS and stained with FVD before surface stain. Cells were then fixed and permeablizied with IC Fixation Buffer (eBioscience) and stained for intracellular TNF-α (eBioscience).

FACS sorting and real-time Q-PCR analysis of relative mRNA expression

To isolate splenic CD4 + RTEs, cells from Rag1-GFP WT and Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO mice were harvested and first subject to negative selection using a biotin-labeled cocktail of antibodies (B220, CD11b, Ter119, Gr-1, CD19, CD11c and CD8) to eliminate unwanted populations using magnetic bead selection (Miltenyi Biotec) prior to sorting. All sorting was done on a FACSAria (BD Bioscience), and RTEs were sorted by gating on CD4 + CD44 CD62L + Rag1-GFP + . mRNA was later isolated from sorted CD4 + RTEs using an RNeasy Mini kit (QIAGEN). cDNA was then generated and amplified with the Ovation PicoSL WTA V2 kit (NuGen). The mRNA expression was measured using TaqMan probes (Applied Biosystems) for ST8Sia1, ST8Sia4, ST8Sia6, ST3Gal1, ST3Gal2 and ST3Gal6. TaqMan probe for 18S rRNA is used as the internal control. Samples were analyzed using an ABI RT-PCR StepOne Plus System (Applied Biosystems), and relative gene expression was calculated via the 2-ΔΔCT method. Data shown is from independent isolations of CD4+ RTEs from 3 Rag1-GFP WT and 3 Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO mice.

Generation of mixed bone marrow chimera

Recipient B6.SJL mice were given 1000 rad in one dose and rested for at least 5 hours before receiving mixed bone marrow cells. Mixed BMCs were generated by iv injection of 4 × 10 6 whole bone marrow cells from either mixes of Rag1-GFP WT (CD45.2 +/+ )/B6.SJL (CD45.1 +/+ ) or Rag1-GFP CD4-cre Runx1 cKO (CD45.2 +/+ )/B6.SJL (CD45.1 +/+ ) at a 1:1 ratio into irradiated congenic B6.SJL (CD45.1 +/+ ) recipients. Chimeric mice received enrofloxacin in their drinking water for 3 weeks and were analyzed after 10 weeks.

Statistinė analizė

Unpaired student's t test was used to calculate statistical significance between groups and the calculation was performed with GraphPad Prism software. p < 0.05 was considered statistical significant. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SEM.

Papildoma informacija

How to cite this article : Hsu, F.-C. et al. An Essential Role for the Transcription Factor Runx1 in T Cell Maturation. Mokslas. Rep. 6, 23533; doi: 10.1038/srep23533 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.