Mds ksenografas, naudojant paciento ląstelių liniją | leukemija

Mds ksenografas, naudojant paciento ląstelių liniją | leukemija

Anonim

Dalykai

  • Vėžio modeliai
  • Mielodisplastinis sindromas

Buvo sunku nustatyti gyvūnų modelius, kurie tiksliai atspindėtų mielodisplastinio sindromo (MDS) klinikinius požymius. MDS yra hematologiniai sutrikimai, susiję su neveiksminga hematopoezė, kraujo citopenijomis, mieloidine displazija ir padidėjusia ūminės mieloleukemijos (AML) rizika. Nors pirminių AML ląstelių transplantacija į pelių, kurių imuninė sistema susilpnėjusi, buvo sėkminga, pirminiai MDS pacientų mėginiai buvo blogai įsodinami, o gyvūnams-recipientams ligos požymių nėra. 1, 2, 3 Pirminių MDS mėginių įsodinimą dar labiau apsunkina dažnas normalių HSC klonų peraugimas. Šie iššūkiai pabrėžia dabartinius pirminių MDS ląstelių implantacijos apribojimus ir neveiksmingumą. Naujausi patobulinimai pirminių MDS ląstelių įsisavinime buvo pastebėti persodinant imunofenotipiškai apibrėžtą HSC iš MDS pacientų čiulpų arba kartu švirkščiant stromos ląsteles, sukurtas gaminti ne kryžmiškai reaguojančius žmogaus citokinus. 5, 6 Deja, net ir patobulinus pirminių MDS ląstelių įspaudimą, pelės nepasiduoda ypatybėms, primenantiems žmogaus MDS, užkertant kelią naudoti šiuos modelius ikiklinikiniams tyrimams. Norėdami apeiti dabartinius apribojimus, sukūrėme modelį, kuriame naudotos pelės, kurių imunitetas susilpnėjęs, ir žmogaus MDS ląstelių linija (MDSL), gauta iš MDS sergančio paciento, kuriam nėra atsparios anemijos žiedais, žievės sideroblastų neleukeminės fazės. 7, 8, 9 MDSL linija buvo gauta kaip MDS92 pogrupis ir palaiko faktorių priklausomybę nuo ląstelių augimo, tačiau, palyginti su MDS92, turi mažesnį diferenciacijos pajėgumą. 10 Čia mes pranešame apie sėkmingą MDSL ląstelių įsodinimą į NOD / SCID-IL2Rγ pelės (NSG) ir NSG-hSCF / hGM-CSF / hIL3 (NSGS) peles ir atkuriamą ligos vystymąsi, įskaitant citopenijas, klonų išsiplėtimą ir šeimininkų hematopoetines slopinimas. Be to, mes parodome, kad MDSL ksenografinis modelis yra naudinga priemonė vertinant naujas ir esamas MDS terapijas.

Kaip pranešta apie pradinę tėvų MDS92 liniją, 11 MDSL ląstelių išlaikė priklausomybę nuo citokinų in vitro . Nutraukus hIL-3, MDSL ląstelės nustoja augusios per tris dienas ir miršta per penkias dienas (1a pav.). Atsižvelgiant į pirminių žmogaus MDS mėginių įskiepijimo iššūkius, mes siekėme nustatyti MDSL įsisavinimo ir ligos inicijavimo galimybes. Iš viso 1 × 106 MDSL ląstelių buvo švirkščiama į veną 8–10 savaičių amžiaus subtaltališkai apšvitintoms NSG ar NSGS pelėms, stebimos pelės, ar nėra piktybinių kraujodaros pakitimų. MDSL įsisavinimas NSGS arba NSG sukėlė mirtiną hematologinę ligą, susijusią su citopenija, kaulų čiulpų nepakankamumu ir organų infiltracija. Vidutinis išgyvenamumas buvo atitinkamai 24 ir 70 dienų po injekcijos (1b pav.). Trumpesnis su NSGS stebėtas latentinis laikotarpis priskiriamas transgeninei trijų nereaguojančių žmogaus citokinų (SCF, GM-CSF ir IL3) ekspresijai, kurie suteikia padidintą mieloidinių ląstelių transplantacijos aplinką. 12 Nužudymo metu atlikta srauto citometrinė analizė parodė efektyvų hCD45 + ląstelių MDSL įsisavinimą kaulų čiulpuose (BM), blužnyje (SP) ir periferiniame kraujyje (PB) tiek NSG, tiek NSGS gavusių pelių (1c paveikslas). Įdomu tai, kad NSG arba NSGS pelių kondicionavimas subaltaline radiacija nebuvo būtinas MDSL ląstelių įsodinimui, tačiau nešvitinti recipientai turėjo vėluojančią ligos latentinę reikšmę (duomenys nepateikti).

Image

MDSL ksenografo modelio sukūrimas ir apibūdinimas. a ) MDSL augimo kreivės, kultivuojamos su hIL-3 arba be jo (10 ng / ml). Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas atliekant trypano mėlynojo išskyrimą nurodytais laiko momentais. b ) NSG ir NSGS gyvūnai buvo subaltališkai apšvitinti ir į veną sušvirkšta 1 × 10 MDSL ir įvertintas išgyvenamumas. ( c ) MDSL ląstelės (1 × 106) buvo persodintos į NSG ir NSGS peles. Ligos metu kaulų čiulpai (BM), blužnis (SP) ir periferinis kraujas (PB) buvo surinkti ir išanalizuoti, ar jie nėra įsodinti srauto citometrijos metodu. d ) MDSL įsodintoms ( n = 4) pelėms buvo atlikti serijiniai čiulpų aspiratai 53 ir 82 dienomis po injekcijos ir ištirti naudojant srauto citometriją, siekiant įvertinti žmogaus ir pelės ląstelių transplantaciją. e ) Ištirtas NSG pelių, ląstelių ksenografijos būdu atliktų su žmogaus CD34 + virkštelės kraujo (UCB) ląstelėmis ( n = 5) arba su MDSL ląstelėmis ( n = 5), ląstelių BMG tyrimas. ( f ) Hematoksilinu ir eozinu dažymas buvo atliktas ant parafino įterptų kaulų iš MDSL ir CD34 + UCB implantuotų NSG pelių. ( g ir h ) MDSL ląstelės buvo ištirtos srauto citometrijos antikūnų grupėje prieš injekciją pelėms ( In vitro , g ) ir po derliaus nuėmimo iš gyvulių, sergančių mirtinai ( Ex vivo , h ). i ) Wright – Giemsa dažytos MDSL, augintos in vitro , ir ląstelės, surinktos iš NSG gyvūnų BM, SP ir PB. Rodyklės rodo MDSL langelius. j ) Mėginant NSG gyvūnus ( n = 3), ksenografuotus MDSL ląstelėmis (mirties metu) arba CD34 + UCB ląstelėmis (praėjus 10 savaičių po transplantacijos ( n = 8)), atliktas pilnas kraujo tyrimas. * P vertė <0, 05; *** P vertė <0, 001. Žr. Papildomą informaciją apie medžiagas ir metodus.

Visas dydis

Intrafemoraliniai NSG BM aspiratai praėjus 53 dienoms po transplantacijos parodė, kad vidutinis žmogaus MDSL (CD45 + CD33 + ) transplantatas yra 2% viso čiulpų (1d pav.). Tačiau mirties metu (82 dienos po transplantacijos) MDSL ląstelės palaipsniui išsiplėtė ir užėmė ∼ 60% visų kaulų čiulpų (1d pav.). 10 savaičių po transplantacijos MDSL ir CD34 + virkštelės kraujyje persodintoms NSG pelėms buvo nustatytas kaulų ląstelių judrumas. Nors laikui bėgant MDSL ląstelės palaipsniui plėtėsi, bendras MDSL įsodintų kaulų čiulpų ląstelių kiekis buvo 70% mažesnis nei CD34 + virkštelės kraujyje įsodintų kaulų čiulpų (5 × 106, palyginti su 22 × 106 ląstelių / šlaunikaulio) (1e pav.). Imunohistocheminiu tyrimu iš MDSL implantuotų NSG pelių buvo patvirtintas hipoceliuliarinis čiulpas, tuo tarpu kontrolinėse CD34 + ląstelėse įsodintose pelėse buvo normalus BM ląstelių pobūdis (1f pav.). Pelėms, į kurias įsodinta MDSL, mes taip pat stebėjome kaulų atsinaujinimą endosteume (1f pav.). Šie radiniai rodo, kad MDSL ląstelės išsiplečia kloniškai, tuo pačiu išstumdamos šeimininkės ir pelės BM ląsteles.

Norint ištirti subkloninę atranką po transplantacijos, MDSL ląstelės buvo imunofenotipiškai įvertintos hematopoetinio kamieno / progenitoriaus ir mieloidinių ląstelių žymenų ekspresijai prieš pat transplantaciją (1g paveikslas) ir 10 savaičių po transplantacijos (1h paveikslas). Buvo nustatyta, kad prieš transplantaciją MDSL ląstelės ekspresuoja kraujodaros kamieninius / progenitorinius žymenis (CD34 ir CD117), taip pat kelis mieloidinių ląstelių žymenis (CD11b, CD38 ir CD33) (1g paveikslas). Palyginimui, MDSL ląstelės, išskirtos iš NSG pelių BM, turėjo panašius imunofenotipinius žymenis (1h pav.). MDSL ląstelių morfologija buvo nustatyta pagal Wright – Giemsa dažymą citospinais ir kraujo tepinėliais prieš ir po transplantacijos (1i pav.). In vitro išaugusios MDSL morfologija atspindėjo tai, kas pastebėta ksenografuotų pelių gavėjų BM, SP ir PB (1i paveikslas). Abiem laiko momentais MDSL ląstelės turėjo dismorfinį ir nevienalytį mieloidinį fenotipą (1i paveikslas). Po in vivo išsiplėtimo, MDSL ląstelės neįgijo blastinio fenotipo, būdingo daugeliui AML ląstelių linijų. Be to, abiejų pelių, turinčių imunodeficito, padermių metu buvo atlikta antrinė MDSL transplantacija. Antrinių transplantacijų ligos fenotipas buvo panašus, o ligos vėlavimas reikšmingai nesiskyrė nuo pirminių transplantacijų (duomenys nepateikti). Visi šie stebėjimai rodo, kad MDSL ksenografuose įvyksta minimali subkloninė atranka ir imunofenotipinė raida.

Mes pasirinkome toliau apibūdinti NSG gyvūnus, nes jie turėjo vyraujantį BM transplantatą, kuris galėtų labiau atspindėti žmonių ligos patologiją MDS. Norint ištirti MDSL ksenografų įtaką šeimininko ir pelės kraujodarai, gautos NSG pelės, persodintos MDSL arba kontrolinėmis CD34 + ląstelėmis, buvo stebimos atliekant išsamią kraujo analizę. Iki 10 savaičių pelių, ksenografuotų su MDSL ląstelėmis, organizme buvo sumažėjęs pelių eritrocitų ( P = 0, 04), hemoglobino lygis ( P = 0, 02) ir trombocitų skaičius ( P = 0, 07), palyginti su pelėmis, persodintomis su CD34 + ląstelėmis (1j paveikslas). Šis pastebėjimas rodo, kad MDSL ląstelių transplantatas pablogina pelių kraujodaros procesą, sukeldamas anemiją ir trombocitopeniją.

Toliau mes išbandėme MDSL ksenografo modelį kaip ikiklinikinį vaistinio preparato veiksmingumo tyrimo įrankį. Lenalidomidas (LEN) yra FDA patvirtintas pirmojo pasirinkimo mažos rizikos del (5q) MDS, 13 ir MDSL ląstelių gydymui, kaip pranešta in vitro . 8 Dėl šių priežasčių mes tikėjome, kad LEN bus idealus terapinis agentas mūsų eksperimentinei sistemai išbandyti. Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis, MDSL gydymas in vitro 10 μM LEN padidino apoptozę (matuojama dažant aneksino V / PI dažymą; 2a pav.) Ir sumažino augimą (matuojant trypano mėlynojo išskyrimu; 2b paveikslas). Be to, LEN poveikis progenitorių funkcijai buvo įvertintas naudojant metilceliuliozės testą. MDSL ląstelės, auginant LEN, sudarė 50% mažiau kolonijų ( P <0, 05) metilceliuliozėje (2c paveikslas). Siekiant ištirti LEN poveikį in vivo , 1 × 106 MDSL ląstelės buvo ksenografuotos į NSG peles po subatalinio švitinimo. Norint imituoti panašų dozavimo režimą, kaip ir MDS sergantiems pacientams, NSG pelėms 7 savaites buvo skiriama beveik ištisinė 25 mg / kg LEN dozė (2d paveikslas). Kad būtų užtikrintas efektyvus MDSL įsodinimas, LEN skyrimas pradėtas praėjus 10 dienų po transplantacijos. MDSL ląstelių transplantatas (hCD45 + CD33 + ) buvo stebimas NSG gyvūnų kraujyje 55 dieną ir 70 dieną po transplantacijos. Abiem laiko momentais LEN apdorotoje kohortoje sumažėjo MDSL įsisavinimas (2e pav.). NSG pelės, persodintos su MDSL, bet gavusios tik kontrolinį nešiklį (DMSO), atrodė mirtinai pavojingos nuo 40 iki 75 dienų (išgyvenimo mediana: 48 dienos; 2f pav.). Priešingai, LEN gydytas NSG pasiekė žymiai ilgesnį bendrą išgyvenamumą (išgyvenimo mediana: 82 dienos; 2f pav.). Visi šie duomenys leidžia manyti, kad LEN yra pajėgus slopinti MDSL kloną tiek in vitro , tiek in vivo , kurį suteikia mūsų ksenografo modelis.

Image

MDSL ksenografo modelis kaip ikiklinikinis vaisto vertinimo įrankis. a ) MDSL, auginto DMSO arba 10 μM LEN, dažymas aneksine V / PI buvo nustatytas po 48 valandų. ( b ) Gyvas MDSL ląstelių augimas buvo tiriamas tripano mėlynuoju išskyrimu, esant DMSO arba LEN (10 μM). c ) MDSL ląstelės buvo įvertintos dėl kolonijų susidarymo metilceliuliozėje, turinčioje arba DMSO, arba LEN (10 μM). d ) gyvūnams, kurie buvo mirtinai švitinti, NSG gavusiems gyvūnams buvo sušvirkšta 1 × 106 MDSL; po 10 dienų pelėms buvo atlikti septyni DMSO arba LEN (25 mg / kg) ciklai, naudojant IP. e ) NSG gyvūnams buvo nuleista kraują 55 ir 70 dieną. Raudonieji kraujo kūneliai buvo lizuojami, ląstelės dažytos mCD45-APC-Cy7, hCD45-FITC ir CD33-PE ir ištirtos srauto citometrija. ( f ) MDSL ksenografą turinčių NSG pelių, vartotų IP su LEN, Kaplan-Meier analizė. * P vertė <0, 05; ** P vertė <0, 01. Žr. Papildomą informaciją apie medžiagas ir metodus.

Visas dydis

Šiame tyrime mes ištyrėme NSG ir NSGS pelių gebėjimą palaikyti MDS auginamų ląstelių linijos augimą. Fenotipinis MDSL apibūdinimas atskleidė, kad jie išlaiko displazinę, nesprogstančią morfologiją in vitro ir in vivo . Skirtingai nuo AML ląstelių linijos ksenografų, MDSL transplantatas neatliekamas kloninėje selekcijoje ir po antrinės transplantacijos neturi trumpesnio ligos latencijos. Taigi mūsų išvados pabrėžia šio modelio tinkamumą MDS. Vienos ląstelių linijos ksenografų sistemos naudojimui ekstrapoliuoti žmogaus ligą ir ikiklinikiniam terapijos vertinimui yra pastebimi apribojimai, tačiau yra keletas svarbių pranašumų. Pelėms, persodintoms su MDSL, būdinga efektyvi transplantacija, kuri leidžia nuosekliai sekti MDS kloną ir išsivysto mirtina liga. Svarbu tai, kad kai kurie MDSL ksenografuotų pelių hematopoetiniai parametrai, būtent anemija ir trombocitopenija, atspindi žmogaus MDS.

Po MDSL transplantacijos tiek NSG, tiek NSGS gyvūnams buvo parodyta žmogaus ląstelių transplantacija, tačiau ligos požymiai pasireiškė NSGS gyvūnams, kurių latentinis laikotarpis buvo žymiai sutrumpėjęs. Pagreitėjusi NSGS ksenografuotų pelių liga rodo, kad transgeninė hGM-CSF, hSCF ir hIL3 ekspresija padidina MDSL ląstelių augimą ir išgyvenimą in vivo . Atsižvelgiant į tai, kad tiek NSG, tiek NSGS pelės leidžia efektyviai įsodinti MDSL ląsteles į kaulų čiulpus, tačiau esant skirtingai kinetikai, šis modelis suteikia platformą tirti nišinę sąveiką ir MDS ląstelių tarpusavio ryšius su šeimininko ir čiulpų aplinka. Įdomu tai, kad hipoplastinis MDS potipis (∼ 15% visų atvejų) paprastai yra susijęs su imuniteto sukelta patogeneze, padidėjusia priešuždegiminių citokinų koncentracija. 14 Mūsų MDS modelis sukuria hipoceliuliarinę čiulpų aplinką ir suteikia galimybę išsamiau ištirti šį ligos variantą.

Be to, MDSL ląstelės gali persodinti imunodeficito recipientuose nenaudodamos radiacijos, todėl šiuos gyvūnus galima gydyti tradicinėmis kombinuotomis chemoterapijomis. Įvertinti chemoterapiją šioje modelio sistemoje būtų neįmanoma, jei MDSL įsodinimui būtų reikalingas išankstinis radiacijos kondicionavimas. 15 Visų pirma, šio modelio trumpalaikis ligos latentinis laikotarpis suteikia galimybę laiku atlikti eksperimentinius rodmenis ikiklinikinių MDS tyrimų metu. Be to, anemija ir trombocitopenija, parodyta šiame modelyje, suteikia lengvai išmatuojamus antrinius padarinius vertinant naujų agentų ligą modifikuojantį poveikį in vivo . Apibendrinant, atsižvelgiant į ištikimą MDS tipo fenotipo pakartojimą ir greitą eksperimentinių ligų rodmenis, mes manome, kad MDSL ksenografai taps svarbia priemone tiriant naujų MDS sukėlėjų veiklą.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento Leukemijos svetainėje (//www.nature.com/leu)