Priešuždegiminės shikonino savybės prisideda prie geresnės ankstyvosios stadijos diabetinės retinopatijos | mokslinės ataskaitos

Priešuždegiminės shikonino savybės prisideda prie geresnės ankstyvosios stadijos diabetinės retinopatijos | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Akių ligos
  • Farmakologija

Anotacija

Diabetinė retinopatija (DR), pagrindinė mikrovaskulinė diabeto komplikacija, sukelia tinklainės kraujagyslių nutekėjimą, neuronų disfunkciją ir tinklainės apoptozę. Šiame tyrime mes sujungėme STZ su viso kūno hipoksija (10% O 2 ), kad C57BL / 6 pelėms būtų galima greičiau sukelti ankstyvos stadijos retinopatiją. Taip pat palyginome didelės gliukozės būklės, kartu su hipoksija (1% O 2 ), poveikį su maža gliukozės koncentracija, naudojant tinklainės pigmento epitelio (RPE) ląsteles, kurios yra esminis išorinio kraujo-tinklainės barjero komponentas, o pažeidimas yra susijusios su retinopatija. DM / hipoksinių C57BL / 6 pelių tinklainėje buvo rastas nenormalus a ir b bangų aktyvumas, gelsvai baltos dėmės, hiperfluorescencija ir sumažėjęs tinklainės storis, naudojant elektroretinografiją (ERG), fotojuostos fotografavimą (FP), pamato fluoresceino angiografiją. (FFA) ir optinės koherentinės tomografijos (OCT). Atsižvelgiant į dozę (0, 5–50 mg / kg, per os ), šikoninas apsaugojo nuo DM / hipoksijos sukeltų pažeidimų. Akies audinyje šikonino vartojimas taip pat susilpnino DM / hipoksijos sukeltą priešapoptozinį baltymo BAX raišką, taip pat uždegiminių baltymų ciklooksigenazės-2 (COX-2) ir indukuojamo azoto oksido sintazės (iNOS) gamybą. Mes taip pat įrodėme, kad šikonino vartojimas gelbsti dėl didelio gliukozės / hipoksijos (1% O 2 ) sukelto uždegimo, sumažėjusios jungties baltymų ekspresijos ir pralaidumo RPE ląstelėse. Šie rezultatai rodo, kad gydymas šikoninu gali užkirsti kelią regėjimo praradimui, susijusiam su DR.

Įvadas

Visame pasaulyje cukriniu diabetu serga daugiau nei 347 milijonai žmonių, tikimasi, kad iki 2030 m. Ji taps septinta pagrindine mirties priežastimi 1, 2 . Diabetinė retinopatija (DR), pagrindinė mikrovaskulinė diabeto komplikacija, yra viena iš pagrindinių darbingo amžiaus gyventojų regėjimo praradimo ir regėjimo sutrikimų priežasčių 3 . DR patogenezė yra labai sudėtinga, nes naudojami keli kryžminiai mechanizmai, dėl kurių atsiranda ląstelių disfunkcija ir tinklainės adaptaciniai pokyčiai 4 .

Klinikinis DR sunkumas svyruoja nuo neproliferacinio (NPDR) ir preproliferacinio (PDR) iki sunkiau proliferacinio DR; Dėl stiklakūnio kraujavimo ar tinklainės atsiskyrimo gali sumažėti visiškas ar dalinis regėjimas. Centrinio regėjimo praradimas taip pat gali būti tinklainės kraujagyslių nutekėjimo ir vėlesnės edemos pasekmė 5, 6 . NPDR yra būdinga mikroaneurizma ir „taškinis bei dėmėtasis“ kraujavimas, o PDR būdinga nenormali tinklainės neovaskuliarizacija. Kliniškai svarbios PDR pasekmės yra tinklainės ir stiklakūnio kraujavimas, taip pat traukos tinklainės atsiskyrimas.

Daugybė šiuo metu galimų DR neovaskuliarizacijos gydymo būdų yra invaziniai, įskaitant fotokoaguliaciją lazeriu, antivaskulinių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) agentų ar steroidų injekciją į stiklakūnį ir vitrektomiją 7, 8 . Be to, šie gydymo būdai nėra veiksmingi ankstyvosiose DR stadijose ir visiškai nepanaikina aklumo rizikos 5 . Todėl reikia naujų prevencinių gydymo strategijų, kurios gali būti naudojamos anksčiau ligos procese, siekiant atidėti ar užkirsti kelią DR progresavimui.

Tikslūs mechanizmai, kuriais hiperglikemija sukelia kraujagyslių ir neuronų pokyčius DR, nėra visiškai išaiškinti 9, 10 . Tinklainės pažeidimai, pastebėti ankstyvojo DR metu, gali būti papildomi arba sinergetiniai su uždegimo pokyčiais, kraujagyslių okliuzija ir pakitusiu kraujagyslių pralaidumu. Taigi, pažeidimai gali būti glaudžiai susiję su progresuojančia išemija ir hipoksija, pasireiškiančiomis ligos metu 9, 11 .

Atlikta daug tyrimų, naudojant gyvūninius diabeto modelius. Tai suteikė vertingos informacijos apie DR ankstyvosios stadijos patogenezės ląstelinius ir molekulinius aspektus 12, 13, 14, 15 . Keletas tokių modelių apima cheminį diabeto indukciją, naudojant streptozotociną (STZ). Maždaug po šešių mėnesių nuo ligos pradžios STZ sukeltos diabetinės C57BL / 6 pelės demonstruoja ankstyvas DR savybes, tokias kaip ląsteliniai kapiliarai ir kraujagyslių ląstelių apoptozė tinklainėje 16 . Kito tyrimo metu buvo pranešta apie gangliono ląstelių praradimą ir reikšmingą tinklainės vidinio ir išorinio sluoksnių plonėjimą 17, 18 . Visi šie rezultatai rodo, kad STZ sukeltas diabetas yra tinkamas ankstyvosios stadijos DR modelis.

Šikoninas yra pagrindinis raudonasis naftochinono pigmentas, kurį galima išskirti iš Lithospermum erythrorhizon Sieb šaknies. et Zucc. (Boraginaceae) ir buvo naudojamas tradiciniame vaistažolių medicinoje kaip tepalas, skirtas tymams, gerklės skausmams ir nudegimams gydyti 19 . Jo cheminė struktūra parodyta 1A pav.

Image

( A ) Šikonino cheminė struktūra. ( B ) Parodyta STZ sukelto diabeto kartu su hipoksija schema. C57BL / 6 pelėms kasdien penkias dienas buvo švirkščiamos intraperitoninės (55 mg⁄kg) STZ injekcijos. Kontrolinei grupei buvo įšvirkštas tik ekvivalentinis citrato buferio tūris. Po diabeto sukėlimo, pelės atsitiktinai buvo padalintos į penkias grupes; kontrolinė grupė buvo patalpinta normaliomis sąlygomis, tuo tarpu kitos keturios grupės buvo dedamos į uždarą hipoksijos kamerą ir tiekiamos su 10% deguonies. Trys iš keturių hipoksijos grupių vartojo 0, 5 mg / kg, 5 mg / kg arba 50 mg / kg šikonino per parą. Galutinei hipoksijos grupei buvo skirtas tik 1% DMSO. Elektroretinogramos (ERG) buvo darytos 3, 12 ir 25 dienomis, o fonų fotografavimas (FP), dugno fluoresceino angiografija (FFA) ir optinės koherencijos tomografija (OCT) buvo atliekami kas savaitę iki 28 dienos. Sėkmingas eksperimentinio diabeto vystymasis Pelės, gydomos STZ, buvo patvirtintos matuojant gliukozės kiekį kraujyje 0 ir 28 dienomis. ( C ) DM / hipoksinių C57BL / 6 pelių, gydytų su / be 0, 5 mg / kg, 5 mg / kg arba be jų, gliukozės ir HbA1c lygio kraujyje ypatumai. Pateikiama 50 mg / kg šikonino. Duomenys išreiškiami kaip penkių kiekvienos grupės gyvūnų vidurkis ± SD. a p <0, 05, b p <0, 01, c p <0, 001 palyginti su normalia ANOVA kontrole.

Visas dydis

Daugybė tyrimų parodė, kad šikoninas turi įvairų klinikinį poveikį, įskaitant antimikrobinį poveikį 20, 21, antioksidantinį poveikį 22, 23, 24 ir proliferacinį poveikį žaizdų gijimui 25, 26, 27, 28 . Tai antialerginis agentas 29, 30 ir turi priešvėžinį poveikį 31, 32 . Be to, įrodyta, kad šikoninas yra stiprus priešuždegiminis agentas 33, 34, 35 .

Atsižvelgiant į tai, kad pelėms, kurių vien tik STZ sukelia DR, prasideda ilgas laikotarpis (keli mėnesiai), mes sujungėme STZ diabeto indukciją su sistemine hipoksija (10% O 2 ), kad imituotume ilgalaikį uždegimą ir hipoksiją, atsirandančią sergant STZ. ankstyvosios stadijos DR 10, 36, 37, 38 . Tada buvo ištirtas šikonino veiksmingumas silpninant DR. Galimi terapinio taikymo tikslai, įskaitant neuronų pažeidimą ir kraujagyslių pralaidumo pokyčius, buvo tiriami tiek in vivo, tiek in vitro . Naudodamiesi funkcinėmis ir molekulinėmis procedūromis, parodome, kad mechanizmai, kuriais grindžiamas anti-DR poveikis, yra šikonino, turintys priešuždegiminį ir antiapoptozinį poveikį, ir kad šikoninas gali padėti palaikyti normalų kraujagyslių pralaidumą.

Rezultatai

Duomenys apie gyvūnus

Kontrolinių pelių gliukozės kiekis kraujyje buvo 152 ± 6, 7 mg / dL, DM / hipoksinių grupių pelių gliukozės kiekis kraujyje buvo žymiai padidėjęs (351 ± 29, 9 ~ 366, 6 ± 32 mg / dL, p 250 mg / dL (357, 8 ± 21, 3). ~ 376, 8 ± 35 mg / dL, p <0, 001) DM / hipoksinės būklės 28 dieną (1 pav. C). DM / hipoksinės ir DM / hipoksinės pelės, gydomos 0, 5 mg / kg, 5 mg / kg arba 50 mg / kg shikonino kūno svoris buvo žymiai mažesnis nei amžių atitinkančių sveikų pelių (1 pav. C).

ERG ištirtas šikonino poveikis DM / hipoksijos sukeltai retinopatijai

ERG yra diagnostinis tyrimas, kurio metu matuojamas tiek neuroninių, tiek neneuroninių ląstelių, esančių tinklainėje, elektrinis aktyvumas, reaguojant į šviesos stimulą. Pradėję hipoksiją, 3, 12 ir 26 dienomis atlikome ERG tyrimus. Tipiškas ERG nuo 26 dienos yra parodytas 2A pav. Netiesioginiai a ir b bangų laikai grupėse reikšmingai nesiskyrė (2B ir C pav.). DM / hipoksijos sukeltų pelių vidutinė a bangos amplitudė buvo žymiai mažesnė nei kontrolinės grupės tiek 12-tą dieną (86, 9 ± 8, 2; p <0, 001), tiek tyrimo pabaigoje (69, 2 ± 8, 2; p <0, 001). ). Kaip parodyta 2D pav., Priklausomai nuo dozės, shikoninas panaikino bangų, susijusių su DM / hipoksija, sumažėjimą. Be to, vidutinė b bangų amplitudė DM / hipoksijos sukeltose DR pelėse buvo 234, 7 ± 10, 3 12 dieną ir 143 ± 14, 9 26 dieną, kurios abi buvo mažesnės už kontrolinių b bangų amplitudę; tačiau šikonino vartojimas priklausomai nuo dozės panaikino šį žalingą poveikį (2 pav. E).

Image

( A ) Tipinės a ir b bangų diagramos iš kontrolinių grupių, neapdorotų DM / hipoksinių grupių ir trijų shikoninu gydytų DM / hipoksinių grupių (įvairios dozės) 26 dieną. ERG duomenys buvo renkami 3 dienomis, 12 ir 26, o a- ir b-bangų vidutiniai numanomi laikai (ms) yra parodyti atitinkamai ( B ir C ). ERG bangos formos a ir b bangų amplitudės (μV) taip pat buvo analizuojamos histograma ir parodytos atitinkamai ( D ir E ). Duomenys išreikšti kaip penkių gyvūnų vidurkis ± SD. *** p <0, 001, palyginti su 12 dienos kontroline grupe. ‡‡ p <0, 01, ‡‡‡ p <0, 001, palyginti su 12 paros DM / hipoksinių grupių grupe. ††† <0, 001, palyginti su 26 dienos kontroline grupe. §§§ p <0, 001, palyginti su 26 dienos DM / hipoksinių grupe.

Visas dydis

FP ir FFA analizė apie shikonino poveikį DM / hipoksijos sukeltai retinopatijai

Po pirmojo FP ir FFA gydymo grupės buvo dedamos į viso kūno hipoksijos kamerą ir geriamos po 0, 5 mg / kg, 5 mg / kg arba 50 mg / kg šikonino kiekvieną dieną 28 dienas. FP, FFA ir UŠT tyrimai buvo atliekami kas savaitę, kaip parodyta 1B pav. 3A ir B paveiksluose pavaizduoti kontrolinių pelių, neapdorotų DM / hipoksinių pelių ir DM / hipoksinių pelių, kurių 0 ir 28 dienomis buvo gydomi 50 mg / kg šikonino, reprezentatyvūs FP ir FFA mikrografai. Sveikoje tinklainėje FP ir FFA rezultatai rodo aiškų visas pilvo ir fluorescencinių vaizdų regionas. DM / hipoksinių pelių fonduose buvo gelsvai baltos dėmės, gretimi pleistrai ir pažeidimai, primenantys geografinę žalą visose FP, paimtose nuo 14 dienos iki 28 dienos (3 pav. A, demarked area). Plotas, atitinkantis gelsvai baltas dėmeles FP, tiriant FFA parodė hiperfluorescenciją (3 pav. B. Demarked area). Taip pat pastebėta regioninė hipofluorescencija (3B pav., Raudonos rodyklės). Be to, neryškus visos tinklainės vaizdas iš neapdorotos DM / hipoksinės grupės rodo nenormalų kraujagyslių pralaidumą fluoresceinui. Visų pirma, QD gydymas 50 mg / kg šikonino sėkmingai užkerta kelią geografinei žalai, hiperfluorescencijai, regioninei hipofluorescencijai ir padidintam kraujagyslių pralaidumui, kurį sukelia DM / hipoksijos sukelta retinopatija.

Image

( A ) Kasdien buvo imami židinio vaizdai, vaizduojami kontrolinės grupės, neapdorotų DM / hipoksinių grupių ir 50 mg / kg šikonino terapijos grupių vaizdai 0 ir 28 dienomis. Taškinės linijos apsuptas plotas rodo 28 dieną neapdorotos DM / hipoksinės grupės tinklainės geografinius pažeidimus. ( B ) Fluoresceino angiografija buvo atlikta praėjus maždaug 30 sekundžių po 10% natrio fluoresceino tirpalo injekcijos į veną. Plotas punktyrinėje linijoje rodo hiperfluorescencinį tinklainės pažeidimą, o raudonos rodyklės rodo keletą hipofluorescencinių sričių neapdorotų diabetinių / hipoksinių pelių tinklainėje 28 dieną. Juodos linijos iš ( A ) ir ( B ) žymi regioną, parinktą vertikaliam nuskaitymui. 4 pav.

Visas dydis

Šikonino poveikio UTT analizė DM / hipoksijos sukeltai retinopatijai

Norėdami toliau apibūdinti pažeidimus, stebimus FP ir FFA, ir patikrinti shikonino veiksmingumą, mes panaudojome realaus laiko UŠT, kad apibrėžtume FP ir FFP sritis (3A ir B pav., Juodos linijos). Reprezentatyvūs UŠT mikrografiniai vaizdai (4A pav.) 0 ir 28 dienomis buvo gauti iš kontrolinės grupės, neapdorotos DM / hipoksinės grupės ir DM / hipoksinės grupės, gavusių 50 mg / kg šikonino. Skerspjūvio OCT b-skenavimas aiškiai parodė skirtingus tinklainės sluoksnius, įskaitant fotoreceptoriaus sluoksnio NFL, GCL, IPL, INL, OPL, ONL, OLM, IS / OS, tinklainės pigmento epitelį ir choroidą. Jie yra pažymėti skydelio dešinėje (4A pav.). DM / hipoksinių pelių, kurioms nebuvo taikomas papildomas gydymas, tinklainėje nebuvo anomalijų 14 dieną, kuri tęsėsi iki eksperimento pabaigos. 28 dieną tinklainės pigmento epitelis buvo aiškiai atskirtas (rodyklė) ir buvo rasti struktūriniai branduolinių sluoksnių architektūros sutrikimai (demarkuota sritis) (4A pav.). Shikonin užkirto kelią šiems DM / hipoksijos sukeltiems struktūriniams pažeidimams. Tinklainės storis buvo matuojamas kas savaitę. Kaip parodyta 4B pav., Normalių kontrolinių pelių tinklainės storis svyravo nuo 223, 31 ± 2, 4 ~ 225, 72 ± 3, 02 μm, o bendras tinklainės storis iš DM / hipoksinių pelių buvo sumažintas priklausomai nuo laiko iki 214, 52 ± 3, 19 (diena). 14; p <0, 001), 206, 36 ± 3, 41 (21 diena; p <0, 001) ir 204, 16 ± 1, 26 (28 diena; p <0, 001). Trys tinklainės sluoksniai buvo apibrėžti kaip vidinis sluoksnis (NFL-IPL), vidurinis sluoksnis (INL-OLM) ir išorinis sluoksnis (IS / OS-RPE). Kiekvieno sluoksnio storis 28 dieną kontrolinėje grupėje, negydytoje DM / hipoksinėje grupėje ir DM / hipoksinėje grupėje, gydomoje shikoninu (0, 5–50 mg / kg), parodytas 4C – E pav. Mes nustatėme, kad tinklainės storio sumažėjimas, stebimas DM / hipoksinėmis pelėmis, įvyko tiek viduriniame fotoreceptoriuje, tiek vidiniame neuronų sluoksnyje.

Image

( A ) Pateikiami SD-OCT skenavimo duomenys nuo 0 ir 28 dienų. Tinklainės sluoksnių apibrėžimas pateiktas skydelio dešinėje. OCT buvo atliekamas toms pačioms pelėms po FP ir FFA, išsamiai parodant tinklainę. Plotas punktyrinės linijos viduje rodo 28 dieną neapdorotos DM / hipoksinės pelės tinklainės geografinį pažeidimą. Rodyklė rodo tinklainės pigmento epitelio (RPE) sluoksnį, plyšusį Brucho membranoje. Savaitiniai tinklainės bendro storio matavimai iš SD-OCT kontrolinėje grupėje, neapdorotoje DM / hipoksinio grupėje ir trijose gydymo shikoninu grupėse pateikiami ( B ). Duomenys išreikšti kaip 5 gyvūnų vidurkis ± SD. ** p <0, 01, *** p <0, 001, palyginti su santykine kontrole. †† p <0, 01 ir ††† p <0, 001, palyginti su negydyta DM / hipoksine grupe. SD-OCT skenavime parodomi trys pelės tinklainės sluoksniai 28 dieną: išorinis sluoksnis (NFL-IPL), vidurinis sluoksnis (IPL-IS / OS) ir vidinis sluoksnis (IS / OS-RPE) ) ( C - E ). Duomenys išreikšti kaip 5 gyvūnų vidurkis ± SD. ** p <0, 01, *** p <0, 001, palyginti su kontroline grupe; p <0, 05, ††† p <0, 001, palyginti su negydyta DM / hipoksine grupe.

Visas dydis

Histologinis shikonino tyrimas esant DM / hipoksijos sukeltai retinopatijai

Po 28 dienų procedūros pagal mūsų DM / hipoksijos sukeltą retinopatijos modelį, visos pelės buvo išnaikintos, o dešinė akis dažyta hematoksilinu ir eozinu (H&E). Kaip parodyta 5A pav., Buvo pastebėti ONL, INL ir NFL struktūriniai sutrikimai ir ląstelių netekimas. Vartojant 50 mg / kg šikonino, buvo išvengta DM / hipoksijos sukeltų anomalijų. Norėdami apibūdinti DM / hipoksinių pelių ONL, INL ir NFL pastebėtus ląstelių nuostolius, mes panaudojome galinį deoksinukleotidil-transferazės tarpininkaujamą dUTP slapyvardžio galutinio žymėjimo (TUNEL) tyrimą. DM / hipoksinių pelių tinklainėje buvo nežymių TUNEL teigiamų ląstelių ONL, tuo tarpu kontrolinių pelių ir DM / hipoksinių pelių, gavusių 50 mg / kg shikonino, tinklainėje nebuvo TUNEL teigiamų ląstelių. Taip pat buvo atlikta ląstelių skaičiaus analizė. Kaip parodyta 5B ir C paveiksluose, INL ir ONL ląstelių reikšmingai sumažėjo DM / hipoksinio poveikio grupėje, o išgertas šikonino (50 mg / kg) kiekis išgelbėjo ląstelių praradimą. Trijų atsitiktinai parinktų pelių kairioji akis iš kiekvienos grupės buvo paimta ir atlikta Western blot analizė. Mes nustatėme, kad preapoptozinio BCL-2 šeimos baltymo (BAX), su uždegimu susijusio baltymo ciklooksigenazės-2 (COX-2) ir indukuojamo azoto oksido sintazės (iNOS) raiška buvo didesnė DM / hipoksinėms pelėms nei kontrolinė; tačiau DM / hipoksinės pelės, gydomos shikoninu, nuo baltymų ekspresijos sumažėjo nuo dozės ir grįžo į pradinį lygį (5 pav. D). Ši histologinė analizė kartu su atitinkamais FP, FFA ir UŠT duomenimis rodo, kad nuo dozės priklausomas shikoninas apsaugo nuo pažeidimų susidarymo, RPE ląstelių pažeidimų, kraujagyslių pralaidumo ir galbūt edemos.

Image

( A ) Tinklainės morfologija iš kontrolinės grupės 28 dieną (viršutinė paveikslo dalis), neapdorota DM / hipoksinė grupė ir 50 mg / kg šikoninu gydyta grupė parodyta dažant H&E. Apatiniame skydelyje pavaizduotos šviesiai mėlynos, TUNEL teigiamos ląstelės, esančios tinklainėje iš reprezentatyvios neapdorotos DM / hipoksinės pelės (raudona rodyklė). ( B ) Vidinio branduolinio sluoksnio (INL) ląstelių skaičius. C ) Išorinio branduolinio sluoksnio (ONL) ląstelių skaičius. Duomenys išreikšti kaip 5 gyvūnų vidurkis ± SD. *** p <0, 001, palyginti su kontroline grupe; ### p <0, 001, palyginti su negydyta DM / hipoksine grupe. ( D ) Trijų atsitiktinai parinktų pelių iš kiekvienos grupės (5 gyvūnai) kairioji akis buvo atskirai surinkta ir audiniai homogenizuoti dideliu greičiu 2 × 30 sek., Naudojant Minilys audinių homogenizatorių (Bertin Technologies, Prancūzija). Tada homogenatas buvo centrifuguojamas 14 000 g 10 minučių 4 ° C temperatūroje ir supernatantas buvo surenkamas. Baltymų koncentracija supernatante buvo nustatyta naudojant Bradfordo reagentą. Absorbcija 595 nm bangoje buvo išmatuota spektrofotometru (Optizen POP, Korėja). Lizato baltymai (80 μg) iš kiekvienos akies buvo analizuojami atskyrus 10% redukuojančius SDS-PAGE gelius ir atlikus Western blot analizę.

Visas dydis

Shikoninas apsaugo RPE ląsteles nuo didelės gliukozės / hipoksijos sukeltų pažeidimų

RPE ląstelės yra esminis išorinio kraujo-tinklainės barjero komponentas; diabetinės retinopatijos progresavimas yra susijęs su RPE ląstelių pažeidimu. Hiperfluorescencija, stebėta DM / hipoksinėms pelėms tiriant FFA (3 pav. B), gali būti pažeista RPE ląstelėms. Čia mes ištyrėme kelis priešuždegiminius ir jungiamuosius baltymus, taip pat ląstelių pralaidumą RPE ląstelėse. Į RPE kultūras, inkubuotas žemos gliukozės (1 g / l) arba aukštos gliukozės (4, 5 g / l) DMEM su 10% šilumos inaktyvuota FBS, buvo pridėta skirtinga shikonino koncentracija (0, 1–10 μM). Po 30 minučių RPG ląstelės, apdorotos labai gliukozės kiekiu, 24 valandas buvo inkubuojamos hipoksijos kameroje (1% O2), o tada jų gyvybingumas buvo matuojamas MTT tyrimu. Kaip parodyta 6A pav., Kultūrose, apdorotose mažesnėmis kaip 3 μM šikonino koncentracijomis, ląstelių gyvybingumui nepakito, tuo tarpu 10 μM shikonino sukėlė citotoksiškumą tiek mažai gliukozės, tiek aukštos gliukozės / hipoksijos paveiktose RPE ląstelėse. Mažasis gliukozės ir aukštos gliukozės / hipoksija gydytų RPE ląstelių, ląstelių, inkubuotų su šikoninu (0, 3–10 μM), tarpląstelinis pralaidumas buvo matuojamas naudojant FITC pažymėtą dekstraną. Ryškiai padidėjęs FITC-dekstrano 40–70 kDa srautas padidėjo gliukozės / hipoksijos grupėje (6B pav., C), o šikonino (0, 3–3 μM) koncentracija priklausomai nuo šio srauto sumažėjo. Tačiau RPE ląstelėse, apdorotose 10 μM shikonino, vėl buvo pastebėtas padidėjęs 40 ir 70 kDa FITC-dekstrano srautas. Toliau atlikome Western blot analizę, norėdami išanalizuoti uždegiminių ir jungiamųjų baltymų raiškos pokyčius. Kaip parodyta 6D pav., Didelė gliukozės / hipoksija padidino hipoksijos sukelto 1-α faktoriaus (HIF 1-α), COX-2 ir mieloperoksidazės (MPO) raišką. Šikonino (0, 3–3 μM) koncentracija priklausomai nuo šių baltymų ekspresijos padidėjimo sumažino. Įdomu tai, kad iNOS ekspresijai neturėjo įtakos aukšta gliukozės / hipoksija RPE ląstelėse. Priešingai, sandaraus jungiamojo baltymo ZO-1 ekspresiją sumažino padidėjusi gliukozės / hipoksija - poveikis, kuris buvo sušvelnintas priklausomai nuo koncentracijos, gydant šikoninu (0, 3–10 μM). Viso gydymo metu okludino ir claudino-19 lygiai nepakito (6 pav. E).

Image

RPE ląstelės 24 valandas buvo inkubuojamos esant didelei ar mažai gliukozės koncentracijai ir hipoksijai (1% O 2 ) su arba be šikonino (0, 01–10 μM). Ląstelių gyvybingumas buvo palygintas tarp ląstelių, inkubuotų esant žemai ar aukštai gliukozės koncentracijai, naudojant MTT testą. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SD iš bent trijų nepriklausomų eksperimentų. * p <0, 05, *** p <0, 001, palyginti su mažai kontroliuojamu gliukozės kiekiu. ( A ) Paraceululiniai tracer-flux tyrimai buvo atlikti naudojant FITC-dekstraną (molekulinės masės atitinkamai 40 kDa ( B ) ir 70 kDa ( C )) ir tankius RPE monosluoksnius, apdorotus šikoninu arba be jo (0, 01–10 μM, 24 val.). . Parodyti bent 3 nepriklausomų eksperimentų rezultatai. *** p <0, 001, palyginti su mažai kontroliuojamu gliukozės kiekiu. # p <0, 05, ## p <0, 01 ir ### p <0, 001, palyginti su negydyta didelės gliukozės / hipoksijos grupe. ( D ) RPE ląstelės buvo inkubuojamos su šikoninu arba be jo (0, 003–0, 3 μM) 24 valandas žemos gliukozės / hipoksinės arba aukštos gliukozės / hipoksinės sąlygomis. Ląstelių lizato baltymai (40 μg) iš kiekvienos inkubacijos buvo analizuojami atskiriant 10% redukuojančius SDS-PAGE gelius ir atlikus Western blot analizę su specifiniais antikūnais prieš uždegiminius baltymus, hipoksijos indukuojamą 1-α faktorių (HIF1-α), ciklooksigenazę-2 (COX-2). ), indukuojamą azoto oksido sintazę (iNOS) ir mieloperoksidazę (MPO). ( E ) reprezentatyvūs „Western blot“ vaizdai, rodantys adreno jungimosi baltymų ir sandarių jungčių baltymų ekspresijos pokyčius RPE ląstelėse, apdorotose su šikoninu arba be jo, esant mažai gliukozės / hipoksinės ar aukštos gliukozės / hipoksinės sąlygoms.

Visas dydis

Diskusija

Didelė diabeto komplikacijų našta sveikatai išlieka dėl to, kad nuolat didėja diabeto paplitimas, taip pat dėl ​​blogos glikemijos kontrolės ankstyvosiose ligos stadijose. Naujausi tyrimai parodė, kad ankstyva gliukozės kontrolė netrukdo DR 39 ; taigi, norint surasti naują DR gydymo metodą, reikia didelių pastangų.

Iki šiol nėra tobulo gyvūnų modelio, kuris apimtų visus žmogaus DR, o pažeidimo atsiradimo laikas įvairioms rūšims ir kamienams skiriasi. Tiksliau, praėjus 4–8 mėnesiams po cukrinio diabeto sukėlimo, Lewis žiurkėms buvo nustatytas greičiausias tinklainės kapiliarų ir tinklainės ganglinių ląstelių (RGC) netekimas iš visų modelių, Wistar žiurkėms kapiliarų degeneracija nebuvo reikšminga neurodegeneracija, o „Sprague Dawley“ žiurkėms nebuvo jokių pažeidimų 39. . STZ sukeltos diabetinės B6 pelės taip pat demonstruoja ankstyvas DR savybes praėjus maždaug 6 mėnesiams nuo diabeto pradžios 16 .

Savo tyrime įvertinome priešuždegiminio agento shikonino poveikį DM / hipoksijos sukeltai DR. Tų pačių gyvūnų kraujagysliniai ir ne kraujagysliniai DR pokyčiai realiuoju laiku buvo stebimi naudojant ERG, FP, FFA ir UŠT. Pažeidimai, rodantys ankstyvos stadijos DR, buvo rasti jau po 12 dienų nuo DM / hipoksinės ligos pradžios. Visus apibrėžtus pažeidimus patvirtino Jau-De, Ho, MD, Taipėjaus medicinos universiteto ligoninės Oftalmologijos skyriaus vedėjas. Kadangi tinklainės neurodegeneracija yra ankstyvas DR patogenezės įvykis, buvo atlikta ERG. A banga žymi pradinę ragenos neigiamą deformaciją, atsirandančią iš išorinių fotoreceptorių sluoksnių kūgių ir strypų, o b banga rodo ragenos teigiamą įlinkį, atsirandantį dėl tinklainės vidinių neuronų funkcijų. Mūsų rezultatai rodo, kad negydytos DM / hipoksinės pelės turėjo žymiai mažesnę a-bangos ir b-bangos amplitudę (2 pav., E), tai rodo atitinkamai išorinių tinklainės ląstelių ir tinklainės vidinių sluoksnių fotoreceptorių sužalojimus. Iš tiesų, UŠT tyrimų rezultatai parodė, kad C57BL / 6 pelių bendras tinklainės storis pradėjo reikšmingai mažėti praėjus dviem savaitėms nuo diabeto / hipoksijos pradžios (4 pav. B). Vidurinio tinklainės sluoksnio susitraukimas yra pagrindinė tinklainės storio mažėjimo priežastis, o vidinis sluoksnis yra iš dalies susijęs (4C pav., D). Galiausiai morfologiniai H&E dažymo stebėjimai ir TUNEL dažymo metu aptikti DNR pažeidimai dar patvirtino šiuos rezultatus nurodydami apoptozinių ląstelių buvimą (5A pav.). Gelsvai baltos dėmės ir pažeidimai, primenantys FP pastebėtą geografinę atrofiją, ir atitinkami FFA stebimi hiperfluorescenciniai plotai, parodė, kad tinklainės pigmento epitelio pažeidimas ir padidėjęs tinklainės kraujagyslių pralaidumas įvyko praėjus dviem savaitėms po gydymo DM / hipoksija C57BL / 6 pelėms (pav. 3A, B). Taip pat buvo rasta keletas hipofluorescencinių dėmių, kurios rodo, kad galėjo atsirasti regioninė edema. Be to, mes įvertinome normalias C57BL / 6 peles hipoksinėmis sąlygomis, taip pat STZ sukeltas diabetines C57BL / 6 peles, naudodamiesi tais pačiais eksperimentiniais įrankiais ir ta pačia eksperimento laiko juosta, kaip aprašyta aukščiau, ir neradome matomų pažeidimų (duomenys nepateikti); tai rodo, kad nei diabetas, nei hipoksija nebuvo pakankami, kad sukeltų greitą pažeidimų, stebėtų C57BL / 6 pelėms, naudojamoms šiame tyrime, sukėlimą.

Hipoksija, dėl kurios palaipsniui blogėja tinklainės išemija, dažniausiai sukelia makrofagų ir kitų imuninių ląstelių kaupimąsi 40 . Šių ląstelių aktyvinimas lemia citokinų, sukeliančių uždegimą sukeliančių baltymų ekspresiją, padidėjimą ir apoptozę. Konkrečiai kalbant, padidėjęs iNOS ir COX-2 tinklainės ekspresija yra pagrindinis veiksnys, lemiantis diabeto sukeltą tinklainės uždegimą 36 . Akių audiniai, paimti iš DM / hipoksinių pelių, pastebimai padidino „iNOS“ ir COX-2, taip pat proapoptozinio baltymo BAX raišką (5 pav. D).

Įrodėme, kad priešuždegiminis agentas shikoninas sumažino DM / hipoksinių pelių tinklainės audinių pažeidimus. DM / hipoksinėms pelėms, kurioms buvo duota 50 mg / kg šikonino, DR nesivystė iki eksperimento laikotarpio pabaigos (28 diena). Priešingai, į DR panašūs pažeidimai anksčiau išsivystė negydytoms DM / hipoksinėms pelėms. Be to, šikoninas žymiai sumažino neuronų ląstelių praradimą, taip pat tinklainės kraujagyslių nutekėjimų, stebėtų DM / hipoksinėmis pelėmis, skaičių. Kadangi RPE ląstelės yra esminis išorinio kraujo tinklainės barjero komponentas ir jų pažeidimai yra susiję su diabetinės retinopatijos 41 progresavimu, mes ištyrėme gydymo shikoninu poveikį išaugintoms aukštos gliukozės / hipoksijos pažeistoms RPE ląstelėms. Mes nustatėme, kad gydymas shikoninu daro teigiamą poveikį ląstelių, taip pat ir uždegiminių baltymų HIF-1α, COX-2 ir MPO, pralaidumui ir ekspresijai, taip pat ir uždegiminiams baltymams HIF-1α, COX-2 ir MPO (6B – E pav.). Tačiau šikoninas nesumažino padidėjusio FITC-dekstrano srauto, sąlygojamo padidėjusio gliukozės / hipoksinės būklės, esant 10 μM, nepaisant to, kad atgavo padidėjusios gliukozės / hipoksijos sumažintą ZO-1 raišką. Mes prognozuojame, kad esant šiai koncentracijai, shikoninas daro tam tikrą citotoksinį poveikį (6 pav. A) ir gali pakeisti kitus sukibimus ir sandarius sujungimo elementus, todėl padidėja pralaidumas. Pabrėžta, kad iNOS ekspresija RPE ląstelėse nepasikeitė po gydymo, tai rodo, kad inNivo eksperimentų metu nustatytas iNOS padidėjimas greičiausiai priskirtinas kitoms ląstelėms, tokioms kaip gliaudinės ląstelės.

Tyrime mes panaudojome DMSO kaip tirpiklį; Neseniai buvo pranešta, kad DMSO daro priešuždegiminį poveikį 42, 43 . Tačiau šiame tyrime panaudotas DMSO kiekis buvo daug mažesnis, nei anksčiau buvo pranešta, kad jis turi priešuždegiminį poveikį, o DM / hipoksinėms pelėms, gydomoms tik DMSO, jokio teigiamo poveikio nepastebėta, tai rodo, kad melioracinis poveikis DR yra priskirtinas gydymui shikoninu, o ne DMSO. Mes taip pat skyrėme metforminą, paprastai naudojamą kaip standartinis antidiabetinis vaistas, kad palygintume hipoglikemijos efektyvumą STZ sukeltų vidutinio sunkumo diabeto modelių metu, hipoksinėms / diabetinėms pelėms 4 savaites. Nors gydymas metforminu (300 mg / kg, qd) reikšmingai sumažino nevalgiusio cukraus kiekį kraujyje nevalgius, jis negalėjo užkirsti kelio DM / hipoksijos sukeltiems pažeidimams, nustatytiems FP ir FFA stebėjimais (žr. Papildomą S1 pav.). Be to, gydymas shikoninu neturėjo įtakos gliukozės koncentracijai kraujyje (1 pav. C), o svorio netekimas buvo panašus į neapdorotų DM / hipoksinių pelių, tai rodo, kad šikoninas daro unikalų DR poveikį, nepriklausomai nuo gliukozės kiekio kraujyje reguliavimo. Nors mūsų in vitro eksperimentuose 10 μM šikoninas sukėlė citotoksiškumą RPE ląstelėse, DM / hipoksinėms pelėms, skiriamoms po 50 mg / kg šikonino per parą, pastebimo šalutinio poveikio nepastebėta. Kad būtų užtikrintas šikonino saugumas vartojant dozes, kurias mes naudojome eksperimentuose, pelių serume buvo tiriami glutamo oksalacetatinės transaminazės (GOT), glutaminės piruvato transaminazės (GPT) ir šlapalo azoto (BUN) parametrai pelėse po 28 dienų kasdienio gydymo 50 mg / kg šikonino, taip pat kontrolinėje grupėje. Nebuvo pastebėtas nepageidaujamas poveikis normalioms, DM / hipoksinėmis ir šikoninu gydytoms DM / hipozinėms C57Bl / 6 pelėms (žr. Papildomą S1 lentelę). Taip pat neseniai buvo tiriamas pakartotinių chikonino darinių dozių toksiškumas Wistar žiurkėms 44 ; 800 mg / kg šikonino, kasdien sušvirkščiant 180 dienų, nesukelia hematologinio ar nehematologinio toksiškumo, o tai rodo, kad DR terapinis langas yra didelis.

Apibendrinant, mes sukūrėme naują DR gyvūnų modelį ir sėkmingai panaudojome aukštos skiriamosios gebos realaus laiko fundus vaizdus, ​​kad išanalizuotume ankstyvas DR tipo sindromo stadijas. Šie duomenys rodo, kad šikoninas yra perspektyvus DR gydomasis agentas. Nurodomas tolesnis tyrimas, siekiant nustatyti jo klinikinį pagrįstumą.

Metodai

Cheminių medžiagų ir reagentų aprašymas, tarpląstelinio pralaidumo tyrimas, ląstelių kultūros ir hipoksijos gydymas, histochemija, TUNEL tyrimas ir Western blot analizė pateikiami papildomuose prieduose.

DM / hipoksijos sukeltas DR modelis C57BL / 6 pelėms

Eksperimentinė schema parodyta 1B pav. Visos eksperimentinės procedūros, susijusios su gyvūnų naudojimu, atitiko Vizijos ir oftalmologijos tyrimų asociacijos (ARVO) teiginius, susijusius su gyvūnų naudojimu oftalmologiniais ir regos eksperimentiniais tyrimais, o toliau išvardytas gyvūnų naudojimo protokolas buvo peržiūrėtas ir patvirtintas Institucinėje gyvūnų globos organizacijoje. Taipėjus medicinos universiteto Naudojimo komitetas (patvirtinimo numeris: LAC-2014-0194).

C57BL / 6 pelės (8 savaičių amžiaus) buvo gydomos 55 mg / kg STZ kasdieninėmis intraperitoninėmis (IP) injekcijomis 5 dienas, o nediabetinės kontrolės pelės buvo švirkščiamos tik citrato nešikliu. Iš nevalgiusių gyvūnų uodegos kraujo mėginiai buvo paimti ir ištirti, ar nėra gliukozės koncentracijos serume, naudojant „Fuji Dri-Chem Slide“ ir „Fuji Dri-Chem 1000“ („Fuji Film Med. Co.“, Tokijas, Japonija), siekiant patikrinti, ar sėkmingai vystosi eksperimentinis diabetas STZ. -apdoroti gyvūnai. Tada C57BL / 6 pelės atsitiktine tvarka buvo padalintos į penkias grupes, įskaitant neciabetinę kontrolinę grupę, palaikomą normaliomis sąlygomis. Kitos keturios diabetikų grupės buvo palaikomos hipoksijos kameroje, kuriai buvo tiekiamos 10% deguonies, 4 savaites (išskyrus narkotikų gydymo laikotarpius ar funkcinių tyrimų atlikimą); trims iš keturių grupių buvo išgertos dienos dozės: 0, 5 mg / kg šikonino, 5 mg / kg šikonino arba 50 mg / kg šikonino (ištirpinto 1% dimetilsulfoksido [DMSO]). Galutinė grupė buvo gydoma vien hipoksija, lygiaverčiu 1% DMSO kiekiu. The oxygen concentration was continuously monitored by a gas analyzer (Anaerobic System ProOx model 110; BioSpherix, Lacona, NY, USA). HbA1c (glycated hemoglobin) was determined by the Department of Laboratory Medicine, Taipei Medical University using cardiac blood collected when the animals were sacrificed.

Fundus photography (FP) and fundus fluorescein angiography (FFA)

A Micron III retinal imaging microscope (Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA) was used to monitor morphological and pathological changes in the fundus of C57BL/6 mice. Briefly, mice were anesthetized by IP injection of ketamine (80 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), and eyes were dilated with 0.125% atropine. Each mouse was held on its side on the microscope platform and the right eye was rinsed with 2% Methocel gel (OmniVision, SA, Neuhausen, Switzerland). After color FP was performed, fluorescein (10%; 0.05 mL) was used for FFA examination through IP injection. Serial images were then collected using SteamPix 5™ software.

Optical coherence tomography (OCT) imaging and thickness analysis

The OCT module of the Micron III (Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA) retinal imaging microscope was used to obtain images from retinal layers. A high-resolution b-scan of retinal cross-sections (right eye) was obtained by averaging and spatially aligning 5 individual b-scans along the same vertical axis. Retinal layers were segmented using InSight XL (Phoenix Research Laboratories, San Ramon, CA, SA) for further analysis. Three retinal layers were defined and measured in the C57BL/6 mice included in this study: the inner layer, which comprises the retinal nerve fiber layer (RNFL), the ganglion cell layer (GCL), and the inner plexiform layer (IPL); the middle layer, which comprises the inner nuclear layer (INL), the outer plexiform layer (OPL), the outer nuclear layer (ONL), and the outer limiting membrane (OLM); and the outer layer, which comprises the inner and outer segments (IS/OS) of the photoreceptors and the retinal pigment epithelium.

Electroretinogram (ERG)

A light stimulator (Grass PS33 Photic Stimulator; Grass Instruments, Warwick, USA) was held 10 cm from the right eye and allowed to flash before recording the ERG using Dawson, Trick, and Litzkow (DTL) fiber electrodes. ERG signals were amplified with an MP36 4-channel data acquisition system (BIOPAC Systems, Inc., Pershore, UK). ERG signals were amplified (DC to 300 Hz) and digitized at 1 kHz with a resolution of 2 μV. Wave amplitude was measured from the baseline to the trough of a- and b- waves. Implicit time is a measure of the time interval from the onset of the stimulus to the peak of the a- and b-wave.

Statistinė analizė

All data are expressed as the mean ± SD from at least 3 independent experiments (n ≥ 3). Statistically significant differences between groups were determined using one-way analysis of variance (ANOVA). A p -value < 0.05 was considered statistically significant.

Papildoma informacija

How to cite this article: Liao, P.-L. et al . Anti-inflammatory properties of shikonin contribute to improved early-stage diabetic retinopathy. Mokslas. Rep. 7, 44985; doi: 10.1038/srep44985 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.