Angiotenziną konvertuojantis fermentas 2 / angiotenzinas (1–7) / mas ašis suaktyvina aktyvųjį signalą, palengvinantį kepenų steatozę | mokslinės ataskaitos

Angiotenziną konvertuojantis fermentas 2 / angiotenzinas (1–7) / mas ašis suaktyvina aktyvųjį signalą, palengvinantį kepenų steatozę | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Molekulinė medicina
  • Nealkoholinė riebalinių kepenų liga

Anotacija

Klasikinė renino ir angiotenzino sistemos (RAS) ašis, angiotenziną (Ang) konvertuojantis fermentas (AKF) / Ang II / AT1, prisideda prie nealkoholinės riebalinių kepenų ligos (NAFLD) vystymosi. Tačiau RAS (angiotenziną konvertuojančio fermento 2 (ACE2) / Ang- (1–7) / Mas) apeigos ašies vaidmuo kepenų steatozėje vis dar nėra aiškus. Čia mes parodėme, kad ACE2 ištrynimas apsunkina kepenų steatozę, kuri yra koreliuojama su padidėjusia kepenų lipogeninių genų ekspresija ir sumažėjusia su riebiųjų rūgščių oksidacija susijusių genų ekspresija kepenyse su ACE2 išmušimo pelėmis ( ACE2 - per metus ). Tuo tarpu ACE2 - / y pelėms taip pat sustiprėjo oksidacinis stresas ir uždegimas. Priešingai, dėl padidėjusio ACE2 ekspresijos pagerėjo riebalų kepenys db / db pelėmis, o su riebalų rūgščių oksidacija susijusių genų mRNR lygis buvo sureguliuotas. In vitro ang- (1–7) / ACE2 palengvino kepenų steatozę, oksidacinį stresą ir uždegimą laisvųjų riebalų rūgščių (FFA) sukeltose HepG2 ląstelėse, o dar daugiau - Akt inhibitoriai sumažino ACE2 tarpininkaujamą lipidų metabolizmą. Be to, ACE2 sąlygojamą Akt aktyvaciją gali susilpninti blokuodamas ATP / P2 receptorių / kalmodulino (CaM) kelią. Šie rezultatai parodė, kad Ang- (1–7) / ACE2 / Mas ašis gali sumažinti kepenų lipidų kaupimąsi iš dalies reguliuodama lipidus metabolizuojančius genus ATP / P2 receptorių / CaM signalizacijos keliu. Mūsų išvados patvirtina galimą ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies vaidmenį kepenų lipidų metabolizmo prevencijoje ir gydyme.

Įvadas

Nealkoholinė riebiųjų kepenų liga (NAFLD) yra viena iš labiausiai paplitusių lėtinių kepenų ligų visame pasaulyje 1 . Kaip galimas NAFLD patogenezės modelis yra plačiai priimta „dviejų įvykių hipotezė“. „Pirmasis įvykis“ yra lipidų kaupimasis kepenyse, todėl kepenys tampa jautresnės „antrajam poveikiui“, tokiems kaip oksidacinis stresas, endotoksinai ar nenormalus citokinų gaminimasis, kurie gali sukelti kepenų uždegimą ir (arba) galimą fibrozę 2., 3 .

Įrodyta, kad klasikinė renino ir angiotenzino sistemos (RAS) ašis, angiotenziną (Ang) konvertuojantis fermentas (ACE) / Ang II / AT1, prisideda prie NAFLD 4, 5 vystymosi. Ang II sukelia NAFLD vystymąsi ir progresavimą transgeniniame Ren2 žiurkių modelyje (su padidintu audiniu Ang II) padidinant kepenų reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) 5 . Pastebėtas padidėjęs sisteminės ir vietinės RAS aktyvavimas pacientams, sergantiems 6 ciroze ir lėtiniu hepatitu C 7 . RAS blokavimas žymiai palengvina kepenų fibrogenezę gyvūnų modeliuose, kuriuos sukelia metionino cholino trūkumas, CCl4 arba tulžies latakų ligacija. 8, 9, 10 .

Neseniai mes su Santosu ir kt. pranešė, kad ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašis yra priešinga ACE / Ang II / AT1axis kepenyse 11, 12 . Pirmą kartą įrodėme, kad pelėms, kurių AKE2 išmušamos ( ACE2 - per metus ), progresuoja gliukozės tolerancijos sutrikimas ir sumažėja pirmosios fazės insulino sekrecija ir kad ACE2 gali būti naujas taikinys II tipo diabeto gydymui 13, 14 . Visai neseniai pranešėme, kad suaktyvinus ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašį, pagerėjo kepenų atsparumas kepenų insulinui per Akt / PI3K / IRS-1 / JNK insulino signalizacijos kelią 12 . Kita vertus, AKE2 aktyvumo praradimas pablogina kepenų fibrozę lėtinio kepenų pažeidimo modeliuose, o rekombinantinio ACE2 vartojimas rodo terapinį potencialą 15 . Nors yra nustatyta ACE2 / Ang- (1–7) funkcijos, susijusios su kepenų atsparumu insulinui ir kepenų fibrozei, jo vaidmuo NAFLD vis dar nežinomas.

ACE2 yra ekspresuojamas kepenyse 16, kuris yra vienas iš pagrindinių organų, reguliuojančių trigliceridų (TG) ir cholesterolio metabolizmą. Tačiau iki šiol nėra paskelbto tyrimo, kuriame būtų naudojamas genetinis modelis, turintis per didelį ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies aktyvumą, kad būtų galima tiesiogiai įvertinti jo vaidmenį kepenų steatozėje. Šiame tyrime pateikiami ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies pagerėjimo kepenų steatozėje fiziologiniai ir molekuliniai įrodymai bei naujos įžvalgos ir supratimas apie galimus ACE2 / Ang- (1–7) kepenų lipidų metabolizmo mechanizmus kepenyse. Mas ašis.

Rezultatai

ACE2 ištrynimas apsunkina kepenų steatozės vystymąsi pelėse ACE2 - / y

ACE2 - / y pelėms buvo sukurtas ryškus riebalinių kepenų fenotipas, pasižymintis blyškia kepenų išvaizda, kurią sukelia didelis riebalų kaupimasis. Histologinio tyrimo rezultatai ir kepenų skyrių dažymas alyvuogių-raudonai parodė, kad kepenų lipidai nusėda kepenyse ACE2 - / y pelėse ir sumažėja laukinio tipo (WT) pelių kepenų sankaupos (1A pav.). Nuosekliai kepenų svoris ir kepenų TG kiekis buvo žymiai didesnis ACE2 - / y pelėse nei WT pelėse (1B pav., C), tačiau cholesterolio kiekis reikšmingai nepasikeitė (1 pav. D).

Image

( A ) Reprezentatyvūs WT ir ACE2 pelių kepenų pjūvių vaizdai, dažyti alyvos raudonuoju-O (n = 5 / kiekvienoje grupėje). ( B – D ) Buvo nustatytas kepenų svoris, kepenų trigliceridų ir cholesterolio kiekis (n = 8 / kiekvienoje grupėje). * P <0, 05 ir *** P <0, 001, palyginti su WT pagal Studento testą.

Visas dydis

ACE2 pašalinimas sunkina kepenų steatozę, oksidacinį stresą ir uždegimą ACE2 pelėms

Lipidus metabolizuojančių genų baltymų lygis, įskaitant sterolius reguliuojančius elementus jungiančius baltymus-1c (SREBP-1c), acetil-CoA karboksilazės α (ACCα), kepenų X receptorių α (LXRα), riebalų rūgščių sintazės (FAS) ir atjungimą. baltymas-2 (UCP-2) buvo sureguliuotas, o AdipoR1 buvo represuotas ACE2 - / y pelėse (2A pav.). Tuo tarpu su riebalų rūgščių oksidacija susijusių genų mRNR, karnitino palmitoiltransferazės Iα ( CPT-1α ), peroksisomų proliferatorių aktyvuoto alfa receptoriaus ( PPARα ), PPAR gama ( PPARγ ) ir PPARγ koaktyvatoriaus 1α ( PGC-1α ) lygis buvo sumažintas., ir mažai pasikeitę ACE2 - / y pelių kepenyse vidutinės grandinės acy -CoA dehidrogenai ( MCAD ) (2B pav.). Šie rezultatai rodo, kad ACE2 ištrynimas gali pasunkinti kepenų steatozę pelėms, sergančioms ACE2 / per metus .

Image

( A ) santykinis baltymų, metabolizuojančių lipidus (ACCα, SREBP-1c, LXRα, FAS, AdipoR1 ir UCP-2), kiekis. ( B ) Su riebalų rūgščių oksidacija susijusių genų ( PGC-1α , CPT-1α , PPARα , PPARγ ir MCAD ) santykiniai genų ekspresijos lygiai. ( C ) santykinis oksidacinio streso signalų (katalazės, GPX1 ir SOD2) baltymų ir ( D ) uždegimo (TNF-α, MCP-1 ir IL-8) kiekis. Duomenys pateikiami kaip n = 4 nepriklausomų eksperimentų su ACE2 - / y pelėmis vidurkis ± SD. * P <0, 05 ir ** P <0, 01, palyginti su WT pelėmis pagal Studento t testą.

Visas dydis

ACE2 nebuvimas taip pat reguliuoja genų, susijusių su oksidaciniu stresu ir uždegimu, išraišką. ACE2 - / y pelėms buvo sumažintas oksidacinio streso signalų, kaip glutationo peroksidazės (Gpx1), katalazės ir superoksido dismutazės 2 (SOD2), genai (2 pav. C). Pelėms, sergančioms ACE2 - / y, padidėjo uždegimą sukeliančių citokinų, kaip naviko nekrozės faktoriaus (TNF) -α, monocitų chemotaktinio baltymo-1 (MCP-1) ir interleukino-8 (IL-8), išraiška (2 pav. D). Šie rezultatai parodė, kad ACE2 delecija gali padidinti oksidacinį stresą ir uždegimą ACE2 - / y pelių kepenyse.

Didelis AKE2 ekspresijos lygis pagerina kepenų steatozę db / db pelėmis

Norint toliau ištirti ACE2 poveikį in vivo , ACE2 buvo per daug ekspresuotas db / db pelių kepenyse, siekiant įvertinti jo vaidmenį lipidų metabolizme. Palyginti su pelėmis, gydomomis Ad-GFP, pelėmis, gydomomis Ad-ACE2, pastebimai sumažėjo riebalų kaupimasis kepenyse (3A pav.). Be to, Ang II, TG ir alanino aminotransferazių (ALT) kiekis serume sumažėjo dėl kepenų AKE2 ekspressijos (3B – D pav.), Nedaug pakitus cholesterolio ir Aspartate aminotransferazių (AST) lygiui serume (3C, D pav.). Pagerėjus plazmos lipidų profiliams po per daug išreikštos AKE2, AKE2 gali turėti įtakos viso kūno jautrumui insulinui. Norint patikrinti, ar ACE2 pagerino gliukozės metabolizmą, buvo atlikti gliukozės tolerancijos testai (GTT). Palyginti su pelėmis, gydomomis Ad-GFP, pelės, padidėjusios Ad-ACE2, jautrumas insulinui žymiai pagerėjo (atraminė S1A, S1B pav.).

Image

( A ) Reprezentatyvūs kepenų pjūvių vaizdai iš db / db, db / db + GFP ir db / db + ACE2 pelių, dažytų alyva-raudona-O. Kiekybinis ( B ) AngII, ( C ) triglicerido ir cholesterolio, ( D ) ALT ir AST lygio tyrimas ACE2 ekspresuojančioms db / db pelėms. * P <0, 05 atvirkštinio db / db + GFP pelės (n = 6). ( E ) Su riebalų rūgščių oksidacija susijusių genų ( PGC-1α , CPT-1α , PPARα , PPARγ ir MCAD ) santykinis genų ekspresijos lygis. * P <0, 05 palyginti su db / db + GFP pagal Studento testą.

Visas dydis

Toliau mes ištirsime su lipidų metabolizmu susijusių genų ekspresijos lygius. Su riebiųjų rūgščių oksidacija susijusių genų, CPT-1α , PPARα ir PPARγ, mRNR lygis buvo aukščiau reguliuojamas, o PGC-1α ir MCAD mRNR lygio pokyčiai Ad-ACE2 gydytų pelių kepenyse nebuvo pastebėti (3 pav. E). ). Mes taip pat pasidomėjome, ar ACE2 keičia lipogenezės genų raišką. Tačiau lipogenezės genų raiška neparodė reikšmingo skirtumo tarp Ad-GFP ir Ad-ACE2 gydytų grupių (atraminė S1 C pav.). Visi šie rezultatai parodė, kad ACE2 reikšmingai pagerino kepenų steatozę db / db pelėms.

Ang- (1–7) / ACE2 gydymas pagerina FFA sukeltą kepenų steatozę HepG2 ląstelėse per Akt

Norėdami ištirti Ang- (1–7) įtaką kepenų steatozei, mes apdorojome HepG2 ląsteles FFA, kad sukeltų in vitro ląstelių steatozės modelį. Kaip parodė „Oil-Red-O“ dažymas, FFA paskatino didelį lipidų kaupimąsi HepG2 ląstelėse, o Ang- (1–7) apdorotos HepG2 ląstelės žymiai užkirto kelią lipidų kaupimuisi (4 pav.). Panašų rezultatą Nilo raudonumas nustatė ir ang- (1–7) apdorotose ląstelėse, tuo tarpu Mas receptorių antagonistas (A779) nepadarė įtakos Ang- (1–7) poveikiui lipidų kaupimuisi (4 pav. B). .

Image

Ląstelės 24 valandas veikiamos 2 mM FFA (2: 1, oleatas: palmitatas). FFA sukelta kepenų steatozė HepG2 ląstelėse, gydomose Ang- (1–7) arba A779. ( A ) Išanalizuokite lipidų kaupimąsi dažydami aliejų raudonai. ( B ) Tarpląsteliniai lipidai buvo dažomi Nilo raudona, o Nilo raudonojo fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas srauto citometrija. ( C ) Tarpląstelinių lipidų kiekio analizė po AKE2 ekspresijos. ( D ) ACCα, SREBP-1c, LXRα, FAS, UCP-2 ir AdipoR1 santykinis baltymų lygis ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse ir FFA sukeltose HepG2 ląstelėse. ( E ) santykinis ACCα, SREBP-1c, LXRα ir FAS baltymų lygis API-2 arba MK-2206 apdorotose ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse. Ląstelės 24 valandas buvo apdorotos API-2 (20 μM) ir MK-2206 (10 μM). Duomenys pateikiami kaip n = 3 nepriklausomų eksperimentų HepG2 ląstelėse vidurkis ± SD. * P <0, 05 ir ** P <0, 01, palyginti su GFP grupe vienpusė ANOVA; # P <0, 05 palyginti su ACE2 grupe vienpusė ANOVA.

Visas dydis

Norėdami toliau tirti šias išvadas, tada ištyrėme ACE2 poveikį FFA sukeltoms HepG2 ląstelėms. Aptikta ACE2 išraiška ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse (Palaikoma S2 pav.). Panašiai, lipidų kaupimasis buvo žymiai slopinamas kontrolinėse arba FFA sukeltose ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse (4 pav. C).

Norėdami patikrinti, ar Ang- (1–7) / ACE2 daro įtaką riebalų rūgščių metabolizmui, mes ištyrėme ACCα, SREBP-1c, LXRα, FAS, UCP-2 ir AdipoR1 AKE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse. ACCα, SREBP-1c, LXRα, FAS ir UCP-2 buvo reguliuojami aukščiau, o AdipoR1 buvo sumažintas (4 pav. D). Nuosekliai ACCα, SREBP-1, LXRα ir FAS ekspresija buvo slopinama, o AdipoR1 padidėjo FFA sukeltose ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse (4 pav. D). Šie rezultatai parodė, kad Ang- (1–7) / ACE2 gali palengvinti kepenų lipidų kaupimąsi.

Norėdami nustatyti, ar ACE2 slopinantį poveikį lipidų kaupimuisi reguliuoja Akt, ACE2 per daug ekspresuojančios HepG2 ląstelės buvo gydomos Akt inhibitoriais (triciribinu (API-2) ir MK-2206). Įdomu tai, kad ACCα, SREBP-1c, LXRα ir FAS išraiška padidėjo grupėse, gydomose API-2 ir MK-2206 (4 pav. E). Šie rezultatai parodė, kad gydymas ACE2 per daug ekspresuojančiomis HepG2 ląstelėmis Akt inhibitoriais gali sumažinti ACE2 sąlygotą lipidų metabolizmą in vitro .

Ang- (1–7) / ACE2 slopina FFA sukeltą oksidacinį stresą ir uždegimą HepG2 ląstelėse

Taip pat mes išmatuojome tarpląstelinės ROS lygį, naudodami DCF-DA FFA sukeltose HepG2 ląstelėse. Mes pastebėjome reikšmingą tarpląstelinės ROS sumažėjimą ang- (1–7) gydytų FFA sukeltose HepG2 ląstelėse. Mas receptorių antagonistas A779 iš dalies neutralizavo Ang- (1–7) poveikį ROS gamybai HepG2 ląstelėse (5 pav. A). Šie rezultatai parodė, kad Ang- (1–7) sumažina ROS gamybą FFA sukeltose HepG2 ląstelėse.

Image

( A ) Tarpląstelinės ROS koncentracijos dažytos DCF-DA, o DCF-DA fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas srauto citometrija. ( B ) antioksidacinių su stresu susijusių baltymų (katalazės, GPX1 ir SOD2) ir su uždegimu susijusių baltymų (TNF-α, MCP-1 ir IL-8) santykinis baltymų kiekis ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse. Duomenys pateikiami kaip n = 3 nepriklausomų eksperimentų HepG2 ląstelėse vidurkis ± SD. * P <0, 05 ir ** P <0, 01, palyginti su kontrole arba tuščiu vektoriu vienpusė ANOVA.

Visas dydis

Western blot rezultatai taip pat patvirtino, kad ACE2 reguliuoja genų, susijusių su oksidaciniu streso signalizavimu ir uždegimu, išraišką. Oksidacinio streso signalizacijos žymenų genų (Gpx1, katalazės ir SOD2) ekspresija buvo padidinta, o uždegimą slopinančių citokinų (TNF-α, MCP-1 ir IL-8) sumažėjo (5B pav.). Šie rezultatai rodo, kad ACE2 gali apsaugoti nuo oksidacinio streso ir uždegimo HepG2 ląstelėse.

Per didelis ACE2 ekspresija aktyvina Akt per ATP / P2 receptorių / CaM kelią

Atsižvelgiant į tai, kad Ang II gali sukelti mitochondrijų reaktyviųjų deguonies rūšių gamybą, o pelėms, kurių ACE2 - / y padidėjo oksidacinio streso lygis 12, 17, buvo tiriamas ACE2 poveikis mitochondrijų funkcijai, nustatant ląstelių ATP kiekį. Tikimasi, kad dėl AKE2 ekspresijos padidėjo tarpląstelinio ir tarpląstelinio ATP lygiai HepG2 ląstelėse (6A pav.).

Image

( A ) Tarpląstelinio ir tarpląstelinio ATP lygiai ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse. ( B ) ACE2 sukeltą Akt aktyvavimą slopino IP3R antagonistas (2-APB), ATP receptoriaus P2 antagonistas (PPADS) ir CaM antagonistas (CPZ). Užkrėstos HepG2 ląstelės prieš valandą buvo matuojamos 2-APB (10 μM), PPADS (50 μM) arba CPZ (100 μM) 1 valandą. Duomenys pateikiami kaip n = 3 nepriklausomų eksperimentų HepG2 ląstelėse vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, # P <0, 05, palyginti su Ad-ACE2 infekuotomis ląstelėmis be 2-APB, PPAD ar CPZ gydymo (n = 3). ( C ) ACE2 sukeltas Akt aktyvinimas iš dalies priklausė nuo tarpląstelinio kalcio buvimo. Užkrėstos ląstelės 2 valandas buvo tiriamos be kalcio terpės HANK'S, prieš tai nustatant pAkt lygį. Duomenys pateikiami kaip n = 3 nepriklausomų eksperimentų HepG2 ląstelėse vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis; #P <0, 05 palyginti su Ad-ACE2 užkrėstomis ląstelėmis su kalciu (n = 3).

Visas dydis

Norėdami toliau tirti šias išvadas, mes tada ištyrėme ATP / P2 receptorių / CaM signalizacijos kelią ACE2 per daug ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse. ACE2 sukeltas Akt aktyvinimas buvo sustabdytas inozitolio 1, 4, 5-trifosfato receptorių (IP3R) antagonistu (2-APB) ir kalmodulino (CaM) antagonistu (CPZ) HepG2 ląstelėse (6 pav. B). Svarbu tai, kad ACE2 sukeltą Akt fosforilinimą HepG2 ląstelėse visiškai panaikino ATP receptoriaus P2 antagonistas (PPADS) (6 pav. B). Be to, ACE2 sukeltas Akt aktyvinimas taip pat iš dalies priklausė nuo tarpląstelinio Ca 2+ buvimo (6 pav. C). Šie rezultatai rodo, kad ACE2 sukelta Akt aktyvacija iš dalies priklauso nuo ATP / P2 receptorių / CaM signalizacijos kelio.

Diskusija

Klasikinis RAS kelias, ACE / AngII / AT1, moduliuoja ir prisideda prie NAFLD 4, 5, 8 kūrimo . Kita vertus, Ang- (1–7) atlieka svarbų kovos su nutukimu vaidmenį Mas receptorių 11, 18, 19, 20 . Šis tyrimas pirmasis paaiškina galimus ACE2 / Ang- (1–7) / Mas mechanizmus, reguliuojančius kepenų steatozę. Parodome, kad ACE2 ištrynimas pasunkino kepenų steatozę, oksidacinį stresą ir uždegimą pelėse, kuriose yra ACE2 - / y . Atvirkščiai, per didelis ACE2 ekspresija pagerino hiperglikemiją ir riebalines kepenis db / db pelėms. In vitro tyrimas ang- (1-7) / ACE2 pagerino kepenų steatozę, oksidacinį stresą ir uždegimą FFA sukeltose HepG2 ląstelėse. Pažymėtina, kad Akt inhibitoriai sumažina ACE2 sąlygojamą lipidų metabolizmą, o dar daugiau, ACE2 sąlygojamą Akt aktyvaciją gali susilpninti blokuodama ATP / P2 receptorių / CaM kelią. Kartu žiūrint, Ang- (1–7) / ACE2 / Mas ašis gali sumažinti kepenų lipidų kaupimąsi, iš dalies reguliuodama lipidus metabolizuojančius genus ATP / P2 receptorių / CaM signalizacijos keliu. Palengvinant kepenų steatozę, taip pat gali sumažėti oksidacinis stresas ir uždegimas.

Dėl daugybinių metabolizmo būdų išsivysto kepenų steatozė, įskaitant padidėjusią lipogenezę ir lipolizę bei sumažėjusią riebalų rūgščių oksidaciją 21 . Pagrindiniai transkripcijos reguliatoriai, tokie kaip LXRα ir SREBP-1c, koordinuoja lipogenezę 22 . LXRα ir SREBP-1c padidina pagrindinių lipogeninių genų, įskaitant FAS, SCD1 ir ACC 23, raišką. ACC1 paverčia acetil-CoA į malonilo-CoA ir slopina riebalų rūgščių patekimą į mitochondrijas, mažindamas β oksidaciją. FAS naudoja ir acetil-CoA, ir malonil-CoA, kad sudarytų palmitino rūgštį (C16: 0). Be to, atrodo, kad adiponektinas vaidina pagrindinį vaidmenį gerinant riebalų rūgščių oksidaciją ir mažinant riebalų rūgščių sintezę 24 . Kepenys turi adiponektino receptorius, todėl jų stimuliacija padidina riebalų rūgščių β oksidaciją ir sumažina kepenų TG kiekį. Neįprastas šių veiksnių indukcija gali prisidėti prie kepenų steatozės. Šiame tyrime šių genų pokyčiai ACE2 - / y pelėse ir AKE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse patvirtina mintį, kad ACE2 palengvina kepenų steatozę.

Keletas tyrimų parodė, kad per didelis reaktyviųjų deguonies rūšių susidarymas ir pakitusi redokso pusiausvyra skatina kepenų lipidų kaupimąsi 5, 25, 26 . Ankstesniame mūsų tyrime buvo užfiksuota, kad ROS lygis padidėjo ACE2 - / y pelių kepenyse, tuo tarpu HepG2 ląstelėse Ang- (1–7) galėjo apsaugoti nuo oksidacinio streso slopindamas NADPH oksidazės ekspresiją 12 . Apsaugoti nuo oksidacinio streso yra sudėtinga fermentinių antioksidantų (SOD, GPX, glutationo reduktazės, katalazės) ir ne fermentinių antioksidantų (glutationo (GSH), vitaminų C ir D) sistema 27 . Šiame tyrime padidėjęs lipidų kaupimasis kepenyse gali būti susijęs su fermentinių antioksidantų genų ekspresijos sumažėjimu ir dėl to padidėjusia ROS gamyba. Oksidacinio streso signalizacijos išraiška pelėse ACE2 - / y ir FFA sukeltose ACE2 ekspresuojančiose HepG2 ląstelėse sutapo su ankstesniais duomenimis.

Daugybė tyrimų pranešė apie ryšį tarp NAFLD ir sisteminio uždegiminio streso 28, 29 . Steatozė yra būtinas NAFLD patogenezės žingsnis, tačiau norint sukelti steatohepatitą reikia uždegimo, kuris sukelia lėtinį kepenų pažeidimą ir progresuojančią fibrozę. Įrodyta, kad padidėjusi priešuždegiminių citokinų raiška, kaip TNF-α, skatino kepenų lipidų kaupimąsi 30 . Keletas tyrimų parodė, kad daugelis RAS komponentų yra ekspresuojami kepenyse vykstančiuose metaboliniuose ir uždegiminiuose procesuose. 5, 31, 32, 33 . Padidėjusi Ang II ekspresija sukelia NAFLD ir modifikuoja uždegiminių ląstelių pritraukimą į kepenis kepenų pažeidimo metu 4, 5 . Be to, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad RAS yra stiprus tarpininkas suaktyvinant uždegimo mechanizmus, susijusius su nutukimu. Dabartiniai mūsų atradimai atitinka šiuos duomenis ir pirmą kartą patvirtina, kad uždegiminis lygis padidėjo ACE2 - / y pelių kepenyse, tuo tarpu HepG2 ląstelėse ACE2 galėjo apsaugoti nuo uždegiminio streso, slopindamas proinflammatorinių citokinų raišką.

Anksčiau buvo pranešta, kad sumažėjęs kepenų ATP lygis yra susijęs su NAFLD išsivystymu žiurkėms 34 . Įrodyta, kad ATP yra signalinė molekulė, aktyvinanti PI3K / Akt signalizacijos kelią 35, 36, 37 . ATP receptoriai (P2X ir P2Y receptoriai) tarpina tokį veiksmą. P2X receptoriai yra pralaidūs kalciui, kurie yra ligandiniai jonų kanalai37. P2Y receptoriai yra receptoriai, sujungti su G baltymais, kurie skatina PLC padidinti IP3 gamybą, todėl kalcis išsiskiria iš vidinių atsargų37. Padidėjęs citozolinis laisvasis kalcis suaktyvina CaM, todėl suaktyvėja PI3K / Akt kelias 38, 39 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad P2 receptorių antagonistai (PPADS) visiškai panaikino ACE2 sukeltą Akt aktyvaciją, kuri atskleidžia kritinį ATP receptorių vaidmenį šiame procese. Be to, Akt aktyvaciją taip pat labai blokavo IP3R antagonistas (2-APB), CaM antagonistas (CPZ) ir tarpląstelinio kalcio išeikvojimas HepG2 ląstelėse. Šie duomenys atskleidžia galimą ATP / P2 receptorių / CaM signalo kelio įtaką ACE2 sąlygotam kepenų atsparumui insulinui ir kepenų lipidų kaupimuisi HepG2 ląstelėse. Be to, šie atradimai suteikia dar vieną įtikinamą paaiškinimą apie ryšį tarp ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies ir kepenų gliukozės / lipidų metabolizmo molekulinio pagrindo.

Atsparumas insulinui ir steatozė yra glaudžiai susiję su NAFLD 40 vystymusi. Padidėjęs kepenų FFA pablogina atsparumą insulinui. Dėl padidėjusio oksidacinio streso ir uždegimą sukeliančių citokinų gaminant kepenų lipidus kaupiasi dar didesnis atsparumas insulinui, todėl susidaro užburtas ciklas 3 . Riebalų rūgščių sintezė susikerta su signalizacija apie insuliną, o Akt vaidina pagrindinį vaidmenį signalizuodamas apie gliukozės ir lipidų apykaitą 41 . Nustatyta, kad Akt ne tik reguliuoja gliukoneogenezę ir glikogenolizę, bet ir vaidina svarbų vaidmenį kepenų lipidų metabolizmo reguliavime. Akt aktyvinimas slopina lipogenezę ir apsaugo nuo per didelio lipidų nusėdimo kepenyse. Be to, padidėjęs Akt fosforilinimo lygis kepenyse yra susijęs su diabeto pelių steatozės pagerėjimu 45 . Neseniai atliktame tyrime apie ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies poveikį kepenų atsparumui kepenims, Akt fosforilinimo lygis žymiai padidėjo ACE2 ekspresuojančiose ląstelėse, o reikšmingai slopinamas ACE2 kepenyse - per metus. pelės. Kaip ir tikėtasi, Akt inhibitoriai gali sumažinti ACE2 sąlygotą lipidų metabolizmą. Be to, padidėjęs kepenų AKE2 ekspresija pagerino hiperglikemiją ir riebalines kepenis db / db pelėms. Kartu su šiais dviem tyrimais, mechanizmas, kuriuo grindžiamas gliukozės ir lipidų metabolizmas, gali apimti ACE2 / Ang- (1–7) gebėjimą suaktyvinti Akt.

Vienas iš šio tyrimo apribojimų yra tas, kad negavome teigiamų rezultatų iš pelių, kurių organizme yra riebalai ir kurių sudėtyje yra daug riebalų ( ACE2 - / y ). homeostazė, įgimtas imunitetas, žarnyno mikrobų ekologija ir užkrečiamas jautrumas kolitui 46, kuris gali turėti įtakos riebalų turinčių dietų metabolizmui. Tai reikia patvirtinti tolesniame sisteminiame eksperimente; galbūt kepenims būdingos išmuštos ACE2 pelės gali išspręsti šią problemą.

Apibendrinant, kaip aprašyta 7 pav., Mūsų tyrimas rodo, kad ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies aktyvacija vaidina svarbų vaidmenį kepenų lipidų apykaitoje per mechanizmą, kuris gali apimti lipidus metabolizuojančių genų reguliavimą per ATP / P2 receptorių / CaM signalizacijos kelias ir oksidacinio streso bei uždegimo mažinimas. Kartu su mūsų naujausiais tyrimais dėl ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašies gali slopinti kepenų atsparumą insulinui, dabartiniai mūsų duomenys rodo, kad ACE2 / Ang- (1–7) / Mas ašis yra potencialus narkotikų terapijos tikslas. NAFLD.

Image

Viršutinis arba žemutinis metabolizmo kelių reguliavimas nurodomas rodyklėmis (↑ padidintam reguliavimui ir ↓ žemyn reguliavimui).

Visas dydis

Metodai

Gyvūnas

ACE2 išmušimo (ACE2 KO, ACE2 - / y ) pelės buvo prof. Dr. Josef Penninger iš Molecular Biotechnology GmbH instituto dovana. Kiekviename eksperimente ACE2 KO pelės buvo identifikuojamos PGR pagalba iš genominės DNR, ekstrahuotos iš uodegos biopsijos. Db / db pelės patinai, sulaukę 6 savaičių, buvo įsigyti iš Nanjingo biologinio medicinos tyrimų instituto, priklausančio Nanjingo medicinos universitetui. db / db pelės buvo laikomos BKS fone. ACE2 KO pelės buvo identifikuotos PGR metodu, naudojant genomo DNR, išgautą iš uodegos biopsijos. Visos pelės buvo palaikomos 12 valandų šviesos / tamsos cikle. Visi šio tyrimo eksperimentai buvo atlikti su pelių patinais ACE2 / per metus ir jų amžiaus bei lyties laukinio tipo (WT) pakratų draugais ir buvo šeriami standartiniu čiau.

Visi gyvūnai buvo tvarkomi pagal protokolą, kurį patvirtino Pekino Tongreno ligoninės, Pekino, Kinijos, Pekino Tongreno ligoninės gyvūnų tyrimų etikos komitetas.

Ląstelių kultūra ir vaistai

HepG2 ląstelės (ląstelių išteklių centras, IBMS, CAMS / PUMC) buvo auginamos DMEM (Hyclone), turinčiame 10% galvijo vaisiaus serumo (FBS) (Hyclone), 100 V / ml penicilino ir 0, 1 mg / ml streptomicino. Ląstelės buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje, sudrėkintame ore, esant 5% CO 2, ir praeinamos kas 2 dienas tripsinu. In vitro ląstelių steatozės modelis palmitino rūgštis (C16: 0) ir oleino rūgštis (C18: 1) (Sigma, Sent Luisas, MO) buvo ištirpintos izopropanolyje, norint gauti 20 arba 40 mM pradinio mišinio tirpalą (2: 1 oleatas: palmitatas), o nešiklio koncentracija galutinėse inkubacijose buvo 1%. Ląstelės buvo veikiamos 1 arba 2 mM laisvųjų riebalų rūgščių (FFA) 24 valandas.

Triciribino (API-2) ir MK-2206 Akt inhibitoriai buvo įsigyti iš „Selleck Chemicals“ ir ištirpinti DMSO. Ląstelės 24 valandas buvo apdorotos API-2 (20 μM) ir MK-2206 (10 μM).

Per didelis AKE2 ekspresija HepG2 ląstelėse ir pelės kepenyse

Norint per daug ekspresuoti ACE2 kepenyse, adenovirusas, koduojantis žiurkių ACE2 (rACE2), prieš sustiprinto žalio fluorescencinio baltymo (eGFP) reporterio geną (Ad-rACE2-eGFP) arba vien su eGFP virusu (Ad-eGFP), buvo įsigyti iš „SinoGenoMax“. (Pekinas, Kinija) ir buvo suleistos db / db pelėms (patinai, 5–7 savaičių amžiaus) per uodegos veną (5 × 10 8 dalelių formavimo vienetai (pfu), bendras tūris 100 μL 0, 9% masės / tūrio druskos tirpalo). Šeštąją dieną po viruso injekcijos buvo atlikti gliukozės tolerancijos testai (GTT). 7 dieną šeriami gyvūnai buvo paaukoti eksperimentinei analizei. Norint per daug ekspresuoti ACE2 HepG2 ląstelėse, HepG2 ląstelės 48 valandas buvo užkrėstos 1, 0 x 104 pfu Ad-ACE2 arba Ad-GFP.

Biocheminiai tyrimai

Trigliceridų, cholesterolio, aspartato aminotransferazių ir alanino aminotransferazių kiekis serume buvo išmatuotas naudojant fermentinius rinkinius (Biosino, Kinija), naudojant automatinį biocheminį analizatorių (Hitachi 7160, japonai). Ang II serume buvo matuojamas radioimunologiniu tyrimu (BEIJING SINO - JK BIOLOGINĖS TECHNOLOGIJOS INSTITUTAS, Kinija).

RNR ekstrahavimas ir kiekybinis realiojo laiko RT-PGR

Visa RNR buvo išskirta naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Iš viso 500ng RNR buvo panaudota kaip šablonas pirmosios grandinės cDNR sintezei naudojant „ReverTraAceqPCR RT Kit“ (TOYOBO, Osaka, Japonija) pagal gamintojo protokolą. Transkripcija buvo kiekybiškai įvertinta naudojant „Light Cycler 480Real-Time“ PGR sistemą (Roche, Bazelis, Šveicarija). Gruntai buvo sukurti naudojant „Primer Quest“ (Integrated DNA Technologies, Inc).

Histologinė analizė

Audinių mėginiai buvo fiksuojami 10% formaldehide 1 valandą 4 ° C temperatūroje, tada fiksuoti mėginiai buvo dehidratuoti ir įterpti į parafiną pagal standartinę procedūrą. Mėginiai buvo supjaustyti į 5 μm storio ir nudažyti aliejumi-raudonu-O, kad kauptųsi lipidai. Tada pjūviai buvo stebimi mikroskopu (200 ×) ir analizuojami keturiuose atsitiktiniuose laukuose / skaidrėse.

ROS lygių nustatymas

Dažiklis 2 ′, 7′-dichlorfluorescino diacetatas (DCF-DA) (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo., JAV) buvo naudojamas aptikti ląstelių ROS gamybą ląstelėse. Šio oksiduojančio elemento fluorescencija žymiai padidėja. Kultivuojamos HepG2 ląstelės buvo stimuliuojamos naudojant FFA (1 mM) su išankstiniu inkubavimu su Ang- (1–7) (10 nmol / L) arba A779 (1 μmol / L) arba be jo. Po 1 valandos 5 min. / DCF-DA tirpalas 40 min. Buvo pridėtas 37 ° C temperatūroje tamsoje. Ląstelės buvo plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS), tripsino pavidalu ir pakartotinai suspenduotos 1 ml PBS, o fluorescencijos intensyvumas buvo nedelsiant nuskaitytas naudojant FACScan srauto citometrą (Biosciences, San Chosė, CA, JAV), esant 500 nm. sužadinimui ir 530 nm bangos ilgiui.

Nilo raudonoji analizė

Nilo raudona yra puiki dėmė aptikti tarpląstelinius lipidų lašelius fluorescencine mikroskopija ar srauto citometrija. Fluorescencijos intensyvumas parodo lipidų lašelių skaičių ląstelėse. Palyginus su alyvai raudona O spalva, Nilo raudona O dažymas turi didesnį tikslumą, o Nilo raudonai O dažymas yra paprastesnis. Lipidų kiekis auginamose ląstelėse buvo įvertintas fluorometriškai, naudojant Nilo raudonumą. HepG2 ląstelės buvo pasėtos 3 × 105 ląstelių / duobutėje į 12 šulinėlių plokšteles ir po to apdorotos 10 nmol / L Ang- (1–7) arba 1 μmol / L A779, esant Nilo raudonajam tirpalui, kai galutinė koncentracija buvo 200 ng / ml PBS 30 minučių. Fluorescencijos intensyvumas buvo nedelsiant nuskaitytas naudojant FACScan srauto citometrą (Biosciences, San Chosė, CA, JAV), esant 488 nm sužadinimui ir 550 nm, kai spinduliuotė. Buvo surinkta 10 000 vienaląsčių įvykių duomenų. Siekiant atmesti klaidingą teigiamą rezultatą, gydymas vaistais, kai nebuvo Nilo raudonojo, buvo įvertintas kaip pagrindas. Duomenims analizuoti buvo naudojami santykiniai fluorescencijos intensyvumai atėmus foninius lygius.

Trifosfato (ATP) kiekio nustatymas

Kultivuojamos ląstelės lizuojamos lizės buferiu, pateiktu ATP-Lite Assay Kit (Vigorous Biotechnology Pekinas). Taip pat buvo surinkta auginamų ląstelių terpė ATP nustatyti. Tame pačiame mėginyje buvo išmatuotas ATP kiekis (nmol) ir normalizuotas pagal baltymų koncentraciją (nmol / mg) ir pateiktas kaip kontrolinės medžiagos procentinė dalis.

Vakarų botas

30–60 μg baltymų buvo atskirti 10% SDS-PAGE, pernešti į PVDF membranas (Millipore), užkimšti 5% neriebiu sausu pienu ir per naktį tirti antikūnais 4 ° C temperatūroje. Blotai buvo inkubuojami su HRP konjuguotu anti-IgG, po to aptikti su ECL (Santa Cruz). Antikūnai prieš naviko nekrozės faktorių (TNF) -α, monocitų chemotaktinį baltymą-1 (MCP-1), interleukiną-8 (IL-8) ir Akt - buvo įsigyti iš „Cell Signaling“. Acetil-CoA karboksilazė 44, sterinus reguliuojančius elementus jungiantis baltymas (SREBP) -1c, kepenų X receptorių α (LXRα), riebalų rūgščių sintazė (FAS), atsiejantis baltymas-2 (UCP-2), superoksido dismutazė (SOD) 2, glutationo peroksidazės (Gpx) 1, katalazės ir adiponektino 1 receptoriaus (AdipoR1) buvo gauti iš „Santa CruZ“.

Statistinė analizė

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. Duomenys prireikus buvo analizuojami naudojant Studento testą arba vienpusį ANOVA (naudojant Bonferroni post-hoc testus, kad būtų galima palyginti pakartojamas vertes). Statistiniai palyginimai buvo atlikti naudojant „Prism5“ („GraphPad Software“, San Diegas, CA). P vertės, mažesnės nei 0, 05, buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. Parodomi reprezentatyvūs mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatai, jei nenurodyta kitaip.

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį : Cao, X. et al. Angiotenziną konvertuojantis fermentas 2 / angiotenzinas (1-7) / Mas ašis suaktyvina Akt signalą, kad pagerėtų kepenų steatozė. Mokslas. Rep. 6, 21592; „doi“: 10.1038 / srep21592 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.