Onkogeninis daugelio 1 tipo endokrininės neoplazijos genų vaidmuo sergant prostatos vėžiu | prostatos vėžys ir prostatos ligos

Onkogeninis daugelio 1 tipo endokrininės neoplazijos genų vaidmuo sergant prostatos vėžiu | prostatos vėžys ir prostatos ligos

Anonim

Anotacija

Prostatos vėžys yra antra pagrindinė JAV vyrų mirčių nuo vėžio priežastis, daugiausia dėl metastazių, kurios galiausiai baigiasi mirtimi. Geresnis metastazių biologijos supratimas leis pagerinti prognozavimą ir terapiją. Anksčiau pranešėme, kad 11q13.1 prieaugis nepriklausomai numatė pasikartojimo po radikalios prostatektomijos atvejus. Daugybinė endokrininė neoplazija I ( MEN1 ) rodo šios kopijos skaičiaus padidėjimo regioną esant agresyviems prostatos navikams ir buvo įrodyta, kad jis yra vienintelis genas šiame lokuse padidėjus ekspresijai prostatos vėžyje. Čia parodytas onkogeninis MEN1 vaidmuo sergant prostatos vėžiu, naudojant įvairius nepriklausomus tyrimus.

Įvadas

Daugybinės endokrininės neoplazijos (MEN) naviko slopintuvo genas MEN1 priskiriamas 11q13.1 ir koduoja menino baltymą, kuris yra sindromo, kuriam jis pavadintas, pagrindu, MEN 1. 1, 2, 3. Manoma, kad MEN1 genas yra pajėgus koduojantis gausų sujungimo variantų ir galbūt baltymų repertuarą. Gerai žinoma, kad MEN1 mutacijos sukelia MEN 1 autosominiu dominuojančiu būdu. 4 Navikai MEN1 atvejais atsiranda dėl dviejų paspaudimų mechanizmo, kuris atitinka auglio slopintuvo geną. Nenuostabu, kad MEN1 vaidmuo biologijoje ir patologijoje buvo tiriamas daugiausia prieskydinių liaukų, hipofizės ir kasos, tačiau jo funkcija išlieka paslaptinga. Keletas tyrimų parodė, kad meninas vaidina transkripcijos moduliaciją, sąveikaudamas su histono deacetilazėmis ir histono metiltransferazėmis. 6, 7 klinikinės MEN1 apraiškos yra hormonų, tokių kaip insulinas, prieskydinis hormonas ar augimo hormonas, perprodukcijos rezultatas. 8, 9, išskyrus gastrinomas, dauguma su MEN1 susijusių asocijuotų navikų metastazuoja.

Ankstesniame lyginamojo genomo hibridizacijos (aCGH) tyrime, kurio tikslas buvo nustatyti DNR pagrįstus biomarkerius, numatančius pooperacinį pasikartojimą ir metastazes, nustatėme MEN1 lokusą. Paradoksalu, kad siauras regionas, nukreiptas į MEN1, yra įgyjamas ir neprarandamas dėl agresyvių prostatos navikų. Be to, atliekant išsamų genų ekspresijos tyrimą, buvo pašalinti visi kiti lokuso kandidatai. 10 Be to, MEN1 raiška padidėjusių normalių ir prostatos navikų porų rinkinyje buvo didesnė visuose navikuose su 11q13.1 kopijų skaičiaus padidėjimu ir vienu atveju su normaliu MEN1 kopijų skaičiumi. 10 Pastarasis atvejis siūlo mechanizmą, nepriklausomą nuo kopijų skaičiaus padidėjimo, siekiant panaikinti MEN1 geno ekspresijos reguliavimą prostatos navikuose. Tai taip pat pateikia įtikinamų įrodymų, kad MEN1 genas yra pagrindinis amplifikacijos taikinys. Padidėjusi MEN1 ekspresija prostatos navikuose taip pat stebėta atliekant tyrimus, kuriuose naudojami ekspresijos mikrotraumai. 11 Bendrai kalbant, įrodymai rodo, kad MEN1 gali būti onkogenas prostatos navikuose. Pateikiame įrodymų, patvirtinančių MEN1 vaidmenį skatinant augimą ir silpninant apoptozę, dar labiau patvirtinantį MEN1 kaip onkogeno vaidmenį sergant prostatos vėžiu.

medžiagos ir metodai

Fluorescencinė in situ hibridizacija su audinių mikrotrauma

CTD-2220I9 BAC klonas iš Invitrogen (Carlsbad, CA, JAV), kuriame yra MEN1, buvo naudojamas fluorescencinės in situ hibridizacijos (FISH) zondui gaminti. Klonas buvo dryžuotas ant chloramfenikolio LB plokštelių. Pavienės kolonijos buvo išskirtos 3 ml pradinių kultūrų. DNR buvo išskirta laikantis gamintojo Plasmid Midi DNR rinkinio protokolo (Qiagen, Valensija, CA, JAV). DNR buvo tiesiogiai pažymėta fluorescenciniu būdu, laikantis modifikuoto atsitiktinio pradėjimo protokolo. Trumpai tariant, buvo atliktos dvi ženklinimo reakcijos, kurių kiekvienoje buvo 100 ng BAC DNR, 1 x atsitiktinių pradmenų (Invitrogen BioPrime rinkinys) ir vandens, kad tūris būtų 16 μl. Mišinys denatūruotas 99 ° C temperatūroje 15 min., Po to iškart dedamas ant ledo. Iš viso 20 vienetų „Klenow“ („Invitrogen BioPrime“ rinkinys), 2 μl FITC-dCTP (1 mM, PerkinElmer, Waltham, MA, JAV) ir 2 μl dNTP tirpalo (2 m M dATP, dGTP ir dTTP, ir Pridedama 0, 5 mM dCTP) ir inkubuojama O / N 37 ° C temperatūroje. Dvi ženklinimo reakcijos buvo sujungtos ir etanolis nusodinamas esant COT-1 (Žmogaus Hyblocas; Applied Genetics, Melburnas, FL, JAV). FISH tyrimai buvo atlikti Dr Marko Rubino laboratorijoje. Išsamią FISH procedūrą rasite Perner et al. 12 FISH signalų buvo išanalizuoti naudojant skaitmeninę vaizdo mikroskopiją. Buvo bandoma įvertinti bent 100 ląstelių kiekvienu atveju. Audinių mikrotraumą (TMA) sudarė 30 metastazavusių prostatos navikų iš įvairių organų vietų, gautų skrodimo metu. 13

IMA imunohistochemija

Imunohistochemija (IHC) buvo atlikta naudojant polikloninį MEN1 antikūną (dosniai padovanotus dr. Francis Collins ir dr. Lee Burns iš NIH) skiedžiant santykiu 1: 1500. Antigeno išėmimas buvo atliekamas šildant plokšteles 7 minutes 10 m M citrinos rūgšties buferiu. TMA sudarė branduoliai iš 48 pacientų, sergančių prostatos vėžiu, kuriems pagal Kattan nomogramą operacijos metu buvo didelė pasikartojimo rizika. Kiekvienas atvejis turėjo tris ar daugiau tipinių branduolių.

IHC skambučius savarankiškai atliko du patologai (SP, JS). 1 patologas (SP) pateikė teigiamą skambutį, jei 5% ląstelių parodė, kad MEN1 dažėsi. 2 patologas (JS) paskatino teigiamą skambutį, jei 5% ląstelių dažėsi 2 ar 3 kartus. 2 + dažymas stebimas naudojant × 10 ir 3 +, jei objektyvas yra × 4. Abu patologai iškvietimą toliau apibrėžė kaip branduolį ar citoplazmą.

Ląstelių kultūros

Prostatos vėžio ląstelių linijos, įskaitant PC3, DU145, LNCaP, MDAPCA2A ir krūties vėžio ląstelių liniją BT474, buvo gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (Manassas, VA, JAV) ir buvo išaugintos pagal gamintojo protokolus.

MEN1 numušimas su siRNR

siRNR, nukreipti į keturis skirtingus MEN1 koduojančios sekos regionus, buvo gauti iš „Qiagen“. DU145 ląstelės buvo transfekuotos siRNR, nukreipiančiomis į MEN1 , suplakta siRNR (nehomologiška bet kuriai žinomai žmogaus cDNR sekai) arba vien tik transfekcijos reagentu, serumo neturinčiomis sąlygomis, 24 valandas po sėjimo. Kiekviena terpė be serumo (25 μl) su 0, 75 μl HiPerfect (Qiagen) ir 5 nM siRNR tirpalas buvo paruošti atskirai, inkubuojami 5 minutes kambario temperatūroje (RT) ir po to sujungiami. Tada buvo leista susidaryti liposomų-siRNR kompleksams, toliau inkubuojant 15 minučių kambario temperatūroje. Šis 50 μl transfekcijos mišinys buvo pridėtas prie esamų terpių ląstelėse ir paliktas inkubuoti 37 ° C temperatūroje mažiausiai 24 valandas prieš norimą apdorojimą. Išvardyti tūriai yra skirti 96 šulinėlių formatui, kurio reikia toliau aprašytiems ACEA eksperimentams, ir buvo atitinkamai pakoreguoti šešiems šulinių tyrimams atliekant fluorescenciniu būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimą (FACS) ir atvirkštinės transkripcijos (RT) –PCR eksperimentus.

ACEA

ACEA (San Diegas, CA, JAV) RT-CES × 16 sistema buvo naudojama stebėti ląstelių augimo indeksą MEN1 numuštų ląstelių srityje. ACEA technologija matuoja jutiklių elektrodų, integruotų mikrotitrinių plokštelių dugne, elektroninę varžą. Ląstelės dedamos ant šių specialių šulinėlių ir auginamos inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje esant 5% CO 2 . Elektrinė varža naudojama ląstelių indeksui apskaičiuoti, kuris, nuolat stebint, realiu laiku pateikia šulinio ląstelių augimo charakteristikas.

Fono varžos matavimai atlikti kiekviename šulinyje su terpe. Tada iš viso į vieną šulinėlį buvo pasėta 1000 DU145 ląstelių, iš viso 150 μl terpėje. Po 24 val., Transfekcijos buvo atliktos terpėje, kurioje nėra serumo. Tada ląstelių indeksas buvo nuolat stebimas serumo badavimo metu, taip pat atliekant gelbėjimą serumo terpėmis, įvairiomis eksperimentinėmis sąlygomis. Nustatyta, kad serumo badas (48 val.) Yra optimaliausias laikotarpis, kai galima sustabdyti ląstelių augimą MEN1 siRNR transfekuotose ląstelėse, išlaikant gyvybingas ląsteles. Be to, ląstelių skaičius buvo patvirtintas rankiniu būdu (duomenys nepateikti).

Fluorescenciniu būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimas (aneksinas V ir propidium jodidas)

Ląstelės buvo sėjamos į šešių šulinėlių plokšteles dviem egzemplioriais ir po 24 valandų transfekuojamos be serumo. Po bado serume 48 valandas, ląstelės buvo išgelbėtos serumu dar 48 valandas, prieš jas surenkant tripsinu. Kontrolinės buvo ląstelės, išaugintos serumo terpėje, netransfekuotos serumo badaujančios ląstelės, netikros tranzitinės (tik transfekcijos agento) serumo badavusios ląstelės ir plaktos siRNR transfekuotos serumo badautos ląstelės. Kultūros terpė buvo išmesta po to, kai ląstelės buvo granuliuotos, centrifuguojant 5 minutes. Ląstelės buvo atskirtos ir suspenduotos 5 ml fosfatu buferiniame druskos tirpale (PBS). Kiekvienam mėginiui buvo atliktas ląstelių skaičius, o 500 μl PBS buvo sulaikytas vienodas ląstelių skaičius (maždaug 106). Tada ląstelės buvo fiksuotos 5 ml 70% etanolio 30 minučių. Ląstelės buvo susuktos ir pašalintas etanolis. Ląstelės nuosėdos buvo suspenduotos 5 ml PBS ir vėl centrifuguotos. Ląstelėms dažyti buvo pridėtas propidium jodidas (PI) / Triton X-100 (1 ml; Sigma, Sent Luisas, MO, JAV; 1 mg / ml PI 0, 1% Triton X-100) dažymo tirpale su RNaseA. Srauto citometrija buvo atlikta po 15 minučių dažymo kambario temperatūroje. Atitinkamai priekinis ir šoninis išsibarstymas (FSC / SSC) ir 2 fluorescencija (FL2) buvo išmatuoti FACS (FACS kalibravimo sistema; Becton Dickinson, San Chosė, CA, JAV) ir analitine programine įranga (Treestar, Ashland, OR, JAV; FlowJo) buvo naudojamas pavienėms ląstelėms perduoti, remiantis šviesos sklaida, ir ištirti gautus ląstelių ciklo pasiskirstymo modelius naudojant smailės dekonvoliuciją (Deen-Jett, Watson).

Panašiai ląstelės taip pat buvo tiriamos dėl apoptozės, naudojant aneksino dažymą po transfekcijos. Ląstelės buvo išskirtos tripsinu, išplautos PBS, po to suspenduotos 100 μl 1x aneksiną surišančio buferio, prieš dažant pagal V priedą (Molecular Probes-Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. FACS („Becton Dickinson FACS Calibur System“), po to, kai FSC / SSC vartai buvo panaudoti norint atskirti šiukšles ir dubletus, gyvų, negyvų ir apoptozinių subpopuliacijos frakcijų pokyčiai buvo nustatyti atsižvelgiant į neigiamą gydymo kontrolę.

MTS

Ląstelės buvo paruoštos transfekcijai ir gydymui, kaip aprašyta aukščiau, bet 96 šulinėlių plokštelėse ir trimis egzemplioriais. Po bado serume praėjus 48 valandoms, pagal gamintojo instrukcijas buvo naudojamas „Promega“ (Madisonas, WI, JAV) „CellTiter 96“ vandeninio vieno tirpalo ląstelių proliferacijos tyrimas, siekiant kiekybiškai įvertinti NADH / NADPH lygį ląstelėse. 3-4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5-3-karboksimetoksifenil) -2-4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, vidinės druskos (MTS) redukcija buvo įvertinta, registruojant absorbciją 490 nm bangoje „Wallac – PerkinElmer“. „Victor2 1420“ kelių etikečių skaitiklis.

Kiekybinis RT – PGR

MEN1 siRNR RNR numušė DU145 ląsteles ir atitinkamos kontrolinės medžiagos buvo išskirtos naudojant „Trizol“ (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą ir apdorotos dezoksiribonukleazės (DNazės) būdu. cDNR buvo pagaminta naudojant „iScript First Strand Synthesis kit“ (BioRad, Hercules, CA, JAV).

„TaqMan“ tyrimai, patvirtinantys MEN1 numušimą siRNR eksperimentuose, buvo atlikti UCSF Genomo branduolyje. „TaqMan“ patvirtino ABI raiškos masyvo rezultatus DU145 MEN1 siRNR eksperimentams atliko dr. Davidas Ginzingeris („LinkageBio“, San Franciskas, Kalifornija, JAV). Visi „TaqMan“ tyrimai buvo atlikti pagal ABI protokolus. „TaqMan“ pradinio zondo rinkiniai buvo įsigyti kaip „Assays on Demand“ rinkiniai per ABI (Foster City, CA, JAV). Visi genų ekspresijos rezultatai buvo apskaičiuoti atsižvelgiant į namų tvarkymo geno BGUS ekspresijos lygius.

ABI išraiškos masyvai

//bioconductor.org/packages/1.9/bioc/html/ABarray.html). Zondų signalo intensyvumas mikrotraumuose buvo normalizuotas naudojant kvantilinį metodą. 14 Funkcijos, kurių signalo / triukšmo vertės 3 ir kokybės vėliavos vertės <5000, buvo laikomos aptiktomis ir palygintos t- testu. Gauti genų sąrašai, kurių P vertė <0, 05, buvo klasifikuojami naudojant PANTHER duomenų bazę (//www.pantherdb.org). 15, 16

Rezultatai

Fluorescencinė in situ hibridizacija su audinių mikrotraumu

Hibridizacija in situ buvo atliekama fluorescenciniu būdu, siekiant toliau tirti MEN1 lokuso kopijų skaičiaus padidėjimą sergant metastazavusiu prostatos vėžiu. Atlikta FISH į TMA, kurioje yra branduoliai iš 30 metastazavusių prostatos navikų. Išsamūs rezultatai pateikti papildomoje S1 lentelėje. Du atvejai buvo pašalinti dėl audinių trūkumo. Iš 28 skaitomų atvejų 26 audiniai buvo iš daugelio metastazavusių vietų. Apibrėžus 11q13.1 padidėjimą kaip 10% ląstelių, turinčių 3 signalus, bent viename paciento branduolyje, 5 iš 28 (18%) atvejų buvo teigiami. Tačiau jei riba buvo apibrėžta kaip 5% ląstelių, turinčių 3 signalus bent viename paciento šerdyje, 11 iš 28 atvejų (39%) buvo teigiami. Taikant 5% ribą, 8 iš 11 (73%) atvejų, kurių 11q13, 1 prieaugis buvo teigiamas, teigiama daugiau nei vienoje metastazavimo vietoje vienam pacientui. 1a paveiksle pateiktas padidinto kopijos skaičiaus 11q13.1 lokuso vietoje vieno paciento minkštųjų audinių ir plaučių metastazėse pavyzdys. Į TMA taip pat buvo įtraukti gerybinio prostatos audinio ( N = 2), gerybinės hiperplazijos ( N = 2) ir prostatos intraepitelinės neoplazijos ( N = 1) bei normalaus krūties audinio ( N = 1) kontroliniai branduoliai, iš kurių nė vienas iš MEN1 nebuvo teigiamas. ŽUVYS.

Image

Fluorescencinės hibridizacijos in situ (FISH) ir imunohistochemijos (IHC) pavyzdžiai. a ) FISH patvirtino to paties paciento 11q13.1 kopijų skaičiaus padidėjimą minkštųjų audinių (kairėje) ir plaučių (dešinėje) metastazėse. Žali signalai žymi zondo, apimančio daugybinę endokrininės neoplazijos I ( MEN1 ) lokusą, raudoni signalai, vaizduojantį atskaitos zondą. b ) Reprezentatyvus IHC dažymas, parodantis MEN1 raišką gerybinio prostatos audinio citoplazmoje (kairėje) ir branduolinę MEN1 raišką naviko mėginyje (dešinėje) iš skirtingų pacientų.

Visas dydis

Imunohistochemija audinių mikropakopui

Norint ištirti menino kiekį prostatos vėžyje, IHC buvo atliktas naudojant MEN1 antikūną ant TMA, sudarytą iš 48 prostatos vėžiu sergančių pacientų, turinčių didelę pasikartojimo riziką operacijos metu, kaip apibrėžta Kattan nomogramoje, šerdžių. 17 Rezultatų išsami informacija pateikiama lentelėse, esančiose papildomoje S2 lentelėje. Iš šių atvejų 36 turėjo bent du branduolius, kuriuos sugebėjo įvertinti du patologai. Jų skambučiai buvo suderinti tik su trimis skambučiais dėl nesutarimų. Vienas atvejis buvo gerybinis atvejis, klasifikuojamas kaip teigiamas arba neigiamas. Kiti du nesutarimai abejojo, ar audinys buvo gerybinis, ar PIN, tačiau abu dažymą dažymas pavadino teigiamu. Penki iš trisdešimt šešių (14%) naviko atvejų buvo teigiami MEN1 . Dėmimas buvo aptiktas navikinių ląstelių branduoliuose (1b pav.). Pogrupiui atvejų buvo prieinamas gerybinis audinys. Penki iš trisdešimt šešių atvejų (14%) buvo teigiami MEN1 gerybinėse prostatos liaukose. Įdomu tai, kad dažymas šiais atvejais buvo nustatytas citoplazmoje (1b pav.).

MEN1 išraiškos duomenų bazės užklausa

Buvo atlikta metaanalizė, siekiant įvertinti MEN1 raišką paskelbtuose ir viešai prieinamuose prostatos vėžio tyrimuose. „Oncomine“ duomenų bazėje (//www.oncomine.org) buvo užduoti tyrimai, kurie nustatė MEN1 raišką prostatos audinyje. Tyrimai, kuriuose buvo vėžinis audinys ir kurių P- reikšmė 0, 05 buvo skirtingai ekspresuojami, parodyti 2 paveiksle. Apskritai, MEN1 raiškos tendencija šiuose tyrimuose buvo ta, kad MEN1 raiška padidėjo pirminių ir metastazavusių navikų srityje, palyginti su gerybiniu audiniu.

Image

Daugybinės endokrininės neoplazijos I raiškos prostatos vėžyje Oncomine duomenų bazės užklausos rezultatai (diferencinė išraiška P <0, 05). Pilkos spalvos analizės metu turi padėti atskirti kiekvieną audinių tipą. Atitinkama lentelės legenda apibūdina kiekvieną analizę.

Visas dydis

MEN1 raiškos lygis ląstelių linijose

RNR buvo išgauta iš įvairių prostatos ląstelių linijų (PC3, DU145, LNCaP, MDAPCA2A), kad būtų galima kiekybiškai įvertinti MEN1 ekspresijos lygius ir nustatyti jų tinkamumą in vitro numušimo eksperimentams. Į vertinimą buvo įtraukta BT474, krūties vėžio ląstelių linija, taip pat plaučių cDNR, nes žinoma, kad jis ekspresuoja žemą MEN1 lygį. Visos ląstelių linijos išreiškė MEN1 . Papildomame paveiksle S1 pateikiami „TaqMan“ rezultatai, gauti naudojant MEN1 penkiose ląstelių linijose ir kontrolėje. MDAPCA2A ir LNCaP yra pusiau lipnios ląstelių linijos ir nebuvo tiriamos fenotipinių tyrimų metu.

Pilno dydžio lentelė

MEN1 siRNR atmušimo eksperimentai DU145

In vitro MEN1 gebėjimas moduliuoti ląstelių fenotipus, tokius kaip augimas , in vitro buvo matuojamas naudojant RNR. PC3, kuris gaunamas iš kaulų metastazių, neatsakė į MEN1 siRNR numušimo eksperimentus. Tačiau DU145, gaunamas iš metastazių smegenyse, parodė numušimo fenotipą, todėl buvo panaudotas visuose vėlesniuose eksperimentuose. Ląstelių augimas realiu laiku buvo stebimas naudojant „ACEA Biosciences RT-CES System“, ląstelėmis pagrįstą tyrimą, kuris netiesiogiai stebi ląstelių augimo indeksą, matuojant elektrinę varžą tarp jutiklio elektrodų, integruotų mikrotitrų plokštelių dugne. Įvertintos keturios nepriklausomos siRNR, nukreiptos į skirtingus MEN1 nuorašo regionus. Buvo panaudotos visos tinkamos kontrolinės medžiagos, įskaitant suplaktas siRNR. MEN1 tylėjimas slopino ląstelių augimą DU145 ląstelėse maždaug 30%, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis (3a pav.). TaqMan buvo naudojamas patvirtinti MEN1 ekspresijos susilpnėjimą siRNR apdorotose ląstelėse (3b pav.). SiRNR sumažino MEN1 mRNR gausą maždaug 60%.

Image

Fenotipinis daugialypės endokrininės neoplazijos I ( MEN1 ) siRNR nutildymo poveikis. a ) Ląstelių proliferacijos tyrimas in vitro, naudojant ACEA instrumentą, rodantį sumažėjusį DU145 ląstelių, persodintų keturiais skirtingais MEN1 siRNR ( M1-4 ), proliferaciją . Transfekcijos buvo atliktos serumo neturinčiomis sąlygomis; ląstelės buvo išgelbėtos ir palaikytos serumo terpėje 48 valandas. Kontrolės priemonės yra netransfekuotos (SFM), tik transfekcijos reagentas (HP) ir suplaktos siRNR (AF, S5). ( b ) rodo atitinkamus tų pačių mėginių „TaqMan“ duomenis, patvirtinančius MEN1 ekspresijos sumažėjimą ląstelėse su siRNR, 72 h po transfekcijos. c ) DU145 ląstelės buvo transfekuotos be serumo, o po 48 valandų išgelbėti serumo terpėje. Ląstelių gyvybingumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant MTS analizę po 72 valandų gelbėjimo. Mėginiuose yra DU145 ląstelės, transfekuotos trimis skirtingais MEN1 siRNR (M1, M3 ir M4). Kontrolę sudaro netransfekuotas (SFM), tik transfekcijos reagentas (NC) ir plakta siRNR (AF). Doksorubicinu apdorotos DU145 ląstelės buvo įtrauktos kaip papildoma kontrolė (Dox500).

Visas dydis

MTS tyrimas, proliferacijos tyrimas, tiesiogiai proporcingas gyvų ląstelių skaičiui kultūroje, buvo naudojamas kaip nepriklausomas proliferacijos matas siRNR apdorotose DU145 ląstelėse. Šie rezultatai patvirtina, kad MEN1 nutildymas lemia ląstelių augimą. Ląstelių skaičius buvo maždaug 15% mažesnis MEN1 siRNR apdorotose ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis 48 val. Po transfekcijos serumo badavimo sąlygomis (3c paveikslas).

Norėdami ištirti mechanizmą, kuriuo MEN1 nutildymas slopina ląstelių proliferaciją, PI dažymas ir FACS buvo naudojami ląstelių pasiskirstymo G1, S ir G2 / M fazėse kiekybiniam įvertinimui skirtingose ​​transfekuotose ląstelėse (4a pav.). Dėl MEN1 slopinimo padidėjo S ir G2 ląstelių skaičius, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis. Anneksino dažymas padidėjo ląstelėse, kur buvo nutildyta MEN1 raiška (4b paveikslas). Iš šių rezultatų galima daryti išvadą, kad MEN1 išsekimas gali padidinti apoptozę ir ląstelių ciklo sustojimą DU145 ląstelėse, apdorotose MEN1 siRNR.

Image

Fluorescenciniu būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimo (FACS) analizė. ( a ) Daugybinės endokrininės neoplazijos I ( MEN1 ) siRNR paveiktų DUI45 ląstelių pasiskirstymas ląstelių cikle. Transfekuotos ląstelės buvo analizuojamos FACS, siekiant išsiaiškinti MEN1 numušimo poveikį ląstelių ciklui. DU145 ląstelės buvo transfekuotos ir badaujamos terpėje, kurioje nėra serumo, 48 valandas, prieš išgelbėjimą serume. Po 48 valandų ląstelės buvo fiksuotos etanolyje ir dažytos PI. Mėginiuose yra DU145 ląstelės, transfekuotos 2 skirtingais MEN1 siRNR (M1 ir M4). Kontrolę sudaro DU145 ląstelės (REG), neperkeltos (SFM), tik transfekcijos reagentas (NC) ir plakta siRNR (AF). Šviesiai pilkos juostos žymi ląsteles G1 fazėje, tamsiai pilkos juostos žymi S fazę, o G2 fazės ląsteles žymi baltos juostos. Kiekvienas mėginys buvo paimtas dviem egzemplioriais ir parodomas vidurkis. ( b ) FACS ištyrė transfekuotas ląsteles, kad ištirtų MEN1 tylėjimo poveikį apoptozės indukcijai. DU145 ląstelės buvo transfekuotos ir badaujamos terpėje, kurioje nėra serumo, 48 valandas prieš gelbėjimą serumo terpėje. Po 48 valandų ląstelės buvo nudažytos aneksinu, kad būtų galima atsekti fosfatidilino serino lipnumą ląstelių membranose, o tai yra ankstyvosios apoptozės požymis. Mėginiuose yra DU145 ląstelės, transfekuotos dviem skirtingais MEN1 siRNR (M1 ir M4). Kontrolę sudaro DU145 ląstelės (Reg), neperkeltos (SFM), tik transfekcijos reagentas (NC) ir plakta siRNR (AF). Dvi skirtingos doksorubicinu apdorotų DU145 ląstelių koncentracijos buvo įtrauktos kaip papildomos kontrolinės medžiagos. Kiekvienas mėginys buvo paimtas dviem egzemplioriais ir parodomas vidurkis.

Visas dydis

Išraiškos masyvai

Norėdami išsiaiškinti tariamus kelius, kuriuos trikdo abejotina MEN1 raiška prostatos navikuose, mes atlikome ekspresijos mikrotrauminius tyrimus su RNR iš siRNR eksperimentų. RNR iš DU145 ląstelių su patvirtintu MEN1 triukšmo slopinimu (siRNR M4) buvo palyginta su kontrolinėmis RNR (kiekviena komplektacija trimis egzemplioriais). Analizė apsiribojo genais, kurių ekspresijos pokyčiai, kai P reikšmės buvo <0, 05. Papildomoje S3 lentelėje išvardytos biologinių funkcijų kategorijos, kurioms buvo per daug atstovaujama ir per mažai atstovaujama MEN1 siRNR raiškos tyrimams. Tada pasirinktų genų ekspresija buvo patikrinta naudojant „TaqMan“ su MEN1 kaip kontrolę. 5a paveikslas rodo integrino-β1 ( ITGβ1 ), kaspazės 8 ( CASP8 ) ir p53 efektoriaus, susijusio su PMP22 ( PERP ), rezultatus. 5b paveiksle parodytas šių genų patvirtinimas naudojant kiekybinį RT – PGR.

Image

a ) pasirinktų genų DU145 išraiškos masyvo rezultatai. Išvardijamas genas ir atitinkamas išraiškos matricos kartos pokytis. Atlenkimo pokytis apskaičiuojamas kaip išraiškos santykis I daugybinės endokrininės neoplazijos I ( MEN1 ), išmušusių DU145 ląsteles, santykiu, palyginti su kontroliniais (be siRNR ir peštynių kartu). ( b ) „TaqMan“ patvirtino DU145 išraiškos matricos rezultatus. Kiekviena geno išraiška buvo matuojama, palyginti su naminį palaikančio geno BGUS . Parodyti „TaqMan“ rezultatai ITGβ1 (šviesiai pilka), CASP8 (tamsiai pilka) ir PERP . Kiekvienas rezultatas nubraižomas kaip procentinė išraiška, palyginti su neapdorotu DU145. Reg vaizduoja DU145 ląsteles be siRNR, iššifruotos yra DU145 ląstelės, kurios buvo apdorotos siRNR, neturinčiomis homologijos žinomoms cDNR, MEN1 siRNR yra DU145 ląstelės, apdorotos siRNR. Kiekviena juosta žymi du biologinius pakartojimus, kurie buvo paleisti trimis egzemplioriais prieš rezultatų vidurkį.

Visas dydis

Diskusija

Ankstesniame darbe naudodami aCGH mes nustatėme maždaug 25% pirminių prostatos navikų, progresavusių iki metastazių, prieaugio MEN1 lokuse. 10 Dabar naudodami FISH metastazavusiems navikams, mes aptikome MEN1 padidėjimą 18–39% metastazavusių navikų, atsižvelgiant į naudojamą slenkstį. TMA konstravimui naudojamos metastazės yra iš greitos skrodimo programos ir daugumos skrodimų metu TMA pavaizduotos kelios organų vietos. Tai leido mums ištirti MEN1 pelno nevienalytiškumą organų vietose atskirais atvejais. Daugeliu atvejų organų vietos buvo vienodos. Tai gali reikšti prostatos vėžio metastazių kloninę kilmę ir tai, kad MEN1 bent jau yra susijęs su agresyviu prostatos vėžiu. Ankstesniuose darbuose patvirtinta galimybė, kad MEN1 gali būti susijęs su agresyviu prostatos vėžiu, kai buvo nustatyta, kad MEN1 lokuso padidėjimas yra nepriklausomas ligos pasikartojimo po radikalios prostatektomijos prognozė. 10 Taigi gali būti, kad sergant prostatos vėžiu, MEN1 yra teigiamas agresyvios ligos reguliatorius.

Jei padidėjęs MEN1 kopijų skaičius yra priežastiniu ryšiu susijęs su agresyvia liga, tada tikimasi, kad padidės MEN1 geno ekspresija atitinkamame navike. Iš tiesų pranešta apie tokį pirminių navikų išraiškos padidėjimą. 11 Be to, atlikus prostatos vėžį viešų MEN1 genų ekspresijos duomenų metaanalizė atskleidžia tendenciją, kad keliuose skirtinguose tyrimuose padidėjo MEN1 raiška prostatos navikuose ir metastazėse, palyginti su normaliu audiniu. 18, 19, 20, 21, 22 duomenys . Kolektyviniai įrodymai rodo, kad MEN1 gali veikti kaip onkogenas. Jei MEN1 genas veikia kaip onkogenas, jis turėtų suteikti fenotipą, atitinkantį šią funkciją. Norėdami tai išbandyti, MEN1 nuorašai buvo nutildyti naudojant siRNR ir ląstelių proliferaciją stebimas realiu laiku naudojant ACEA RT-CES sistemą. Atliekant kelis nepriklausomus eksperimentus, MEN1 nutildymą prostatos vėžio ląstelių linijoje lydėjo sumažėjęs ląstelių proliferacija ir padidėjusi apoptozė. Gamintojo teigimu, ACEA RT-CES sistemos sugeneruotos kreivės formos rodo specifinius ląstelių atsakus. Šios kreivės rodo citostatinį atsaką, kurį taip pat patvirtino rankinis ląstelių skaičiavimas. Be to, šie rezultatai, ląstelių proliferacijos sumažėjimas ir apoptozės padidėjimas, buvo pakartoti naudojant MTS testą ir FACS analizę. Šie eksperimentai pateikia pirmuosius įrodymus, kad MEN1 gali veikti kaip onkogenas in vitro tinkamoje ląstelėje.

SiRNR eksperimentai parodė, kad sumažėjęs MEN1 reguliavimas sustiprina apoptozę. Todėl atlikome ekspresijos mikrotrauminius tyrimus, kad nustatytume menino efektorius. Išraiškos masyvo tyrimai nustatė genus, suderintus su MEN1 . Du genai, PERP ir CASP8 , gali sukelti apoptozę, ir buvo pastebėta, kad padidėjusi ekspresija, kai slopinamas MEN1 . Taigi, kai MEN1 yra per daug išreikštas prostatos navikais, šie teigiami efektoriai gali būti sureguliuoti, susilpninant apoptozę. CASP8 išvados prieštarauja tam, kas buvo pranešta, kai MEN1 veikia kaip naviko slopiklis. Šiame kontekste meninas slopina augliogenezę iš dalies padidindamas CASP8 ekspresiją. 23 Panašiai ITGβ1 išraiška padidėja, kai sumažėja MEN1 išraiška. Todėl padidinus MEN1 dozę, ITGβ1 ekspresija sumažėja. Integrinai dalyvauja ląstelių adhezijoje ir proliferacijoje, o jų panaikinimas gali palengvinti metastazes. Tai rodo MEN1 sąsają skatinant prostatos vėžio metastazes.

Meninas nedetalizuoja jokio žinomo baltymo. Išskyrus du branduolio lokalizacijos signalus, 24, 25 meninas neturi identifikuojamų funkcinių motyvų. IHC tyrimai, atlikti Guru ir kt. tarpfazinių somatinių ląstelių skaičius parodė, kad menino baltymas yra branduolyje. 24 Siekdami išaiškinti MEN1 vaidmenį prostatos vėžyje , atlikome IHC tyrimus. Gerybinėse prostatos liaukose, esančiose šalia navikinių ląstelių, IHC dažymas atskleidė citoplazmoje esančius meninus, nors naviko ląstelėse buvo stebimas branduolinis lokalizavimas. Du geno funkciniai branduolio lokalizacijos signalai atitinka mūsų pastebėjimą, kad menino baltymas gali lokalizuotis arba citoplazmoje, arba branduolyje. Įdomu tai, kad tiek normalus gretimas prostatos audinys, tiek navikas taip pat gali neigiamai nudažyti meniną.

Yra daugybė MEN1 stebėjimų, kurie rodo molekulinį ir biologinį sudėtingumą. Pirmiausia, ne tik tai, kad VEN gali turėti kelis židinius kiekviename paveiktame organe, bet ir tai, kad tuo pačiu metu gali būti paveikta daugybė skirtingų endokrininių organų. Antra, MEN1 egzistuoja keli alternatyvūs sujungimo modeliai, kurie rodo kelių baltymų izoformų galimybę. Daugelis MEN1 navikų yra gerybiniai, o kai kurie jų navikai yra piktybiniai. Įdomu tai, kad MEN1 pacientai, kuriems išsivysto gastrinomos, diagnozę turi metastazes, 15% jų progresuoja į agresyvų piktybinį naviką. 26, 27, 28 įrodyta, kad net tradicinis MEN1, kaip naviko slopintuvo, vaidmuo yra sudėtingas. MEN1 gali veikti kaip transkripcijos aktyvatorius, palaikantis augimą reguliuojančių genų ekspresiją, ir transkripcinis corepressor, neigiamai reguliuojantis augimą skatinančius genus. 7, 29, 30 Nors istoriškai buvo manoma, kad MEN1 veikia kaip naviko slopiklis, mišrios kilmės leukemijos (MLL) metu meninas laikomas onkogenu. 31 Yokoyama ir kt. elegantiškai pademonstravo, kad norint inicijuoti MLL sukeltą leukemogenezę reikalinga fizinė sąveika tarp onkogeninio MLL sulieto baltymo ir menino. Todėl MEN1 gali būti onkogeninis MLL kofaktorius. Galiausiai Karnik ir kt. taip pat parodė, kad MEN1 reguliuoja prolaktinas ir progesteronas, todėl padidėja tikimybė, kad signalizacijos kelių, kuriuos reguliuoja steroidiniai hormonai, defektai gali būti susiję su fenotipais, susijusiais su MEN1 inaktyvacija. 32 Priešingai, įsivaizduojama, kad padidėjusi MEN1 raiška gali turėti įtakos hormonų sukeltam vėžiui, pavyzdžiui, prostatos vėžiui, kaip čia siūloma. Norint toliau išsiaiškinti MEN1 onkogeninio potencialo mechanizmą, taip pat išsiaiškinti bendro reguliavimo genų vaidmenį, reikės atlikti papildomus tyrimus.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi S1 paveikslai

  2. 2.

    Papildomos lentelės S1

  3. 3.

    Papildomos lentelės S2

  4. 4.

    Papildomos lentelės S3

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomų lentelių aprašymas

    Papildoma informacija pridedama prie prostatos vėžio ir prostatos ligų tinklalapio (//www.nature.com/pcan).