Atorvastatinas slopina proliferaciją ir apoptozę, tačiau sukelia kepenų miofibroblastų senėjimą ir tokiu būdu mažina žiurkių kepenų fibrozę | laboratorinis tyrimas

Atorvastatinas slopina proliferaciją ir apoptozę, tačiau sukelia kepenų miofibroblastų senėjimą ir tokiu būdu mažina žiurkių kepenų fibrozę | laboratorinis tyrimas

Anonim

Dalykai

  • Kepenų fibrozė
  • Veiksmo mechanizmas
  • Senescencija

Anotacija

Kepenų miofibroblastai (MFB) rodo padidėjusį proliferaciją, migraciją ir kolageno gamybą, kurie yra nepaprastai svarbūs kepenų fibrogenezei. Gydymas atorvastatinu slopina MFB proliferaciją, apoptozę ir citokinų gamybą žiurkėms su tulžies lataku (BDL) in vivo . Čia mes toliau tyrėme pagrindinius mechanizmus. Pirminės žiurkės kepenų žvaigždžių ląstelės (HSC) buvo išskirtos ir kultivuotos į kepenų MFB. Po 3 dienų inkubacijos su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10 –6 M), realiojo laiko PGR buvo analizuojami profibrotinių citokinų (transformuojančių augimo faktorių β1, jungiamojo audinio augimo faktorių ir TIMP1) ir prokollageno I transkripcijos lygiai. . Proliferacija buvo tiriama 5'-brom-2'-deoksiuridino tyrimais. α-lygiųjų raumenų aktino baltymų ekspresija buvo tiriama atliekant Western blot analizę. Apoptozės matavimui buvo naudojama aneksino V ir propidium jodido, naudojant fluorescencinę ląstelių rūšiavimo analizę. Be to, MFB buvo tiriami p21 vesterno blotai ir β-galaktozidazės dažymas kaip senėjimo žymenys. Vėliau buvo analizuojama desmino ir senėjimo žymenų kepenų ekspresija žiurkių kepenyse, vartojančiose atorvastatino (15 mg / kg * d) 1 savaitę, pradedant 3 ir 5 savaites po BDL. Atorvastatinas slopino HSC aktyvaciją MFB ir sumažino citokinų ir kolageno gamybą MFB in vitro . Be to, atorvastatinas sumažino MFB proliferaciją, citokinų ir kolageno gamybą. Atorvastatinas inicijavo apoptozę esant 10–4 M ir susilpnėjo esant 10–5 M. Atorvastatinas sukėlė P21 baltymo ekspresiją ir β-galaktozidazės MFB dažymą in vitro ir in vivo . Kaip anksčiau buvo pastebėta in vivo, atorvastatinas sukelia panašų poveikį MFB: jis sumažina MFB apykaitą ir fibrogenezę. Mes siūlome, kad kitas mechanizmas, paaiškinantis šį poveikį, yra ląstelių senėjimas.

Pagrindinis

Kepenų fibrozės metu suaktyvinamos desmin teigiamos kepenų žvaigždžių ląstelės (HSC) ir kitos miofibroblastinės ląstelės (MFB) ir jos rodo profibrotinį aktyvumą. 1, 2, 3 Šios profibrotinės MFB gamina didelį kiekį tarpląstelinių matricos baltymų (pvz., Kolageno) ir profibrotinių citokinų (transformuojančių augimo faktorių β, TGF-β; jungiamojo audinio augimo faktorių, CTGF; iš trombocitų gauto augimo faktoriaus, PDGF). remti fibrozės progresavimą autokrininiu ir parakrininiu būdu. 4, 5 MFB išreiškia α-lygiųjų raumenų aktiną (α-SMA), kuris naudojamas kaip jų aktyvacijos žymeklis. 2, 6, 7

Statinai parodė teigiamą poveikį kepenų fibrozei ir portalo hipertenzijai, sergantiems ciroze, greičiausiai todėl, kad HMG-CoA-reduktazės slopinimas trukdo mažoms GTPazėms (RhoA ir Ras). 8, 9, 10, 11, 12, 13 Portalo slėgį mažinantis poveikis buvo priskirtas dėl RhoA perkėlimo į miofibroblastinio HSC membranos slopinimą ir tuo būdu sutrikdytas RhoA / Rho-kinazės signalo perdavimas, dėl kurio sumažėjo šių ląstelių susitraukimas ir sumažėjęs intrahepatinis atsparumas. 9 Progresuojantis ir ankstyvas gydymas atorvastatinu atliekant progresuojančią tulžies latakų fibrozę naudojant tulžies latakų ligaciją (BDL) 14, sumažino MFB aktyvaciją ir vėlesnį kolageno nusėdimą. 8 Visiškai nustatant tulžies fibrozę, gydymas atorvastatinu sumažino MFB apykaitą sumažindamas apoptozę ir MFB proliferaciją. 8 Šis poveikis, tuo pat metu nesumažinant ląstelių skaičiaus, gali būti paaiškintas augimo sustojimu ir sumažėjusiu fibroziniu aktyvumu. Tokie reiškiniai anksčiau buvo stebimi senstančiame miofibroblastiniame HSC. 15, 16, 17, kaip parodyta prostatos vėžio ląstelėms , statinai gali sukelti senėjimą. 18 Po ląstelių streso daugelyje ląstelių padidėja β-galaktozidazės ekspresija, daugiausia lizosomose, atspindinti senėjimą. 19, 20, 21 Tolesni senėjimo žymenys yra padidėjusi p21, 22, 23 ekspresija ir Wnt kelio aktyvacija. 24 WNT1 indukuojamas signalinis kelio baltymas 2 (WISP-2) (CCN5), Wnt kelio komponentas, tarpininkauja augimo sustabdymui ir silpnina TGF-β sukeltą poveikį. 25, 26

Šiame tyrime nagrinėjamas atorvastatino poveikis ląstelių kepenų MFB in vitro ir in vivo , ypač pabrėžiant proliferaciją, apoptozę ir senėjimą.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Pirminės žiurkės HSC išskyrimas ir kultūra

HSC buvo išskirti, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, po nuoseklaus kepenų perfuzijos in situ su IV tipo kolagenazės (Sigma, Sent Luisas, JAV) ir E pronazės (Merck, Darmštatas, Vokietija) tirpalu, disperguotos ląstelės buvo frakcionuojamos tankio gradiento centrifugavimu, naudojant Optiprep (Nycomed, Švedija). ). Ląstelės buvo imamos esant tankiui <1, 053 (9% Optiprep). Gyvybingumas ir grynumas buvo sistemingai didesnis nei 95%, kaip nustatoma pagal trypano-mėlynojo išskyrimą ir morfologinį apibūdinimą (vitamino A autofluorescencija). Ląstelės buvo pasėtos ant nepadengtų plastikinių kultūrinių indų ir kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10% vaisiaus veršelio serumo, 0, 6 TV / ml insulino, 2 mM glutamino ir 1% antibiotiko – antimikotinio tirpalo (Invitrogen, Karlsruhe, Vokietija). Dėl sąlyčio su plastiku HSC suaktyvėja ir po to diferencijuojasi. 27 Terpė buvo atnaujinama kas 48–72 val.

Pirminio žiurkės HSC inkubavimas su atorvastatinu

Į HSC kultūrinę terpę buvo pridėta atorvastatino, esant skirtingoms koncentracijoms ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M), pradedant 1 arba 3 dieną po izoliavimo. Kultūra aktyvuota HSC priėmimo terpė be atorvastatino tarnavo kaip kontrolė. Citologiniai požymiai (lipidų lašeliai, ląstelių forma ir plitimas) buvo įvertinti šviesos mikroskopu. Ląstelės buvo naudojamos eksperimentams 7 dienas po išskyrimo. Po pirmo praėjimo miofibroblastinis HSC buvo visiškai suaktyvintas. Šiems eksperimentams į šių ląstelių auginimo terpę 3 dienas buvo pridėta atorvastatino, esant skirtingoms koncentracijoms ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M), arba ląstelės liko neapdorotos. Eksperimentai buvo atlikti naudojant bent tris nepriklausomas izoliacijas.

HSC 5'-brom-2'-deoksiuridino (BrdU) platinimo tyrimas

Atorvastatino poveikis žiurkių HSC proliferacijos greičiui buvo nustatytas naudojant kolorimetrinį BrdU ELISA rinkinį (Roche Diagnostic GmbH, Penzberg, Vokietija). Trumpai tariant, ląstelės buvo pasodintos 6 x 105 ląstelių / ml tankumu plokščio dugno 96 šulinėlių plokštelėse. Per paskutines 24 valandas eksperimento ląstelės buvo paženklintos 10 μM BrdU ir jo įsiskverbimas buvo išmatuotas pagal gamintojo rekomendacijas (Roche Diagnostic GmbH).

Apoptozės nustatymas taikant aneksino V fluorescenciniu būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimo (FACS) analizę

Apoptozinės žiurkės kepenų miofibroblastinio HSC (MFB) analizė buvo atlikta naudojant komerciškai prieinamą „Annexin V“ apoptozės aptikimo rinkinį („BD Biosciences“, Heidelbergas, Vokietija). Trumpai tariant, 105 žiurkės MFB buvo du kartus plaunamos aneksiną V surišančiu buferiu. Ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 100 μl priedą V surišančio buferio ir 15 minučių kambario temperatūroje tamsoje inkubuotos su 5 μl FITC konjuguotu aneksinu V ir 5 μl propidium jodido (PI) dažymo tirpalu. Pridėjus 400 μl aneksino V surišančio buferio, ląstelių suspensija buvo ištirta srauto citometrija per 30 min. Apoptozinės ląstelės buvo apibrėžtos kaip neigiamos PI ir aneksino V atžvilgiu.

Apoptozės / nekrozės nustatymas nustatant subG1 ląsteles, naudojant ciklo analizę

105 MFB buvo plaunami šaltu fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) ir švelniai suspenduoti 500 μl PI hipotoninio lizės buferio (0, 1% (m / t) natrio citrato, 0, 1% (m / t) Triton X-100, 100 μg). / ml RNazės ir 50 μg / ml PI dejonizuotame H2O). Po mažiausiai 20 minučių inkubacinio laikotarpio 2 valandas po hipotoninio gydymo laisvieji branduoliai buvo ištirti citometriškai. Srauto citometrinė analizė buvo atlikta naudojant „FlowJo“ programinės įrangos ląstelių ciklo įrankį (Tristar, Ashland, JAV), kuris apima automatinį ląstelių ciklo fazių identifikavimą. 28

Vakarų balinimas

Užšaldytos ląstelės ir kepenų mėginiai buvo homogenizuoti buferiniame tirpale, kuriame yra 25 mM Tris / HCl, 5 mM etilengndiamino tetraacto rūgšties, 10 μM fenilmetansulfonilo fluorido, 1 mM benzamidino ir 10 μg / ml leupeptino. Mėginiai buvo praskiedžiami mėginių buferiu, kaip aprašyta anksčiau. 9 Homogenatų baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant DC-assay rinkinį (Bioradas, Miunchenas, Vokietija). Mėginiams (20 μg baltymų vienoje juostoje) buvo atlikta SDS-poliakrilamido gelio elektroforezė (10% gelių), o baltymai išpūsti į nitroceliuliozės membranas. Dažymas Ponceau-S buvo atliekamas siekiant užtikrinti vienodą baltymų kiekį, o GAPDH tarnavo kaip endogeninė kontrolė. Membranos buvo užblokuotos, inkubuotos su pirminiais α-SMA (Abcam plc, Kembridžas, JK), GAPDH, p21 (sc-25778, sc-397, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, JAV) arba desmino (GeneTex, Irvine) antikūnais., CA, JAV). Vėliau membranos buvo inkubuotos su atitinkamais antikūnais, sujungtais su peroksidaze (Calbiochem, San Diegas, JAV). Blotai buvo sukurti naudojant sustiprintą chemoliuminescenciją (Amersham, JK). Skaitmeniniu būdu aptiktų juostų intensyvumas buvo įvertintas densitometriniu būdu naudojant „Chemi-Smart“ (PeqLab Biotechnologies, Erlangen, Vokietija).

Kiekybinis realaus laiko PGR (RT-PGR)

RNR išskyrimas, atvirkštinė transkripcija su 0, 5 μg bendros RNR ir aptikimas RT-PGR būdu buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau. 9 pradmenys ir zondai RT-PGR buvo gauti kaip paruoštas naudoti mišinys (TGF-β-1, TIMP1, CTGF, prokologeno Ia ir PDGF-β receptoriai (PDGFβ-R)) iš „Applied Biosystems“ (Foster City, JAV). ). 18S rRNR tarnavo kaip endogeninė kontrolė (pradmenis ir zondus, paruoštus naudoti mišinyje „Applied Biosystems“). RT-PCR (ABI 7300 sekos detektorius) ir PGR reakcija (2x TaqMan-PCR-mastermix, Applied Biosystems) buvo atliktos, kaip aprašyta anksčiau. 9 Kiekvienam genui buvo atliktas patvirtinimo eksperimentas. Tikslinio geno ir endogeninės kontrolės RT-PGR efektyvumas buvo maždaug vienodas. −Δ C T išreiškia skirtumą tarp tikslinių genų ciklų ( C T ) ir endogeninės kontrolės. Norėdami geriau suprasti, mes normalizavome visas Δ C T reikšmes, palyginti su valdymo elementais. Kepenų mėginių rezultatai buvo išreikšti kaip 2 ΔΔCt ir išreiškė dvigubą geno ekspresijos padidėjimą, palyginti su kontroline grupe. Eksperimentai buvo atlikti naudojant bent tris nepriklausomas izoliacijas.

Ląstelių dažymas β- galaktozidaze

MFB buvo fiksuoti 2% formaldehidu ir 0, 2% glutaraldehidu. Po plovimo PBS, ląstelės buvo inkubuojamos per naktį 37 ° C temperatūroje su 0, 1% (m / v) X-Gal (Peqlab) 5 mM kalio heksacianoferrate (III), 5 mM kalio heksacianidoferrate (II), 2 mM magnio chlorido, 0, 01% (m / t) natrio deoksicholato ir 0, 02% (t / t) nonidet P-40 PBS. Vizualizacija buvo atlikta naudojant „Nikon Eclipse TS100“ mikroskopą su NIS-Elements D3.2 programine įranga (Nikon, Diuseldorfas, Vokietija).

Gyvūnai

Mes naudojome patinas „Sprague-Dawley“ žiurkes, kurių pradinis kūno svoris buvo nuo 180 iki 200 g. Kaip aprašyta anksčiau, šešiolikai žiurkių buvo atliktas BDL. Aštuoni gyvūnai buvo nužudyti praėjus 4 savaitėms po BDL (4 W), o aštuoni gyvūnai buvo nužudyti praėjus 6 savaitėms po BDL (6 W). Praėjus 3 ir 5 savaitėms po BDL, pusė 4 W BDL ir 6 W BDL žiurkių 1 savaitę prieš vartojimą buvo geriamos 15 mg atorvastatino 1 kg kūno svorio, prieš tai žudant, kaip aprašyta anksčiau. 8, 9 išpjaustytos kepenys buvo supjaustytos į fragmentus ir užšaldytos skystame azote (laikomos –80 ° C temperatūroje) arba laikomos formaldehide, kaip aprašyta anksčiau. 9 Tyrimą patvirtino vietinis tyrimų su gyvūnais komitetas (Bezirksregierung Köln, 50.203.2-BN22, 46 / 05).

Dvigubas β- galaktozidazės, α- SMA ir Desmino dažymas

Kriosekcijos iš kepenų audinio (20 ir 7 μm) buvo fiksuotos 2% formaldehidu ir 0, 2% glutaraldehidu. Po plovimo PBS, sekcijos buvo inkubuojamos per naktį 37 ° C temperatūroje su x-Gal-tirpalu (Peqlab). Imunohistocheminiam α-SMA dažymui 20 μm skaidrės su sekcijomis buvo inkubuotos su pelės anti-SMA antikūnu (1A4 klonas; Sigma-Aldrich), praskiestu santykiu 1: 600 Tris buferiniame druskos tirpale, 60 minučių. Buvo uždėtas biotiniluotas triušių ir pelių antrinis antikūnas, absorbuotas žiurkės serume (Dako, Glostrup, Danija) (1: 200, 45 min.) Ir kompleksuotas su strepdavidinu konjuguota šarmine fosfataze (1: 200, 45 min .; Dako). Dėmė buvo sukurta šviežiame fuksino-naftalino AS-BI tirpale (Sigma-Aldrich). Morfometrinei analizei dažyti bandiniai buvo analizuojami mažiausiai 10 mm 2 kepenų audinio, naudojant aprašomąją analizę (Histoquant, 3DHistech, Budapeštas, Vengrija), kaip aprašyta. 29, 30 Neįtraukti dideli tulžies latakai ir kraujagyslės.

Septynių mikrometrų kriosekcijos buvo analizuojamos konfokaline mikroskopija, naudojant LSM710 konfokalinį mikroskopą (Zeiss, Jena, Vokietija). Kad X-Gal dažymas būtų derinamas su anti-α-SMA arba anti-desmin imunohistochemija ir DAPI, plokštelės buvo papildomai inkubuojamos su anti-SMA antikūnais (1: 100; A2547, Sigma-Aldrich) arba anti desmin antikūnais. (1: 100; GTX 28592, GeneTex) ir su atitinkamu antriniu cy5 ženklu pažymėtu antikūnu arba „Dylight 649“ antikūnu (Dianova, Hamburgas, Vokietija). Po X-Gal dažymo sekcijos buvo kontrastuojamos DAPI (Sigma-Aldrich). Mėginiai buvo stebimi naudojant fluorescencinę mikroskopiją ir vertinami naudojant „AxioVision 4.8“ (Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland).

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sem. Mokinio t- testas buvo naudojamas palyginimui, kur tinka; Mann – Whitney U testas buvo naudojamas palyginimui tarp grupių. P vertės <0, 05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.

REZULTATAI

Atorvastatinas slopina pirminio žiurkės HSC aktyvaciją ir dauginimąsi in vitro

Neseniai mes parodėme, kad gydymas atorvastatinu palengvina kepenų fibrozę BDL žiurkėms. 8 Norint išanalizuoti atorvastatino poveikį HSC aktyvacijai, pirminės ramybės būsenos žiurkių HSC buvo gydomos atorvastatinu nuo pirmosios (d1) arba trečiosios dienos (d3) po izoliacijos, arba jie nebuvo gydomi. Analizė buvo atlikta 7 dieną po išskyrimo (1a pav.). Šių HSC proliferacija in vitro , vertinant BrdU tyrimu, žymiai sumažėjo priklausomai nuo dozės, vartojant didesnes atorvastatino dozes ( 10–4 ir 10 –5 M), nepriklausomai nuo inkubacijos laiko taško (d1, d3 ), tuo tarpu mažiausia dozė ( 10–6 M) neparodė BrdU įsisavinimo pokyčių, palyginti su kontroliniais (1b pav.). Panašiai PDGFβ-R mRNR lygiai, naudojami kaip HSC aktyvavimo žymeklis, buvo žymiai mažesni d1 ir d3 HSC po inkubacijos su didesnėmis atorvastatino dozėmis ( 10–4 ir 10–5 M). Vėlgi, atorvastatinas esant 10–6 M neturėjo įtakos PDGFβ-R mRNR pusiausvyros būsenos lygiui (1c paveikslas). Didžiausia atorvastatino koncentracija ( 10–4 M) sumažino α-SMA baltymo ekspresiją (1d pav.). Panašiai atorvastatinas, esant 10–5 M, žymiai sumažino HSC α-SMA baltymo ekspresiją kaip aktyvacijos žymeklį, tuo tarpu 10–6 M iš esmės neturėjo jokio poveikio HSC aktyvacijai (1d pav.). Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad atorvastatinas mažina ramybės būsenoje esančio HSC aktyvaciją ir slopina miofibroblastinio HSC proliferaciją.

Image

HSC proliferacija ir aktyvacija praėjus 7 dienoms po išskyrimo. Eksperimento planavimas naudojant pirminį žiurkės HSC ( a ). Ramios HSC inkubacija su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M) pradėta 1 (d1) arba 3 (d3) dieną po izoliacijos. Kontrolinis HSC liko neapdorotas. HSC eksperimentai buvo atlikti praėjus 7 dienoms po jų išskyrimo iš sveikų žiurkių kepenų. Ląstelių proliferacija buvo įvertinta įtraukiant BrdU naudojant ELISA ( b ). PDGFβ-R ( c ), kaip proliferacijos žymeklio, santykinė mRNR išraiška buvo nustatyta HSC lizatuose naudojant kiekybinį RT-PGR, pataisytą į 18 S rRNR kaip namų ruošos geną ir palygintas su HSC kontrolėmis (išreikšta 2 ΔΔCt ). Atorvastatino dozė priklausomai nuo HSC proliferacijos slopino. Α-SMA baltymų ekspresija atorvastatinu apdorotame ir kontroliniame HSC buvo matuojama Western blot ( d ) būdu. Atorvastatino dozė priklausomai slopino pirminio žiurkių HSC aktyvaciją. Eksperimentai buvo atlikti naudojant tris nepriklausomas izoliacijas.

Visas dydis

Atorvastatino inkubacija sumažino profibrotinių citokinų ir kolageno transkripciją ramybės būsenoje

Vėlesniuose eksperimentuose mes įvertinome atorvastatino įtaką HSC profibrotiniam aktyvumui, kurį atspindi profibrotinių citokinų ir kolageno mRNR lygiai. Pirminio HSC inkubavimas su atorvastatinu esant didesnėms koncentracijoms ( 10–4 ir 10 –5 M) sąlygojo žymiai sumažėjusius profibrotinių citokinų TGF-β-1 ir CTGF mRNR lygius, palyginti su negydytu HSC, tuo tarpu joks poveikis nebuvo matuojamas esant mažiausiai dozės atorvastatino (2a ir b paveikslai). Priešingai, matricos metaloproteazės inhibitoriaus TIMP1 ekspresija buvo blokuojama esant visoms atorvastatino koncentracijoms ir laiko momentams, kas rodo tiesioginį, nuo dozės ir laiko nepriklausomą poveikį (2c paveikslas). Atsižvelgiant į antifibrotinį atorvastatino poveikį, prokologeno Ia mRNR lygis reikšmingai sumažėjo tiek laiko momentu, tiek visose koncentracijose (2d paveikslas). Didžiausia atorvastatino koncentracija sumažino prokollageno Ia ekspresijos lygį beveik iki nulio (2d paveikslas). Taigi atorvastatinas, matyt, užkirto kelią pirminio žiurkės HSC aktyvacijai ir taip jų dauginimuisi bei profibrotiniam aktyvumui.

Image

Ramios HSC profibrotinis citokinas ir kolageno raiška. HSC buvo inkubuojami su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M), pradedant 1 (d1) ar 3 (d3) dienomis po izoliacijos. Rezultatai buvo palyginti su visiškai aktyvuota HSC kontrole praėjus 7 dienoms po išskyrimo. TGF-β-1 ( a ), CTGF ( b ), TIMP1 ( c ) ir Ia ( d ) tipo prokollageno santykinė mRNR išraiška buvo nustatyta HSC lizatuose kiekybine RT-PGR ir pataisyta į 18 S rRNR kaip namų tvarkymo geną ir palyginta. su HSC kontrole (išreikšta 2 ΔΔCt ). Eksperimentai atliekami naudojant tris nepriklausomus atskyrimus.

Visas dydis

Atorvastatino inkubacija sumažino MFB proliferaciją

Ankstesniame tyrime mes galėjome įrodyti, kad gydymas BDL žiurkėmis atorvastatinu esant nustatytai kepenų fibrozei sumažino MFB proliferaciją. Vis dėlto atorvastatino poveikis jau suaktyvintai MFB liko neaiškus. Todėl mes panaudojome kultūrą suaktyvinamą pirminį žiurkės HSC po pirmojo praėjimo, etapo, kuriame HSC yra į miofibroblastus panašios ląstelės (MFB). Šios ląstelės buvo inkubuojamos su atorvastatinu 3 dienas arba liko neapdorotos (3a pav.). Priešingai nei ramiai veikiantis HSC (1 paveikslas), MFB inkubavimas atorvastatinu nepakeitė jų α-SMA išraiškos (3b paveikslas). Įdomu tai, kad MFB paplitimą, įvertintą BrdU tyrimu, reikšmingai ir priklausomai nuo dozės sušvelnino didesnės atorvastatino dozės ( 10–4 ir 10 –5 M), tuo tarpu mažiausia dozė ( 10–6 M) neturėjo įtakos BrdU įsisavinimui. MFB, palyginti su kontrole (3c paveikslas). Panašiai PDGFβ-R mRNR kiekiai MFB labai sumažėjo po inkubacijos su atorvastatinu visomis dozėmis (3d pav.). Vėlgi, 10–6 M atorvastatinas turėjo mažesnę įtaką PDGFβ-R raiškai nei didesnės atorvastatino koncentracijos, tačiau poveikis vis tiek buvo reikšmingas (3 pav.). Šis eksperimentų rinkinys parodė, kad nors atorvastatinas sumažino MFB proliferaciją, jis nepakeitė α-SMA, jų aktyvavimo žymens, išraiškos.

Image

MFB platinimas ir aktyvinimas. Eksperimentinis dizainas DFB ( a ). MFB inkubacija su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M) buvo pradėta po pirmojo praėjimo 3 dienas. Kontrolinė MFB liko neapdorota. Α-SMA ( b ) baltymų ekspresija tiriamu ir kontroliuojamu MFB buvo matuojama Western blot būdu, tačiau nesiskyrė tarp grupių. Ląstelių proliferacija buvo įvertinta įtraukiant BrdU, naudojant ELISA ( c ). PDGFβ-R ( d ) santykinė mRNR ekspresija MFB lizatuose buvo nustatyta kiekybine RT-PGR ir pataisyta į 18 S rRNR kaip namų tvarkymo geną ir palyginta su MFB kontrole (išreikšta 2 -ΔΔCt ). Atorvastatino dozė priklausomai nuo MFB proliferacijos slopino. Eksperimentai atliekami naudojant tris nepriklausomus atskyrimus.

Visas dydis

Atorvastatino inkubacija sumažino profibrotinių citokinų ir kolageno ekspresijos lygius MFB

BDL žiurkių gydymas atorvastatinu esant nustatytai kepenų fibrozei sumažino citokinų raišką audinių lygyje, bet ne kepenų kolageno kiekį. 8 Čia mes išsamiai išanalizavome MFB profibrotinių citokinų ir kolageno raišką po inkubacijos su atorvastatinu. Profibrotinių citokinų TGF-β-1 ir CTGF mRNR lygis taip pat reikšmingai sumažėjo MFB po inkubacijos su atorvastatinu, palyginti su negydytu MFB (4a ir b paveikslai). Lygiai taip pat reikšmingai sumažėjo TIMP1 ir prokollageno Ia transkripcija esant visoms koncentracijoms (4c ir d paveikslai). Didžiausia atorvastatino koncentracija turėjo didžiausią poveikį CTGF ir prokollageno Ia transkripcijai, tuo tarpu mažiausia atorvastatino koncentracija turėjo mažiausią, tačiau vis dar reikšmingą poveikį TGF-β-1 ir TIMP1 mRNR lygiams (4 pav.). Šie rezultatai rodo, kad atorvastatinas slopina MFB profibrotinį aktyvumą, nes sumažina profibrotinių citokinų ir kolageno transkripciją.

Image

Profibracinis MFB citokinų ir kolageno išraiška. MFB inkubacija su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M) buvo pradėta po pirmojo praėjimo 3 dienas. Kontrolinė MFB liko neapdorota. TGF-β-1 ( a ), CTGF ( b ), TIMP1 ( c ) ir Ia ( d ) tipo prokollageno santykinė mRNR išraiška MFB lizatuose buvo nustatyta kiekybine RT-PGR ir pataisyta iki 18 S rRNR kaip namų tvarkymo geno ir palyginta. su MFB kontrole (išreikšta 2 ΔΔCt ). Atorvastatino dozė priklausomai nuo MFB proliferacijos slopino. Eksperimentai atliekami naudojant tris nepriklausomus atskyrimus.

Visas dydis

Apoptozės ir ląstelių mirties analizė MFB po atorvastatino inkubacijos

Atorvastatinas sumažina MFB proliferaciją nekeisdamas α-SMA išraiškos (3 pav.). Norėdami paneigti, kad šis poveikis yra tiesiog dėl apoptozės indukcijos, kaip kiti parodė HSC (bet ne MFB), 31 buvo atlikta V priedo FACS analizė, norint aptikti MFB apoptozę po atorvastatino inkubacijos, palyginti su MFB kontrole. Didžiausia atorvastatino koncentracija (10–4 M) padidino aneksino V teigiamų, ty apoptozės, MFB skaičių (5a ir b paveikslai). Taikoma tarpinė koncentracija ( 10–5 M atorvastatino) nepadidino aneksino V teigiamos MFB skaičiaus ir parodė žymiai mažiau apoptozės MFB nei didesnė dozė. Buvo MFB apoptozės mažėjimo tendencija, tačiau tai nebuvo statistiškai reikšminga (5a ir b pav.). Mažiausia atorvastatino koncentracija, palyginti su MFB kontrole, reikšmingų apoptozės pokyčių nepakito, tačiau žymiai daugiau apoptozinės MFB, palyginti su 10–5 M, ir žymiai mažiau apoptozės, palyginti su didžiausia atorvastatino koncentracija (5a ir b paveikslai). .

Image

MFB apoptozė in vitro . MFB inkubacija su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M) buvo pradėta po pirmojo praėjimo 3 dienas. Kontrolinė MFB liko neapdorota. Apibrėžus MFB po atorvastatino inkubacijos, MFB aptikti buvo naudojama FACS analizė ir palyginta su MFB kontrole ( a ). Reprezentatyvūs eksperimentai parodyti b . SubG1 ląstelių frakcijos ( c ) buvo aptiktos atliekant FACS analizę, naudojant Watson 28 aprašytą metodą, ir palygintos su MFB kontrole. Didžiausia atorvastatino ( 10–4 M) koncentracija sukėlė MFB apoptozę, tuo tarpu 10–5 M atorvastatino koncentracija apsaugo nuo apoptozės. Eksperimentai atliekami naudojant tris nepriklausomus atskyrimus.

Visas dydis

Nekrozinės / apoptozinės ląstelės (subG1 ląstelės) buvo aptiktos FACS naudojant Watsono aprašytą metodą. 28 Panašiai kaip ir aneksino V tyrime, didžiausia atorvastatino dozė ( 10–4 M) sukėlė didžiulę ląstelių mirtį, tuo tarpu 10–5 M atorvastatinas veikė apsaugingai (5c paveikslas). Vėlgi, atorvastatinas, esant 10–6 M, nepadidino ląstelių žūties, palyginti su kontroliniais, tačiau parodė žymiai daugiau ląstelių žūties nei esant 10–5 M koncentracijai (5c paveikslas).

Apibendrinant šiuos duomenis, atrodyta, kad MFB inkubacija 3 dienas esant 10–5 M koncentracijai apsaugo nuo apoptozės ir ląstelių žūties. Priešingai, dėl aukštesnių atorvastatino koncentracijų MFB apoptozės ir nekrozės lygis buvo žymiai didesnis nei tarpinės.

Atorvastatino inkubacija sukėlė MFB sensaciją

Mūsų rezultatai rodo, kad atorvastatinas sumažino MFB proliferaciją, profibrotinį aktyvumą ir modifikuotą apoptozę. MFB fenotipas, analizuotas pagal α-SMA raišką, išliko nepakitęs, tačiau ląstelės atrodo ramesnės. Todėl mes išanalizavome nustatyto senėjimo žymens p21 22, 23 išraišką, kad paaiškintume šią MFB būseną. Didžiausia atorvastatino koncentracija ( 10–4 M) nepadidino p21 ekspresijos padidėjimo MFB, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis (6a pav.). Atvirkščiai, inkubacija su atorvastatinu 10–5 ir 10–6 M temperatūroje 3 dienas pastebimai padidino p21 raišką MFB (6a pav.).

Image

MFB sensacija in vitro . MFB inkubacija su atorvastatinu ( 10–4, 10–5 ir 10–6 M) buvo pradėta po pirmojo praėjimo 3 dienas. Kontrolinė MFB liko neapdorota. Baltymo p21, senescence markerio, ekspresija buvo išmatuota Western blot metodu atorvastatinu gydytoje MFB ir palyginta su kontrolinėmis medžiagomis ( a ). Reprezentatyvios MFB (mėlynos) spalvos β-galaktozidazės sekcijos aptiktos senstančios MFB. Dėmės kiekybinis įvertinimas parodytas c . Wnt1 ( d ) ir WISP-2 ( e ) santykinė mRNR išraiška MFB lizatuose buvo nustatyta kiekybine RT-PGR ir pataisyta į 18 S rRNR kaip namų ruošos geną ir palyginta su MFB kontrole (išreikšta 2 -ΔΔCt ). Senescenciją MFB sukėlė 10–5 M atorvastatinas. Eksperimentai atliekami naudojant tris nepriklausomus atskyrimus.

Visas dydis

Norėdami sustiprinti šį atradimą, mes panaudojome β-galaktozidazės dažymą kaip papildomą įrankį senėjimui nustatyti. 19, 20, vėlgi, atorvastatinas žymiai padidino MFB β-galaktozidazės dažymą ( 10–4 ir 10 –5 M), palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (6b ir c paveikslai). Tačiau MFB inkubacija su atorvastatinu esant 10 - 6 M nepadėjo dažyti β-galaktozidazės (duomenys nepateikti).

Kitas užuomina apie senėjimo buvimą mezenchiminėse ląstelėse yra Wnt kelio aktyvinimas. 24 Mes ištyrėme tai kaip trečią įrodymų, patvirtinančių padidėjusį MFB senėjimo po inkubacijos su atorvastatinu, eilutę. Iš tikrųjų esant 10–4 M koncentracijai, Wnt1 ekspresija nebuvo aptinkama, tačiau Wnt1 mRNR lygis labai padidėjo esant 10–5 ir 10–6 M koncentracijai (6d paveikslas). Pasroviui po Wnt signalizacijos kelio yra sukeliama WISP-2 (CCN5), kuri vaidina svarbų vaidmenį augimo sustabdyme ir TGFβ kelių represijose, raiška, 25, 26 . Vėlgi, pastebimai padidėjus WISP-2 mRNR lygiui MFB po inkubacijos su atorvastatinu esant 10–5 M (6e pav.). Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad 10–5 M atorvastatino koncentracija gali sukelti miofibroblastinio HSC in vitro sensaciją (6 paveikslas).

BDL žiurkių sensacijos analizė

Anksčiau mes parodėme, kad gydymas žiurkėmis atorvastatinu 1 savaitę sumažina kepenų α-SMA teigiamos MFB proliferaciją ir apoptozę, nepakeisdamas jų skaičiaus. 8 Kadangi mūsų in vitro eksperimentai rodo aktyvuotos MFB senėjimą, mes ištyrėme šių žiurkių kepenų senėjimą, naudodamiesi aukščiau aprašytais žymenimis, p21 ir β-galaktozidaze. BDL žiurkės buvo gydomos atorvastatinu 1 savaitę po 3 arba 5 BDL savaičių arba jos nebuvo gydomos (7a ir b pav.). Anksčiau aprašėme, kad gydymas atorvastatinu žymiai sumažino kepenų MFB citokinų ekspresiją, proliferaciją ir apoptozę, nepaveikdamas jų bendro skaičiaus ar kolageno kaupimosi abiejuose gydymo režimuose. 8

Image

p21 ir desmino baltymų ekspresija BDL žiurkės modelyje in vivo . In vivo eksperimentas su BDL žiurkėmis ( a, b ). Žiurkėms buvo sukelta fibrozės sukelta tulžies latako ligacija ir jos buvo laikomos atitinkamai 4 savaites ( a ) ir 6 savaites, gydant atorvastatinu tik paskutinę savaitę abiejose grupėse (kiekvienoje grupėje n = 4). P21 ( c, d ) ir desmino ( e, f ) baltymų ekspresija kepenyse buvo analizuojama atliekant Western blot analizę. C, d, e ir f skyriuose pateikiami reprezentatyvūs vesternų blotai ir densitometriniai kiekybiniai rodikliai, išreikšti ± ± santykiniais densitometriniais vienetais (du), palyginti su kontrolinėmis BDL žiurkėmis (100 du). Atorvastatinas sukėlė kepenų p21 baltymo ekspresiją 6 W BDL žiurkėms in vivo ( d ) ir sumažino kepenų desmino baltymų ekspresiją šiose žiurkėse ( f ).

Visas dydis

Gydymas atorvastatinu vieną savaitę, praėjus 3 savaitėms po BDL (7a pav.), Reikšmingai nepakeitė šių žiurkių kepenų p21 ar desmino ekspresijos (7c ir e paveikslai). Atvirkščiai, gydymas atorvastatinu po 5 savaičių BDL (7 pav. B) padidino p21 ekspresiją kepenyse ir sumažino desmino baltymo ekspresijos lygį, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (7d ir f pav.).

Be šių išvadų, mūsų eksperimentai taip pat atskleidė, kad gydymas atorvastatinu reikšmingai padidino β-galaktozidaze teigiamų ląstelių skaičių abiejuose gydymo režimuose (8a ir b paveikslai). Imuninis dažymas parodė perinuklearinę β-galaktozidazės ekspresijos lokalizaciją - galbūt lizosomose - kaip aprašyta su senėjimu susijusios β-galaktozidazės ekspresijai. 19, 20, 21 Šios ląstelės citoplazmoje ekspresuoja α-SMA arba desminą, kaip parodyta dvigubo dažymo ir konfokalinės mikroskopijos būdu (8c ir d paveikslai). Šie duomenys rodo senėjimo indukciją aktyvuotame HSC ir kepenų MFB (8c ir d paveikslai).

Image

Senyvių ląstelių lokalizacija BDL žiurkių kepenyse in vivo . Originali kepenų β-galaktozidazės išraiška (mėlyna, rodyklė) buvo nustatyta atorvastatinu gydytoms žiurkėms, kai gydymas buvo pradėtas praėjus 3 savaitėms (4 W) ir 5 savaitėms (6 W) po BDL, kaip parodyta tipiniuose a skirsniuose. Β-galaktozidazės dažų kiekybinis įvertinimas pateiktas b reikšme kaip vidurkis ± c. Skydelyje parodytas α-SMA (viršutinė plokštė) arba desmino (apatinė panelė) imunofluorescencinio dažymo konfokalinė dalis raudonai, branduolinės spalvos DAPI (mėlyna) ir branduolio lizosominė β. -galaktozidazės dažymas (juodas) 4 W BDL + atorvastatino kepenų skyriuose. D skyriuje pateikiami tipiniai α-SMA (viršutinė skydinė) arba desmino (apatinė skydinė) imunofluorescencinių dažų konfokaliniai skyriai raudonais, branduoliniais dažais DAPI (mėlyna) ir perinuklearinėmis lizosominėmis β-galaktozidazės spalvomis (juodos spalvos) kepenų skyriuose, kurių 6 W BDL + atorvastatino. Padengtuose konfokaliniuose ruožuose (dažant DAPI, βGal ir desmin / αSMA) dažymas perinukleariniame lizosominiame β-galaktozidazės dažyme yra citoplazminiuose α-SMA ir DAPI teigiamuose branduoliuose, o tai rodo sensacijos indukciją aktyvuotose HSC ir MFB ląstelėse. in vivo abiejose grupėse, gydomomis atorvastatinu.

Visas dydis

DISKUSIJA

Šiame tyrime mes ištyrėme ląstelių atorvastatino poveikį ramybės būsenos HSC in vitro, taip pat aktyvuotai MFB in vitro ir in vivo . Mes nustatėme, kad inkubavimas su atorvastatinu slopina kultivuojamos ramybėje gyvenančios žiurkės pirminio HSC aktyvaciją. Be to, atorvastatinas sukėlė MFB senėjimą ir in vitro, ir in vivo . Senėjimo indukcija bent iš dalies galėtų paaiškinti, kodėl MFB sumažėjo proliferacija, apoptozė ir profibrotinis aktyvumas po gydymo atorvastatinu.

Kepenų MFB, nepaisant kilmės, yra pagrindinis vaidmuo skatinant sužalojimų sukeltą kepenų fibrozę. 2, 3, 4, 5 Kepenų pažeidimas suaktyvina MFB, kuriam būdingas padidėjęs citokinų (TGF-β, PDGF ir CTGF) ir kolageno ekspresija, pakitęs receptorių susidarymas (PDGFβR padidėjęs reguliavimas) ir padidėjęs proliferacija. Įrodyta, kad 2, 4, 5 inaktyvuota HSC keičia jų morfologiją praradus lipidų lašelius ir padidėjus α-SMA ekspresijai. 32, 33, 34

Ankstesniame mūsų tyrime profilaktinis gydymas, pradėtas iškart po BDL, sumažino MFB kiekį kepenyse ir sumažino kolageno kaupimąsi, tačiau reikšmingai nesumažėjo citokinų gamyba ar uždegimas. 8 Jei atorvastatinas buvo skiriamas vėliau, bet vis dar iki išsivysčiusiai fibrozei, kolageno formavimasis buvo sumažintas. Šie in vivo radiniai dabar buvo iš esmės pabrėžti atliekant mūsų ląstelių kultūros eksperimentus. Visų pirma, nuo dozės priklausomas atorvastatinas slopino miegančio HSC proliferaciją (1 paveikslas), nesukeldamas apoptozės, kaip anksčiau aprašė kiti. 31 Kadangi PDGFβR (proliferacijos žymeklis) ir α-SMA (MFB žymeklis) ekspresija buvo žymiai sumažėjusi (1 paveikslas), greičiausias paaiškinimas yra HSC aktyvacijos slopinimas. Remiantis šia prielaida, atorvastatinu inkubuotas MFB išreiškė mažiau profibrotinių citokinų ir kolageno (2 pav.).

Atorvastatino poveikis MFB, priešingai, išlieka paslaptingas. Kaip nustatyta mūsų anksčiau paskelbtuose duomenyse, esant in vivo diagnozuotai fibrozei, gydymas atorvastatinu sumažino citokinų ekspresiją, nesukeldamas pastebimo uždegimo ar kepenų ląstelių pažeidimo sumažėjimo. Be to, sumažėjo MFB paplitimas, o tai rodo tiesioginį atorvastatino poveikį MFB fibrozinėse kepenyse. Šis poveikis dabar buvo išsamiau išanalizuotas in vitro ir mes nustatėme, kad tiek proliferacija, tiek profibrotinių mediatorių ekspresija buvo sumažinta inkubuojant atorvastatiną priklausomai nuo dozės (3 ir 4 pav.). Įdomu tai, kad šis poveikis nebuvo susijęs su α-SMA baltymo ekspresijos pokyčiais (3b pav.), Kas rodo, kad nors MFB išliko aktyvuota, jų profibrotinį aktyvumą užtemdė atorvastatinas.

Taigi, atsižvelgiant į atorvastatino dozę, sumažėjo MFB proliferacija ir profibrotinių veiksnių transkripcija šiuose aktyvuotuose ir visiškai transdiferencijuotuose MFB.

Anksčiau buvo įrodyta, kad kultūra, suaktyvinta HSC, rodo nuo dozės priklausomą apoptozės padidėjimą po 22 valandų inkubacijos su atorvastatinu. 31 Aprigliano ir kt. 31 šį poveikį priskyrė ląstelių ciklo sustabdymui ir kaspazės indukcijai. Šis poveikis gali rodyti ankstyvą toksinį atorvastatino poveikį ląstelių kultūrai. Priešingai nei šie in vitro duomenys, lėtinis gydymas atorvastatinu 1 savaitę mūsų rankose kaspazės aktyvumo nepakeitė; tai netgi sumažino MFB apoptozę ląstelėse, turinčiose visišką fibrozę, kaip parodyta anksčiau žiurkėms. 8 Todėl šiame tyrime mes panaudojome visiškai diferencijuotą MFB (po pirmojo praėjimo) ir inkubavome juos su atorvastatinu ilgesnį laiką (3 dienas), nei tai padarė Aprigliano ir kt . 31 Šioje situacijoje MFB apoptozė padidėjo tik po inkubacijos su didžiausia atorvastatino doze ( 10–4 M), tačiau sumažėjo esant 10–5 M (5 paveikslas). Po 3 dienų inkubacijos su 10–5 M poveikis buvo gana stabilus, be galimo toksiško sutapimo, koks galėjo būti didelės dozės ( 10–4 M) atveju. Toksinis poveikis taip pat gali paaiškinti pastebėtą trumpalaikį poveikį, kaip aprašyta anksčiau. 31

Apibendrinant, atorvastatinas sumažino MFB (bent 10–5 M) proliferaciją, profibrotinį aktyvumą ir apoptozę. Mes siūlome MFB senėjimą, anksčiau aprašytą HSC, 15, 16, 17, kaip vieną paaiškinimą šiam radiniui. Tačiau atorvastatino poveikis apoptozės ar senėjimo indukcijai priklauso nuo dozės. Didelė atorvastatino dozė ( 10–4 M) sukėlė senėjimą (β-galaktozidazės dažymą), po kurio įvyko apoptozė (5 ir 6 pav.). Priešingai, mažesnė dozė ( 10–5 M) daugiausia paskatino p21 ir β-galaktozidazės ekspresiją kaip senėjimo žymenis, nedidindama šių ląstelių apoptozės. Recently, it has also been shown that Wnt1 might induce senescence in mesenchymal cells. 24 Interestingly, atorvastatin at 10 −5 M induced the expression of Wnt1 and its downstream effector WISP-2 (Figure 6), a repressor of the TGF-β pathway. 26

We also investigated senescence in vivo using p21 and β-galactosidase staining in rats treated for 1 week with atorvastatin 3 and 5 weeks after BDL (Figures 7 and 8). 8 In these rats, atorvastatin did not affect collagen and MFB accumulation, but decreased proliferation, transcription of profibrotic factors and apoptosis of MFB. 8 At the same time our present work revealed an induction of senescence, as assessed by β-galactosidase stainings (Figure 8a and b). This was more pronounced in more advanced stages of fibrosis (6 W BDL, Figure 8b), and might explain why p21 expression, a further senescence marker, was only increased in the 6-week BDL group treated with atorvastatin. The higher rate of senescent cells is probably caused by the fact that livers with more advanced fibrosis harbor more MFB. Co-localization microscopy (Figure 8c and d) identified MFB (α-SMA-positive cells) and HSC (desmin-positive cells) as the senescent cells (β-galactosidase-positive cells). This senescence of MFB we found is currently believed to be a stage between their profibrotic active state and apoptosis. 15, 16, 17

Thus, our in vivo and in vitro findings suggest that atorvastatin drives MFB to senescent, inactive cells, which are not yet apoptotic.