Arhgap17, rggtpazę aktyvinantis baltymas, reguliuoja gleivinės ir epitelio barjerą pelės dvitaškyje | mokslinės ataskaitos

Arhgap17, rggtpazę aktyvinantis baltymas, reguliuoja gleivinės ir epitelio barjerą pelės dvitaškyje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Virškinimo trakto ligos
  • Virškinimo trakto modeliai

Anotacija

Norint palaikyti epitelio ląstelių poliškumą, taip pat jų proliferacijai ir migracijai, reikalingas koordinuotas aktino citoskeleto reguliavimas Rho GTPazių šeimoje. Yra žinoma, kad RhoGTPazę suaktyvinantis baltymas 17 (Arhgap17) dalyvauja daugelyje ląstelių procesų in vitro , įskaitant sandarių sankryžų palaikymą ir pūslelių judėjimą. Tačiau Arhgap17 funkcija nebuvo ištirta fiziologiniame kontekste. Čia mes sukūrėme Arhgap17 turinčias peles ir ištyrėme jų poveikį žarnos epitelio ir gleivinės barjeruose. Žurnalistės dažymas atskleidė, kad Arhgap17 ekspresija apsiriboja žarnos žaizdiniu epiteliu. Pelėms, kurių organizme trūksta „Arhgap17“, yra padidėjęs tarpląstelinis pralaidumas ir abejotina viršūninės jungties komplekso lokalizacija ties žandikaulio epiteliu, tačiau nesivysto spontaninis kolitas. Vidinis gleivių sluoksnis yra nepralaidus žarnyno bakterijoms, nepriklausomai nuo Tff3 sumažėjusio pelių, kuriems trūksta Arhgap17. Įdomu, tačiau gydymas natrio dekstrano sulfato tirpalu (DSS) padidina DSS ir TNF produkcijos kaupimąsi intraluminalinėse ląstelėse ir greit sunaikina vidinį gleivių sluoksnį, todėl padidėja kolito sunkumas pelių mutantuose. Apskritai šie duomenys rodo, kad Arhgap17 atlieka naują funkciją - reguliuoti transceliulinį transportą ir išlaikyti žarnyno barjerų vientisumą.

Įvadas

Žarnyno epitelio ląstelės (IEC) atlieka pagrindinį vaidmenį pasisavinant maistines medžiagas ir užkertant kelią sisteminiam kenksmingų medžiagų įsiskverbimui į virškinimo traktą. Norėdami išsaugoti epitelio vientisumą, buvo sukurti du barjerai: gleivinės barjeras, kurį sudaro gleivių sluoksnis už IEC viršūninio paviršiaus ir epitelinis barjeras, jungiantis viršūninio jungimosi komplekso (AJC) baltymus tarp gretimų epitelio ląstelių 1 . Nepavykus bet kuriam barjerui atsiranda įvairių žarnyno patofiziologijos formų, įskaitant uždegimines žarnyno ligas (IBD) 2, 3, 4 . Gleivių sluoksnis apima vidinį ir išorinį gleivių sluoksnius, turinčius stipriai glikozilintus mucinus, išskiriamus iš žarnyno taurių ląstelių 3 . Vidinis gleivių sluoksnis veikia kaip fizinė kliūtis, neleidžianti bakterijoms prasiskverbti į liumeną, tuo tarpu išorinis gleivių sluoksnis yra buveinė kommensaliniams mikroorganizmams 5 . Genetinis Muc2, pagrindinio gleivių komponento, netekimas sukelia spontaninį pelių kolitą pelėse, parodant gleivinės barjero svarbą žarnyno bakterijoms 6 . DSS sukelto opinio kolito (UC) metu bakterijos prasiskverbia į vidinį gleivių sluoksnį dar ilgai iki uždegimo pradžios, o tai rodo, kad DSS gali tiesiogiai pakeisti gleivių savybes7. Vidinio gleivių sluoksnio pobūdis taip pat yra glaudžiai susijęs su patologinėmis pelių, kurioms trūksta pelių Il10 ir kurių UC 8, patologijomis.

AJC, įskaitant sandarią jungtį (TJ) ir adreno jungtį (AJ), IEC vaidina svarbų vaidmenį formuojant ir palaikant epitelio barjerus. TJ sudaro transmembraniniai adhezijos baltymai claudinai, oklludinas, JAM, tricellulinas ir pagrindiniai citoplazminiai pastolių baltymai ZO – 1, –2 ir –3 9 . Homofilinis transmembraninių baltymų adhezija tarp gretimų ląstelių riboja tarpląstelinę difuziją ir reguliuoja selektyvų pernešimą. ZO baltymai organizuoja TJ, jungdami transmembraninius baltymus su aktino citoskeletu. AJ sudaro E-kadherinas, pagrindinis transmembraninis adhezijos baltymas, ir citoplazminiai adapteriai, įskaitant p120-kateniną, β- kateniną ir α- kateniną, kurie E-kadherino citoplazminę uodegą jungia su aktino citoskeletu 2 . AJ suteikia mechaniškai lipnius ryšius tarp gretimų elementų ir taip pat padeda surinkti TJ. Epitelio barjero sutrikimas dėl AJC disfunkcijos, dėl kurios bakterijos, dietiniai antigenai ir mikroorganizmai prasiskverbia per epitelį, sukelia žarnyno patogenezę 4 .

AJC formavimąsi ir palaikymą reguliuoja daugybė veiksnių, įskaitant Rho GTPazių šeimą 10 . Rho GTPazės šeimos nariai, įskaitant Cdc42, Rac ir Rho pogrupius, veikia kaip molekuliniai jungikliai daugelyje ląstelių procesų, lydinčių citoskeleto organizaciją 11 . Rho GTPazių aktyvumą griežtai reguliuoja guanino nukleotidų mainų faktoriai (GEF) ir Rho GTPazę aktyvuojantys baltymai (GAP), kurie atitinkamai sukuria į GTP jungiamas aktyvias ir BVP ribojamas neaktyvias GTPazes 11 . Taikymas pagal geną atskleidė naują Rho GTPazių ir reguliatorių funkciją fiziologiniame kontekste 12, 13 . IEC specifinis Cdc42 išbraukimas pelėms daro įtaką ląstelių proliferacijai, diferenciacijai, migracijai ir poliškumui, todėl šie pokyčiai kartu sukelia rimtus žarnyno epitelio barjero ir homeostazės sutrikimus 14 . GAP reikšmė žarnyno barjerinei funkcijai yra pagrįsta Myosin IXB (MYO9B) - viengalvio molekulinio variklio, turinčio GAP aktyvumą, tyrimais. Genetiniai MYO9B variacijos yra labai koreliuojami su IBD 15, 16, o Rho tarpininkaujamo aktino citoskeleto struktūros trūkumas palaikant TJ gali prisidėti prie su MYO9B susijusių IBD 17 .

Iš pradžių Arhgap17 (dar žinomas kaip Rich1) buvo identifikuotas kaip neuronams būdingas GAP, dalyvaujantis reguliuojamoje egzocitozėje 18 . Kiek vėliau kita grupė atskleidė, kad tai Cip4 surišantis RhoGAP, plačiai ekspresuojama žmogaus audiniuose 19 . Abiejuose tyrimuose jie parodė, kad Arhgap17 moduliuoja Cdc42 ir Rac1 aktyvumą. Neseniai paaiškėjo, kad Arhgap17 prisideda prie TJ palaikymo, moduliuodamas Cdc42 aktyvumą, jungdamasis su TJ pastolių baltymu angiomotinu 20 . Be to, Arhgap17 tarpininkauja merlino naviko slopintuvo funkcijai, sumažindamas Rac1 aktyvumą po to, kai yra paleistas iš angiomotino-Arhgap17 komplekso TJ 21 . Palyginti su in vitro tyrimais, Arhgap17 funkcija yra daug mažiau apibrėžta fiziologiniuose kontekstuose, išskyrus išvadą, kad Arhgap17 Drosophila ortologas „dRich“ moduliuoja sinapsių augimą ir funkcijas, reguliuodamas Gbb sekreciją postsinapsinėse musių ląstelėse 22 . Norėdami dar labiau atskleisti Arhgap17 funkciją in vivo , sukūrėme Arhgap17 turinčias peles ir ištyrėme hipotezę, kad Arhgap17 gali reguliuoti epitelio barjerus žarnyne. Mes nustatėme, kad Arhgap17 ekspresijos praradimas žarnyno trakte sąlygoja dalinį AJC baltymų neteisingą lokalizavimą, šiek tiek padidėjant tarpląsteliniam pralaidumui, tačiau nesukelia savaiminio kolito. Tačiau pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, buvo padidėjęs jautrumas DSS sukeltam kolitui, kuris greičiausiai susijęs su greitu DSS kaupimu intraluminalinėse ląstelėse ir padidėjusiu vidinio gleivių sluoksnio pažeidžiamumu. Šie rezultatai rodo, kad Arhgap17 vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant tarpląstelinį transportą ir gleivinės barjerą, o pelės, turinčios Arhgap17 trūkumą, yra naudingas modelis tiriant UC.

Rezultatai

Arhgap17 pelių mutantai normaliai vystosi

Duomenys apie Arhgap17 mutantinių pelių generavimą ir Arhgap17 ekspresijos praradimą pelių mutantuose yra aprašyti papildomoje medžiagoje ir papildomame 1 pav. Arhgap17 nuorašai buvo išreikšti visur (1A pav.). Audinių ir ląstelių tipui būdinga Arhgap17 geno ekspresija buvo analizuojama histologiškai ištyrus LacZ aktyvumą. Besivystančiame embrione LacZ dažymas buvo aptiktas plačiai, tačiau suaugusiųjų audinių subregione jis buvo ribotas (papildomas 2A, B pav.). Stemplės ir skrandžio stratifikuotame plokščiame epitelyje buvo pastebėtas intensyvus dažymas. Inkstuose ir sėklidėse santykinai vidutinio sunkumo dažymas buvo nustatytas ląstelių pogrupyje, tuo tarpu punkcinis LacZ dažymas buvo stebimas hipokampo, širdies, plaučių, raumenų ir odos srityje. Įdomu tai, kad vidutinio sunkumo LacZ dažymas buvo aptiktas tik žarnos žarnos epitelyje, bet ne kriptiniame epitelyje (1 pav. B). Išraiškos būdas žarnyne rodo, kad Arhgap17 greičiausiai dalyvauja žarnyno epitelio fiziologijoje. Tačiau bendroji laukinio tipo ir Arhgap17 trūkumų turinčių pelių storosios žarnos histologija buvo panaši (1 pav. C), išskyrus tai, kad žarnyne buvo rasta keletas išsiplėtusių taurių ląstelių. BrdU ir TUNEL teigiamų ląstelių skaičius Arhgap17 turinčių pelių storosios žarnos (1 pav. C, D) ir ileum (papildomi 3 pav. A, B) buvo atitinkamai panašios į laukinio tipo pelių. Pelėse, kuriose trūksta Arhgap17, buvo pastebėtas tik nežymus IEC migracijos padidėjimas (papildomas 3C pav., D). Nepaisant plačios geno išraiškos, pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, normaliomis fiziologinėmis sąlygomis neparodė akivaizdžiai nenormalus fenotipas, išskyrus tai, kad patinų kūno svoris padidėjo šiek tiek mažiau (papildomas 4 pav.).

Image

( A ) Arhgap17 mRNR lygio qRT -PGR analizė įvairiuose 129 / S6 pelių audiniuose. Santykinis Arhgap17 mRNR kiekis buvo lyginamas su plonosios žarnos kiekiu. ( B ) Endogeninė Arhgap17 raiška buvo tiriama tiriant LacZ dažais pelių, kurių trūkumas Arhgap17, žarnyne. ( C ) Storosios žarnos sekcijos buvo dažytos H&E, imuniniu būdu pritvirtintos anti-BrdU antikūnais arba ištirtos TUNEL tyrimu. ( D ) Parodytas BrdU teigiamų ląstelių arba TUNEL teigiamų ląstelių skaičius (rodyklės) kriptoje (BrdU, n = 4; TUNEL, n = 6). + / +, laukinio tipo; m / m , pelės, turinčios Arhgap17. Mastelio juosta, 50 μm.

Visas dydis

Pelės, turinčios Arhgap17, yra jautresnės DSS sukeltam kolitui

Arhgap17 greičiausiai nebus būtinas žarnyno homeostazei normaliomis fiziologinėmis sąlygomis. Todėl mes ištyrėme Arhgap17 turinčias peles po DSS gydymo. Kolito sunkumas buvo tiriamas po nuolatinio 1, 5% DSS poveikio geriamajame vandenyje, kurio koncentracija buvo mažesnė už tipinę koncentraciją, sukeliančią kolitą laukinio tipo pelėms. Didelis kūno svorio kritimas pradėjo reikšti pelių, sergančių Arhgap17-deficitu, penkias dienas po DSS poveikio, o laukinių pelių kūno svoris net po septynių dienų neprarado svorio (2 pav. A). DSS papildyto vandens suvartojimas dviejose grupėse pirmąsias tris dienas nesiskyrė, tačiau pelės, kurių organizme trūko Arhgap17, sunaudojo mažiau DSS vandens. Storosios žarnos ilgis buvo panašus abiejuose genotipuose prieš gydymą, tačiau pelių mutantų gydymas DSS buvo žymiai sutrumpintas (2 pav. B). Sunkūs pažeidimai buvo rasti mutantų gaubtinės žarnos distalinės srities atžvilgiu (2 pav. C), todėl pelių mutantų histologinio pažeidimo balai buvo aukštesni (2 pav. D). Tačiau abiejų genotipų pažeidimai blauzdikaulyje buvo reti (2C pav., D). Be to, LacZ dažymas storosios žarnos epitelio ląstelėse buvo sušvelnintas dėl epitelio ląstelių suirimo po DSS gydymo (papildomas 5A pav.).

Image

( A ) Kūno svorio pokytis, išreikštas kūno masės procentais, pirmąją DSS poveikio dieną. ( B ) Storosios žarnos storosios žarnos ilgis ir ( C ) storosios žarnos žarnos ir storosios žarnos skerspjūvis praėjus 7 dienoms po apdorojimo, tiriamas H&E dažymu. Mastelio juosta, 100 μm, 100x padidinimas. ( D ) Kiekvienas taškas parodo atskiros pelės histologinio pažeidimo balą. Ileum, n = 6; dvitaškis, n = 10.

Visas dydis

Norint išanalizuoti DSS sukelto mutito ankstesnio pasireiškimo mechanizmą, prieš dvi dienas po gydymo žarnyne buvo tiriama uždegiminių citokinų ir chemokinų genų ekspresija. Prieš gydymą laukinio tipo pelėmis ir Arhgap17 turinčiomis pelėmis mRNR lygis nesiskyrė (3 pav. A). Tačiau Tnf ir Cxcl2 , kuriuos abu sukuria makrofagai 23 , 24 , mRNR lygis žymiai padidėjo tik DSS gydytose Arhgap17 turinčiose pelėse, tai rodo, kad uždegiminis atsakas jau buvo pradėtas. Kai po gydymo Il1b ir Il10 mRNR lygis sumažėjo abiejuose genotipuose, kiti mRNR lygiai išliko pastovūs, nepriklausomai nuo gydymo ar genotipo. Atsižvelgiant į staigų Tnf mRNR padidėjimą, anti-TNF antikūno imuninis padengimas atskleidė, kad intraluminalinių ląstelių pogrupyje buvo didelis TNF baltymo kiekis pelėse, kuriose trūksta Arhgap17 (3B pav.). Tačiau ląstelių proliferacija, apoptozė ir ląstelių migracija buvo panašios tarp laukinio tipo pelių ir Arhgap17 trūkumų turinčių pelių storosios žarnos ląstelių praėjus dviem dienoms po gydymo DSS (papildomas 5B pav., C).

Image

( A ) Santykinis kiekvienos mRNR kiekis buvo nustatytas atliekant qRT-PGR analizę ir palygintas su laukinio tipo pelių kiekiu prieš gydymą (0 diena) arba po DSS gydymo 2 dienas (2 diena). n = 8–11. Strypai su skirtingomis raidėmis yra žymiai skirtingi (dvipusiai neporiniai t- testai, p <0, 05), ns rodo nereikšmingą rezultatą. ( B ) distalinės gaubtinės žarnos dalys buvo imuniškai pritvirtintos anti-TNF antikūnais. Kairėje, 200X padidinimas; Dešinysis, padidinant stačiakampį 400x. Rodyklė rodo stiprų dažymąsi submukozinėje srityje. Mastelio juosta, 50 μm.

Visas dydis

„Arhgap17“ palaiko tinkamus barjerinės jungties baltymus

Arhgap17 palaiko TJ vientisumą epitelio ląstelėse moduliuodamas Cdc42 in vitro 20, teigdamas, kad jis taip pat gali reguliuoti IEC poliškumą in vivo . TJ ir AJ baltymų lokalizaciją žarnyne nustatėme dažydami imunofluorescenciniu būdu. Oklludino pasiskirstymas buvo panašus tarp laukinio tipo ir Arhgap17 turinčių pelių storosios žarnos epitelyje (4A pav.) Arba ileum (papildoma 6A pav.), Nepriklausomai nuo genotipo. Įdomu tai, kad ZO-1 pasiskirstymas buvo šiek tiek sutrikdytas tik Arhgap17 turinčių pelių storosios žarnos epitelyje, bet ne storosios žarnos kripto epitelyje. Panašiai, daliniai ZO-1 lokalizacijos defektai buvo pastebėti tik villus, bet ne mutanto šilumnešio kriptoje (papildomas 6A pav.). Pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, kai kuriose žaizdinėse epitelio ląstelėse pastebimas iš dalies žemyn sureguliuotas E-kadherino ir β- katenino dažymas viršūninėje / šoninėje sienelėje (4 pav. B). Be to, pelių, turinčių Arhgap17, baziniame regione dažnai buvo rasta gumulėlių, kuriuose buvo didelis E-kadherino ir β- katenino kiekis. Tačiau šių abejotinų AJ baltymų lokalizacijų kripto epitelyje nepastebėta. Panašiai, AJ baltymų lokalizavimas buvo pakartotinai aprašytas blauzdikaulyje (papildomas 6B pav.). E-kadherino dažymo išnykimas viršūninėje / šoninėje sienelėje buvo aiškiau pastebėtas kartu su imunitetu su F-aktinu, apikalaus membranos žymeniu, pelių, sergančių Arhgap17 trūkumu, IEC (papildomas 7A, B pav.).

Image

AJC baltymų dažymas imunofluorescenciniu būdu distaliniame dvitaškyje ( A, B ) prieš arba po ( C, D ) po DSS gydymo 2 dienas. ( A, C ) skyriai buvo imunizuoti su nurodytu antikūnu. Rodyklės rodo neteisingą TJ baltymų apiteliamą epitelinių ląstelių viršūninę / šoninę ribas, n = 3–4. ( B, D ) Sekcijos buvo imunizuotos nurodytu antikūnu, n = 5–6. Rodyklės rodo AJ baltymų praradimą epitelinių ląstelių viršūninėje / šoninėje sienelėje, tuo tarpu rodyklės galiukai nurodo baltymų gabalus bazolateriniame epitelyje. Šviesos epitelis parodytas kairėje („Luminal“); kripto epitelis parodytas dešinėje (kriptas). Mastelio juosta, 20 μm.

Visas dydis

TNF sukeliamas žarnyno pralaidumo padidėjimas yra svarbus patogeninis žarnyno uždegimo vystymosi veiksnys 4, 25 . Kadangi pastebimas TNF gaminančių ląstelių indukcija po DSS gydymo pelėms, kuriose trūksta Arhgap17, gali sutrikdyti žarnyno epitelio TJ barjerą, po dviejų dienų po gydymo išanalizavome TJ ir AJ baltymų lokalizaciją. Dalinis oklludino ir ZO-1 praradimas (4 pav. C) ir sunkesnis E-kadherino ir β- katenino neteisingumas pelių, turinčių Arhgap17, epitelyje buvo aiškiai matomas kaip DSS gydymo rezultatas (4 pav. D). Priešingai, TJ ir AJ baltymų integracija laukinio tipo pelėse liko beveik nepakitusi, tik pasiskirstant šiek tiek. Panašiai kaip žarnyne, apdorojant DSS, pelės, turinčios Arhgap17 trūkumų, bet ne laukinio tipo pelėse, nustatė abejotiną TJ ir AJ baltymų lokalizaciją (papildomas 6C pav., D).

Pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, padidėjo žarnyno pralaidumas

Atsižvelgiant į tai, kad dėl neteisingo TJ baltymų padidėjimo žarnyno pralaidumas padidėjo, mes siekėme patikrinti, ar Arhgap17 trūkumas turi panašų poveikį. Tai buvo padaryta matuojant FITC-dekstrano koncentraciją serume po dozavimo. FITC-dekstrano lygis pelių, sergančių Arhgap17, serume buvo 2 kartus didesnis nei laukinio tipo pelių (5 pav. A), rodo padidėjusį žarnyno pralaidumą. Nepaisant nedidelio TJ baltymų klaidingo padidėjimo praėjus dviem dienoms po gydymo DSS, FITC-dekstrano koncentracija serume buvo panaši į negydytų pelių, kurių organizme nebuvo Arhgap17, koncentraciją serume. Nuosekliai fluorescencinė mikroskopinė analizė parodė gilesnį FITC-dekstrano įsiskverbimą į pelių, turinčių Arhgap17 trūkumą, storosios žarnos epitelyje, palyginti su laukinio tipo pelėmis, tačiau panašiu mastu gydant ar netaikant DSS (5 pav. B). Tai, kad nepaisant dramatiškos TNF indukcijos, nepaisant dramatiško TNF indukcijos, nepaisant dramatiško TNF indukcijos, DSS gydant DSS, nepastebėtas reikšmingas epitelio pralaidumo padidėjimas, rodo, kad TNF sukeltas žarnyno TJ barjerų ardymas nėra pradinis DSS sukelto kolito atvejis šioms pelėms.

Image

In vivo žarnyno pralaidumas buvo tiriamas atitinkamai prieš gydymą DSS ir po jo 2 dienas. ( A ) Buvo išmatuota FITC-dekstrano koncentracija serume, n = 7–9. ( B ) Buvo tiriami fluorescenciniai mikroskopiniai vaizdai, skirti FITC-dekstrano vietai distaliniame dvitaškyje po dažymo, n = 9. Originalus padidinimas, 100X; Viršuje kairėje, 400x brėžto stačiakampio padidinimas. Mastelio juosta, 50 μm.

Visas dydis

Padidėjęs intraluminalinis DSS kaupimasis pelėse, kuriose trūksta Arhgap17

Atrodo, kad reikšmingas TNF indukcija pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, apdorojant DSS, bent jau iš pradžių neturi įtakos žarnyno pralaidumui. DSS gydymas jūrų kiaulytėje parodė selektyvų DSS įsisavinimą epitelio ląstelėse ir paskesnį kaupimąsi intraluminaliniuose makrofaguose 26, tai rodo, kad DSS praeina per epitelio ląsteles ir pasklinda į lamina propria. Todėl vieną dieną po gydymo DSS, naudojant FITC-DSS, mes ištyrėme DSS lokalizaciją gleivinėje (6A, B pav.). Proksimaliniame dvitaškyje DSS teigiami luminaliniai IEC dažniau buvo randami pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, tačiau DSS teigiamos ląstelės buvo retos abiejų genotipų intraluminalinėje srityje. Vidurinėje ir distalinėje dvitaškyje DSS buvo aptiktas ir tiesiosios žarnos IEC, ir intraluminalinėse ląstelėse, nepriklausomai nuo genotipo. Tačiau pelių, turinčių Arhgap17, distalinės dvitaškio dalies gleivinės dugne pastebimai padidėjo DSS teigiamos ląstelės. Raumenėlėje abu genotipai rodė punkcinį DSS kaupimąsi vazelės, bet ne kriptos IEC. Šie rezultatai rodo, kad padidėjęs DSS kaupimasis intraluminalinėse ląstelėse gali būti susijęs su dramatiška TNF indukcija ir paskesniu kolitu Arhgap17 deficito pelėse.

Image

DSS pasiskirstymas buvo ištirtas po FITC-DSS apdorojimo 24 val., Naudojant konfokalinį mikroskopą, n = 4. ( A ) Parodyti reprezentatyvūs fluorescenciniai mikroskopiniai vaizdai, padidinimas 400x. Rodyklių galvutės rodo DSS nuosėdas lamina propria ląstelėse apatinėje gleivinės dalyje. ( B ) 1x brūkšniuoto stačiakampio padidinimas. Mastelio juosta, 20 μm.

Visas dydis

Arhgap17 turinčios pelės normaliomis fiziologinėmis sąlygomis turi nepažeistą gleivinės barjerą

Norėdami nustatyti Arhgap17 tinkamumą mucino sekrecijai, histologiškai ištyrėme taurių ląsteles ir gleivių sluoksnio vientisumą. Sergant A / PAS dažymu, serbentų ląstelių skaičius buvo panašus pelių, kurių trūkumas buvo Arhgap17, žarnyne ar storosios žarnos, palyginti su laukinio tipo pelėmis (7A, B pav.). Įdomu tai, kad pelėms, kurių organizme trūksta Arhgap17, pūslelių, išsidėsčiusių su mucinu, buvo daugiau išsiplėtusių žarnos žarnos žarnoje, bet ne dvitaškyje. „Muc2“ mRNR ekspresijos lygiai parodė nedidelį pelių žarnos žarnos, bet ne Arhgap17 deficito storosios žarnos sumažėjimą. PAS dažymas parodė, kad storosios žarnos vidiniai gleivių sluoksniai buvo panašaus storio tarp dviejų grupių (7 pav. C). Arhgap17 trūkumas nei bendroms, nei tvirtoms gleivėms neturėjo įtakos storio atžvilgiu (7 pav. D). Gleivių sluoksnio vientisumas buvo toliau tiriamas hibridizuojant in situ, naudojant bendrąjį 16S rRNR zondą, kad būtų bakterijų, ir gaubtą gaubiant anti-Muc2 antikūnais gaubtinėje žarnoje (7 pav. E). Laukinio tipo ar Arhgap17 turinčių pelių vidiniame gleivių sluoksnyje nebuvo bakterijų, tai rodo, kad normaliomis fiziologinėmis sąlygomis gleivinės barjero funkcija nepriklausė nuo Arhgap17.

Image

( A ) AB / PAS mucinų dažymas blauzdikaulyje (viršuje) ir distalinėje dvitaškyje (apačioje). Originalus padidinimas, 200X; Apatinė pusė dešinėje, brūkšniuoto stačiakampio padidinimas 1000 kartų. ( B ) viršuje - taurės ląstelių skaičius viename villume (ileum) arba kriptoje (dvitaškis); Vidurinis - pūslelių pūslelių plotas; Apačia, Muc2 mRNR lygis. ( C ) Parodytas PAS dažymas gleivių sluoksniui ištirti. ( D ) Bendras ir tvirtas gleivių storis in vivo distalinėje dvitaškyje. ( E ) Gleivių sluoksnis distalinėje dvitaškyje buvo analizuojamas hibridizuojant su EUB338 zondu, po to atlikus imuninį dažymą anti-Muc2 antikūnais ir dažant DAPI. ( B ) viršuje, n = 8–11; Vidurys, n = 8–9; Apačia, 7–9; ( D ) n = 9–10; ( E ) n = 4. O, išorinis gleivių sluoksnis; Aš, vidinis gleivių sluoksnis; E, epitelio sluoksnis. Mastelio juosta, 50 μm.

Visas dydis

DSS sukelia greitą gleivinės barjero sunaikinimą pelėse, kuriose trūksta Arhgap17

Gleivių sluoksnio pakitimas, naudojant DSS, lemia bakterijų įsiskverbimą į vidinį gleivių sluoksnį per 12 valandų, gerokai prieš uždegiminių ląstelių infiltraciją 7 . Todėl mes išbandėme, ar pelėms, kurių trūkumas yra Arhgap17, gleivių sluoksnis yra jautresnis DSS gydymui. Po dviejų dienų gydymo visoms pelėms įvyko dalinis vidinio gleivių sluoksnio erozija, tačiau pelių, turinčių Arhgap17 trūkumą, erozija buvo didesnė nei laukinių pelių (8A pav.). Nuosekliai Arhgap17 turinčių pelių gleivių sluoksniai buvo plonesni nei laukinio tipo pelių (8 pav. B). Tai buvo taikoma tiek visam, tiek tvirtam gleivių sluoksniui. Be to, dažymas EUB338 parodė tiesioginį IEC kontaktą su bakterijomis išsiskyrusiose gleivėse (8C pav., Papildomas 8A pav.). Nuosekliai, epitelio regiono procentas, sąlytyje su bakterijomis, buvo žymiai didesnis pelėse, kuriose trūksta Arhgap17, nei laukinio tipo pelėse (8 pav. D). Buvo pranešta, kad dėl trečiojo kūno šeimos nario Tff3 genetinio praradimo gali sutrikti gleivinės atstatymas dėl DSS sukeltos kolito 27 . Taigi pelėms, kurių trūkumas Arhgap17, mes atlikome imuninį dažymą Tff3. Laukinio tipo pelių dvitaškyje buvo pastebėtas gana storas ir šiurkštus Tff3 dažymas gleivinės sluoksnio, kuris, atrodo, buvo pritvirtintas prie žaizdinio epitelio, apačioje (9A pav.). Pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, liko tik labai plonas Tff3 dažymo sluoksnis. Šis dažymo sumažėjimas buvo susijęs su aptinkamu baltymų lygio sumažėjimu (9 pav. B) ir žymiu mRNR lygio sumažėjimu pelėse, kuriose trūksta Arhgap17 (papildomas 8B pav.). Šie rezultatai rodo, kad Arhgap17 prisideda prie žarnyno gleivių vientisumo palaikymo, nes skatina tinkamą Tff3 ekspresiją ir sekreciją.

Image

( A ) Parodytas PAS dažymas. Rodyklės rodo išnaikintas gleivių sluoksnio vietas. ( B ) Buvo nustatytas bendras ir tvirtas gleivių storis in vivo . ( C ) Gleivinės barjeras buvo analizuojamas hibridizuojant su EUB338 zondu, po to atlikus imuninį dažymą anti-Muc2 antikūnu ir DAPI. Žvaigždutės nurodo likusį vidinį gleivių sluoksnį, pritvirtintą prie epitelio ląstelių. Punktyrinės linijos žymi sritis, kuriose liečiasi bakterijos. O, išorinis gleivių sluoksnis; Aš, vidinis gleivių sluoksnis; E, epitelio sluoksnis. ( D ) Buvo įvertinta epitelio sričių, liečiančių su bakterijomis, dalis. ( B ) n = 7–8; ( C ) n = 7; ( D ) n = 7. Mastelio juosta, 50 μm.

Visas dydis

Image

( A ) Distalinės storosios žarnos dalys buvo imuniškai padengtos anti-Tff3 antikūnais. Originalus padidinimas, 200X; dešinėje, brūkšniuoto stačiakampio padidinimas 400x. Aš, vidinis gleivių sluoksnis; E, epitelio sluoksnis. Rodyklės rodo vietas, kuriose tamsiai nudažytos laukinio tipo spalvos, o rodyklės galiukai nurodo plonai nudažytas pelių, kuriose trūksta Arhgap17, trūkumą. ( B ) Tff3 baltymo Western blotinimas distalinėje dvitaškyje. Santykinis Tff3 juostos intensyvumas buvo normalizuotas iki ACTB lygio, n = 10. Rodyklė rodo specifinę Tff3 juostą.

Visas dydis

Diskusija

Dinaminė aktino citoskeleto organizacija turėtų būti griežtai reguliuojama ląstelių dalijimuisi, migracijai ir vezikulų prekybai poliarizuotomis IEC. Tokių procesų kritiniai reguliatoriai, RhoGEFs ir RhoGAPs, kurie moduliuoja Rho GTPazių šeimą, IEC nėra gerai žinomi. Arhgap17, RhoGAP, buvo funkciškai išanalizuotas in vitro, naudojant MDCK ląsteles, bendrą epitelio ląstelių modelį, kuris išreiškė pakankamą Arhgap17 kiekį, kad būtų galima atlikti 20, 21 Western blot analizę. Remiantis Arhgap17 sąveika su angiomotino TJ pastolių baltymais ir CIN85 / CD2AP endocitiniais adapteriais, buvo pasiūlyta, kad Arhgap17 ląstelių funkcija apima tarpląstelinį TJ baltymų prekybą ir TJ palaikymą reguliuojant Cdc42 aktyvumą 20 . Čia pranešime apie naują susijusių Arhgap17 funkcijų rinkinį IEC, kad Arhgap17 prisideda prie AJC palaikymo, taip pat kaip tarpląstelinio transporto moduliavimas ir gleivių sluoksnio vientisumas.

IBD bruožas yra padidėjęs IEC paraceuliarinis pralaidumas 1, 4 . Kadangi TJ vaidina svarbų vaidmenį epitelio barjeruose, IEC specifinis Claudin-7, vyraujančio žarnyno claudino, trynimas padidina tarpląstelinio pralaidumą ir sukelia spontaninį kolitą pelėms 28 . Atvirkščiai, oklidalino trūkumas neturi įtakos žarnyno pralaidumui pelėms 29, o JAM-A sutrikimas nesukelia savaiminio kolito, nepaisant padidėjusio žarnų pralaidumo 30, 31 . Skirtingai nuo rimto TJ sutrikdymo tik dėl Arhgap17 numušimo MDCK ląstelėse 20, tiek TJ, tiek AJ parodė dalinius žaizdinio epitelio defektus, praradus Arhgap17, lydint šiek tiek padidėjusį tarpląstelinio pralaidumą. Tačiau Arhgap17 trūkumo nepakako savaiminiam kolitui išsivystyti ir žarnyno homeostazei sutrikdyti, tai rodo epitelio barjerinės funkcijos palaikymą, jei nėra Arhgap17. Įdomu rasti šiek tiek padidėjusį IEC migraciją nepakeitus pelių, kurių trūkumas Arhgap17, proliferacijos ir apoptozės pokyčių. Aberrantinis E-kadherino lokalizavimas, atrodo, yra svarbus padidėjusiai IEC migracijai pelėse, kuriose trūksta Arhgap17, nes IEC specifinis Cdh1 delecija sukelia padidintą migraciją 32 . Atsižvelgiant į tai, kad Arhgap17 ekspresijos kripte epitelyje nėra, Arhgap17 greičiausiai nedalyvauja pradiniame AJC formavime. Tačiau klaidingas AJC baltymų išsidėstymas pelių, turinčių Arhgap17 trūkumą, epitelyje rodo, kad Arhgap17 yra būtinas tinkamam AJC palaikymui.

Patologiniai požymiai, įskaitant DSS sukelto kolito sunkumą, priklauso nuo DSS molekulinės masės ir žarnyno vietos 33 . Pelėms sušvirkštus 40 kDa DSS, kolitas sukelia daugiausia distalinę ir vidurinę storosios žarnos dalis, bet retai proksimalinę žarną. Pradinis DSS sukelto kolito mechanizmas vis dar nėra aiškus, tačiau neseniai paskelbtoje publikacijoje teigiama, kad DSS nanolipokompleksų susidarymas su vidutinės grandinės ilgio riebiosiomis rūgštimis vaidina DSS pristatymą ir vėlesnius storosios žarnos epitelio ląstelių pažeidimus. 34 . Be DSS IEC, DSS kaupimasis laukinio tipo pelių intraluminalinėse ląstelėse per dieną po gydymo DSS rodo, kad yra transceliulinis DSS transportas. Lyginant su mažų molekulių judėjimu paracelluliniu būdu, žinomas, kad transceliuliarinis transportas vaidina svarbų vaidmenį IEC atliekant įsisavinimą ir sekreciją makromolekulių, tokių kaip šviesų antigenai ir išskiriami antikūnai 35 . Perinuklearinio DSS lokalizavimas IEC yra netikėtas - tai rodo DSS įsisavinimą net šiluminėje žarnoje. Gana įdomu, kad gilus DSS įsiskverbimas į intraluminalines ląsteles įvyksta ypač distalinėje dvitaškyje prieš žymiai padidėjant epitelio pralaidumui, ir yra susijęs su DSS sukelto kolito išsidėstymu žarnyne ir padidėjusiu kolito sunkumu Arhgap17 turinčiose pelėse. Kaip siūloma in vitro tyrime, Arhgap17 gali reguliuoti makromolekulių transceliuliarinį pernešimą IEC, o DSS tarpląstelinio pernešimo regioniniai skirtumai yra vienas iš faktorių, lemiančių DSS poveikį regionui specifiniam kolitui.

Neseniai paskelbtoje publikacijoje buvo pasiūlyta, kad DSS sukeltas kolitas prasideda DSS sukeltu gleivių struktūrų pasikeitimu, kuris leidžia bakterijoms prasiskverbti ir suirti vidinį gleivių sluoksnį 7 . „Muc2“ mucinas kartu su kitais baltymais, įskaitant Fcgbp ir Tff3, išskiriamus iš taurių ląstelių, sudaro tankiai užpildytą vidinį struktūrinį barjerą, nepralaidų kommensaliniams mikroorganizmams 36, 37, 38 . Taigi gleivių sluoksnio suirimas yra tiesiogiai susijęs su žarnyno patogeneze 3, 5 . Žarnyno katės ląstelės palaiko gleivių sluoksnį, išskirdamos baltymus per 5 junginio egzocitozę, kurią koordinuoja daugybė baltymų, įskaitant egzocistą, SNARE ir aktino citoskeleto kompleksą 39 . Tačiau nežinoma, kaip Rho GTPazės reguliuoja mucino sekreciją gobtelio ląstelėse. Tai, kad pelėse, kuriose trūksta Arhgap17, nepastebėta gleivinės sluoksnio storio pokyčių, rodo, kad Arhgap17 gali nedalyvauti gleivių sekrecijoje. Be to, vidinis gleivių sluoksnis veikė bent jau kaip kliūtis žarnyno bakterijoms pelėse, kuriose trūksta Arhgap17. Pelių, turinčių Arhgap17 trūkumą, pūslelių dydžio padidėjimas rodo, kad Arhgap17 gali būti susijęs su vezikulės ir pūslelės susiliejimu tarp žarnyno.

Įdomu tai, kad pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, padidėjo jautrumas DSS sukeltam kolitui, panašiai kaip Tff3 išmušimo pelėms. Pelėms, neturinčioms Tff3, sumažėjo epitelio migracija ir padidėjo DSS sukeltas gleivinės sužalojimas, nekeičiant mucino dažymo 27 . Rekombinantinio Tff3 panaudojimas šviesoje lengvina sužalojimą, parodydamas tarpląstelinį Tff3 poveikį 27, 40 . Tff3 taip pat sudaro su disculfidais sujungtą heteromerą su Fcgbp ir prisideda prie mucino tinklo organizavimo per Fcgbp-Muc2 jungtį 36, 37 . Tff3 lokalizacijos radimas daugiausia vidinio gleivių sluoksnio apačioje po sekrecijos yra netikėtas. Nors pelių, turinčių Arhgap17, Tff3 sluoksnis buvo daug plonesnis nei laukinio tipo pelių, vidinis gleivių sluoksnis vis tiek gali veikti kaip funkcinis barjeras žarnyno bakterijoms. Pelių, turinčių Arhgap17, vidinis gleivių sluoksnis buvo labiau pažeidžiamas DSS, tai rodo gleivinės savybių pasikeitimą. Atsižvelgiant į žalingą DSS poveikį tiesiogiai IEC, yra tikimybė, kad padidėjęs DSS sukeltas kolitas Arhgap17 turinčiose pelėse yra dėl skirtingo DSS kaupimosi IEC. Tačiau panašus FITC-DSS kaupimasis ir apoptozinis indeksas IEC, neatsižvelgiant į genotipą, rodo, kad IEC pažeidimas nėra tikėtinas pradinis DSS sukelto kolito atvejis pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą. Įdomu, kad Tff3 lygis žąsies ląstelėse taip pat sumažėjo pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą. Atsižvelgiant į ankstesnę ataskaitą, rodančią, kad Tlr2 išmuštų pelių DSS sukeltas kolitas sunkumas yra susijęs su Tff3 ekspresijos sumažėjimu taurelės ląstelėse 40, padidėjęs jautrumas DSS sukeltam kolitui pelėms, turinčioms Arhgap17 trūkumą, taip pat gali būti sumažėjęs. Tff3 išraiškos. Taigi mes parodome Arhgap17 funkcinę savybę, kurios praradimas palaikant vidinį gleivinį sluoksnį yra UC rizikos veiksnys.

Metodai

Pelės ir histologija

Pelės „Arhgap17“ buvo sugeneruotos ir palaikytos įgimtos C57BL / 6J fone (papildomos medžiagos). Visi eksperimentai su pelėmis buvo atlikti vadovaujantis gairėmis ir juos patvirtino Ewha Womans universiteto Institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (leidimo numeris: 2011-01-009). Buvo naudojamos pagal amžių suderintos pelės. Plonoji žarna buvo padalinta į 10 lygių dalių, o tolimiausia dalis, esanti šalia stuburo, buvo naudojama kaip blauzdos audinio mėginys analizei. Storosios žarnos buvo padalintos į 3 lygias dalis, proksimalinę, vidurinę ir distalinę sritis, o distalinė dalis buvo naudojama analizei, išskyrus histologinį balų nustatymą po DSS gydymo. Histologijai nustatyti žarnos buvo pritvirtintos 10% buferiniu formalinu ir įterptos parafinu. Rehidratuoti parafino skyriai buvo dažyti alcian blue (AB) tirpalu ir periodiniais rūgšties Schiff (PAS) reagentais pagal gamintojo protokolą (Sigma-Aldrich) dažyti serbentų ląsteles. Skaidrės buvo toliau dažomos hematoksilinu. Serbentų ląstelių skaičius žandikaulyje buvo suskaičiuotas iš daugiau nei 10 villi, tik su skilties viduriu gumbelio. Kiekvienos taurės ląstelės plotas buvo nustatytas matuojant pūslelės dydį naudojant NIS-Elements BR 3.2 vaizdavimo programinę įrangą (Nikon) ir Image J (imagej.nih.gov). Serbentų ląstelių skaičius ir plotas distalinėje dvitaškyje buvo nustatytas panašiai, išskyrus analizuojant serbentų ląsteles, esančias 0, 1 mm atstumu nuo žaizdinio epitelio. 8, 36 .

Atvirkštinė transkripcija ir kiekybinis PGR (qRT-PGR)

Bendras RNR paruošimas, atvirkštinė transkripcija, realaus laiko PGR ir mRNR kiekybinis įvertinimas buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau 41, išskyrus tai, kad buvo naudojama KAPA SYBR FAST qPCR rinkinys (KAPA Biosystems) ir GAPDH arba 18S rRNR kaip endogeninė kontrolė. Grunto sekos, naudojamos qRT-PGR, yra papildomose medžiagose.

DSS gydymas ir histologinis įvertinimas

Norėdami sukelti kolitą, 1, 5% (m / v) DSS (36–50 kDa, MP Biomedicals) buvo gydoma taip, kaip aprašyta anksčiau 42 . Storosios žarnos dalis buvo surinkta septintą dieną po gydymo, o proksimalinės, vidurinės ir distalinės storosios žarnos histologinės dalys buvo nudažytos hematoksilinu ir eozinY (H&E). Sužalojimo sunkumas buvo įvertintas taip, kaip aprašyta papildomoje medžiagoje.

Imunofluorescencija ir imunohistochemija

Stiklinė žarna arba distalinė dvitaškis praplaunami PBS ir fiksuojami 10% buferiniu formalinu. Imunofluorescencinis dažymas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau 41 . Trumpai tariant, rehidratuotas parafinas arba užšaldyti pjūviai buvo užblokuoti naudojant 5% normalaus ožkos serumo arba MOM pelės Ig blokuojančio reagento (Vector Lab) ir per naktį apdoroti pirminiu antikūnu 4 ° C temperatūroje. Skyriai buvo toliau inkubuojami su antriniais antikūnais, konjuguotais su Alexa 488 (Life Technologies), prieškonkretinti DAPI ir vizualizuoti LSM 510 Meta konokaliniu mikroskopu (Carl Zeiss). Imunohistochemijai pakartotinai hidratuoti parafino skyriai buvo apdoroti 3% H 2 O 2 dejonizuotame vandenyje ir imuninis dažymas buvo atliktas naudojant Vectastatin ABC rinkinį (Vector Lab) pagal gamintojo protokolus. Antigeno ir antikūno kompleksai buvo aptikti naudojant DAB peroksidazės rinkinį (Dako). Tff3 imunohistochemijai surinkti distalinės storosios žarnos mėginys su išmatų nuosėdomis ir fiksuotas metanolio-Carnoy tirpale per naktį 38 . Pirminių antikūnų šaltiniai yra papildomose medžiagose.

Žarnyno pralaidumas in vivo

Žarnyno epitelio barjerinė funkcija buvo įvertinta išmatuojant FITC-dekstrano (4 kDa, Sigma-Aldrich) koncentraciją serume po 43 -iojo pjūvio. Pelės nevalgė 4 valandas ir joms buvo duota 30 mg / ml FITC-dekstrano (0, 6 mg / g kūno svorio). Kraujas buvo surinktas po 4 valandų širdies punkcija po CO 2 eutanazijos. Supernatantas buvo surinktas centrifuguojant 10 minučių 3000 aps./min. Serumo fluorescencija buvo matuojama naudojant multimode detektorių DTX880 (Beckman Coulter), o koncentracija buvo nustatyta palyginant su standartine serijiniu būdu praskiesto FITC-dekstrano kreive. Histologiškai distalinė dvitaškis buvo kruopščiai praplautas PBS ir fiksuotas 4% paraformaldehidu PBS, esant 4 ° C temperatūrai per naktį, ir užšaldyti skyriai buvo išlyginti DAPI. Vaizdai buvo tiriami naudojant fluorescencinį mikroskopą (ECLPISE 80i EPI, Nikon).

Histologinė DSS pasiskirstymo žarnyne analizė

Norint ištirti DSS pasiskirstymą gleivinėje, 1, 5% (m / t) FITC-DSS (40 kDa, „TdB Consultancy AB“) buvo praskiestas dešimtadaliu 1, 5% (m / v) DSS (36–50 kDa, MP). Biomedicinos) ir pelėms buvo duodama per parą ad libitum 24 val. Žvakutė ir dvitaškis kruopščiai praplaunami PBS ir per naktį fiksuojami metanolio-Carno tirpale. Į parafiną įterpti skyriai buvo nudažyti DAPI ir vizualizuoti naudojant LSM 510 Meta konfokalinį mikroskopą (Carl Zeiss).

Gleivių storio matavimas

Gleivių storis in vivo buvo matuojamas, kaip aprašyta anksčiau 38, šiek tiek modifikuojant. Distalinis dvitaškis buvo išpjautas išilgai, o gleivių sluoksnis buvo vizualizuotas pridedant medžio anglies miltelių suspensijos PBS. Silikonizuota stiklinė mikropipetė (1 μm galiuko skersmuo) buvo laikoma mikromanipuliatoriumi (KITE-R, „World Precision Ins“), sujungtu su digimatinės mikrometro galvute (350–251, Mitutoyo), o visas gleivių storis (bendras) buvo išmatuotas išpjaustymo mikroskopas (SMZ1000, Nikon). Po tirpių gleivių aspiracijos buvo išmatuotas likęs gleivių (tvirtas) sluoksnis. Vidutinis storis buvo apskaičiuotas išmatuojant mažiausiai dešimt skirtingų dėmių kiekvienoje pelėje.

Fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) bakterijų lokalizavimui

FISH distaliniame gaubtinės žarnos skyriuje buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau 38, išskyrus tai, kad hibridizacijai buvo naudojamas 10 μg „Alexa Fluor 488“ konjuguoto bakterinio rRNR EUB338 zondo. Epitelio regionas, kontaktuojantis su bakterijomis, buvo įvertintas FISH dažytame skyriuje, o epitelio regiono, kontaktuojančio su bakterijomis, dalis buvo nustatyta iš visos žarnyno dalies aklu būdu naudojant NIS-Elements BR 3.2 vaizdavimo programinę įrangą (Nikon). Norėdami atlikti bendrą imuninį dažymą, FISH dažyti stikleliai buvo užblokuoti ir inkubuojami su anti-Muc2 antikūnais (sc-15334, Santa Cruz Biotech.) Per naktį 4 ° C temperatūroje. Objektyvai buvo toliau inkubuojami su ožku anti-triušiu „Alexa 568“ (Life Technologies), ištirpinti DAPI tirpalu (0, 5 μg / ml PBS) ir vizualizuoti konokaliniu mikroskopu.

Statistinė analizė

Šios vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± SEM. Kiekybiniai duomenys buvo įvertinti naudojant dvipusį neporinį t- testą su „GraphPad Prism“ programa ir kiekviena p reikšmė pažymėta paveiksle. Laikoma, kad p reikšmė žemiau 0, 05 yra statistiškai reikšminga.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Lee, S.-y. et al . „Arhgap17“, „RhoGTPase“ aktyvinantis baltymas, reguliuoja gleivinės ir epitelio barjerą pelės dvitaškyje. Mokslas. Atstovas 6, 26923; „doi“: 10.1038 / srep26923 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.