Antihipoksinis ginsenosido rbl poveikis naujagimių žiurkės kardiomiocitams yra susijęs su specifiniu gliukozės nešiklio-4 aktyvinimu ex vivo | acta pharmaologica sinica

Antihipoksinis ginsenosido rbl poveikis naujagimių žiurkės kardiomiocitams yra susijęs su specifiniu gliukozės nešiklio-4 aktyvinimu ex vivo | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti, ar Gs-Rbl palengvina naujagimių žiurkių kardiomiocitų CoCl 2 sukeltą apoptozę ir gliukozės nešiotojo-4 (GLUT-4) vaidmenį.

Metodai:

Gs-Rbl (0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L), adenino 9-β- D- arabinofuranozidas (ara A, 500 μmol / L; AMPK inhibitorius) ir wortmanninas (0, 5 μmol / L) ; PI3K inhibitorius), tik kartu su 200 μmol / L Gs-Rbl, buvo skiriami hipoksiniams kardiomiocitams, kuriuos 12 val. Sukėlė 500 μmol / L CoCl2. Tada apoptozinis greitis (AR), 2- [3H] -deoksi- D -gliukozės (2- [3H] -DG) įsisavinimas ir GLUT-4 (įskaitant plazmos membraną, PM), fosfo Tirti -AMPKα (Thr172), AMPKα ir Akt ląstelėse.

Rezultatai:

Palyginti su paprasta hipoksija (0 μmol / L Gs-Rbl), didesni nei 10 μmol / L Gs-Rb1 reikšmingai sumažino apoptozės greitį ( P <0, 01) ir reikšmingai padidino 2- [ 3 H] -DG įsisavinimą ( P <0, 01)., GLUT-4 kiekis ląstelėse ir PM ( P <0, 01), AMPK aktyvumas ( P <0, 01) ir Akt ( P <0, 01) lygis priklausomai nuo dozės. AMPK aktyvumas buvo visiškai slopinamas ara-A, kaip ir Akt buvo slopinamas wortmannino. AR, gliukozės įsisavinimą ir GLUT-4 lygį ląstelėse ir PM iš dalies sumažino ara-A arba wortmanninas.

Išvada:

Gs-Rb1 gali apsaugoti naujagimių žiurkių kardiomiocitus nuo CoCl2 sukeltos apoptozės. Antiapopotinis Gs-Rb1 poveikis gali pasireikšti pagerinant gliukozės įsisavinimą, kuriame pagrindinį vaidmenį atliko GLUT-4 translokacija ir ekspresija. Tiek AMPK, tiek PI3K / Akt keliai gali dalyvauti anti-hipoksinio Gs-Rb1 veiksmingume.

Įvadas

Miokardo išemija širdies raumenį stumia į energijos trūkumo būseną, kuri neatitinka kardiomiocitų energijos poreikio. Išemija ir hipoksija, jei jie neištaisomi, gali sukelti kardiomiocitų „užmigimą“, apoptozę ir net nekrozę. Hibernavusiam miokardui, prisitaikymui reaguojant į išemiją ir (arba) metabolinį pusiausvyros sutrikimą 1, 2, 3, 4, 5, 6, gali atsirasti būdingi ultrainfrastruktūriniai kardiomiocitų pokyčiai, tokie kaip miolizė ir vėlesnis glikogeno kaupimasis 3, 4, 5 miolitinėse vietose ., 6 . Nors kardiomiocitų „žiemos miegas“ ir apoptozė yra grįžtami, jie labai pakenks širdies funkcijai. Todėl kardiomiocitų antihipoksinio atsako pagerinimo metodas tapo svarbia širdies ir kraujagyslių tyrimų sritimi.

Kardiomiocituose išemijos ir hipoksijos metu gliukozė yra pagrindinis metabolizmo substratas. Jo palengvinamas įsisavinimas priklauso nuo gliukozės pernešėjų (GLUT) aktyvumo ląstelės paviršiuje, ypač nuo gliukozės pernešėjų-4 (GLUT-4) 7, 8 . Gliukozės sunaudojimo padidėjimas daugiausia priklauso nuo GLUT-4 perkėlimo per AMP aktyvuotą baltymų kinazę (AMPK) 9, 10, 11, fosfatidilinozitol-3 kinazę (PI3K) 12, 13 ir kt . Padidėjęs gliukozės sunaudojimas suteikia substrato glikolizei ir iš dalies kompensuoja energijos deficitą.

Ginsenoside Rbl (Gs-Rbl), kuris yra pagrindinis ženšenis, išgaunamas iš ženšenio ( Panax ženšenio šaknis CA Meyer, Araliaceae šeimos) kaip tradicinė Azijos šalių medicina, sudėtyje yra aglikonas su dammarano skeletu ir buvo pranešta parodyti įvairius biologinius veiksmus, atsirandančius dėl išeminės reperfuzijos sužeidimo miokardo infarkto metu 14, 15, 16 . Tačiau yra nedaug pranešimų apie tai, ar Gs-Rbl gali užkirsti kelią hipoksinių kardiomiocitų apoptozei ir mirčiai. Taigi mes ištyrėme, ar ir kaip Gs-Rbl atleidžia naujagimių žiurkių kardiomiocitų hipoksijos sukeltą apoptozę ex vivo ( ty kokį vaidmenį šiame tyrime vaidina gliukozės įsisavinimas, GLUT-4 translokacija ir kt.) , Kaip Gs-Rbl pagrįstą apsaugą nuo hipoksijos? .

medžiagos ir metodai

Šis tyrimas buvo įgyvendintas pagal Kinijos medicinos universiteto gyvūnų globos institucines gaires ir patvirtintas vietinio gyvūnų tyrimų komiteto.

Kardiomiocitų kultūra

1–3 dienų amžiaus „Wistar“ žiurkių skilveliai [SCXK (Liao) 2003–0009, tiekiama Kinijos medicinos universiteto laboratorinių gyvūnų centro] buvo sumalti ir paeiliui suvirškinti fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS), kuriame yra 0, 08% tripsino ir 0, 05% kolagenazės II („Gibco“ įmonė) 37 ° C temperatūroje 10 min., Steriliomis sąlygomis; procedūra buvo pakartota du ar tris kartus po ląstelių suspensijos surinkimo. Ląstelių suspensija buvo centrifuguota (100 × g , 10 min.), O tada ląstelės buvo suspenduotos Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje (DMEM) (Gibco), papildytame 10% vaisiaus galvijo serumo (FBS) (Gibco) ir 0, 1 mmol / L bromodeoksiuridinu ( siekiant užkirsti kelią ne miokardo ląstelių dauginimuisi) ir inkubuojamos 100 ml kultūros induose (37 ° C, 5% CO 2, 95% oro; NuAire 8000 Autoflow CO 2 inkubatorius; Thermo Electron Corporation, Franklin, MA) 90 min., kad būtų pašalinti fibroblastai. . Kardiomiocitai buvo atskirti pagal skirtingą adhezijos laiką, kaip aprašyta anksčiau. Neprijungtos ląstelės (daugiausia kardiomiocitai) buvo pasėtos į kultivavimo kolbas, kurių tankis buvo 1, 0 × 105 ląstelių / ml, ir po to buvo inkubuojamos 3 dienas, prieš pradedant naudoti eksperimentams. Apie 85–95% ląstelių buvo identifikuotos kaip kardiomiocitai, nustatant imunocitocheminį dažymą monokloniniu antisarkomeriniu aktino klonu AC40-CY3 (Sigma).

KoCl 2 sukelta hipoksija ir Gs-Rb1 intervencija

Pagal ankstesnį tyrimą 17 ir mūsų išankstinius eksperimentus su CoCl 2 sukelta hipoksija, 500 μmol / l CoCl2 buvo paruošti švieži kultūrinėje terpėje. Po 500 μmol / L CoCl2 intervencijos kardiomiocitai buvo inkubuojami L-DMEM, papildytame 10% FBS ir skirtingomis šviežio Gs-Rb1 koncentracijomis (0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L) 12 h. Be to, 12 val. Buvo skiriami 9-β- D- arabinofuranozidas (ara A, 500 μmol / L; AMPK inhibitorius) ir wortmanninas (0, 5 μmol / L; PI3K inhibitorius), esant 200 μmol / L Gs-Rb1. .

Kardiomiocitų apoptozės srauto citometrinė analizė

Aukščiau aprašytos ląstelės buvo sureguliuotos iki 1, 0 × 106 / ml kiekviename mėginyje ir po to analizuojamos srauto citometrija (FCM) pagal „Annexin V“ FITC / PI rinkinį („Boehringer Mannheim Biological Technology Ltd“). Trumpai tariant, kardiomiocitai buvo surinkti, du kartus plauti šaltu PBS ir po to pritvirtinti 70% etanoliu 4 ° C temperatūroje 12 valandų. Po du kartus plaunamo šaltu PBS, fiksuotos ląstelės buvo suspenduotos PBS, turinčiame RNazę A (1 mg / ml, Sigma-Aldrich), 37 ° C temperatūroje 30 minučių ir centrifuguojamos (1000 x g 5 minutes). Tada ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos PBS, turinčioje V priedo FITC / PI (50 μg / ml), ir dažytos tamsoje 30 min. Sužadinimui buvo naudojamas 488 nm bangos ilgis; dažnių juostos filtru, kurio bangos ilgis 515 nm, nustatyta FITC fluorescencija, o dažnių juostos filtru, kurio bangos ilgis 560 nm, aptikta PI fluorescencija. Daugiau kaip 99% nespecifinio valdymo vamzdžio fluorescencijos buvo priskirti fone ir parodyti 2D taško grotelių žemėlapyje. Dvigubo dispersijos sklaidos diagramoje kairysis apatinis kvadrantas vaizdavo gyvas ląsteles (FITC - / PI - ), dešinysis žemesnis kvadrantas - apoptozines ląsteles (FITC + / PI - ), o dešinysis aukštesnis kvadrantas reprezentavo nekrozės ląsteles (FITC + / PI + ). Duomenys buvo gauti naudojant FACSCalibur (Becton Dickinson) ir išanalizuoti naudojant ModFit LT 3.0 programinę įrangą (Variety Software House).

2- [3H] -deoksi- D -gliukozės įsisavinimas

Kardiomiocitų suspensijos (1, 0 x 105 / ml, 2 ml kiekvienam mėginiui) buvo tris kartus plaunamos 0, 5 ml PBS ir po to nedelsiant supilamos į 0, 5 ml PBS, kuriame yra 2 mmol / L gliukozės, ir nedideli kiekiai (1 μCi / ml) 2-. [3H] deoksi- D -gliukozė (2- [3H] -DG, Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL) 15 minučių 37 ° C temperatūroje. Tada ląstelės keturis kartus plaunamos 0, 5 ml šalto PBS ir po to perkeliamos į skaičiavimo buteliukus su 3, 5 ml scintiliacijos skysčio. Tricarb scintiliacijos skaitiklio 3H langelyje buvo suskaičiuoti 2- [3H] -DG, tada nustatytas gliukozės sunaudojimas (pmol / mg baltymo per 10 min.). Grynasis savitasis įsisavinimas buvo apskaičiuotas kaip skirtumas tarp suminės ir nespecifinės vertės, kuris buvo nustatytas esant D -gliukozės pertekliui (100 mmol / L).

Plazminės membranos paruošimas GLUT-4 translokacijos tyrimui

Kardiomiocitai buvo plaunami (kaip nurodyta aukščiau), 5 minutes centrifuguojami 600 x g greičiu ir po to homogenizuojami buferiniame tirpale A su proteazės inhibitoriais (ląstelių frakcijos rinkinys; Biovision, Mountain View, CA) 50 min. Po 15 minučių centrifugavimo esant 20 000 x g , granulės buvo pakartotinai suspenduotos ir centrifuguotos esant 110 000 x g 60 minučių linijiniam sacharozės gradientui, kurio tankis buvo nuo 1, 05 iki 1, 25 g / ml, kad būtų galima išskirti plazmos membraną (KD)., kurie tiriami dėl GLUT-4 baltymo. Visi centrifugavimai buvo atlikti 4 ° C temperatūroje.

Imunocitochemija

Dangtelio dangteliai buvo pašalinti iš kultūros indų ir tris kartus plaunami PBS 5 minutes per skalavimą; tada dangtelių dangteliai buvo fiksuojami PBS (pH 7, 2) su 4% paraformaldehidu (PFA) 20 minučių 4 ° C temperatūroje ir du kartus plaunami PBS 15 minučių per skalavimą. Pagal GLUT-4 (Sigma) ir Akt (Sigma) rinkinių instrukcijas pirminiai antikūnai prieš GLUT-4 (1: 200) ir Akt (1: 200) buvo inkubuojami per naktį kambario temperatūroje (su neigiama kontrole buvo PBS) ), ir atitinkamai buvo naudojami antriniai antikūnai (ožkos anti-triušio lgG), konjuguoti su HRP arba Cy3 (Invitrogen). Ląstelės buvo fotografuojamos. Buff spalvos arba raudoni fluorescenciniai grūdai ant ląstelės membranos ir (arba) citoplazmoje leido manyti, kad ląstelės buvo teigiamos; kitaip manėme, kad ląstelės buvo neigiamos.

Vakarų pūtimas

Kardiomiocitai (1, 0 × 107), naudojami Western blotinimui, buvo nedelsiant užšaldyti skystame azote ir iki naudojimo laikomi –80 ° C temperatūroje. Visas baltymas buvo ekstrahuotas ledinio lizės buferiu ir centrifuguojamas (4 ° C, 12 000 x g , 10 min.). Baltymas (20 μl mėginyje) buvo paveiktas 12% natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze ir perkeltas į polivinilideno difluorido membranas. Membranos užplikytos pirminiais triušių anti-žiurkių antikūnais prieš GLUT-4 (1: 1000), fosfo-AMPKa (Thr172, p-AMPKα), AMPKα, Akt (1: 1000) ir β-aktinu (1: 1000). Po inkubacijos per naktį 4 ° C temperatūroje, blotai buvo plaunami TTBS 30 minučių ir inkubuojami HRP konjuguotame antriniame antikūnu (ožkos anti-triušio IgG, 1: 2000); juostos buvo vizualizuotos naudojant chemiliuminescenciją (Pierce, Rockford, IL). Visi aukščiau išvardyti pirminiai antikūnai buvo įsigyti iš „Santa Cruz Biotechnology“. Atitinkamas juostos intensyvumas buvo išmatuotas normalizavus β-aktino baltymo kiekį.

AMPK aktyvumo tyrimas

AMPK aktyvumas buvo matuojamas, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, tiek fosfo-AMPKα (Thr172), tiek AMPKα buvo įgyti Western blot būdu. AMPK aktyvumas buvo išreikštas kaip p-AMPK santykis su visu AMPK kiekiu ( ty apibrėžtas kaip optimalus p-AMPKα ir AMPKα santykis).

Duomenų analizė

Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. Visi šio tyrimo duomenys pateikti kaip vidurkis ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA). P reikšmės <0, 05 buvo laikomos reikšmingomis.

Rezultatai

Antiapopotinis Gs-Rb1 poveikis hipoksiniams kardiomiocitams

Kadangi pavienių teigiamų (FITC + / PI - ) populiacijos laikomos ankstyvomis apoptozinėmis arba nekrotinėmis ląstelėmis, tuo tarpu dvigubai teigiamos (FITC + / PI + ) ląstelės egzistuoja vėlyvoje apoptozės stadijoje, tiek FITC + / PI -, tiek FITC + / PI + ląstelės buvo klasifikuojamos kaip apoptozinės ląstelės. Gydant Gs-Rb1 visomis koncentracijomis, išskyrus 10 μmol / L ( P = 0, 057), CoCl 2 sukeltų hipoksinių kardiomiocitų apoptozės santykis reikšmingai sumažėjo, palyginti su 0 μmol / L ( P <0, 001). Be to, buvo reikšmingas nuo dozės priklausomas atsakas nuo 50–200 μmol / L ( P <0, 05); šis atsakas nebebuvo matomas esant didesnei kaip 200 μmol / L koncentracijai ( P > 0, 05). Atsižvelgiant į aukščiau pateiktus rezultatus, 200 μmol / L Gs-Rb1 gali būti optimali koncentracija, ir šie bandymai buvo pagrįsti šia koncentracija (1 paveikslas).

Image

Antiapopotinis Gs-Rb1 poveikis hipoksiniams kardiomiocitams, sukeltas 500 μmol / L CoCl2 ex vivo . Skaičiai 1, 2, 3, 4, 5, 6 ir 7 X ašyje parodo Gs-Rb1 koncentraciją, kurioje ląstelės buvo inkubuojamos 12 h ( ty 0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L). Skaičius 8 yra 500 μmol / L ara A, o skaičius 9 - 0, 5 μmol / L wortmannino, kurie abu buvo dedami į ląsteles, apdorotas 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 500 μmol / L CoCl2. Apoptozinis santykis (įskaitant ir FITC + / PI - ir FITC + / PI + ląsteles) kiekvienoje grupėje buvo 41, 7% ± 5, 44%, 40, 9% ± 3, 91%, 32, 1% ± 4, 13%, 24, 3% ± 2, 84%, 16, 7% ±. 1, 41%, 16, 3% ± 5, 19%, 15, 1% ± 4, 67%, 32, 9% ± 4, 84%, 38, 4% ± 3, 49%. n = 3 visoms grupėms.

Visas dydis

Gs-Rb1 poveikis gliukozės pasisavinimui (2 paveikslas)

Image

Hipoksinių kardiomiocitų, apdorotų skirtingomis Gs-Rb1 koncentracijomis , gliukozės kiekis in vitro . Skaičiai 1, 2, 3, 4, 5, 6 ir 7 X ašyje nurodo Gs-Rb1 inkubacijos koncentraciją 12 h (ty 0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500). μmol / L). Skaičius 8 yra 500 μmol / L ara A, pagrįstas 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 500 μmol / L CoCl 2, o skaičius 9 - 0, 5 μmol / L wortmannino, pagrįsto 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 500 μmol / L CoCl. 2 . Kardiomiocitų vidutinis ± SD gliukozės sunaudojimas (pmol / mg baltymo per 10 min. Inkubacijos) buvo 5, 263 ± 0, 064, 5, 277 ± 0, 107, 9, 070 ± 0, 131, 9, 890 ± 0, 197, 11, 900 ± 0, 200, 15, 933 ± 0, 153, 16, 033 ± 0, 306, 9, 971 ±. Atitinkamai 0, 419 ir 10, 829 ± 0, 607. n = 3 visoms grupėms.

Visas dydis

Kardiomiocitų įsisavinimas 2- [3H] -DG po CoCl 2 sukeltos hipoksijos reikšmingai padidėjo iki 1, 72 ± 0, 24 karto, 1, 88 ± 0, 17 karto, 2, 26 ± 0, 86 karto, 3, 02 ± 0, 21 karto ir 3, 04 ± 0, 34. - apdorojus 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L Gs-Rbl, palyginti su hipoksija ( P <0, 01); reikšmingų pokyčių nepastebėta vartojant 10 μmol / L Gs-Rbl ( P = 0, 85). Pastebėtas reikšmingas nuo dozės priklausomas padidėjimas nuo 50–400 μmol / L; reikšmingo skirtumo tarp 400 ir 500 μmol / L ( P = 0, 315) nepastebėta. Norėdami nustatyti koreliaciją tarp gliukozės įsisavinimo ir ląstelių apoptozės, mes nustatėme stiprią neigiamą koreliaciją ( r = -0, 57, P = 0, 002), kuri leido manyti, kad Gs-Rb1 gali užkirsti kelią hipoksinėms kardiomiocitams atlikti apoptozę pagerindamas gliukozės įsisavinimą.

Stimuliatorių poveikis GLUT-4 baltymų lygiui

Nepaisant hipoksijos ar Gs-Rb1 intervencijos, GLUT-4 baltymas buvo ekspresuojamas ant ląstelių membranų ir (arba) kardiomiocitų citoplazmos (3 paveikslas). Norėdami atsižvelgti į GLUT-4 raiškos modelius ląstelėse ir PM, mes įvertinome tai gydytuose kardiomiocituose. Kaip parodyta 4 paveiksle, GLUT-4 baltymų kiekis ląstelėse buvo žymiai padidintas iki 1, 54 ± 0, 11 karto 50 μmol / L, 2, 29 ± 0, 20 karto 100 μmol / L, 2, 49 ± 0, 19 karto 200 μmol. / L, 2, 50 ± 0, 14 karto, esant 400 μmol / L, ir 2, 49 ± 0, 23 karto, esant 500 μmol / L, kai buvo taikomas Gs-Rb1 (10 μmol / L neturėjo jokio poveikio, P = 0, 148), palyginti su hipoksija. Buvo reikšmingas nuo dozės priklausomas padidėjimas nuo 50 iki 200 μmol / L Gs-Rb1. Panašiai kaip GLUT-4 baltymų kiekis ląstelėse, Gs-Rb1 paskatino GLUT-4 ekspresiją iki 1, 66 ± 0, 10- (50 μmol / L), 1, 84 ± 0, 07 (100 μmol / L), 2, 01 ± 0, 14 (200 μmol). / L), 2, 07 ± 0, 13- (400 μmol / L) ir 2, 05 ± 0, 22 karto (500 μmol / L) padidėja ( P <0, 001) dėl hipoksijos PM (išskyrus 10 μmol / L, P = 0, 899); šis poveikis taip pat priklausė nuo dozės - nuo 50 iki 200 μmol / L, tik nedideli skirtumai, kai dozės buvo didesnės nei 200 μmol / L ( P > 0, 05).

Image

GLUT-4 ir Akt raiška hipoksiniuose kardiomiocituose. A: GLUT-4 imunocitochemija (400 ×); ant ląstelių plazminės membranos ir (arba) citoplazmos atsiranda bufolo spalvos, kas rodo, kad šios ląstelės buvo teigiamos. B: fluorescencinė Akt (200 ×) imunocitochemija; raudoni fluorescenciniai grūdai ant ląstelių plazmos membranos ir (arba) citoplazmoje leido manyti, kad jie buvo teigiami. a: 500 μmol / L CoCl2 sukeltos hipoksijos be Gs-Rb1 inkubacijos 12 val .; b: 200 μmol / L Gs-Rb1 inkubacija po hipoksijos, sukeltos 500 μmol / L CoCl2.

Visas dydis

Image

GLUT-4 turinio išraiška kardiomiocitų ląstelėse (C) ir ląstelių plazmos membranose (PM), naudojant Western blot analizę. A rodo reprezentacinį Western blot, o B - jo poligramą. 1 juosta: 0 μmol / L Gs-Rb1, 2: 10 μmol / L Gs-Rb1, 3: 50 μmol / L Gs-Rb1, 4: 100 μmol / L Gs-Rb1, 5: 200 μmol / L Gs-Rb1, 6: 400 μmol / L Gs-Rb1, 7: 500 μmol / L Gs-Rb1, 8: 500 μmol / L ara A + 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 9: 0, 5 μmol / L wortmannin +200 μmol / L Gs-Rb1; visose juostose yra 200 μmol / L CoCl 2 . β-aktinas tarnavo kaip vidinė kontrolė. n = 3 visoms grupėms.

Visas dydis

Gs-Rb1 poveikis AMPK aktyvumui

Kardiomiocitai išreiškė labai mažą AMPK aktyvumą reaguodami į 500 μmol / L CoCl 2 sukeltą hipoksiją. Palyginti su hipoksija, Gs-Rb1 reikšmingai padidino AMPK aktyvumą ( P <0, 01) 1, 93 ± 0, 13– (50 μmol / L), 3, 30 ± 0, 29– (100 μmol / L), 3, 61 ± 0, 34– (200 μmol / L), 3, 90 ± 0, 26- (400 μmol / L) ir 3, 87 ± 0, 12 karto (500 μmol / L), išskyrus Gs-Rb1 10 μmol / L (1, 02 ± 0, 15 karto, P = 0, 501) (5 ir 6 paveikslai). Atsižvelgiant į gliukozės įsisavinimą ir GLUT-4 ekspresiją, reikšmingas AMPK aktyvumo padidėjimas nuo dozės priklausė nuo 50 iki 200 μmol / L ( P <0, 01), o reikšmingo skirtumo tarp 400 ir 500 μmol / L Gs-Rb1 ( P = 0, 573). Norėdami dar labiau išsiaiškinti, ar AMPK aktyvumas sąlygojo aukščiau paminėtą Gs-Rb1 vaidmenį CoCl 2 sukeltoje hipoksijoje, buvo paskirtas ara-A, konkurencinis AMPK inhibitorius. Kardiomiocitai buvo atsitiktine tvarka suskirstyti į ara-A grupę (inkubuojami 12 valandų kartu su 500 μmol / L CoCl2, 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 500 μmol / L ara-A) arba ne ara-A grupė (inkubuojami sinchroniškai 12 h su 500 μmol / L CoCl2 ir 200 μmol / L Gs-Rb1). AMPK aktyvumas buvo visiškai slopinamas (6 paveikslas), GLUT-4 translokacija ir ekspresija (4B paveikslas) bei gliukozės įsisavinimas (2 paveikslas) buvo žymiai sumažintas, o apoptozės santykis (1 paveikslas) buvo aukščiau sureguliuotas, kai ara-A grupė buvo palyginta su ne ara-A grupe.

Image

p-AMPKα (Thr172), AMPKα ir Akt (Ser473) ekspresijos lygiai kardiomiocituose, naudojant Western blot analizę. 1, 2, 3, 4, 5, 6 ir 7 juostos žymi 0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L Gs-Rb1. 8 juostoje juostos p-AMPKα (Thr172) ir AMPKα buvo apdorotos 500 μmol / L ara-A ir 200 μmol / L Gs-Rb1; Akt juosta 8 juostoje buvo apdorota 0, 5 μmol / L wortmannino ir 200 μmol / L Gs-Rb1. Visos juostos 12 val. Buvo gydomos 200 μmol / l CoCl2. n = 3 visoms grupėms.

Visas dydis

Image

Gs-Rb1 poveikis AMPK aktyvumui kardiomiocituose. 1, 2, 3, 4, 5, 6 ir 7 vaizdavo 0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L Gs-Rb1 inkubaciją, pagrįstą 200 μmol / L CoCl2 12 valandų. Skaičius 8 atstovavo 500 μmol / L ara-A, remiantis 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 200 μmol / L CoCl 2 kartu. n = 3 visoms grupėms.

Visas dydis

Stimuliatorių poveikis Akt baltymų lygiui

Norėdami išsiaiškinti PI3K / Akt kelio vaidmenį per kardiomiocitų apsaugą nuo apoptozės Gs-Rb1, mes toliau tyrėme, ar Gs-Rb1 skatino Akt raišką ir ar Wortmanninas gali slopinti Gs-Rb1 poveikį. Ląstelės buvo atsitiktine tvarka suskirstytos į wortmannino grupę (inkubuojamos kartu su 500 μmol / L CoCl 2, 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 0, 5 μmol / L wortmannin 12 valandų) arba ne wortmannin grupei (inkubuojamos kartu su 500 μmol / L CoCl). 2 ir 200 μmol / L Gs-Rb1 12 h). Kaip parodyta 5 ir 7 paveiksluose, stimuliacija Gs-Rb1 sukuria 1, 05 ± 0, 24– (50 μmol / L), 1, 21 ± 0, 19– (100 μmol / L), 1, 27 ± 0, 17– (200 μmol / L), 1, 26 ±. Akt (0, 1–4) (400 μmol / L) ir 1, 27 ± 0, 09 karto (500 μmol / L) padidėjimas (išskyrus Gs-Rb1 10 μmol / L, P = 0, 714), palyginti su hipoksija, reikšmingu, priklausomai nuo dozės, nuo 50 iki 400 μmol / L. Wortmanninas visiškai slopino Gs-Rb1 tarpininkaujamą Akt ekspresiją ( P <0, 01, 5 ir 7 pav.) Ir iš dalies kontroliavo GLUT-4 (4B paveikslas) perkėlimą ir ekspresiją bei gliukozės įsisavinimą (2 paveikslas) ir aukščiau reguliavo apoptozę. santykis (1 paveikslas).

Image

Gs-Rb1 poveikis Akt ekspresijai kardiomiocituose. Skaičiai 1, 2, 3, 4, 5, 6 ir 7 žymi 0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L Gs-Rb1 inkubaciją, pagrįstą 200 μmol / L CoCl2 12 h. Skaičius 8 reiškia 0, 5 μmol / L wortmannino, remiantis 200 μmol / L Gs-Rb1 ir 200 μmol / L CoCl2. n = 3 visoms grupėms.

Visas dydis

Diskusija

Kadangi hipoksija, patologinė būsena, gali sukelti kardiomiocitų apoptozę, kuri yra svarbus ląstelių žūties būdas sergant įvairiomis širdies ligomis, daugelis širdies ir kraujagyslių srities mokslininkų pasiryžo pagerinti kardiomiocitų antihipoksinį pajėgumą. Nors ženšenis dažnai naudojamas kaip žaliava, geriama daugelyje šalių, jo pagrindinis komponentas Gs-Rb1 vaidina svarbų vaidmenį gerinant išeminę reperfuzijos žalą 14, 15, 16 ; tačiau anti-hipoksinis Gs-Rb1 poveikis buvo retai analizuojamas. Kadangi nebuvo pranešta apie veiksmingą Gs-Rb1 dozę, mes išbandėme skirtingas Gs-Rb1 koncentracijas (0, 10, 50, 100, 200, 400 ir 500 μmol / L) ir nustatėme, kad Gs-Rb1 gali reikšmingai sumažėti apCot2 sukelto hipoksinių kardiomiocitų apoptozinis santykis. Iš tirtų dozių optimali antihipoksinė koncentracija gali būti 200 μmol / L Gs-Rb1. Mūsų duomenys rodo, kad Gs-Rb1 gali veiksmingai apsaugoti hipoksinius kardiomiocitus nuo apoptozės in vitro . Norėdami geriau suprasti, kaip Gs-Rb1 daro savo antiapoptozinį poveikį, tarp kitų galimų mechanizmų mes ištyrėme gliukozės įsisavinimą ir GLUT-4.

Vyraujantis širdies energijos metabolizmo substratas išemijos / hipoksijos metu yra gliukozė; todėl padidėjęs gliukozės sunaudojimas gali užkirsti kelią kardiomiocitų apoptozei, kai jie yra hipoksiniai. Ląstelių apdorojimas 500 μmol / L CoCl 2 žymiai padidina apoptozinį santykį ir slopina gliukozės įsisavinimą; taigi, Gs-Rb1 ex vivo buvo paskirtas hipoksiniams kardiomiocitams (sukeltiems 500 μmol / l CoCl2), kad būtų galima nustatyti tiek Gs-Rb1 veiksmingumą, tiek mechanizmą. Mūsų rezultatai, kuriuose Gs-Rb1 reikšmingai padidino gliukozės sunaudojimą priklausomai nuo dozės, palyginti su hipoksinėmis ląstelėmis, ir tarp gliukozės įsisavinimo bei apoptozės egzistavo stipri neigiama koreliacija, rodo, kad Gs-Rb1 gali užkirsti kelią hipoksinių kardiomiocitų apoptozei. pagerėjęs gliukozės pasisavinimas.

Gliukozė į kardiomiocitus patenka palengvinant transportavimą - procesą, kurį daugiausia skatina GLUT-4 baltymai 7, 8 . Ilgalaikis gliukozės sunaudojimo padidėjimas kardiomiocituose daugiausia priklausė nuo GLUT-4 translokacijos ir išraiškos, o ypač svarbu, kad translokacija ( ty , konstituciškai gyvenanti ląstelės paviršiuje, siekiant optimizuoti ląstelių tarpląstelinės gliukozės poveikį 18) . Esant fiziologinei ląstelių būklei, GLUT-4 randamas ląstelių membranose ir tarpląsteliniame skyriuje; kai ląstelė patiria stresą, tokį kaip hipoksija 19, išemija 20 ir kt . 21, 22, 23, GLUT-4 gali būti greitai perkeltas į ląstelės paviršių, kad ląstelė galėtų laikinai padidinti savo prieigą prie tarpląstelinės gliukozės 24, 25 . Išeminė širdis apsaugo širdies gliukozės pasisavinimą ir glikolizę 26, o gliukozės nešiklio trūkumas sumažina išeminę toleranciją 27 . Šiame tyrime mes parodėme, kad GLUT-4 buvo ekspresuojamas aukštesniame lygyje ir lengvai keičiamasi su ląstelės paviršiumi ir, tikėtina, endosomomis hipoksiniuose kardiomiocituose po ekspozicijos Gs-Rb1. Taigi tikėtina, kad tiek GLUT-4 translokacija, tiek ekspresija vaidina pagrindinį vaidmenį Gs-Rb1 sukeltoje, nuolatinėje, padidėjusioje gliukozės koncentracijoje hipoksiniuose kardiomiocituose.

Didėjantis in vivo 28, 29, 30, 31 ir in vitro 32 tyrimų skaičius rodo, kad AMPK aktyvacija gali tiesiogiai reguliuoti GLUT-4 raišką 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ir sukelti reikšmingą padidėjimą. gliukozės pasisavinimas 9, 10, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 kultivuojamose skeleto raumenų ląstelėse. Kardiomiocituose hipoksija gali padidinti AMPK sukelto gliukozės įsisavinimą ir GLUT-4 translokaciją 35, o to nepakanka, kad padidėtų gliukozės įsisavinimas 36 . Šiame tyrime Gs-Rb1 reikšmingai padidino AMPK aktyvumą priklausomai nuo dozės iki ribinės koncentracijos. AMPK fosforilinimą gali reguliuoti jo fiziologiniai reguliatoriai, įskaitant priešakines kinazes (nuo Ca 2+ / nuo kalmodulino priklausomos baltymų kinazės kinazės) ir LKB1 bei ląstelių AMP / ATP santykį. Reikia išsiaiškinti, ar šie reguliuotojai taip pat įtakojo Gs-Rb1 veiksmingumą AMPK aktyvumui. Norėdami toliau nustatyti AMPK vaidmenį Gs-Rb1 antihipoksijoje, šiame tyrime taip pat buvo naudojamas ara-A (konkurencinis AMPK inhibitorius). Rezultatai parodė, kad AMPK aktyvumas buvo visiškai slopinamas, iš dalies buvo slopinamas tiek gliukozės įsisavinimas, tiek GLUT-4 translokacija (įskaitant išraišką), o apoptozinis santykis buvo padidintas ara-A. Šie duomenys rodo, kad Gs-Rb1 gali apsaugoti kardiomiocitus nuo apoptozės kitais, be AMPK, mechanizmais. Apibendrinant galima pasakyti, kad AMPK aktyvumas buvo svarbus Gs-Rb1 antihipoksinio poveikio kardiomiocitui reguliatorius, kuris gali būti signalizacijos kaskados dalis, pavyzdžiui, suaktyvėja ir miokardo gliukozės įsisavinimas, ir glikolizė, po to padidėja riebalų rūgščių oksidacija.

Šiame tyrime, kaip Gs-Rb1 apsaugo kardiomiocitus nuo apoptozės, mes nustatėme, kad Gs-Rb1 taip pat gali reikšmingai sureguliuoti Akt raišką ir kad ši išraiška buvo visiškai panaikinta atliekant išankstinį inkubavimą su wortmanninu, konkuruojančiu fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) inhibitoriumi. veikla. Taigi paaiškėjo, kad PI3K aktyvumas buvo būtinas Gs-Rb1 Akt sąlygojamam poveikiui. Akt, serino / treonino kinazė, veikianti pasroviui nuo PI3K, aktyvuojama dvigubu mechanizmu, apimančiu fosfatidilinozitolio 3, 4, 5-trifosfato (PIP 3 ) 37 prisijungimą prie Akt PH domeno 38, taip pat fosforilinant bet kurio fosfatidilinozitolio. 3, 4-bisfosfatas (PIP 2 ) arba serinas / treoninas, kurį sukūrė viena ar daugiau Akt kinazių. Gali būti, kad PI3K kelias yra pagrindinis pasroviui esantis Gs-Rb1 kelias. Daugybė tyrimų parodė, kad PI3K / Akt gali būti reikalingas GLUT-4 12, 13, 39, 40 perkėlimui ir gliukozės įsisavinimui. Remiantis šiais duomenimis, dabartiniai rezultatai, kuriuose Gort-Rb1 poveikį iš dalies slopino wortmanninas be Akt aktyvacijos, parodė, kad PI3K iš dalies atsakingas už Gs-Rb1 veiksmingumą. Be to, PI3K taip pat fosforilina insulino receptoriaus substratą-1 (IRS-1), kuris yra šio aktyvumo 41, 42 substratas in vitro , ir pasižymi tiek lipidų, tiek baltymų kinazės aktyvumu - visa tai gali vaidinti svarbų vaidmenį veikiant Gs-Rb1. Mechanizme, per kurį Gs-Rb1 apsaugo kardiomiocitus nuo apoptozės, svarbu nustatyti, ar PI3K gali paveikti Gs-Rb1 keliais šalia Akt. Trumpai tariant, Gs-Rb1 gali leisti kardiomiocitams išgyventi hipoksinėmis sąlygomis, suaktyvinus Akt kaip nuo PI3K priklausomą GLUT-4 translokacijos priešakyje aktyvatorių.

Pusiausvyra tarp anti-apoptotinių ir proapoptozinių baltymų 43, 44, citochromo c išsiskyrimas iš mitochondrijų, kaspazės aktyvacija ir baltymų kinazės C izozimų aktyvinimas gali sumažinti miokardo apoptozę. Vis dar turi būti įrodyta, ar Gs-Rb1 sumažina proapopotinį Bax, ar padidėja anti-apoptotiniai Bcl-2 baltymai, dėl to pasikeičia Bcl-2 / Bax santykis, susilpnėja citochromo c išsiskyrimas iš mitochondrijų ar slopinamas kaspazės aktyvumas.

Apibendrinant, mūsų išvadose yra tiesioginių įrodymų, patvirtinančių Gs-Rb1 vaidmenį saugant hipoksinius kardiomiocitus nuo apoptozės. Be to, stimuliuojant GLUT-4 translokaciją ir gliukozės transportavimo aktyvumą bei hipoksijos sukeltos apoptozės slopinimo nebuvimu, kurį sukelia arba ara-A, arba wortmanninas, galima teigti, kad Gs-Rb1 poveikis gali būti keliais keliais, be AMPK ir PI3K. Nepaisant to, šie rezultatai rodo, kad tiek AMPK, tiek PI3K vaidino svarbų vaidmenį nustatant bendrą gliukozės sunaudojimą. Tačiau norint nustatyti tikslų Gs-Rb1 mechanizmą tarpininkaujant šiam veiksmingumui, reikės būsimų eksperimentų.

Autoriaus indėlis

Hong-Liang KONG sukurti tyrimai; Hong-liang KONG ir Jian-ping WANG atliko tyrimus; Hong-liang KONG, Zhan-quan LI ir Shu-mei ZHAO pateikė naujas analitines priemones ir reagentus; Hong-Liang KONG ir Jing DONG analizuoti duomenys; Straipsnį parašė Hong-liang KONG, Shu-mei ZHAO ir Wei-wei ZHANG.