Iv astragalosidas slopina mikroglia aktyvaciją per gliukokortikoidų receptorių tarpinamą signalizacijos kelią | mokslinės ataskaitos

Iv astragalosidas slopina mikroglia aktyvaciją per gliukokortikoidų receptorių tarpinamą signalizacijos kelią | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vaistų kūrimas
  • Receptorių farmakologija

Anotacija

Mikrogliozės aktyvacijos slopinimas gali padėti gydyti daugelį neurodegeneracinių ligų. Kinijos klinikinių tyrimų metu buvo patikrintas priešuždegiminių savybių turintis Astragaloside IV (ASI) kaip terapinis vaistas. Tačiau nežinomas ASI, slopinančio neuro uždegimą, mechanizmas. Šiame tyrime mes parodėme, kad ASI slopina mikroglia aktyvaciją tiek in vivo, tiek in vitro . Tai galėtų sustiprinti gliukokortikoidų receptorių (GR) -liuciferazės aktyvumą ir palengvinti GR branduolio translokaciją mikroglialinėse ląstelėse. Molekulinio doko ir TR-FRET GR konkurencinio surišimo eksperimentai parodė, kad ASI gali prisijungti prie GR, nepaisant santykinai mažo afiniteto. Tuo tarpu ASI modifikuotas GR tarpininkaujantis signalizacijos kelias, įskaitant PI3K, Akt, I κB ir NF κB defosforilinimą, todėl sumažino priešuždegiminių mediatorių gamybą pasroviui. Slopinimas mikrogliacijos BV-2 aktyvacijai ASI buvo panaikintas GR inhibitoriumi, RU486 arba GR siRNR. Panašiai RU486 neutralizavo lengvatinį ASI poveikį mikrogliozei ir neuronų sužalojimui in vivo . Mūsų išvados parodė, kad ASI bent iš dalies slopino mikroglijų aktyvaciją, aktyvuodamas gliukokortikoidų kelią, ir tai rodo galimą jo terapinį potencialą neuroinfekcijai sergant neurologinėmis ligomis.

Įvadas

Mikroglialinė aktyvacija yra vienas iš svarbiausių išsėtinės sklerozės (MS), progresuojančios demielinizuojančios centrinės nervų sistemos (CNS) ligos 1 požymių. CNS, mikroglialinės ląstelės buvo laikomos įgimtomis imuninėmis ląstelėmis ir veikia kaip periferiniai makrofagai 2, kad apsigintų nuo patogenų išpuolių 3 . Tačiau nuolatinis ir nekontroliuojamas mikrogliukozės suaktyvinimas kaupia daug kenksmingų medžiagų, ypač azoto oksido (NO), laisvųjų radikalų ir uždegimą sukeliančių citokinų (pvz., IL1β, TNFα), ir galiausiai sukelia neuronų sužalojimą, ypač 4- oje MS.

Gliukokortikoidai (GC), klasifikuojami 5, 6 steroidinių hormonų, slopina mikrogliukozės aktyvaciją 7, prisijungdami prie gliukokortikoidų receptorių (GR) 8 . Susirišę su ligandu, GR sąveikauja su citoplazmoje esančiomis signalinėmis molekulėmis, tokiomis kaip fosfoinositido 3-kinazė (PI3K), arba persikelia į branduolį, kur jie slopina kitų transkripcijos veiksnių (pvz., Branduolio faktoriaus κB, NF κB) aktyvumą arba inicijuoja genų transkripcijas, susijusias su priešuždegiminis poveikis 6 . Iš tiesų, GC sukelia nepakeliamą efektyvumą gydant MS 9 . Nors lėtinis AKS vartojamas plačiai, jis gali sukelti sunkių komplikacijų, tokių kaip osteoporozė, nutukimas ir diabetas, ir padidina jautrumą infekcinėms ligoms 10 . Todėl skirtingi vaistai, kurių veiksmingumas yra toks pat kaip GC, tačiau mažesnis šalutinis poveikis, bus labai naudingas klinikinei tų uždegiminių ligų terapijai.

Natūralūs žolelių junginiai yra vienas iš svarbių šaltinių kuriant naujus vaistus. ASI yra cikloartano tipo saponino molekulė, randama Astragalus membranų šaknyse, turinčių antivirusinių 11, 12, antihipertenzinių 13, antioksidacinių 14 ir priešuždegiminių 15 savybių. Be to, naujausi tyrimai rodo, kad ASI gali palengvinti osteoporozę 16, užkirsti kelią diabetui ir diabeto komplikacijoms 17, 18, 19, 20, 21 ir sumažinti nutukimą (nepaskelbti duomenys). Klinikiniai tyrimai įrodo, kad ASI nerodo nepageidaujamų reakcijų ir įvykių 22, yra saugus ir gerai toleruojamas 23, 24 . Dabar Kinijoje tęsiamas III fazės klinikinis ASI gliukozės tyrimas dėl stabilios vainikinių arterijų ligos anginos. Visi tyrimai parodė ASI veiksmingumą ir saugumą gydant minėtas ligas.

Ankstesniame mūsų tyrime nustatyta, kad ASI slopina mikrogliukozės aktyvaciją eksperimentinėms autoimuninio encefalomielito (EAE) pelėms - gyvūnų tyrimo modelis 25 tyrimui. Tačiau jo molekulinis mechanizmas vis dar nėra aiškus. Kadangi daugelis natūralių saponino molekulių, tokių kaip ginsenoside-Rg1 26, ginsenoside-Re 27, protopanaxadiol ir protopanaxatriol 28, per GR sukelia gliukokortikordinį efektą, pagrįstą molekulės struktūra, mes teigėme, kad ASI tikriausiai taip pat veikia per GR kaip aktyvus ligandas. Norėdami patvirtinti hipotezę, dabartiniame tyrime mes ištyrėme ASI poveikį slopinant mikrogliacijos aktyvaciją tiek in vitro, tiek in vivo . Taigi buvo ištirtas ASI poveikis mikrogliacijos GR, taip pat jo pasroviui teikiama signalizacijos kaskada. Rezultatai parodė, kad ASI gali būti saugus ir efektyvus vaistas neuroinfekcijos sutrikimų, kuriems būdingas mikrogliukozės aktyvacija, gydymui.

Rezultatai

ASI slopino LPS sukeltą BV-2 mikroglia ląstelių aktyvaciją

Panašių receptorių (TLR) stimuliacija sukelia aktyvų mikroglialinių ląstelių aktyvavimą. Visų pirma, BV-2 mikroglialinių ląstelių gydymas TLR4 ligandu, LPS, taip pat reikšmingai paskatino uždegimo faktorių TNFα (1 pav., P <0, 001) ir iNOS (1 pav., P <0, 01) baltymų lygio padidėjimą. kaip mRNR lygiai CD11b (1 pav. C, p <0, 05), IL1β, TNFα ir iNOS (1 pav. D – F, p <0, 001). Gydant teigiamą kontrolinį vaistą Dex (10 μM), visi uždegimą sukeliantys veiksniai buvo slopinami tiek baltymų, tiek mRNR lygiu. Priešingai, nuo dozės priklausomas ASI slopino TNFα išsiskyrimą iš aktyvuotų BV-2 ląstelių (1A pav., P <0, 001). Kadangi ASI, esant 50 μM, parodė geriausią slopinamąjį poveikį, vėlesniems eksperimentams buvo pasirinkta dozė. Panašiai kaip Dex, ASI gydymas (50 μM) taip pat sumažino kitų uždegimą sukeliančių veiksnių padidėjusį reguliavimą baltymų ar mRNR lygiu (1B – F pav.). ASI ir Dex įtakos ląstelių gyvybingumui ištirti buvo naudojamas CCK-8 metodas. Kaip parodyta 1G pav., ASI skirtingomis dozėmis (10, 25, 50 ir 100 μM) neturėjo įtakos BV-2 ląstelių gyvybingumui. Šie rezultatai parodė, kad ASI sumažino uždegiminę mikroglijų reakciją stimuliavus LPS.

Image

( A ) ASI užkirto kelią TNFα išsiskyrimui, matuojant ELISA metodu. ( B ) ASI slopino „iNOS“ baltymų ekspresiją. „Inset“ parodė ASI vakarų blotinimo rezultatą „iNOS“ gamyboje. ( C – E ) ASI slopino CD11b, IL1β, iNOS ir TNFα mRNR ekspresijas. ( F ) ASI neturėjo įtakos BV-2 ląstelių ląstelių gyvybingumui. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001, palyginti su LPS grupe, N = 4 / grupė, vidurkis ± SEM. Pateikti duomenys buvo vienas iš tipinių mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatų.

Visas dydis

Norint dar labiau patvirtinti slopinantį ASI poveikį mikrogliacijos aktyvacijai, buvo tiriamos BV-2 ląstelės, nustatančios NF κB raišką ir lokalizaciją. LPS (200 ng / ml) stimuliacija 24 valandas lėmė dramatiškai padidėjusį NF κB-luciferazės aktyvumą BV-2 ląstelėse (2A pav., P <0, 001). ASI, esant 10-50 μM koncentracijai, žymiai sumažino LPS sukeltą NF κB-luciferazės aktyvumą (2A pav., P <0, 05 arba p <0, 01). Be to, Western blotting metodo rezultatai parodė, kad gydymas ASI gali reikšmingai sumažinti p65 NF κB ir I κ stimuliuojamą fosforilinimą, kurį stimuliuoja LPS BV-2 ląstelėse (2 pav. B). Šį slopinimą patvirtino imunocitochemijos (ICC) analizė. Atliekant ICC analizę, ASI taip pat slopino LPS sukeltą fosforilinto NF κB branduolio perkėlimą (2C – K pav.). Taigi ASI slopino LPS sukeltą mikroglia aktyvaciją sumažinant NF κB aktyvaciją.

Image

( A ) ASI slopino NF κB-luciferazės aktyvumą po LPS stimuliacijos. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001, palyginti su LPS grupe, N = 4 / grupė, vidutinis ± SEM ( B ) ASI sumažino NF κB ir I κB fosforilinimą. ( C – K ) ASI užkirto kelią fosforilinto NF κB branduoliniam perkėlimui. Mastelio juosta, 20 μm. Pateikti duomenys buvo vienas iš tipinių bent trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatų.

Visas dydis

ASI slopino mikrogliacijos aktyvaciją ir uždegiminius atsakus EAE pelėms

Norėdami išsiaiškinti, ar ASI turėjo panašų poveikį mikroglia ląstelėms in vivo , mes išanalizavome mikroglia aktyvaciją po EAE. Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad gydymas ASI sumažino EAE sunkumą ir hipokampo mikrogliacijos aktyvaciją, tačiau šio atsako mechanizmas nežinomas. Mikroligijos aktyvacija pastebima neurologinių ligų metu, pasikeitus raumens struktūrai ir reaktyvumui į mikroglia žymeklį IbaI. Normaliose pelių stuburo smegenyse buvo išsklaidyti smulkūs mikroglialinių ląstelių procesai (3A pav.). Priešingai, EAE pelių stuburo smegenyse mikroglialinės ląstelės buvo suintensyvintos įtraukiant procesus ir padidėjo jų skaičius (3 pav. B). Tačiau ASI gydytų pelių mikroglionų forma ir tankis normalizavosi, kaip ir fiziologinės būklės (3 pav. C). Remiantis IHC rezultatais, EAE pelėse buvo šiek tiek padidėjusi CD11b mRNR (3D pav.). Tai lydėjo reikšmingas uždegimo žymenų IL1β, TNFα ir iNOS mRNR padidėjęs reguliavimas (3D pav.). Baltymai IbaI ir iNOS taip pat buvo sureguliuoti (3 pav. E – G), taip pat fosforiluotas tau baltymas (3 pav. H), neuronų pažeidimo žymeklis. Panašiai kaip ir IHC rezultatuose, padidėjusi CD11b, IL1β, TNFα ir iNOS mRNR raiška taip pat buvo slopinama gydant ASI (3D pav.). Be to, IbaI ir iNOS baltymų lygio padidėjimas bei tau fosforilinimas buvo žymiai susilpnintas, palyginti su EAE pelėmis be jokio gydymo (3E – H pav.). Šie duomenys parodė, kad gydant ASI, pastebimai sumažėja mikroglijų aktyvacija, ir tai rodo, kad ASI gali būti veiksminga neurodegeneracinių ligų, suaktyvinant mikroglia, terapija.

Image

( A – C ) Imuninio dažymo rezultatai parodė, kad gydymas ASI sumažino IbaI teigiamą mikroglialių aktyvaciją EAE pelių stuburo smegenyse. ( D ) ASI slopino CD11b, IL1β, TNFα ir iNOS mRNR ekspresijas. N = 4 / grupė. ( E – H ) ASI slopino Iba-I ir iNOS baltymų ekspresiją bei Tau fosforilinimą. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001, palyginti su EAE grupe, N = 3 / grupė, vidurkis ± SEM. Pateikti duomenys buvo vienas iš tipinių mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatų.

Visas dydis

Nuo ASI GR priklausomai sumažėjo mikroglia aktyvinimas

Mechanizmas, kuriuo ASI sumažino mikrogliacijos aktyvaciją, nežinomas. Kadangi ASI yra natūrali saponino molekulė ir kadangi buvo įrodyta, kad kitos saponino molekulės daro panašų į gliukokortikoidus, mes ištyrėme, ar ASI slopino mikrogliukozės aktyvaciją per GR. Norėdami nustatyti, ar ASI priešuždegiminis poveikis buvo per GR, mes panaudojome RU486 (identišką mifepristonui), GR inhibitorių. Kaip ir ankstesniais rezultatais, LPS stimuliacija sąlygojo žymiai padidintą NO išsiskyrimą, kurį galėjo susilpninti gydymas ASI (50 μM) (4A pav.). Panašus slopinimas buvo stebimas ir žinomu GR stimuliatoriumi Dex. RU486 panaikino tiek ASI, tiek Dex slopinantį poveikį NO gamybai (4A pav.). Tai rodo, kad ASI slopino NO gamybą priklausomai nuo GR.

Image

( A ) ASI slopino NO gamybą LPS stimuliuojamose BV-2 ląstelėse, kurių poveikį gali blokuoti RU486. N = 4 / grupė. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. *** p <0, 001 vs LPS grupė; & p <0, 05, palyginti su LPS + ASI grupe; ### p <0, 001 vs LPS + Dex grupė, Dex, deksametazonas. ( B ) GR siRNR galėtų veiksmingai slopinti jos baltymų ekspresiją. ( C ) GR sumažinimas siRNR sumažino ASI slopinantį poveikį iNOS baltymų ekspresijai BV-2 ląstelėse po LPS stimuliacijos. ( D ) ASI slopinimo greitis iNOS baltymo ekspresijai buvo žymiai mažesnis siGR transfekuotose plius LPS stimuliuotose BV-2 ląstelėse nei LPS stimuliuojamose BV-2 ląstelėse. Statistikai buvo naudojamas nesujungtas t- testas. ** p <0, 01, palyginti su LPS + ASI grupe, N = 3 / grupė, vidutinis ± SEM ( E ) ASI, priklausomai nuo laiko, panaikino PI3K ir Akt fosforilinimą BV-2 ląstelėse, stimuliavus LPS. ( F ) si GR panaikino ASI tarpininkaujantį PI3K ir Akt fosforilinimo reguliavimą LPS suklijuotose BV-2 ląstelėse. Pateikti duomenys buvo vienas iš tipinių bent trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatų.

Visas dydis

Norint patikrinti GR vaidmenį slopinančiame ASI poveikį mikrogliai, buvo naudojama GR siRNR. Kaip parodyta 4B pav., GR siRNR galėtų reikšmingai sumažinti GR baltymo ekspresiją BV-2 ląstelėse. LPS stimuliacija vis tiek sukėlė iNOS raišką GR siRNR transfekuotose ląstelėse (4 pav. C). Tačiau šiose ląstelėse ASI slopinamasis veiksmingumas LPS sukeltai iNOS buvo žymiai sumažėjęs, palyginti su ląstelėmis, kuriose nebuvo perkrauta GR siRNR (4 pav. D).

Kadangi PI3K arba Akt išjungimas yra viena iš suaktyvinto GR savybių, mes toliau ištyrėme, ar ASI paveikė PI3K ir Akt fosforilinimą po LPS stimuliacijos BV-2 ląstelėse. Kaip parodyta 4E pav., LPS stimuliacija, priklausomai nuo laiko, sąlygojo tiek PI3K, tiek Akt fosforilinimą. Tačiau gydymas ASI susilpnino PI3K ir Akt aktyvavimą priklausomai nuo laiko, tai rodo, kad ASI sukėlė GR aktyvaciją. Norint patvirtinti GR vaidmenį slopinančiame ASI poveikį PI3K ir Akt aktyvacijai, PI3K ir Akt fosforilinimas su siGR arba be jo buvo nustatytas naudojant Western blot analizę. Kaip parodyta 4F pav., Slopinantis ASI poveikį PI3K ir Akt fosforilinimui buvo panaikintas siGR, tai rodo, kad ASI moduliavo PI3K / Akt signalizaciją per GR.

Inhibitorių tyrimų, aktyvavimo kelio ir siRNR tyrimų jungtiniai duomenys pateikė tvirtus įrodymus, kad slopinamasis ASI poveikis mikroglijos aktyvacijai buvo tarpininkaujamas GR.

Norėdami nustatyti, ar ASI taip pat veikė per GR, in vivo EAE pelės buvo gydomos ASI, RU486, ASI ir RU486 bei Dex arba be jų. Kaip pranešta anksčiau, ASI administravimas palengvino EAE pelių elgesio sunkumą (5A pav.) Ir slopino uždegiminius atsakus, susijusius su mikrogliuvų aktyvacija. Kartu gydant RU486, ASI nebegalėjo pagerinti EAE, nes stuburo smegenyse buvo rasta daugiau fosforilintų tau baltymų (5 pav. B). Atitinkamai, ASI taip pat negalėjo slopinti CD11b, TNFα, IL1β ir iNOS mRNR išraiškos EAE pelėms (5C – F pav.). Šie duomenys reiškė, kad slopinamasis ASI poveikis mikroglijos aktyvacijai EAE pelėms bent iš dalies buvo susijęs su GR.

Image

( A ) RU486 numatė slopinantį ASI poveikį klinikiniams EAE pelių rodikliams. ( B ) RU486 sušvelnino Tau fosforilinimo slopinimą ASI stuburo smegenyse. ( C – F ) RU486 panaikino slopinamąjį ASI poveikį CD11b, IL1β, TNFα ir iNOS genų ekspresijai EAE pelėse. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001 palyginti su EAE grupe, N = 7 / grupė, vidurkis ± SEM

Visas dydis

ASI sąveikavo su GR, kad sumažėtų mikrogliacijos aktyvacija

Toliau nustatėme, ar ASI paveikė GR veiklą. HEK293 ląstelėse, kartu transfekuotose su GR ir GRE-luciferaze, Dex sukėlė aukštą GR aktyvumo lygį, matuojant luciferazės gamyba (6 pav. A). Gydymas ASI (25 arba 50 μM) sukėlė nuo GR priklausomą luciferazės aktyvumą. Šių ląstelių gydymas RU486 panaikino tiek Dex, tiek ASI sukeltą luciferazės aktyvumą, parodydamas luciferazės aktyvumo specifiškumą GR stimuliacijai.

Image

( A ) ASI padidino GR-luciferazės aktyvumą HEK293 ląstelėse, perkeltose su GR, kurių poveikį galėjo blokuoti RU486. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001, palyginti su kontroline grupe, N = 4 / grupė, vidutinis ± SEM ( B ) ASI sustiprino GR branduolinę translokaciją BV-2 ląstelėse stimuliavus LPS. Pateikti duomenys buvo vienas iš tipinių bent trijų nepriklausomų eksperimentų rezultatų.

Visas dydis

Norint nustatyti, ar ASI aktyviai dalyvavo GR perkėlime, LPS stimuliuotų BV-2 ląstelių branduoliniai ekstraktai, gydomi ASI arba be jos, buvo analizuojami Western blot būdu. Kaip parodyta 6B pav., ASI skatino GR persikėlimą į BV-2 ląstelių branduolį daug greičiau nei ląstelės, stimuliuojamos vien LPS. Taigi atrodo, kad ASI sąveikauja su GR ir dalyvauja GR perkeliant į ląstelių branduolį.

Toliau mes ištyrėme, ar ASI gali tiesiogiai prisijungti prie GR naudodamas molekulinio doko eksperimentą. Buvo atliktas indikacinis, tinkamas, dokas ASI prijungti prie mGR ligando surišimo vietos. Pradiniame mGR ir ASI dokų komplekse buvo keletas atomų susidūrimų, todėl buvo bandoma atlikti 10 ns MD modeliavimą, norint atpalaiduoti sistemą ir pašalinti susirėmimus. Galutinis kompleksas parodė, kad ASI gali patekti į „trikampio“ surišimo vietą (7 pav.), Kurią sudaro daugybė hidrofobinių liekanų, įskaitant Met567, Leu570, Met608, Met611, Ala612, Leu615, Phe630, Met653 ir Leu739. Be to, buvo galima sukurti du silpnus vandenilio ryšius: vienas buvo tarp gliukopiranozilo ir Gln577 OE, o kitas buvo tarp glikozido OH ir Asn571 OD (7B pav., C). Hidrofobinė sąveika sudarė didžiąją dalį ligando ir receptoriaus jungimosi energijos. Galiausiai, norint dar labiau patvirtinti molekulinio doko rezultatą, buvo atliktas konkurencinis TR-FRET GR tyrimas. Kaip parodyta 7D pav., ASI galėtų prisijungti prie žmogaus GR ligando surišimo srities (LBD) priklausomai nuo dozės (nuo 0 iki 100 μM).

Image

( A ) bendra mGR ir ASI komplekso struktūra. Vartų sritis paryškinta geltona spalva. ASI buvo suteiktas lazdelės režimu ir dažytas elementais: pilka, anglis; raudona, deguonis. ( B ) Įrišamos kišenės vaizdas. ASI buvo atvaizduojama rutuliniu lazda ir spalvota elementais. Baltymų liekanos buvo gaminamos lazdelės režimu, o anglis nudažyta liekanos spalva: ruda, stabili sritis; geltona, vartų sritis. ( C ) 2D ligando ir receptoriaus sąveikos schema. ASI turėjo hidrofobinę sąveiką su Met567, Leu570, Phe630, Met608, Met611, Ala612, Leu615, Met653 ir Leu739. Susiformavo du silpni vandenilio ryšiai: vienas yra tarp gliukopiranozilo ir Gln577 OE, o kitas yra tarp glikozido OH ir Asn571 OD. ( D ) ASI galėtų nuo dozės priklausomai jungtis su GR TR-FRET GR konkurencinio surišimo tyrime. Statistikai buvo naudojama vienpusė ANOVA su Dunnett daugybiniu palyginimo testu. * P <0, 05; *** p <0, 001, palyginti su kontroline grupe, N = 4 / grupė, vidurkis ± SEM

Visas dydis

Norėdami išsamiau ištirti galimą ASI sąveiką su GR, mes ištyrėme GR jungimosi sritį. Žmogaus gliukokortikoidų receptoriai (hGR) yra labai panašūs su mGR steroidus jungiančiame domene (SBD, 8A pav.). Juos sudaro 250 aa, o tapatumas ir panašumas tarp jų yra atitinkamai 95, 6% ir 98, 8%, tik 11 neatitinkančių aa. Bendroji GR SBD struktūra susideda iš 12 alfa spiralių ir 4 anti-lygiagrečių beta lakštų (8 pav. B) ir yra gana konservuota tarp hGR ir mGR, kai vidutinė CA RMSD yra 1, 17 Å (8 pav. C). SBD yra apsuptas 7 alfa spiralių ir 2 antiparaleliais beta lakštais: a2, a4, b5, b6, a7, a8, a12, a13 ir a14. Tačiau SBD atrodo labai tankus, kas rodo, kad didelis ligadas, toks kaip ASI, gali nepatekti be jokių konformacijos pokyčių. Tai rodo, kad GR SBD gali būti lanksti, kad būtų galima atidaryti „vartus“ prieš atvykstant ligandui, kad būtų galima surišti. Norint patikrinti hipotezę, buvo surinktos kelios hGR ir mGR struktūros, tiriant SBD lankstumą rišančiuose liganduose. Buvo dedamos devynios hGR SBD struktūros, jungiančios įvairaus dydžio ligandus (9A pav.). Padengtos struktūros rodė, kad N-galas a1 ir ilgas jungiklis tarp a1 ir a2 yra labai lankstūs. 3H52, hGR SBD-mifepristono kompleksas, a1 ir ilgasis jungiklis po a1 projektuojami vertikalia kryptimi. Tačiau jie vis dar buvo toli nuo SBD. A13, a14 ir jungiklis tarp jų taip pat buvo labai lankstūs. Struktūra, kuri pateikė didžiausią įžvalgą apie jungimąsi, buvo 1NHZ, taip pat hGR SBD-mifepristono kompleksas, kuriame a13 ir a14 atsidarė maždaug 45 ° (9 pav. B). Kadangi a13 ir a14 buvo arti SBD, a13 ir a14 judėjimas atidarė surišimo vietą (9C pav., D). Šie duomenys leido manyti, kad hGR SBD gali būti atidarytas ties a13, a14 ir linkeriu, „vartų regionu“.

Image

( A ) hGR ir mGR SBD sekų suderinimas. ( B ) 3D struktūra (PDB ID: 1M2Z) GR SBD. Skirtinga spalva žymi skirtingas antrines struktūras: raudona, alfa-spiralė; geltonas, beta lapas; pilka, atsitiktinė ritė arba posūkis. Paprastai jį sudaro 16 standžių komponentų, iš kurių 12 yra alfa-spiralės, o 4 - anti-beta lakšto. a: alfa-spiralė; b: beta lapas. Skaičius po raidės reiškia eilės tvarką nuo N-terminalo iki C-terminalo. ( C ) hGR SBD ir mGR SBD komplekso superpozicija: mėlyna, hGR SBD (PDB ID: 1M2Z); pilka, mGR SBD (PBP ID: 3MNE). Šios dvi struktūros jungiasi su tuo pačiu ligandu, deksametazonu, kuris taip pat parodytas diagramoje. Tiek baltymas, tiek ligadas yra labai gerai sudėti vienas su kitu, baltymo CA RMSD yra 1, 17 Å.

Visas dydis

Image

( A ) 9 hGR SBD superpozicija (PDB ID: 1M2Z, 1NHZ, 1P93, 3BQD, 3CLD, 3ELC, 3H52, 3K22 ir 3K23). Daugelio komponentų, išskyrus a1 ir vartų sritį (nuo Y735 iki N768), deformacijos yra gana stabilios, paryškintos geltonai. ( B ) „Vartų uždarymas“ ir „Vartų atidarymas“ atitikimų palyginimas. Išsaugota struktūra yra mėlyna, uždarų vartų sritis yra geltona, o atidaryti vartų sritis - geltonos spalvos. C ) „Vartų uždarymo“ formos vaizdas iš paviršiaus. Ligandas yra giliai palaidotas baltymuose. ( D ) „Vartų atidarymas“ formos vaizdas iš paviršiaus. Ligandas gali patekti į surišimo vietą per atvirus vartus. ( E ) 3 mGR SBD struktūrų superpozicija (PBP ID: 3MNE, 3MNO ir 3MNP). Vartų sritis (nuo Y741 iki N774) yra geltonos spalvos. ( F ) CA baltymo atomo svyravimo diagrama atsirado MD imituojant mGR „apo“ struktūrą iš 3MNE. Viršutinė schema yra CA B faktorius: raudona, gauta iš 10 ns MD modeliavimo; žalia, išgauta iš PBP failo. Apatinis brėžinys yra CA RMSF (šaknies vidurio struktūros svyravimas). Dvi punktyrinės linijos uždengia likučius, esančius vartų srityje. Smailė rodo, kad jungtis tarp a13 ir a14 yra lanksti ir gali sukelti „vartų“ judėjimą.

Visas dydis

Mes taip pat palygino 3 mGR SBD struktūras, kurios visos buvo kompleksuotos su Dex (9 pav. E). Daugelis stuburų buvo gana konservuoti, išskyrus jungtį tarp a1 ir a2. Iš ribotų mGR struktūrų panašios „vartų atviros“ struktūros nebuvo galima pastebėti. Tačiau, remiantis stebėjimu dėl hGR struktūrinio kintamumo, taip pat su labai seka ir struktūros homologija tarp hGR SBD ir mGR SBD, duomenys rodo, kad „vartai panašus“ mechanizmas taip pat gali būti mGR, kad padidėtų jo gebėjimas tilpti į didelius. ligandą kaip ASI. MGR SDB „apo“ (be jokio ligando, sujungto su baltymais rentgeno spindulių struktūroje) MD modeliavimo rezultatai patvirtino, kad mGR SBD vartų sritis (a13, a14 ir jungiklis tarp jų) taip pat buvo lanksti (9 pav. F ). Tai parodė panašias ASI funkcijas GR žmonėms ir pelėms, leidžiančius manyti, kad pelių funkciniai tyrimai gali būti labai svarbūs gydant žmones.

Diskusija

Jau įrodyta, kad visi astragalosidai ir ASI yra saugūs ir gerai toleruojami 24 . Be to, ASI jau patvirtintas kaip naujas vaistas I fazės klinikiniam tyrimui, kurį atliko Kinijos valstybinė maisto ir vaistų administracija 23, nors širdies ir kraujagyslių ligoms gydyti. Naujausi tyrimai parodė, kad ASI arba suminiai astragalozidai gali būti gydomi neurologinių ligų atvejais, kaip parodė trauminių smegenų sužalojimų 29 žiurkėms ir EAE pelėms 25, 30 tyrimai . Tačiau tikslus ASI funkcijos veikimo būdas ar veikimo būdas nebuvo išaiškinti. Šiame tyrime mes parodėme, kad ASI, tiesiogiai jungdamasis su GR, slopino mikroglijos aktyvaciją tiek in vitro, tiek in vivo , tokiu būdu pagerindamas GR branduolio translokaciją ir aktyviai provokuodamas GR tarpininkaujamus priešuždegiminius signalizacijos kelius (10 pav.), būtent PI3K, Akt, IκB ir NFκB defosforilinimas, pagaliau palengvino paskesnius priešuždegiminius mediatorius.

Image

Viena vertus, po prisijungimo prie GR ASI slopino PI3K ir Akt aktyvaciją, o tai sumažino fosforilinto I κB srautą ir paskatino NF κB dezaktyvaciją. Kita vertus, ASI ir GR kompleksas buvo perkeltas į branduolį, kur jis neleido NF κB prisijungti prie savo veikiančio elemento ir moduliavo pasroviui esančių iNOS, TNFα ir IL1β genų ekspresijas. Diagrama buvo sudaryta naudojant „Pathway Builder Tool 2.0“ („Protein Lounge“, San Diegas, Kalifornija).

Visas dydis

Pranešama, kad neurouždegimas, pasireiškiantis kaip per didelis mikroglialio suaktyvinimas ar mikrogliozė, yra glaudžiai susijęs su daugeliu neurodegeneracinių ligų, įskaitant Alzheimerio ligą, Parkinsono ligą ir SM. Dėl šių ligų CNS funkciniai ir pažeidimo sutrikimai dažnai sukelia tolesnius morfologinius mikrogliukozės pokyčius, pasižymint puikiais molekuliniais parašais. Aktyvavęsi, mikroglialinės ląstelės praranda normalią formą, susitraukia ir tampa apvalios iki ameoidinės morfologijos. EAE pelėse gausu aktyvuotų mikrogliozių, paženklintų IbaI, ir padidėjusia CD11b mRNR, viena iš integrinų šeimos narių, tarnavusių kaip mikroglijos žymeklis, rasta nugaros smegenų pilkojoje medžiagoje (3 pav.). Po ASI gydymo šie mikroglionai vėl įgavo normalią pavidalą, o tai rodo, kad ASI gali sumažinti mikroglia aktyvaciją, todėl suvaržė tolesnį neuroinfekciją.

Uždegiminių mediatorių, tokių kaip NO, IL1β ir TNFα, išsiskyrimas yra viena iš per daug suaktyvintų mikroglia savybių uždegiminėmis aplinkybėmis 31 . Šie citotoksiniai veiksniai gali sukelti reikšmingą neurotoksinį poveikį 32 . Smegenyse NO gamina neuronų azoto oksido sintazė (nNOS) ir iNOS. Tačiau normalios fiziologinės būklės mikroglijos neišreiškia iNOS, nebent jas suaktyvina įvairūs uždegimą sukeliantys veiksniai 33, 34 . Nenuostabu, kad padidėjęs iNOS, IL1β ir TNFα lygis dažnai laikomas neurodegeneracinių ligų požymiais 35 . Mūsų tyrime EAE pelių stuburo smegenyse, taip pat LPS stimuliuotose BV-2 ląstelėse rasta žymiai padidėjusių iNOS, IL1β ir TNFα mRNR išraiškų. Tačiau ASI vartojimas aktyviai slopino šių veiksnių padidėjimą, parodydamas stiprų priešuždegiminį poveikį. Atitinkamai, EAE pelėms, gydomoms ASI, reikšmingai sumažėjo tau fosforilinimas, neurodegeneracijos rodiklis. Nors, sumažinant EAE, gali dalyvauti keli mechanizmai, be abejonės, ASI slopindamas mikrogliaijas, todėl šiame procese lemiamą vaidmenį užkirto kelią tolesniam neurotoksinų susidarymui 25 .

NF κB yra glaudžiai susijęs su lėtinėmis uždegiminėmis ligomis, sukeldamas uždegimą sukeliančių veiksnių gamybą 36, 37 . Neaktyvios būklės NF κB dimerai jungiasi prie I κB baltymų. Varikliai, tokie kaip priešuždegiminiai citokinai ir LPS, suaktyvina I κB kinazės kompleksą, sukeldami I κB fosforilinimą, ubikvitinaciją ir skilimą. Išlaisvinti NF κB dimeriai bus perkelti į branduolį ir inicijuos taikinių genų transkripciją, prisijungdami prie specifinių DNR sekų. Mūsų tyrime LPS stimuliacija sustiprino IκB fosforilinimą, todėl buvo suaktyvinta NF κB, parodyta padidėjus fosforilinto NF κB branduolio perkėlimu ir pasroviui esančių genų transkripcija BV-2 ląstelėse (2 pav.). Vis dėlto visus šiuos LPS padarinius galima veiksmingai panaikinti gydant ASI, o tai rodo, kad NF κB kelias turi įtakos ASI priešuždegiminiam poveikiui.

PI3K / Akt kelias yra būtinas LPS sukeltai mikroglijų aktyvacijai per jo specifinį receptorių (TLR4) 38 . Ir NF κB bei PI3K / Akt keliai buvo kryžminami 39 . Tyrimai rodo, kad PI3K / Akt slopinimas efektyviai panaikina NF κB sąlygotą uždegiminių citokinų gamybą BV-2 ląstelėse, kai LPS stimuliacija yra 40, 41 . Mūsų eksperimentuose ASI galėjo panaikinti LPS sukeltą PI3K ir Akt aktyvaciją. Kadangi GR suaktyvinimas išjungia PI3K / Akt 6 kelią, o mūsų eksperimentuose GR numušimas siRNR neutralizavo ASI reguliavimą fosforilinant PI3K ir Akt BV-2 ląstelėse, todėl pagrįstai galima teigti, kad ASI užkirto kelią mikroglia aktyvacijai. per GR. Norėdami patvirtinti mūsų hipotezę, buvo atlikti keli kiti eksperimentai. HEK293 ląstelėse, per daug ekspresuojančiose GR, ASI sukėlė reikšmingą luciferazės, kurią kontroliuoja GRE (gliukokortikoidų atsako elementas), aktyvaciją. Be to, RU486 gali blokuoti jo poveikį. In vitro konkurencinio jungimosi tyrime ASI slopino Fluormone pažymėto ligando jungimąsi su GR nuo dozės. Atliekant molekulinį dokų tyrimą, nustatyta, kad ASI jungiasi ir prie mGR ligando surišimo vietos. Kai GR buvo numuštas BV-2 ląstelėse arba užblokuotas RU486 EAE pelėms, ASI priešuždegiminis poveikis buvo sušvelnintas.

Trumpai tariant, visi šie rezultatai stipriai patvirtino mūsų hipotezę: ASI slopino mikrogliukozės aktyvaciją per GR, kad sukeltų jos antineuroinfekcinį poveikį. Šie nauji atradimai gali atskleisti ASI ar jos darinių, kaip veiksmingo ir saugaus vaisto, vystymąsi gydant MS ir kitas neurodegeneracines ligas, kurioms būdingas neuroinfekcija.

Medžiagos ir metodai

EAE indukcija ir gydymas

Eksperimentinis autoimuninis encefalomielitas buvo sukeltas 6 savaičių C57BL / 6 pelių patelėms, kaip aprašyta anksčiau 42 . Kiekviena pelė buvo imunizuota po oda 300 μg MOG 35–55, emulguoto į visišką Freundo adjuvantą (CFA), kuriame yra 400 μg termiškai inaktyvuotos Mycobacterium tuberculosis H37RA. Kontrolinėms pelėms buvo injekuotas adjuvantas be MOG 35–55 . Intraperitoniškai kokliušo toksinas (200 ng / pelė) buvo sušvirkštas nedelsiant ir vėl po 48 valandų. Klinikinis pelių elgesys buvo vertinamas kiekvieną dieną pagal kriterijus, kuriais vadovavosi Peiris M ir jo kolegos 43 .

ASI (grynumas> 98%, 20 mg / kg) su RU486 arba be jo (10 mg / kg) buvo skiriama į pilvaplėvės ertmę kiekvieną dieną prieš EAE indukciją ir 2 savaites iš eilės. Po trijų savaičių gyvūnams buvo atlikta histopatologinė analizė pagal žemiau aprašytą metodą arba audiniai paimti po anestezijos, naudojant 20% uretano.

Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti pagal Šanchajaus tradicinės kinų medicinos universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto patvirtintus protokolus, kurie atitinka tarptautines taisykles ir politiką. Atliekant eksperimentus su gyvūnais buvo laikomasi etikos pagal ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) gaires ir jas patvirtino Šanchajaus tradicinės kinų medicinos universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas. Buvo stengiamasi sumažinti kančias ir sumažinti naudojamų gyvūnų skaičių.

Imunohistochemija (IHC)

Po anestezijos pelės buvo intrakardialiai perfuzuotos PBS, po to 4% paraformaldehido PBS. Nugaros smegenų vainikiniai pjūviai 20 μm atstumu buvo gauti naudojant Leica 1950 kriostatą. IHC procedūra buvo atlikta anksčiau aprašytais metodais 25 . Trumpai tariant, pjūviai buvo permerkti ir užblokuoti 10% asilo serumu PBS, turinčiame 0, 3% Triton X-100, pusvalandžiui. Todėl jie buvo inkubuojami su pirminiu antikūnu prieš Iba I (Gene Tex, GTX100042) 4 ° C temperatūroje per naktį, po to kruopščiai plaunami PBS. Po inkubacijos su antriniu antikūnu, konjuguotu su Alexa 488 (Invitrogen, A21208), sekcijos buvo sumontuotos ant plokštelių. Fluorescencija buvo vizualizuota naudojant apverstą fluorescencinį mikroskopą (Olympus IX 81, Japonija).

BV-2 ląstelių kultūra ir gydymas

Pelės mikroglialinių ląstelių linija, gauta iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC), buvo palaikoma DMEM terpėje, papildytoje 10% galvijo vaisiaus serumo 37 ° C temperatūroje su CO2. Ląstelės subkultūros buvo auginamos 6, 12 arba 96 šulinėlių plokštelėse, kurių tankis buvo 2 × 105 ląstelės / ml, jei nebuvo nurodyta kitaip.

MRNR ekspresijos modelio tyrimui ląstelės buvo iš anksto apdorotos ASI (50 μM) arba be jos (50 μM) arba deksametazonu (Dex, 10 μM) arba 2 valandas prieš LPS stimuliaciją. Po 24 val. Apdorojimo LPS (200 ng / ml), ląstelės buvo lizuotos Trizol (Life Technologies). Visa RNR buvo išgaunama pagal gamintojo pateiktą protokolą ir po to laikoma –80 ° C temperatūroje.

Fosforilinto PI3K ir Akt analizei ląstelės 2 valandas buvo iš anksto apdorotos ASI arba be jos (50 μM), po to stimuliavo LPS (200 ng / ml) 5, 15, 30 ir 60 minučių. Po to 0, 5 valandos jie buvo lizuojami CelLytic TM MT žinduolių audinių lizės reagentu (Sigma, JAV), papildytu proteazės inhibitoriaus kokteiliu (Sigma, P3840) ir fosfatazės inhibitoriaus kokteiliu 2 (Sigma, P5726). Lizato supernatantas, po centrifugavimo esant 10 000 aps./min. 10 min. 4 ° C temperatūroje, buvo patikrintas Western blotting metodu.

NF κB ir GR branduolio translokacijos tyrimui ląstelių branduolių ekstraktas buvo gautas naudojant NE-PER® branduolinius ir citoplazminius ekstrahavimo reagentus pagal pagaminimo vadovą („Thermo Scientific“, JAV) ir buvo atliktas Western blot analizė.

Norint įvertinti GR numušimo įtaką priešuždegiminiam ASI poveikiui, BV-2 ląstelės buvo laikinai perkeltos GR siRNR (GCUGGAAGAAAUGAUUGCATT) arba suplakta siRNR (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT), naudojant lipofektaminą 3000 (Life Technologies). Po dvidešimt keturių valandų ląstelės buvo iš anksto apdorotos ASI arba be jos (50 μM) 2 h, po to stimuliavo LPS (200 ng / ml) dar 20 h. Po to ląstelės buvo surinktos ir lizuotos Western blot analizei atlikti.

Western blot analizė

Baltymai iš ląstelių ar audinių buvo išgauti ultragarsu, naudojant „CelLytic TM MT“ žinduolių audinių lizės reagentą su proteazės ir fosfatazės inhibitorių kokteiliais. Po centrifugavimo 10 000 aps./min. 10 min. 4 ° C temperatūroje, lizato supernatantas buvo surinktas ir baltymų koncentracija buvo nustatyta BCA metodu. Iš viso trisdešimt mikrogramų baltymų iš kiekvieno mėginio buvo atskirti 10% SDS-PAGE ir perkelti į PVDF membranas. Po užkimšimo 5% liesu pienu, membranos buvo inkubuotos su atitinkamais pirminiais antikūnais prieš fosfo-NF κB (p-Ser536, CST, 3033S), NF κB (CST, 6956), iNOS (Abcam, ab15323), fosfo-I κB. (p-Ser32, CST, 2859S), I κB (CST, 4812S), LaminB1 (Epitomics, 6581-1), GR (Eptomics, 3626-1), fosfo-Tau (p-Ser202 / Thr205, Pierce, MN1020)., Tau (Abcam, ab3931), Akt (CST, 2920), p-Akt (p-S129, Epitomics, 550-1), p-PI3K (p-Tyr458, CST, 4228), PI3K (Epitomics, 3838-1 ) ir β-aktino (Sigma, A5441) ir, paeiliui, antrinių antikūnų, konjuguotų su krienų peroksidaze (Life Technologies). Signalas buvo vizualizuotas naudojant ECL pagrindinį rinkinį („GE Healthcare“, JK). Santykinis juostų kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant „Image J 1.46r“ (NIH, JAV).

Imunocitochemija (ICC)

Norint patvirtinti ASI poveikį branduoliniam NF κ translokacijai, buvo atliktas ICC dažymas. BV-2 ląstelės buvo iš anksto apdorotos ASI arba be jos (50 μM) 2 valandas prieš LPS stimuliaciją (200 ng / ml). Po valandos ląstelės buvo plaunamos PBS du kartus, po to fiksuojamos 4% PFA 10 min. Po to jie buvo permerkti ir užblokuoti 5% normalaus asilo serumo PBS, turinčiame 0, 1% Triton X-100. Po pusvalandžio ląstelės buvo inkubuotos su fosfo-NF κB p65 antikūnu 4 ° C temperatūroje per naktį. Kruopščiai nuplauti PBS, jie buvo toliau inkubuojami su Alexa-594 konjuguotu antriniu antikūnu kambario temperatūroje 1 val. Po to ląstelės buvo sumontuotos vektorine laikymo terpe, papildyta DAPI, išplautos PBS. Ląstelių fluorescencija buvo vizualizuota Olympus DX81 fluorescenciniu mikroskopu.

Uždegiminių veiksnių tyrimas

BV-2 ląstelės buvo iš anksto apdorotos ASI (50 μM) arba Dex (10 μM) arba be jos 2 h, po to 24 valandas stimuliuotos LPS (200 ng / ml). Kultūrinė terpė buvo surinkta ir atlikta sekanti analizė. TNFα koncentracija buvo nustatyta naudojant TNFα ELISA rinkinį (eBiosciences, JAV) pagal TNFα standartinę kreivę, paruoštą rekombinantiniu baltymu. NO kiekis terpėje buvo nustatytas naudojant Griess testą. Briefly, after incubated with nitrate reductase for 1 h at 37 °C to reduce nitrate to nitrite, the medium was mixed with equal volume of Griess reagent (Sigma). The optical density of the mixture was immediately measured at 540 nm with a Varioskan flash spectral scanning multimode reader (Thermo Scientific, USA). The concentration of nitrate in the medium was determined by a standard curve of sodium nitrate. Data obtained were expressed as fold change over controls.

Liuciferazės aktyvumo tyrimas

BV-2 cells were seeded in a 24-well plate at 2 × 10 5 cells/well and cultured overnight. The cells were transiently co-transfected with NF κB reporter vector pGL6 (luc2P/NF-κB-RE/Hygro) (Beyotime, China) and Renilla luciferase plasmids using Lipofectamine™ LTX and Plus reagent (Life Technologies). Eighteen hours after transfection, the cells were treated with ASI (0, 10, 25, and 50 μM) for 2 h followed by stimulation with LPS (200 ng/ml) for an additional 24 h. At last, cells were washed once with PBS and lysed in 1 × passive lysis buffer (Promega, USA). The lysates were centrifuged at 10, 000 rpm for 2 min at 4 °C. The luciferase activity of the supernatant was assayed using a Dual-luciferase Reporter assay system (Promega) with a Glomax 20/20 luminometer (Promega). To avoid the bias of transfection efficiency, final activities were designated as the activity of firefly luciferase normalized to that of Renilla luciferase.

HEK293 cells were seeded in a 24-well plate at 2 × 10 5 cells/well and cultured overnight. Eighteen hours after being transiently transfected with GR reporter vector pGRE-luciferase (Beyotime) and Renilla luciferase plasmids, the cells were pre-treated with RU486 (1 μM) for 30 min followed by Dex (10 μM) or ASI (10, 25, and 50 μM) treatment. Thirty hours later, the cells were lysed and subjected to luciferase activity assays as described above. Concentration of Dex used was determined according to the previously published report 44 .

Kiekybinis PGR

Total RNAs from the tissues or cells were extracted using Trizol reagent (Life Technologies). After eliminating trace amounts of DNA contamination with DNase I, total RNA was reversely transcripted into cDNA with Prime Script RT reagent (TakaRa, China). Quantitative PCR was carried out using Taqman SYBR kit (Life Technologies). Quantity of target genes was determined by standard curves generated with template plasmids containing fragments of respective target genes. Thereafter, they were normalized to that of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in the same sample. The sequences of forward and reverse primers were listed as follows: for iNOS, 5′-AACATCAGGTCGGCCATCAC-3′ and 5′-CCAGAGCCTGAAGTCATGTTTG-3′; for TNFα, 5′-AACCTCCTCTCTGCCGTCAAG-3′ and 5′-CCTCCCAGGTATATGGGCTCAT-3′; for IL1β, 5′-TGGGCCTCAAAGGAAAGAATC-3′ and 5′-GGTATTGCTTGGGATCCACACT-3′; for CD11b, 5′-GGTCGGCAAGCAACTGATTT-3′ and 5′-CAACTTGCATTATGGCATCCA-3′; for GAPDH, 5′-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′ and 5′-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′.

Molecular docking experiment

The canonical sequence of mouse glucocorticoid receptor (mGR, P06537) was retrieved from UniProt (//www.uniprot.org). The 3D structure of mGR was downloaded from Protein Database (PDB) by mapping the UniProt ID to PDB with the ID mapping tools on UniProt website and subjected to MOE 2013.08 (MOE) for structural consensus and flexibility analysis. An mGR steroid binding domain complexed with dexamethasone, 3MNE, was chosen as the starting model for docking analysis. The bread loop (G553 to P559), missing atoms, hydrogen and partial charge issues of the protein was fixed within MMFF94x forcefield using Structure Preparation tool in MOE. The hydrogen network was optimized by using Protonate 3D. Since S608 was close to the ligand binding pocket, a back mutation from serine to phenylalanine, was carried out by using the Rotamer Explorer to build a wild-type mGR steroid binding domain (SBD) model. Finally, whole complex was minimized with fixed heavy atoms except the atoms within 4.5Å around the mutated F608. The processed complex structure was saved for further docking study. All the docking and MD simulation were performed on Dell T5500 workstation installed with Quadro K600 graphic card.

GR competitive ligand-binding assay

To confirm if ASI could bind to GR, a LanthaScreen TR-FRET glucocorticoid receptor competitive binding assay kit was used (Invitrogen). Briefly, series dilutions of ASI (0, 10, 20, 40, 80, and 100 μM) were competed with Fluormone TM GS1 Green for binding with terbium labeled GR-LBD on a 384-well plate. One hour later after incubation at room temperature, the fluorescence intensity was detected on a microplate reader (Excitation: 340 nm; Fluorescein emission: 520 nm; Terbium emission: 490 nm; Envision TM, PerkinElmer). The final data were shown by normalizing the signal of fluorescein to that of terbium.

Statistinė analizė

Difference among groups was analyzed by one-way ANOVA using Graphpad Prism 5 software with Dunnett's multiple comparison test (La Jolla, CA, USA). Meanwhile, t-test was employed to compare the difference between two groups. Difference was considered significant when p < 0.05. All data were presented as mean ± SEM

Papildoma informacija

How to cite this article : Liu, H.-S. et al. Astragaloside IV inhibits microglia activation via glucocorticoid receptor mediated signaling pathway. Mokslas. Rep. 6, 19137; doi: 10.1038/srep19137 (2016).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.