Afaf-1 nepriklausoma užprogramuota ląstelių žūtis kuriant pelę | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Afaf-1 nepriklausoma užprogramuota ląstelių žūtis kuriant pelę | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Anotacija

Daugelis ląstelių žūsta žinduolių vystymosi metu ir yra apimtos makrofagų. DNase II - / - embrionuose TUNEL teigiama apoptozinių ląstelių DNR paliekama nesuvirškinta makrofaguose, sukuriant sistemą užprogramuotai ląstelių mirčiai pelių vystymosi metu tirti. Čia mes parodėme, kad „ Apaf-1“ mutacija DNase II - / - embrionuose smarkiai sumažino makrofagų, nešančių DNR, skaičių E11.5. Tačiau vėlesniuose embriogenezės etapuose nemažas skaičius makrofagų, turinčių nesuvirškintą DNR, buvo „ Apaf-1 - / -“ embrionuose, tai rodo, kad ląstelės mirė ir buvo pasinėrusios nepriklausomai nuo „ Apaf-1“ . Daugelyje „ Apaf-1 - /“ embrionų audinių neapdorota kaspazė-3 nebuvo nustatyta, o negyvų ląstelių, susikaupusių makrofaguose, DNR pasirodė nepažeista. Embrionų „ Apaf-1“ / / - uodegoje rasta daug neapoptotinių negyvų ląstelių, kurios rodo, kad įvyko nuo „ Apaf-1“ nepriklausomų užprogramuotų ląstelių mirtis, o šias negyvas ląsteles apėmė makrofagai. Priešingai, aktyvioji kaspazė-3 buvo nustatyta E14.5 užkrūčio liaukame Apaf-1 - / - embrionuose. Vaisiaus timocitų gydymas staurosporinu, bet ne etopozidu, paskatino 3 ir 9 procaspazių apdorojimą, parodydamas, kad E14.5 timocitai turi galimybę atlikti kaspazių priklausomą apoptozę priklausomai nuo Apaf-1 . Taigi atrodo, kad užprogramuotą ląstelių žūtį kuriant pelę, kuri paprastai vykdoma naudojant veiksmingą nuo Apaf-1 priklausomą mechanizmą, palaiko nepriklausomos „Apaf-1“ mirties sistemos.

Pagrindinis

Gyvūnų vystymosi metu susidaro daug nenaudingų ir toksiškų ląstelių, kurios pašalinamos užprogramuotos ląstelių mirties dėka, kurią daugiausia skatina apoptozė. 1, 2 Apoptozę lydi morfologiniai pokyčiai, tokie kaip ląstelių pūtimas ir kondensacija, membranos simetrijos praradimas ir branduolio kondensacija. 3 Vėliau, apoptozės metu, mirštančios ląstelės suskaidomos į mažus „apoptozinius kūnus“, kuriuos fagocitai atpažįsta kaip sugertis. Šis morfologinis ląstelių pokytis ir greitas jų sunaikinimas skiriasi nuo nekrozės, kai ląstelės išsipučia, plazmos membranos plyšta, ir manoma, kad ląstelių turinys išsiskiria.

Signalo perdavimas, susijęs su apoptozinių ląstelių mirtimi, buvo intensyviai tiriamas 4, 5 ir parodyta, kad jis eina dviem pagrindiniais keliais - išoriniu ir vidiniu. Išoriniame kelyje signalai iš mirties receptorių, tokių kaip Fas ir TNF receptoriai, suaktyvina kaspazę iniciatorę, kaspazę-8, kuri suaktyvina pasroviuose esančias efektorines kaspazes, daugiausia kaspazę-3, ir todėl skaidosi daugiau nei 300 ląstelinių baltymų. 6, 7 Vienas iš kaspazės-3 substratų yra kaspazės aktyvuotos DNazės (CAD) inhibitorius, o jos skaidymas kaspazės-3 dėka inaktyvuoja gebėjimą susieti su CAD, leisdamas CAD sukelti chromosomų DNR suskaidymą į nukleosominius vienetus. 8 Būdingu keliu mirties signalai išskiria citochromą c iš mitochondrijų per Bcl-2 šeimos baltymus, turinčius tik BH3. 9, 10 Citochromas c jungiasi prie „Apaf-1“ ir aktyvuoja kaspazę-9, o tai skatina kaspazės-3 ir CAD aktyvavimą, dėl to ląsteliniai substratai suskaidomi ir chromosomų DNR suskaidoma. Apoptozinės ląstelės, kurios miršta vidiniu ar išoriniu keliu, savo paviršiuje išskiria fosfatidilseriną. 11 makrofagai ir nesubrendusios dendritinės ląstelės atpažįsta fosfatidilseriną ir greitai įsisavina apoptozines ląsteles. 12 Sugertos negyvos ląstelės perkeliamos į lizosomas, kur visi jų komponentai yra suardomi.

Vidinio apoptotinio kelio vaidmuo užprogramuotai ląstelių mirčiai buvo ištirtas nustatant peles, kurioms trūksta genų, dalyvaujančių apoptoziniame signalo perdavime. 13, 14, 15, 16, 17 Rezultatai, gauti su šiomis nokautuotomis pelėmis, ne visada buvo vienodi tarp grupių. Pavyzdžiui, Yoshida ir kt. 14 ir Kuida ir kt. 13 pranešė, kad „Apaf-1“ ir „kaspazė-9“ yra būtini ląstelių mirčiai, kurią sukelia citotoksiniai agentai ar γ- spinduliuotė įvairiuose audiniuose, tuo tarpu Marsden et al. 18 pranešė, kad limfocitai apoptozė be Apaf-1 ar kaspazės-9, kai trūksta citokinų. Be to, išskyrus „craniofacial“ anomalijas ir neuronų ląstelių hiperproliferaciją, pelės, kurių „ Apaf-1“ nepakanka, yra normalios, ypač C57BL / 6 fone 19, ir tai rodo, kad egzistuoja „Apaf-1“ tarpininkaujamos apoptozės atsarginė sistema. pelės vystymasis.

Kadangi mirštančios ląstelės greitai įsisavinamos ir skaidomos makrofagų, apoptozinių ląstelių aptikimas gyvūnams nėra lengva užduotis. DNase II yra atsakinga už apoptozinių ląstelių DNR virškinimą po to, kai makrofagai jas apkerpa, o DNR II trūkumu pasižyminčiuose embrionuose yra daugybė makrofagų, kuriuose yra įsisavintos DNR. 20, 21, 22 Čia mes panaudojome pelių DNase II trūkumą, kad aptiktume užprogramuotą ląstelių mirtį, kuri atsiranda kuriant pelę, ir nustatėme, kad Apaf-1 atrodo nepakeičiamas šiam procesui. Apaf-1 - / - embrionų šlaunikaulyje E14.5 kaspazės buvo aktyvuotos nepriklausomai nuo Apaf-1. Daugelyje kitų audinių ląstelės mirė nuo „Apaf-1“ nepriklausomo nepoptozinio mechanizmo ir buvo sugertos makrofagų. Šie rezultatai rodo, kad nuo „Apaf-1“ nepriklausomos sistemos su aktyvavimu kaspaze arba be jos veikia kaip atsarginės sistemos užprogramuotoms ląstelių žūtims žinduolių vystymuisi.

Rezultatai

Užprogramuota nuo „Apaf-1“ ląstelių žūtis pelių embrionuose E11.5 metu

Kai mes panaudojome TUNEL dažymą apoptozinėms ląstelėms aptikti laukinių E11.5 pelių embrionuose, tai davė vos aptinkamus signalus (duomenys nepateikti). „ Nuc-1“ , DNazės II homologo, mutacija sustiprina TUNEL teigiamą įtaką C. elegans . Panašiai pelės DNase II - / - embrionai rodė labai stiprius TUNEL signalus (1a pav.), Nes tai susikaupė DNR, suskaidytos CAD. 24 TUNEL teigiamos dėmės buvo dažnos keliuose regionuose, tokiuose kaip smegenų dangalų diencephalonas, galinės žandikaulio dalies somitai ir mezonofriniai latakai. Stebėjimai didesniu padidinimu parodė, kad TUNEL pozityvumas šiuose regionuose DNase II - / - buvo daug stipresnis nei laukinio tipo embrionuose. TUNEL teigiamos dėmės DNase II - / - embrionuose buvo sugrupuotos į židinius, kurie buvo DAPI teigiami (1b paveikslas). Židiniai buvo išdėstyti F4 / 80 teigiamų makrofagų viduje, kas rodo, kad jie buvo apimtų apoptozinių ląstelių DNR. Lavonų įsisavinimas C. elegans reikalauja aktyvuoti kaspazę; Ced-3 arba Ced-4 mutacija, atitinkamai kaspazės ir Apaf-1 homologai, užkerta kelią ląstelių įsiskverbimui. Atitinkamai, niekinė „ Apaf-1“ mutacija blokavo TUNEL teigiamų židinių susidarymą (1a ir b paveikslai), rodančius, kad apoptozinė ląstelių žūtis ir negyvų ląstelių įsisavinimas E11.5 pelių embrionuose, matyt, priklausė nuo „Apaf-1“.

Image

„Apaf-1“ priklausoma užprogramuota ląstelių mirtis DNase II - / - pelių embrionuose E11.5. a ) E11.5 sveikų embrionų dažymas tuneliu. Parafino skyriai iš E11.5 Apaf-1 +/− DNase II - / - ir Apaf-1 - / - DNase II - / - embrionų buvo dažomi TUNEL, po to dažant metilo žalia. Masto juosta = 500 μm . b ) įvairių audinių, gautų iš E11.5 embrionų, TUNEL dažymas. Diencephalono, lamina terminalis ir somitų parafino sekcijos iš E11.5 Apaf-1 +/− DNase II + / +, Apaf-1 +/− DNase II - / - ir Apaf-1 - / - DNase II - / - embrionai buvo dažomi TUNEL, prieš tai padengti metilo žalia ir stebimi mikroskopu. Norėdami dažyti F4 / 80, kriosekcijos iš E11.5 Apaf-1 +/− DNase II - / - pelių embrionų buvo dažytos DAPI ir žiurkės MAb prieš pelės F4 / 80, po to inkubuojamos su peroksidaze konjuguotu triušio anti-žiurke. Ig, ir aptinkamas naudojant Cy3 pažymėtą tiramidą. Dažymo profiliai su DAPI ir anti-F4 / 80 yra sujungti ir parodyti vidurinėse plokštėse. Embrionų poliškumas nurodomas kairiosiose plokštėse. a, priekinis; p, užpakalinė; d, dorsalis; v, ventralinis. Geltonos rodyklės galvutės rodo makrofagus, kuriuose yra nesuardyta DNR. Masto juosta = 100 μm

Visas dydis

„Apaf-1“ nepriklausoma užprogramuota ląstelių mirtis pelių embrionuose

Daugybė TUNEL teigiamų židinių taip pat buvo pastebėti DNase II - / - embrionuose, esant E14.5 (duomenys nepateikti). DNazės II embrionai gamina IFN β, kuris yra mirtinas, tačiau mirtingumą gali išgelbėti I tipo IFN receptorių trūkumas. 26 Norėdami atmesti galimą ląstelių žūtį, kurią sukelia IFN β , mes atlikome TUNEL dažymą DNase II - / - IFN-IR - / - embrionais. Įvairiuose DNase II - / - IFN-IR - / - embrionų audiniuose vis dar buvo galima aptikti daug TUNEL teigiamų židinių (2a paveikslas; duomenys nepateikti), kas rodo, kad DNaz II - / - embrionų ląstelės žuvo. pelės embriogenezei, o ne dėl antrinio IFN β poveikio. Nulinė „ Apaf-1“ mutacija blokavo TUNEL teigiamų židinių susidarymą daugumoje E14.5 DNazės II - / - IFN-IR - / - embrionų audinių. Pvz., Daugybė TUNEL teigiamų židinių buvo DNase II - / - IFN-IR - / - embrionų užpakalinių letenų interdigituose, o šiame regione buvo galima aptikti aktyvuotos kaspazės-3 (2a ir b paveikslai). „ Apaf-1 “ trūkumas užkirto kelią kaspazės aktyvacijai ir TUNEL teigiamų židinių atsiradimui. Tikriausiai dėl apoptozinių ląstelių mirties slopinimo interdigitų formavimasis sulėtėjo Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - embrionuose, palyginti su Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN. -IR - / - embrionai, kaip pranešama pelėms „ Apaf-1“ . 14

Image

Užprogramuota ląstelės žūtis interdigite. ( a ir b ) Užprogramuota ląstelių žūtis E14.5. Užpakalinių letenų parafino pjūviai ( a ) arba kriosekcijos ( b ) iš E14.5 Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinė) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - (apatiniai) embrionai buvo dažomi DAPI ir TUNEL ( a ) arba DAPI ir neapdorotu kaspazės-3 mAb ( b ). Masto juosta = 100 μm . ( c ir d ) Užprogramuota ląstelių žūtis E17.5. Užpakalinių letenų kriosekcijos iš E17.5 Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (kairėje) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - (dešinėje) embrionai buvo dažomi DAPI ( c ). ( C ) dėžutės sritys padidintos d punkte. Skyriai iš E17.5 Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinė) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - (apatiniai) pelių embrionai buvo dažyti po DAPI ir žiurkės mAb prieš pelės F4 / 80, po to inkubuojamas su peroksidaze konjuguotu triušio anti-žiurkės Ig ir aptiktas Cy3 pažymėtu tiramidu. Dažymo profiliai su DAPI ir anti-F4 / 80 yra sujungti dešiniajame skydelyje. Rodyklių galvutės nurodo makrofagus, kuriuose yra įsisavinta DNR. Mastelio juostos = 50 μm ( d ). e ) elektronų mikroskopija. Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinė) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - (apatinė) užpakalinių letenų E17.5 sekcijos. pelės buvo tiriamos elektronų mikroskopu. Makrofagai žymimi geltonomis linijomis. Juodomis ir raudonomis dėžėmis apsuptos sritys padidintos vidurinėje ir dešinėje plokštėse. N, branduolinė DNR iš apimtų negyvų ląstelių. Masto juosta = 1 μm

Visas dydis

E17.5 metu „ Apaf-1 + / + DNase II“ - / - IFN-IR - / - embrionuose buvo aptikta mažiau DAPI teigiamų židinių nei E14.5, kaip matyti, pavyzdžiui, tarpsluoksniuose (2c paveikslas) ), kuriuos visiškai suformavo E17.5. Embrionų „Apaf-1 - / - DNase II“ / - IFN-IR - / - embrionų interdigitai turėjo daugiau DAPI teigiamų židinių E17.5, nei E14.5, o šios DAPI teigiamos medžiagos buvo F4 / 80 teigiami makrofagai (2d paveikslas). Elektronų mikroskopija parodė, kad DNR, kaupiama makrofaguose tarp E17.5 Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - embrionų tarpsnių, yra suskaidyta, tuo tarpu DNR Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - embrionai buvo akivaizdžiai nepažeisti (2e paveikslas). Aktyviąją kaspazę-3 buvo galima aptikti „ Apaf-1 + / +“, bet ne „ Apaf-1 - / -“ embrionų interdigituose (duomenys nepateikti). Šie rezultatai leido manyti, kad vėlyvoje embriogenezėje tarpdalelių ląstelės galėjo mirti nepriklausomai nuo Apaf-1, o negyvos ląstelės buvo apimtos makrofagų.

Nuo „Apaf-1“ nepriklausoma nepoptozinė ląstelių mirtis

Pelės embrionuose, esančiuose ventraliniame ektoderminiame uodegos keteroje, daugelyje ląstelių žūsta užprogramuota ląstelių mirtis, kuri buvo nustatyta kaip DAPI teigiami židiniai DNase II - / - IFN-IR - / - embrionuose ties E14.5 (3a ir b paveikslai). ). Embrionuose „Apaf-1 + / + “ DNR, susikaupusi keteroje, buvo TUNEL teigiama, ir šiame regione buvo galima aptikti daugybę perdirbtų kaspazės-3 teigiamų ląstelių. Kita vertus, DNR, kuri kaupėsi „ Apaf-1 - / -“ embrionuose, buvo TUNEL neigiama, o apdirbtos kaspazės-3 teigiamos ląstelės buvo sunkiai aptinkamos. Kadangi DAPI teigiami židiniai buvo gana glaudžiai suskirstyti į uodegos vidurinę ektoderminę keterą (3c pav.), Mes šią sritį išanalizavome elektronų mikroskopija. Kaip parodyta 3d paveiksle, E14.5 Apaf-1 - / - embrionuose buvo aptikta daugybė neinformuotų, neopatotinių mirštančių ląstelių. T. y., Neišnešiotose mirštančiose ląstelėse buvo matomas chromatino kondensatas, branduolinės membranos atsiskyrimas ir plyšimas bei išsiplėtusios mitochondrijos. Maždaug 5% ląstelių, esančių E14.5 Apaf-1 - / - embrionų uodegos keteroje, turėjo neapototinę morfologiją (3e pav.), Tačiau apoptozės metu mirštančios ląstelės buvo sunkiai aptinkamos. Neapoptotinės negyvos ląstelės, esančios Apaf-1 + / + embrionų uodegos keteroje, buvo retos, apie 1%, tačiau ląstelių, turinčių apoptozinių savybių, tokių kaip kondensuoti ir suskaidyti branduoliai, buvo palyginti gausu (1, 72%). Šie rezultatai parodė, kad ląstelėse, esančiose uodegos keteroje, buvo atlikta nepoptozinė ląstelių mirtis, nesant Apaf-1, ir kad šios negyvos ląstelės buvo apimtos makrofagų.

Image

Nuo „Apaf-1“ nepriklausoma nepoptozinė ląstelių mirtis. ( a - c ) Užprogramuota ląstelių žūtis uodegoje. Parafino pjūviai ( a ) arba uodegos kriosekcijos ( b ) iš E14.5 Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinė) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN -IR - / - (apatiniai) embrionai buvo dažyti DAPI ir TUNEL ( a ) bei DAPI ir triušio mAb prieš apdorotus kaspazės-3 ( b ). Masto juosta = 100 μm . ( C ) punkte, skersinis uodegos pjūvis iš Apaf-1 +/− DNase II - / - IFN-IR - / - embriono E14.5 dažytas toluidino mėlyna spalva. Mastelio juostos = 100 μm . d ) elektronų mikroskopija. „ Apaf-1 + / + DNase II +/− IFN-IR - / - (kairė) ir„ Apaf-1 - / - DNase II + / + IFN-IR - / - “E14.5 uodegos sekcijos iš vidurio ir dešinės ) embrionai buvo analizuojami elektroniniu mikroskopu. Parodytos apoptozinės ląstelės Apaf-1 + / + embrionuose (kairėje) ir neapoptozinės negyvos ląstelės (viduryje ir dešinėje) Apaf-1 - / - embrionuose. Rodyklių galvutės rodo išsiplėtusias mitochondrijas. Masto juosta = 1 μm . e ) Nepaapototinių negyvų ląstelių padidėjimas Apaf-1 - / - uodegoje. Surinkti elektronų mikrografijos (55 × 55 μm ) su mažu apaf-1 + / + arba +/− uodegos ventralinių dalių padidinimu ( c dėžute) c ir embrionų E14.5 ties E14.5., o iš 950 ląstelių buvo nustatytas negyvų apoptozinių ir neapoptotinių ląstelių procentas. Iš trijų embrionų gauti vidutiniai skaičiai

Visas dydis

Nuo apafa-1 nepriklausoma užkrūčio liauka

DN14 II - / - IFN-IR - / - embrionų užkrūčio ląstyje E14.5 buvo pastebėta daug TUNEL ir DAPI teigiamų židinių (4a paveikslas). Priešingai nei daugumoje kitų audinių, tokių kaip tarpai ir uodegos, šiame embriogenezės etape, TUNEL teigiami židiniai buvo ir Apaf-1 - / - užkrūčio liaukoje, kur taip pat buvo aptiktos perdirbtos kaspazės-3. Elektroninė mikroskopija parodė, kad DAPI teigiama medžiaga E14.5 užkrūčio ląstoje yra makrofagų viduje, o makrofaguose susikaupusi DNR yra suskaidyta tiek „ Apaf-1 + / +“, tiek „ Apaf-1“ / - užkrūčio šlaunyse (4b paveikslas). ). Šie rezultatai parodė, kad timocitai prie E14.5 gali suaktyvinti kaspazę-3 ir CAD, naudodami nuo „Apaf-1“ nepriklausomą mechanizmą.

Image

Užprogramuota vaisiaus užkrūčio ląstelių mirtis. a ) Užprogramuota ląstelių žūtis E14.5. Užkrūčio ląstos parafino skyriai (kairėje) arba kriosekcijos (dešinėje) iš E14.5 Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinė) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN -IR - / - (apatiniai) embrionai buvo dažomi DAPI ir TUNEL, naudojant digoksigenino / anti-digoksigenino fluoresceino sistemą (kairėje) arba su neapdorotu kaspazės-3 mAb (dešinėje). Mastelio juostos = 100 μm . ( b ) užkrūčio ląstos E14.5 elektroninė mikroskopija. Atskirtys nuo E14.5 „ Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / ((viršutinė) ir„ Apaf-1 “ / - DNase II - / - IFN-IR - / - (apatinių) embrionų užkrūčio ląstos. buvo analizuojami elektroniniu mikroskopu. Buvo padidintos dėžučių zonos. N, branduolinė DNR iš apimtų negyvų ląstelių; MN, makrofagų branduoliai. Masto juosta = 1 μm . c ) užprogramuota ląstelių žūtis E17.5. Gretimos užkrūčio šlaunies kristalizacijos iš E17.5 embrionų naudojant Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinę) ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - ( apatiniai) embrionai buvo dažomi DAPI ir TUNEL (kairėje) arba anti-perdirbtu kaspazės-3 mAb. Mastelio juostos = 100 μm . Dešinėje sekcijos buvo nudažytos DAPI ir žiurkės mAb prieš F4 / 80, ir jų dažymo profiliai buvo sujungti. Geltonos strėlės antgaliai rodo makrofagus, kuriuose yra įsisavinta DNR. Masto juosta = 100 μm . d ) užkrūčio ląstos E17.5 elektroninė mikroskopija. Atskirtai nuo Ef.5.5 „Apaf-1 + / + DNase II - / - IFN-IR - / - (viršutinio) ir„ Apaf-1 “ / - DNase II - / - IFN-IR - / - (apatinio) embrionų užkrūčio buvo analizuojami elektroniniu mikroskopu. Kairėje esančių skydų dėžutės buvo padidintos gretimose dešinėse skydose. N, branduolinė DNR iš apimtų negyvų ląstelių; MN, makrofagų branduoliai. Mastelio juostos = 2 μm

Visas dydis

E17.5 Apaf-1 - / - užkrūčio liauka taip pat turėjo DAPI teigiamus židinius (4c paveikslas). Tačiau, priešingai nei E14.5 Apaf-1 - / - užkrūčio liauka, E17.5 Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - užkrūčio ląstos židinių TUNEL reaktyvumas buvo labai silpnas, o perdirbta kaspazė-3 vos nebuvo aptinkama. Dažymas F4 / 80 parodė, kad DAPI teigiami židiniai Apaf-1 - / - užkrūčio ląstoje yra makrofagų viduje (4c paveikslas), o elektroninė mikroskopija parodė, kad makrofaguose susikaupusi DNR yra nepažeista (4d paveikslas). Šios E17.5 apaf-1 - / - užkrūčio ląstos savybės skyrėsi nuo užkrūčio šlaunies E14.5 savybių, tačiau panašios kaip ir kituose audiniuose (tarpdančiuose ir uodegoje) E14.5 ir 17, 5.

„Apaf-1“ nepriklausomas kaspazės aktyvinimas

Norėdami ištirti, ar timocitai gali būti mirę nuo kaspazės priklausomų apoptozinių ląstelių, nesant Apaf-1, paruošėme timocitus iš laukinio tipo ir Apaf-1 - / - E14.5 embrionų. Jie buvo gydomi dviem skirtingais apoptozės induktoriais etopozidu ir staurosporinu, o kaspazės-3 aktyvumas ląstelių lizatuose buvo nustatytas fluorescenciniu substratu Ac-DEVD-AMC. Kaip parodyta 5a paveiksle, ląstelėse, esančiose laukinio tipo, bet ne Apaf-1 trūkumu turinčiuose timocituose, apdorotuose 50 μM etopozidu, ląstelių lizatuose buvo galima aptikti stiprų kaspazės-3 aktyvumą (apie 5600 U). Ląstelių lizatai iš timocitų, apdorotų 10 μM staurosporinu, taip pat parodė kaspazės-3 aktyvumą (apie 1300 U). Skirtingai nuo gydymo etopozidu, ląstelių lizatai, gauti iš staurosporinu gydytų Apaf-1 - / - timocitų, turėjo reikšmingą kaspazės-3 aktyvumą (500 V). Aktyvioji kaspazė-3 dažnai išsiskiria iš ląstelių į supernatantą. Iš tikrųjų su staurosporinu apdorotų Apaf-1 + / + ir Apaf-1 - / - timocitų supernatantas turėjo didelį kaspazės-3 aktyvumą (10 000–15 000 U). Priešingai, gydymas etopozidu sukėlė kaspazės-3 aktyvumą supernatante su Apaf-1 + / + timocitais , bet ne su Apaf-1 - / - timocitais . Šie rezultatai parodė, kad etoposidas gali suaktyvinti kaspazę-3 E14.5 timocituose priklausomai nuo Apaf-1, tuo tarpu Apaf-1 yra būtinas staurosporino sukeltai kaspazės-3 aktyvacijai. Panašūs rezultatai gauti su E17.5 timocitais, tai yra staurosporinu, bet ne su etopozidais aktyvuota kaspaze-3 E17.5 Apaf-1 - / - timocitais taip efektyviai, kaip su Apaf-1 + / + timocitais , nors aktyvuotos kaspazės apimtis -3 vienoje ląstelėje yra žymiai mažesnė nei nustatyta E14.5 timocituose (5a paveikslas).

Image

„Apaf-1“ nepriklausomas kaspazės aktyvinimas. a ) Kaspazės-3 aktyvinimas. Timocitai buvo gauti iš E14.5 arba E17.5 embrionų su Apaf-1 + / + arba Apaf-1 +/− (C) ir Apaf-1 - / - (K) genotipais ir apdoroti 10 μM staurosporinu arba 50 μM etopozido 4 val. Kaspazės aktyvumas ląstelių lizatuose ir supernatante buvo nustatytas naudojant Ac-DEVD-AMC, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. Kaspazės aktyvumas išreiškiamas savavališkai. Viena ng rekombinantinė žmogaus kaspazė-3 tokiomis pačiomis sąlygomis davė 14 100 V. Eksperimentai buvo atlikti du kartus su skirtinga vaisiaus užkrūčio liauka, parodytos vidutinės vertės. b ) Kaspazės-3 apdorojimas. Kairiajame skydelyje E17.5 embrionų timocitai su Apaf-1 + / + arba Apaf-1 +/− (C) ir Apaf-1 - / - (K) genotipais buvo apdoroti 10 μM staurosporino (STS) 2 metus. valandą arba su 50 μM etopozidu (ETO) 4 h, ir ląstelių lizatai buvo tiriami Western blot metodu su triušio mAb prieš pelės kaspazę-3. Taip pat buvo tiriami ląstelių lizatai iš neapdorotų timocitų (0 val.). Didelės ir suskaidytos kaspazės-3 formos juostos pažymėtos rodyklėmis. Kaip pakrovimo kontrolė, membrana buvo pakartotinai nufotografuota BiP ir parodyta apačioje. Dešiniajame skydelyje timocitai buvo gydomi 4 valandas staurosporinu (STS) arba etopozidu (ETO). Supernatantas buvo nusodintas triušio mAb prieš suskaidytą kaspazę-3 ir atliktas vakarinis blotinimas su tuo pačiu mAb, po to inkubuojamas su HRP konjuguotu baltymu A. Suskaidytos kaspazės-3 juostos pažymėtos rodykle. c ) Kaspazės-9 apdorojimas. Emocijų timocitai su Apaf-1 + / + arba Apaf-1 +/− (C) ir Apaf-1 - / - (K) genotipais buvo apdoroti 10 μM staurosporinu (STS) 2 val. Arba 50 μg. M etopozidas (ETO) 4 val. Ląstelių lizatai iš STS ir ETO apdorotų ir neapdorotų (0 val.) Timocitų buvo atlikti Western blot tyrimu su pelės mAb prieš pelės kaspazę-9. Didelės ir suskaidytos kaspazės-9 formos juostos pažymėtos rodyklėmis. Membrana buvo pakartotinai nufotografuota BiP, ir parodyta apačioje

Visas dydis

Norėdami patvirtinti kaspazės-3 aktyvumą, aptiktą naudojant Ac-DEVD-AMC, dėl perdirbtos kaspazės-3, ląstelių lizatus išanalizavome Western blot metodu naudodami antikūną prieš kaspazę-3. Kaip parodyta 5b paveiksle, su staurosporinu apdorotų Apaf-1 + / + ir Apaf-1 - / - timocitų lizatai parodė 17 kDa juostą perdirbtai kaspazei-3. Ši juosta buvo aptikta etopozidais apdorotų Apaf-1 + / +, bet ne Apaf-1 - / - timocitų lizatuose , o jos intensyvumas koreliavo su aptiktu kaspazės-3 aktyvumu (5a paveikslas). Kai kultūros supernatantai iš staurosporinu arba etopozidais apdoroto E17.5 Apaf-1 + / + timocitų buvo nusodinti antikūnu prieš perdirbtą kaspazę-3, jie parodė 17 kDa juostą Western blot metodu su antikūnu prieš perdirbtą kaspazę-3. (5b pav.). Tačiau etopozidais apdoroto E17.5 Apaf-1 - / - timocitų imunoprecipitate nebuvo nustatyta 17 kD juostos , kuri sutinka su nedideliu kaspazės-3 aktyvumu supernatante (5a pav.).

Vidiniame apoptoziniame kelyje „Apaf-1“ veikia kaip pastoliai, kad suaktyvintų kaspazę-9, kuri skatina procaspazės-3 apdorojimą. 10 Norėdami ištirti kaspazės-9 dalyvavimą kaspazės-3 aktyvavime nuo nepriklausomo „Apaf-1“, atlikome „Western blot“ analizę naudodami antikapazę-9. Kaip parodyta 5c paveiksle, 37 kDa perdirbta kaspazė-9 buvo galima aptikti lizatuose iš staurosporinu apdorotų Apaf-1 + / +, taip pat Apaf-1 - / - timocitų. Priešingai, procaspazės-9 perdirbimas etopozidais apdorotuose timocituose buvo stebimas Apaf-1 + / + timocituose , bet ne Apaf-1 - / - timocituose . Šie rezultatai rodo, kad staurosporinas, bet ne etopozidas, gali suaktyvinti kaspazę-9, kai nėra Apaf-1.

Diskusija

Daug žinduolių miršta žinduolių vystymosi metu. Tačiau kadangi negyvos ląstelės greitai įsisavinamos makrofagais, kad būtų skaidomos, jas sunku aptikti. Pavyzdžiui, užkrūčio užkrūčio vystymosi metu daugiau nei 90% timocitų užprogramuota ląstelių žūtis. Tačiau tik nedidelę dalį ląstelių TUNEL gali dažyti tam tikru laiko momentu. 28 Daugybė neuronų taip pat patiria užprogramuotą ląstelių mirtį smegenyse, tačiau tyrėjų pranešimų skaičius labai skiriasi ( 29, 30, 31), greičiausiai dėl to, kad sunku nustatyti negyvas ląsteles, kurios greitai pašalinamos. Čia mes panaudojome DNase II - niekines peles, kad nustatytume užprogramuotą ląstelių mirtį, kuri įvyksta pelių embriogenezės metu. Pelės, esančios DNase II- niekoje, nešė įvairiuose audiniuose esančius makrofagus, kuriuose buvo nesuvirškinta DNR, ir tai rodo, kad ląstelės mirė apsupdamos makrofagus ir buvo pasinėrusios. Nors sunku nustatyti, kurios ir kiek ląstelių mirė, DNase II - / - pelės vis dėlto buvo naudingos lokalizuojant regionus, kuriuose įvyksta užprogramuota ląstelių mirtis. Makrofagai, turintys nesuvirškintą DNR, ilgainiui išnyko, tikriausiai todėl, kad tie, kurių DNR krūvis yra didelis, negalėjo išgyventi, tai rodo, kad DNase II - / - pelės taip pat gali būti naudojamos įvertinti laiką, kada įvyksta užprogramuota ląstelių mirtis. Tiesą sakant, mes sugebėjome parodyti, kad tam tikruose smegenų neuronų sluoksniuose užprogramuota ląstelių žūtis tam tikruose pelės embriogenezės etapuose (AN, KK ir SN, rankraštis rengiamas).

Kryžiuodami pelių „ Apaf-1 - / -“ su „ DNase II“ - / - pelėmis, mes parodėme, kad didžioji dalis apoptozinių ląstelių žūties pelių embrionų vystymosi metu vyksta per „Apaf-1“ priklausomą kelią. Tai sutinka su ankstesniais pranešimais, kad „ Apaf-1“ arba „ kaspazės-9“ geno ištrynimas blokuoja apoptozinę ląstelių mirtį smegenyse ir ausyse. 13, 14 Panašiai apoptozinę ląstelių mirtį E17.5 užkrūčio liaukoje taip pat sustabdė Apaf-1 trūkumas, tai rodo, kad neigiami ir teigiami CD4 + CD8 + timocitų atrankos vyksta nuo Apaf-1 priklausomu keliu. Priešingai, labai stebėtinai mes nustatėme, kad kaspazė-3 gali būti suaktyvinama be „Apaf-1“ E14.5 užkrūčio liaukoje, kurioje dauguma timocitų yra CD4 - CD8. 32 Be to, staurosporinas, bet ne etopozidas, aktyvuoja kaspazę-3 vaisiaus timocituose be „Apaf-1“. Etopozidas ir staurosporinas yra atitinkamai topoizomerazės ir kinazės C inhibitoriai. Buvo pranešta, kad abu jie suaktyvina kaspazę-3, atpalaiduodami citochromą c iš mitochondrijų. 33, 34 Taigi, netikėtas nė vienas „Apaf-1“ reikalavimas staurosporino sukeltai kaspazės-3 aktyvacijai vaisiaus timocituose. Šis rezultatas rodo, kad staurosporinas gali suaktyvinti kaspazę-3 timocituose per kelią, kuriame nenaudojamas citochromas c , ir šis kelias gali būti panašus į tą, kuris naudojamas nepriklausomai nuo Apaf-1 nepriklausančių apoptozinių ląstelių mirties E14.5 timocitų. Mes pastebėjome, kad kaspazė-3 gali būti suaktyvinama be „Apaf-1“ ne tik vaisiaus užkrūčio liaukoje, bet ir vaisiaus kepenyse (AN, KK ir SN, nepaskelbtas stebėjimas), o tai gali atitikti pranešimus, kad hemopoetinės ląstelės atstatomos vaisiaus kepenyse. ląstelės gali suaktyvinti kaspazę be „Apaf-1“. 18, 35, 36 Norint suprasti šią apoptozę, reikės nustatyti, kaip ir kurias kaspazes aktyvuoja staurosporinas be „Apaf-1“.

Netgi kai kaspazė nebuvo suaktyvinta pelėse, kuriose trūksta „Apaf-1“ , embrione buvo makrofagai, turintys nesuvirškintą DNR, ypač vėlyvame vystymosi etape, tai rodo, kad ląstelės galėjo mirti be „Apaf-1“, ir buvo apimtos makrofagų. Tai sutinka su ankstesne ataskaita, rodančia, kad mieloidinės ląstelės miršta be „Apaf-1“ ar „Kaspazės-9“. 37 Buvo pasiūlyti keli nuo „Apaf-1-“ arba nuo kaspazės nepriklausomi ląstelių mirties procesai, įskaitant autofaginę ląstelių mirtį ir nekrozę. Kaip pranešama apie „ Apaf-1 - / -“ embrionų tarpsnius , 39, „ Apaf-1 - / -“ uodegos ektoderminiame keteroje aptikome daugybę ląstelių, turinčių dėmėto chromatino kondensaciją, branduolinės membranos atsiskyrimą ir plyšimą bei išsiplėtusias mitochondrijas. Tuo tarpu nė vienos ląstelės, turinčios autofagijos požymių (dvigubai membraninės vakuolės), rodančios, kad ląstelės greičiausiai mirė dėl nekrozės. Viena iš galimų neapototinių ląstelių mirties priežasčių yra ta, kad dirgikliai, sukeliantys užprogramuotą ląstelių mirtį pelių embriogenezėje, išskiria citochromą c , suaktyvindami mitochondrijų funkciją, dėl kurios ląstelės žūva. Pelėms, kurioms trūksta ir Bak, ir Bax, kurios yra būtinos citochromo c 40 išsiskyrimui, išryškėja tarpdalinių audinių ilgis 17, o tai rodo, kad Bak / Bax gali sukelti nekrozinių ląstelių mirtį, išlaisvindamas citochromą c . Įdomu bus ištirti, ar niekinės Bax ir Bak mutacijos gali užkirsti kelią makrofagų, turinčių nesuvirškintą DNR DNase II embrionuose, generavimui.

Apaf-1 - / - embrionuose makrofaguose rasta negyvų ląstelių, tai rodo, kad neapoptotinės negyvos ląstelės buvo atpažįstamos makrofagų įsisavinimui. Sergant C. elegans , bendras genų rinkinys padeda pašalinti ir apoptozinius, ir nekrotinius ląstelių lavonus. 41 Ir atvirkščiai, buvo pasiūlyti skirtingi mechanizmai, kaip išvalyti žinduolių sistemos apoptozės ir nekrozės ląsteles. Apoptozinės ląstelės išskiria fosfatidilseriną, kurį atpažįsta specifiniai receptoriai arba opsoninai, kad jie pasisavintų. 12 Kadangi nekrotinės ląstelės taip pat išskiria fosfatidilseriną vėlyvoje stadijoje 38, gali būti, kad panašūs receptoriai arba opsoninai tarpininkauja apoptozinių ir nekrozinių ląstelių įsisavinimui. Komplemento sistema yra dar vienas kandidatas įsisavinti vėlyvas apoptozines ar nekrotines ląsteles. 43 Bus įdomu ištirti nekrozinių ląstelių įsisavinimą, sukryžiavus pelių „ Apaf-1 - / -“ su pelėmis, turinčiomis apoptozinių ar nekrotinių ląstelių. Pelių audiniuose sunku rasti nepanaudotų apoptozinių ląstelių. Tačiau Apaf-1 - / - embrionuose dažnai aptikome negyvas negyvas ląsteles, kurių morfologija neapoptotinė , ir tai rodo, kad negyvų negyvų ląstelių įsisavinimas yra neveiksmingas, palyginti su apoptotinėmis ląstelėmis. Tai gali leisti kenksmingoms medžiagoms išsiskirti iš mirštančių ląstelių. Be to, žinoma, kad nekrozinių, bet ne apoptozinių ląstelių įsisavinimas sukelia uždegiminių citokinų išsiskyrimą. 46 Šiuo atžvilgiu bus įdomu ištirti, ar normaliai besivystančios „ Apaf-1“ / - pelės kenčia nuo uždegiminių ligų.

Medžiagos ir metodai

Pelės

C57BL / 6 pelės buvo įsigytos iš „Nippon SLC“ (Hamamatsu, Japonija) arba „Shimizu Laboratory“ (Kiotas, Japonija) reikmenų. „DNase II“ / - pelės 20 buvo 6 kartus išnuomotos C57BL / 6. IFN-IR - / - pelės 47 C57BL / 6 fone buvo gautos iš Michel Aguet (Šveicarijos eksperimentinių vėžio tyrimų institutas, Epalinges, Šveicarija). „Apaf-1 - /“ pelės C57BL / 6 fone buvo aprašytos anksčiau. 14, 19 DNase II - / - IFN-IR - / - pelių ir Apaf-1 - / - DNase II - / - IFN-IR - / - embrionai buvo sukurti sukryžminus Apaf-1 +/− DNase II - / - IFN -IR - / - tėvai. Pelės buvo laikomos specialiose patogenų neturinčiose patalpose Osakos universiteto medicinos mokykloje ir Rytų biologinėje tarnyboje. Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti vadovaujantis Osakos arba Kioto universiteto eksperimentų su gyvūnais gairėmis. Norėdami nustatyti DNazės II ir IFN-IR alelių genotipą, mes paruošėme DNR iš embriono audinių arba suaugusiųjų uodegos susegimo audinių, kaip aprašyta 48 ir išanalizuota naudojant PGR. DNase II genui - sensacinis pradmuo, būdingas laukinio tipo (5′-GCCCATCTAGACTAACTTTC-3 ′) arba mutantinio alelio (5′-GATTCGCAGCGCATCGCCTT-3 ′); neomicinui atsparaus geno seka) buvo naudojama su įprastu antisense pradmeniu (5′-GAGTCTTAGTCCTTTGCTCCG-3 ′). Laukinio tipo ir mutantiniai aleliai IFN-IR buvo tiriami naudojant laukinio tipo (5′-AAGATGTGCTGTTCCCCTTCCTCTGCTCTGA-3 ′) arba specifiniams mutantams (5′-CCTGCGTGCAATCCATCTTG-3 ′) antisense pradmenis ir sveiko proto pradmenis (5 ′). -ATTATTAAAAGAAAAGACGAGGCGAAGTGG-3 ′). „ Apaf-1“ aleliui buvo naudojamas laukinio tipo (5′-CTCAAACACCTCCTCCACAA-3 ′) arba mutantui (5′-GGGCCAGCTCATTCCTC-3 ′) jutimo pradmuo su įprastu antisense pradmeniu (5′-GTCATCTGGAAGGGCAGCGA-3 ′). ).

Histocheminė analizė su parafino skyriais

Embrionai buvo fiksuojami 4% PFA 0, 1 M Na-fosfato buferyje (pH 7, 2), turinčiame 4% sacharozės, esant 4 ° C, daugiau kaip 1 dieną, purtant. Jie palaipsniui dehidratuojami, kiekvieną valandą panardinant į 50, 70, 80 ir 90% etanolį kambario temperatūroje, po to du kartus po 100% etanolyje. Mėginiai du kartus mirkomi 100% ksileno kambario temperatūroje 1 valandą ksileno ir parafino mišinyje santykiu 1: 1, esant 60 ° C. Jie buvo įterpti į parafiną iš eilės inkubuojant parafiną 12 ir 4 valandas 60 ° C temperatūroje, ir pjaustomi 4 μm atstumu, naudojant mikrotomą (RM2245; Leica, Solms, Vokietija).

TUNEL dažymui pjūviai buvo apdoroti kambario temperatūroje 20 minučių 20 μg / ml proteinazės K ir dažomi Apoptag rinkiniu (Millipore, Bedfordas, MA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas, išskyrus tai, kad terminalo kiekis transferazės sumažėjo iki 10% rekomenduojamos koncentracijos. Skyriai buvo sumontuoti naudojant „Mount-Quick“ („Daido Sangyo“, „Toda“, „Saitama“, Japonija) arba „Fluoromount“ („Diagnostic BioSystems“, Plezantonas, Kalifornija, JAV) ir stebimi fluorescencine mikroskopija (IX-70; „Olympus“, Tokijas, Japonija arba „BioRevo BZ-9000“). ; Keyence, Osaka, Japonija).

Histocheminė analizė su kriosekcijomis

Embrionai buvo fiksuojami 4 ° C temperatūroje 4% PFA, turinčiame 4% sacharozės 0, 1 M Na-fosfato buferiniame tirpale (pH 7, 2) 2 valandoms, paeiliui panardinant į 10 ir 20% sacharozės turinčio 0, 1 M Na-fosfato buferio (pH 7, 2). 4 valandas per naktį, kiekvieną dieną įmerkiant į UŠT junginį (Sakura Finetek, Tokijas, Japonija) ir užšaldytas skystame azote. Skyriai (10 μm ) buvo paruošti naudojant kriostatą (CM3050 S; Leica) šaltyje (nuo –16 iki –25 ° C).

Norėdami aptikti aktyvią kaspazę-3, pjūvius 10 min. Fiksavome 4% PFA tirpalu PBS kambario temperatūroje ir uždengėme 5% normaliu ožkos serumu PBS, turinčiame 0, 3% Triton X-100 kambario temperatūroje, 1 val. Jie buvo dažomi 4 ° C temperatūroje per naktį su 100 kartų praskiestu triušio monokloniniu antikūnu (mAb) prieš aktyvųjį kaspazę-3 (klonas 5A1E; Cell Signaling, Danvers, MA, JAV), po to inkubuojami kambario temperatūroje 1 valandą su Cy3. -konjuguotas ožkų anti-triušio IgG („Jackson Laboratories“, West Grove, PA, JAV).

Norėdami dažyti F4 / 80 antigeną, žiurkės hibridoma prieš pelės F4 / 80 49 buvo auginama GIT terpėje be serumo (Nihon Pharmaceutical, Tokijas, Japonija). Pelių embrionų kriosekcijos buvo fiksuotos kambario temperatūroje 10 min., Naudojant 1% PFA PBS. Po blokavimo 10% normalaus triušio serumo ir 0, 5% BSA PBS kambario temperatūroje 1 valandą, sekcijos buvo inkubuojamos 4 ° C temperatūroje per naktį su F4 / 80 hibridomos supernatantu ir plaunamos PBS, turinčiu 0, 5% BSA. Endogeninė peroksidazė buvo užgesinta, inkubuojant 4 ° C temperatūroje 20–30 min., Naudojant 3% H 2 O 2 metanolyje, ir inkubuojama kambario temperatūroje 45 min. Su peroksidaze konjuguotu triušio anti-žiurkės Ig (Dako, Kopenhaga, Danija). . Signalai buvo aptikti inkubuojant kambario temperatūroje 5 minutes su Cy3 pažymėtu tiramidu (PerkinElmer, Bostonas, MA, JAV).

TUNEL dažymas buvo atliktas, kaip aprašyta aukščiau, išskyrus tai, kad galinės transferazės koncentracija buvo sumažinta iki 0, 4–0, 5% nuo tos, kurią rekomendavo gamintojas. Skyriai buvo sumontuoti su jungiamuoju reagentu, kuriame yra 1–2 μg / ml DAPI (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japonija), ir stebimi mikroskopu, kaip aprašyta anksčiau.

Elektronų mikroskopija

Embrioniniai audiniai buvo fiksuojami inkubuojant 4 ° C temperatūroje 2 valandas 0, 1 M Na-fosfato buferyje (pH 7, 2), turinčiame 2% PFA ir 2% glutaraldehido. Po penkis kartus plaunami 0, 1 M Na-fosfato buferiu (pH 7, 2) 4 ° C temperatūroje 20 minučių, mėginiai 2 valandas buvo fiksuojami 4 ° C temperatūroje, naudojant 1% OsO4 tame pačiame buferyje, ir dehidratuoti. 4 ° C temperatūroje, po 10 minučių panardindami į rūšiuojamą kategoriją (50, 60, 70, 80, 90, 99%) etanolio. Po dviejų 20 minučių panardinimo į 100% etanolio mėginiai 20 min buvo inkubuojami du kartus 35 ° C temperatūroje propileno okside, propileno oksido ir epoksidų mišinyje 3: 1 3: 1 propileno mišinyje. oksidą ir epoksidą 1 valandą, o epoksidą per naktį. Tada jie buvo įterpti į epoksidą, inkubuojant 60 ° C temperatūroje 3 dienas. Itin ploni pjūviai (80–90 nm) buvo paruošti naudojant ultraramotomą (Ultracut N; Reichert-Nissei, Kumamoto, Japonija), dažytus uranilacetatu ir švino citratu, ir stebimi naudojant Hitachi H-7650 mikroskopą (Hitachi High-Technologies, Tokijas)., Japonija).

Kaspazės-3 tyrimas

Tymocitai (4 × 10 4 ląstelės 100 μl) iš E14.5 embrionų arba timocitai (5 × 10 5 ląstelės 200 μl) iš E17.5 embrionų buvo apdoroti 10 μM staurosporinu arba 50 μM etopozidu DMEM, turinčiame 10% FCS. Kaspase-3 aktyvumas ląstelių lizatuose ir terpėje buvo nustatytas naudojant Caspase-3 Cellular Assay Kit PLUS (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, JAV) pagal gamintojo pateiktas instrukcijas. Trumpai tariant, ląstelės buvo surinktos centrifuguojant 5000 aps./min. 5 minutes, perplautos PBS ir lizuotos 50 μl lizės buferiu (50 mM HEPES-NaOH buferiu (pH 7, 4), 0, 1% CHAPS, 5 mM DTT ir 0, 1 mM). EDTA). Terpės arba ląstelių lizatų alikvotai (10 μl) 3 valandas buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje su 30 μM Ac-DEVD-AMC 100 μl tirpalo buferiu (50 mM HEPES-NaOH buferio (pH 7, 4), 100 mM. NaCl, 0, 1% CHAPS, 10 mM DTT, 1 mM EDTA ir 10% glicerolio), o fluorescencija buvo nustatyta naudojant 360 nm sužadinimo bangos ilgį ir 460 emisijos bangos ilgį, naudojant mikroteklių skaitytuvą (Infinite M200; Tecan, Männedorf, Šveicarija). ). Specifinis kaspazės-3 aktyvumas buvo nustatytas atimant reikšmes, gautas esant 0, 1 μM Ac-DEVD-CHO.

Western blot analizė

Vakariniam blotinimui ląstelės (5 × 105) buvo lizuojamos tiesiogiai, kaitinant 85 ° C temperatūroje 30 minučių 15 μl mėginio buferio (30 mM Tris-HCl (pH 6, 8), 1% SDS, 5% glicerolio, 2, 5). % 2-merkaptoetanolio ir 0, 0005% BPB). Baltymai buvo atskirti 10–20% gradientu SDS – PAGE ir perkelti į PVDF membranas (Millipore). Po užblokavimo blokuojančiu buferiu (Tris buferiniu tirpalu, kuriame yra 0, 05% Tween 20 (TBST), papildyta 5% neriebaus sauso pieno arba 4% Block Ace (DS Pharma Biomedical, Suita, Osaka, Japonija)), membranos buvo inkubuojamos 4 ° C per naktį triušio mAb prieš kaspazę-3 (klonas 8G10; ląstelių signalizavimas) arba pelės mAb prieš kaspazę-9 (klonas 5B4; MBL, Nagoja, Japonija) blokuojančiame buferyje. Po plovimo TBST membranos buvo inkubuojamos su HRP konjuguotu anti-triušio Ig arba anti-pelės Ig antikūnu kambario temperatūroje 1 valandą, o antikūno atpažinti baltymai buvo vizualizuojami chemiliuminescencijos reakcija (Immobilon Western, Millipore). Kaip įkrovos kontrolė buvo atliktas Western blot tyrimas su pelės mAb prieš BiP (Grp78) (40 klonas; BD Biosciences).

Norėdami gauti imunoprecipitaciją, kultūros supernatantas iš anksto išvalytas, inkubuojant du kartus 4 ° C temperatūroje su nProtein A-Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Upsala, Švedija) ir baltymo G-Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) 1: 1 mišiniu. 1, 5 val. Po sefarozės pašalinimo centrifuguojant, supernatantas buvo inkubuotas per naktį 4 ° C temperatūroje su triušio mAb prieš suskaidytą kaspazę-3 (klonas 5A1E; ląstelių signalizavimas), po to inkubuojamas su baltymo A-sefaroze. Po plovimo PBS, turinčio 1% Triton X-100, baltymai, surišti į granules, buvo išplaunami verdant SDS mėginio buferyje, atskirti 10–20% SDS – PAGE, pernešti į PVDF membraną ir atlikti triušio vakarinį blotinimą. mAb prieš suskaidytą kaspazę-3, po to inkubuojamas su HRP konjuguotu baltymu A (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV).

Žodynas

CAD

kaspazės suaktyvinta DNazė

mAb

monokloninis antikūnas