Autofagija apsaugo nuo švitinimo sužalojimų ir palaiko kamieną, nes mažėja rožių susidarymas mezenchiminėse kamieninėse ląstelėse ląstelių mirtis ir liga

Autofagija apsaugo nuo švitinimo sužalojimų ir palaiko kamieną, nes mažėja rožių susidarymas mezenchiminėse kamieninėse ląstelėse ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Autofagija
  • Mesenchiminės kamieninės ląstelės

Anotacija

Kamieninėms ląstelėms buvo būdingas jų kamieniškumas: atsinaujinimas ir pluripotenciacija. Mesenchiminės kamieninės ląstelės (MSC) yra unikalus suaugusių kamieninių ląstelių tipas, kurios, kaip įrodyta, dalyvauja audinių atstatyme, imunologiniame reguliavime ir navikogenezėje. Švitinimas yra gerai žinomas veiksnys, sukeliantis kamieninių ląstelių funkcinę kliūtį. Tačiau kamieno palaikymo mechanizmas švitinamose žmonių MSC vis dar nežinomas. Mes parodėme, kad švitinimas gali sukelti reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kaupimąsi, dėl kurio MSC buvo pažeista DNR ir kamienas. Badavimo ar rapamicino sukelta autofagija gali sumažinti su ROS kaupimu susijusius DNR pažeidimus ir palaikyti kamieną MSC. Be to, autofagijos slopinimas padidina ROS kaupimąsi ir DNR pažeidimus, dėl kurių MSC gali prarasti kamieną. Mūsų rezultatai rodo, kad autofagija gali atlikti svarbų vaidmenį saugant MSC kamienus nuo švitinimo traumų.

Pagrindinis

Kamienines ląsteles apibūdina jų gebėjimas atsinaujinti ir daugiapotencialiai diferencijuotis, įskaitant embrionines kamienines ląsteles ir suaugusiųjų kamienines ląsteles (ASC). Mesenchiminės kamieninės ląstelės (MSC) yra unikalus ASC tipas, atsirandantis iš mezodermos. Jie gali diferencijuoti ne tik į mezoderminės linijos ląsteles, tokias kaip osteoblastai ir adipocitai, bet ir į ektodermines bei endodermines ląsteles. 1, 2, 3, 4 MSC dalyvauja imunologiniame reguliavime, navikogenezėje ir audinių atstatyme.

MSC vaidina svarbų vaidmenį atkuriant audinių sužalojimus. Buvo pranešta, kad MSC prisideda prie kelių rūšių audinių atstatymo ir funkcijų atkūrimo, nes atsinaujina ir gali daugintis. Jonizuojančioji spinduliuotė (IR) yra elektromagnetinės spinduliuotės forma, kurią sukuria rentgeno aparatai, fluoroskopija, radioaktyvieji izotopai, taip pat branduolinė aplinkos katastrofa. 5 IR taikymas medicinoje pastaraisiais dešimtmečiais išaugo. 6, 7, 8 IR gali sukelti DNR pažeidimą, chromosomų aberacijas, ląstelių ciklo sustojimą ar ląstelių mirtį. Be to, veikiant švitinimui, ląstelės generuoja reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) ir sukelia vienos ir dvipusės DNR pertraukas. 9, 10 Suprasti šiuos radiobiologinius poveikius išlieka iššūkis ieškant saugios strategijos, kaip atkurti jų gebėjimą atitaisyti DNR žalą ir palaikyti jų kamieną švitinamose MSC.

Autofagijai būdinga dvigubos membranos pūslelių, vadinamų autofagosomomis, formavimasis, kuris įtraukia citoplazmos komponentus ir tiekia juos lizosomoms skaidytis. Autofagija yra konservuotas proteolitinis mechanizmas, kuris skaido citoplazmines medžiagas, įskaitant ląstelių organelius, ir yra svarbus palaikant ląstelių homeostazę ir palaikant ląstelę sveiką, kuri gali būti aktyvuota kaip adaptyvusis atsakas į nepalankią aplinkos būklę, pavyzdžiui, maistinių medžiagų trūkumą, hipoksiją ir kitokias. terapinio streso rūšys. 12, 13, 14, 15, 16, 17 Autofagija yra svarbus įvykis daugelyje skirtingų rūšių ląstelių, 18 įskaitant eritrocitus, 19 limfocitų 20 ir monocitus. 21 Mortensen ir kt. 22 pranešė, kad kraujodaros kamieninėse ląstelėse (HSC) buvo suaktyvinti autofaginiai mechanizmai. HSC, neturintiems su autofagija susijusio geno ATG7 , esminio autofagijos baltymo, negalėjo išgyventi in vivo . Šie rezultatai rodo, kad autofagija yra svarbi kamienų palaikymui ir diferenciacijai HSC. Todėl mes ištyrėme autofagijos vaidmenį išsaugojant savarankiško atsinaujinimo ir daugialypio diferenciacijos potencialą MSC. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad autofagija, kurią sukelia maistinių medžiagų trūkumas arba rapamicinas, gali pakeisti sužalojimų MSC pažeidimus. Mes iškėlėme hipotezę, kad autofagijos indukcija gali apsaugoti MSC nuo švitinimo ir išlaikyti jų daugiapotencialų statusą. Šio tyrimo tikslas yra ištirti autofagijos vaidmenį palaikant kamieną MSC veikiant IR ir galimus mechanizmus.

Rezultatai

Švitinimas kenkia MSC kamienams

Kaip parodyta 1a paveiksle, MSC buvo teigiami specifinių paviršiaus žymenų, tokių kaip CD105, CD90 ir CD29, atžvilgiu, bet neigiami kraujodaros ląstelių paviršiaus žymenų, tokių kaip CD34 ir CD45, atžvilgiu. CD105, CD90 ir CD29 ekspresija apšvitintose MSC pasirodė esanti mažesnė nei kontrolinėje grupėje.

Image

Švitinimo sužalojimo poveikis MSC kamienams in vitro . MSC buvo apšvitintos 6 Gy greičiu ir surinktos praėjus 6 valandoms po apšvitinimo. a ) MSC paviršiaus žymenys skirtingose ​​grupėse buvo aptikti srauto citometrijos metodu. ( b ) CFU-F tyrimai. Kolonijų skaičius buvo nustatytas po 14 dienų auginimo. c ) Tiriant MSC, kuriems buvo švitinta, kamieninių žymenų Nanog, Oct4 ir Sox2 išraišką, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, buvo naudojami realaus laiko PGR ir Western blotting. d ) Alizarino raudonojo dėmės metu buvo nustatyta osteogeninė MSC diferenciacija. e ) Osteogeninių žymenų genų ALPL , OGN ir RUNX2 kiekybinė išraiška buvo matuojama realaus laiko PGR 0, 7 ir 14 dienų metu. ( f ) Adipogeninis MSC diferenciacija buvo aptiktas aliejiniu raudonuoju-O. ( g ) Adipogenezės žymenų genų LPL , CFD ir PPAR-γ kiekybinė išraiška buvo matuojama realaus laiko PGR 0, 7 ir 14 dienomis. Pateikti trijų pakartojimų duomenys, kurių vidurkis ± SE * P <0, 05

Visas dydis

Švitinimo dozių serija, nuo 1 iki 10 Gy, buvo naudojama norint nustatyti tinkamą dozę, darančią įtaką kamienui, neslopinant MSC proliferacijos. Mes nustatėme, kad MSC kolonijų susidarymas buvo veiksmingai slopinamas švitinant 6 Gy doze, o MSC ląstelių gyvybingumas nebuvo (1 papildomas paveikslas). Tuomet buvo tiriama MSC apoptozė 0, 6, 24 ir 48 val. Po 6 Gy apšvitos PI-Anneksiin V-FITC tyrimu. Rezultatai parodė, kad 6 Gy dozės švitinimas reikšmingo poveikio MSC apoptozei ankstyvoje stadijoje neturėjo. (2 papildomas paveikslas).

Savaiminio atsinaujinimo efektyvumas buvo vertinamas pagal kolonijų susidarymo greitį klonus formuojančio vieneto fibroblastų (CFU-F) tyrime. Tiek CFU-F skaičius, tiek vidutinis kolonijos dydis buvo žymiai mažesni švitintose MSC nei kontrolinėje grupėje (1b paveikslas). Apskaičiuotas CFU-F efektyvumas reikšmingai skyrėsi tarp ląstelių kultūrų, gautų iš dviejų grupių. MSC ir švitintų MSC CFU-F efektyvumas buvo atitinkamai 35, 2 (± 2, 69) ir 20, 6% (± 3, 06%).

Mums buvo ypač įdomu suprasti, ar švitinimas taip pat paveikė daugiapotenčius genus. Svarbu ir tai, kad gerai žinomi embrionų transkripcijos veiksniai, tokie kaip Nanog, Oct4 ir Sox2, kurie buvo išreikšti hESC ir buvo kritiškai svarbūs palaikant daugiapotenciumą ir atsinaujinimą, taip pat buvo išreikšti MSC. Buvo atliktas realaus laiko PGR ir vesterno blotinimas, siekiant kiekybiškai įvertinti Nanog, Oct4 ir Sox2 raišką MSC (1c paveikslas). Nanog, Oct4 ir Sox2 raiška švitintuose MSC reikšmingai sumažėjo, palyginti su kontroline grupe.

Norėdami ištirti švitinimo poveikį MSC osteogenezei, MSC buvo paveikti osteogenine indukcine terpe po apšvitinimo. MSC buvo renkami 21 dieną, o Alizarin Red S dažymas buvo naudojamas ląstelių mineralizacijos būklei ištirti auginimo pabaigoje. Suaugus osteogeninei indukcijai, švitinti MSC nusodino mažiau kalcio nei kontroliniai (1d pav.). Realaus laiko PGR buvo naudojama norint nustatyti ALPL , OGN ir RUNX2 mRNR lygius, su osteogenu susijusius žymenis ir transkripcijos faktoriaus geną MSC, sukeliančius osteogeninę indukciją 0, 7 ir 14 dienų. ALPL , OGN ir RUNX2 mRNR ekspresijos lygis abiejose grupėse buvo palaipsniui padidėjęs 14 dieną. 14 dienų osteogeninės indukcijos laikotarpiu švitinti MSC parodė santykinai mažesnį ALPL ir OGN lygį, palyginti su kontrolinėmis grupėmis. Panašiai RUNX2 mRNR ekspresijos lygis žymiai sumažėjo švitintų MSC grupėje, palyginti su kontroline grupe 14 dieną (1e pav.).

Taip pat ištirtas švitinimo poveikis MSC adipogenezei. Švitinti MSC buvo auginami adipogeninėje terpėje. Po 21 dienos adipogeninės indukcijos švitinti MSC parodė žymiai sumažėjusį alyvos raudonojo O + dažymą, palyginti su kontroline (1f pav.). Taip pat buvo įvertinta adipogeninių žymenų mRNR ir LPL , CFD ir PPAR - γ ekspresija švitintose MSC 0, 7 ir 14 dienų adipogeninės diferenciacijos metu. Švitintoje MSC grupėje LPL ir CFD mRNR ekspresijos lygiai buvo ženkliai slopinti, tuo tarpu PPAR - γ parodė nedidelį apšvitintos MSC grupės mRNR ekspresijos sumažėjimą (1g paveikslas). Visi duomenys rodo, kad švitinimas pakenkė MSC atsinaujinimo ir įvairiapusiškumo galimybėms.

Badavimas / rapamicinas sumažina švitinimo sukeltą MSC žalą

Švitinti MSC buvo iš anksto apdoroti badavimu arba rapamicinu, kad būtų sukelta autofagija. Kaip parodyta 2a paveiksle, apskaičiuotas apšvitintų MSC CFU-F efektyvumas buvo mažesnis nei iš bado ar rapamicinu apdorotoje grupėje. Švitintų MSC rodiklis buvo 10, 4% (± 1, 72%) CFU-F efektyvumas, švitintų MSC, iš anksto apdorotų badu ar rapamicinu, CFU-F efektyvumas buvo 16, 4% (± 1, 84%) ir 13, 6% (± 1, 34%). Pluripotentinių transkripcijos faktorių Nanog, Oct4 ir Sox2 išraiška buvo sureguliuota, kai švitinti MSC buvo iš anksto apdoroti badaujant arba rapamicinu (2b paveikslas).

Image

MSC, iš anksto apdoroti badu ar rapamicinu, po švitinimo išlaikė stiebą. a ) CFU-F tyrimai. Kolonijų skaičius buvo nustatytas po 14 dienų auginimo. b ) Švitintų MSC, iš anksto apdorotų badu ar rapamicinu, kamieninių žymenų Nanog, Oct4 ir Sox2 išraiška, išmatuota realaus laiko PGR ir Western blot metodais. c ) Alizarino raudona spalva nustatyta švitintų MSC, iš anksto apdorotų badu ar rapamicinu, osteogeninė diferenciacija. d ) Osteogeninių žymenų genų ALPL , OGN ir RUNX2 kiekybinė išraiška buvo matuojama realaus laiko PGR 0, 7 ir 14 dienų metu. e ) Švitintų MSC, iš anksto apdorotų badu ar rapamicinu, adipogeninis diferenciacija buvo aptiktas aliejumi raudonuoju-O. ( f ) Adipogenezės žymenų genų LPL , CFD ir PPAR-γ kiekybinė išraiška buvo matuojama realaus laiko PGR 0, 7 ir 14 dienomis. Pateikti trijų pakartojimų duomenys, kurių vidurkis ± SE * P <0, 05

Visas dydis

Faktinis kalcio nusėdimo kiekis ir su linija susijusių specifinių žymenų mRNR išraiška bei osteocitų ALPL , OGN ir RUNX2 transkripcijos faktorius buvo padidintas švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant (2c ir d paveikslai). Indukuotų adipocitų skaičius padidėjo, o adipogeninių žymenų LPL , CFD ir PPAR - γ mRNR raiška taip pat padidėjo švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant, palyginti su kontroline grupe (2e ir f paveikslai). Panašių rezultatų buvo galima pastebėti, kai MSC buvo iš anksto apdoroti rapamicinu. Šie stebėjimai parodė, kad švitinti MSC, iš anksto apdoroti badu ar rapamicinu, pasižymi dideliu išplėtimo ir daugialypės diferenciacijos gebėjimu in vitro nei švitinti MSC.

Švitintose MSC autofagiją sukelia badas arba rapamicinas

Vėliau mes ištyrėme autofagiją švitintose MSC, iš anksto apdorotose badu arba rapamicinu, gerai aprašytu autofagijos induktoriumi. Su mikrotubuliu susijusi baltymo 3 lengvosios grandinės (LC3) ekspresija yra dažniausiai naudojamas žymeklis autofagosomų formavimuisi. Autofagijos indukcija, sukelianti LC3, yra suskaidoma, kad susidarytų LC3-I, kuris lokalizuojasi ant autofagosomų membranos. LC3-II yra lipiduota LC3-I forma. Mes ištyrėme LC3-I (18 kDa) ir LC3-II (16 kDa) raišką MSC po švitinimo Western blot metodu. Švitintų MSC ir rapamicinu gydytų grupių LC3-II lygis šiek tiek padidėjo. Tuo tarpu švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant, LC3-II kiekis žymiai padidėjo nei kontrolinėje grupėje (3a pav.). Autofagsomų susidarymui stebėti buvo naudojama elektroninė mikroskopinė analizė. Rezultatai parodė būdingų dvigubos membranos organelių buvimą švitintose MSC, iš anksto apdorotose badu ar rapamicinu (3b pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad badavimas ar rapamicinas sužadintose MSC sukelia autofagiją.

Image

Autofagijos tyrimas MSC, apdorotose badaujant ar rapamicinu veikiant švitinimui. a ) Visi baltymų ekstraktai buvo analizuojami atlikus Western blot analizę su antikūnais prieš LC3. GAPDH išraiška buvo naudojama kaip kontrolė. ( b ) elektronų mikrografais buvo parodyta daugybė vakuolių su citoplazmos kiekiu švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant ar rapamicinu; dauguma jų buvo aiškiai identifikuoti kaip autofagosomos. Masto juosta: 2 μm

Visas dydis

Mes ištyrėme p53 raišką ir aktyvaciją švitintuose MSC ir nustatėme, kad p53 aktyvacijos lygis padidėjo švitintuose MSC, palyginti su kontroline grupe. Taip pat aptikome p53 aktyvacijos lygį švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant. Tačiau mes pastebėjome, kad p53 aktyvacijos reikšmingo skirtumo tarp švitintų MSC, iš anksto paruoštų badu, ir apšvitintų MSC nebuvo (3 papildomas paveikslas).

Autofagija padeda palaikyti apšvitintų MSC kamieną, pašalinant ROS

Toliau mes ištyrėme pagrindinį mechanizmą, pagal kurį autofagija gali apsaugoti MSC nuo švitinimo traumų. Švitinimas skatina ROS susidarymą, dėl kurio pažeidžiama DNR. Tačiau nustatyta, kad autofagiją reguliuoja ROS. 23, 24, 25 Autofagijos praradimas gali sukelti ROS kaupimąsi ir DNR pažeidimą. 26 Gali būti, kad padidėjusi autofagija švitintose MSC taip pat gali būti naudojama kaip adaptacija siekiant užkirsti kelią ROS kaupimuisi; taigi, ląstelių ROS lygį mes nustatėme naudodami fluorescencinį zondo dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA). Švitinimas padidino tarpląstelinį ROS lygį MSC. Tačiau tarpląstelinis ROS lygis sumažėjo MSC, iš anksto apdorotose badaujant ar rapamicinu, ir tai rodo, kad autofagija padeda sumažinti ROS kaupimąsi (4a pav.). Švitinant sukeltas ROS padidėjimas buvo visiškai panaikintas inkubuojant su antioksidantu N- acetilcisteinu (NAC, 2 mM). Priešingai, MSC, kurie gydė H2O2 (100 μM ), parodė padidėjusį ROS kaupimąsi (4a paveikslas). Dėl per didelės ROS atsirastų daugybė DNR pažeidimų formų, įskaitant DNR dvigubų grandžių pertraukas (DSB). γ- H2A.X vaidina pagrindinį vaidmenį rekrutuojant baltymus į DNR DSB vietas. 27 γ- H2A.X MSC buvo ištirtas imunofluorescencijos būdu, siekiant išsiaiškinti, ar DSB buvo sukeltos MSC, apšvitintos. Kaip parodyta 4b paveiksle, švitintuose MSC padidėjo γ- H2A.X intensyvumas, o tai rodo, kad MSC padaugėjo daugiau DNR pažeidimų, kai veikiama švitinimo. Tačiau γ- H2A.X lygis sumažėjo švitintose MSC, iš anksto apdorotose badu ar rapamicinu. Be to, gydymas NAC gali panaikinti oksidacinių DNR pažeidimų poveikį MSC (4b pav.), Patvirtindamas, kad švitinimo sukelta DNR pažala yra tarpininkaujama ROS generacijai.

Image

Autofagija sumažina ROS susidarymą ir palengvina DNR žalą švitintose MSC. a ) Švitinti MSC, iš anksto apdoroti badu ar rapamicinu, buvo nudažyti DCF-DA, kad būtų galima nustatyti ROS lygį, išmatuotą imunofluorescencijos būdu. Ląstelių branduolys buvo nudažytas Hoechst 33258. ( b ) Norėdami nustatyti DNR pažeidimą, MSC dažyti γ- H2A.X antikūnu. Ląstelių branduolys buvo nudažytas DAPI. Vaizdai buvo užfiksuoti fluorescenciniu mikroskopu, padidinimu × 100. ( C ir d ) Mitochondrijų ROS dažymas MitoSOX buvo matuojamas FACS ir imunofluorescencija. ( e ir f ) MMP dažymas rodaminu 123 buvo matuojamas FACS ir imunofluorescencija

Visas dydis

Nors ROS gali būti sugeneruotas naudojant ne mitochondrinius mechanizmus, daugumoje audinių mitochondrijos yra pagrindinis tarpląstelinis ROS šaltinis. Mitochondrijų membranos potencialas (MMP) atspindi mitochondrijų funkcinę būklę; membranos potencialo palaikymas yra svarbi mitochondrijų savybė. Be to, susikaupusi ROS padarė MMP depoliarizaciją ir mitochondrijų žalą. Todėl mes įvertinome mitochondrijų ROS su MitoSOX Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV; 4c ir d paveikslai) ir MMP su Rohdamin123 (4e ir f pav.) MSC, matuojant FACS ir imunofluorescencija. Vien tik apšvitintų MSK mitochondrijų ROS lygis buvo didesnis nei švitintų MSC, iš anksto gydytų badu ar rapamicinu. MMP depoliarizuota švitintose MSC, tačiau palaikoma švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant ar rapamicinu. Šie rezultatai rodo, kad autofagija apsaugo MSC nuo švitinimo traumų mažindama ROS ir mažindama DNR žalą.

Autofagijos inhibitorius slopino apsauginį autofagijos poveikį MSC kamienams

Autofagija buvo slopinama cheminiais inhibitoriais, siekiant nustatyti autofagijos vaidmenį palaikant švitintų MSC kamieną. Plačiausiai naudojamas autofagijos inhibitorius yra 3-metiladeninas (3-MA), kuris blokuoja autofagosomų susidarymą slopindamas III klasės fosfatidilinozitolio 3-kinazę. Chloroquinas (CQ) yra dar vienas autofagijos inhibitorius, slopinantis autofagiją vėlesniame gydymo etape, kuris sukėlė papildomą LC3-II kaupimąsi. 3-MA pridėjimas žymiai sumažino LC3-II ekspresiją, o CQ sukaupė LC3-II ekspresiją švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant (5a paveikslas). Po autofagijos slopinimo naudojant 3-MA ir CQ, švitinti MSC, iš anksto apdoroti badu, parodė mažesnį CFU-F efektyvumą nei kontrolinis (5c paveikslas). Nanog, Oct4 ir Sox2 išraiškos buvo sureguliuotos autofagijos inhibitoriumi 3-MA ir CQ švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant (5d paveikslas). Kai autofagija iš švitintų MSC, iš anksto gydytų badavimu, buvo pašalinta autofagijos inhibitoriumi, MSC osteogenezės ir adipogenezės diferenciacijos galimybė ženkliai sumažėjo (5e ir g paveikslai). Tuo pat metu stebėjome mRNR, siejamo su osteoblastine ir adipocitine diferenciacija, išraišką sureguliuotose MSC, iš anksto apdorotose badaujant, kai buvo slopinama autofagija (5f ir h pav.). Taip pat mes slopinome autofagiją švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant trumpų plaukų smeigtukų RNR (shRNR) -ATG7 arba shRNR-Beclin1. Kaip parodyta 5b – h paveiksluose, ATG7 ir Beclin1 ekspresija buvo smarkiai slopinama, ir atitinkamai dvi shRNR sumažino autofagijos apsaugą MSC kamienuose.

Image

Autofagijos slopinimas sukelia kamieno sužalojimą ir ROS padidėjimą švitintuose MSC. ( a ) LC3 ekspresija buvo nustatyta atliekant Western blotting metodą švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant autofagijos inhibitoriumi 3-MA arba CQ. ( b ) Švitinti MSC, iš anksto gydyti badavimu, buvo transfekuoti shRNR, kad numuštų su autofagija susijusius genus ATG7 ir Beclin1 . Apatiniame skydelyje yra GAPDH įkrovimo valdiklis. c ) CFU-F tyrimai. Kolonijų skaičius buvo nustatytas po 14 dienų auginimo. ( d ) Švitintų MSC kamieninių žymenų Nanog, Oct4 ir Sox2 išraiška, iš anksto apdorotų badavimu slopinant autofagiją, buvo išmatuota realiojo laiko PGR ir Western blot metodais. e ) Osteogeninis apšvitintų MSC, diferencijuotų iš badavimo autofagijos inhibitoriais, dažymas buvo atliktas Alizarin Red S. f ) Osteogeninių žymenų ALPL , OGN ir RUNX2 išraiška buvo matuojama realaus laiko PGR. ( g ) Autofagijos inhibitoriais švitintų MSC, adifogeniniu diferenciacija, apdoroti badavimu, buvo nudažyti aliejumi raudonai-O. ( h ) Adipogeninių žymenų LPL , CFD ir PPAR - γ išraiška buvo išmatuota realiojo laiko PGR. i ) Švitinti MSC, iš anksto badavę autofagijos inhibitoriais, dažytais DCF-DA, kad būtų galima nustatyti ROS lygį, buvo matuojami imunofluorescencija. Ląstelių branduolys buvo nudažytas Hoechst 33258. ( j ) Norėdami nustatyti DNR pažeidimą, apšvitinti MSC, iš anksto apdoroti badavimu autofagijos inhibitoriais, buvo dažomi γ- H2A.X antikūnais. Ląstelių branduolys buvo nudažytas DAPI. Pateikti trijų pakartojimų duomenys kaip vidurkis ± SD * P <0, 05

Visas dydis

Autofagijos slopinimas švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant autofagijos inhibitoriais, padidino bendrą ROS lygį, palyginti su kontroline grupe (5i pav.). Stebėtina, kad dėl autofagijos slopinimo padidėjo DNR pažeidimas, kurį atspindi didesnis γ- H2A.X židinių skaičius švitintose MSC, iš anksto apdorotose badaujant (5j paveikslas). Šie duomenys parodė, kad autofagija mažino ROS lygį ir mažina DNR žalą MSC.

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme, kad autofagija turi lemiamą reikšmę palaikant MSC kamienų kamieną nuo IR traumos. Mes nustatėme, kad švitinimas sutrikdė MSC kamieną, o autofagijos indukcija šį procesą gali pakeisti. Be to, mes parodėme, kad autofagija sumažino ROS kaupimąsi, palengvino DNR pažeidimą ir palaikė kamieną MSC, kai MSC buvo veikiami IR.

Kamieninėms ląstelėms buvo būdingas jų kamieniškumas: atsinaujinimas ir pluripotenciacija. Savarankiškas atsinaujinimas buvo apibūdinamas kaip nediferencijuotų kamieninių ląstelių dauginimasis neįsipareigojant pagal liniją 29, tuo tarpu pliuripotencija reiškia kamieninių ląstelių sugebėjimą diferencijuoti į įvairias ląstelių linijas. 30 MSC, vienos rūšies žmogaus AKS, buvo identifikuoti pagal jų gebėjimą prilipti prie plastiko ir generuoti kolonijas sudarančius vienetinius fibroblastus (CFU-F) kultūroje, taip pat pagal jų galimybę diferencijuoti į kelias linijas. Kamieninės ląstelės turi apsaugoti savo genomą nuo pažeidimų, kad išlaikytų savo baseiną ir atsinaujinimo gebėjimą. 31 Mes atskleidėme, kad autofagijos indukcija bado ar rapamicino dėka apsaugojo MSC nuo sužalojimo sukelto sužalojimo ir išlaikė jų stiebą. Kai MSC yra veikiamos švitinimo, savijautos atsinaujinimo galimybė ir kultūrų pluripotencijos palaikymas susilpnėja. MSC savaiminio atsinaujinimo gebėjimai buvo reguliariai nustatomi atliekant CFU-F tyrimus. MSC buvo didesnis CFU-F efektyvumas, tuo tarpu apšvitintos MSC turėjo mažesnį CFU-F efektyvumą. Autofagijos slopinimas galėtų dar labiau sumažinti apšvitintų MSC CFU-F efektyvumą. Iš tikrųjų pranešta, kad MSC išreiškia daugybę genų, įskaitant embrionų transkripcijos faktorius Nanog, Oct4 ir Sox2, kurie reguliavo MSC kamieną. 32, 33, 34, 35 Mūsų tyrime pluripotencijos praradimas buvo patvirtintas reikšmingu Nanog, Oct4 ir Sox2 ekspresijos sumažėjimu MSC reguliuojant apšvitos metu, kuris vis dėlto buvo atkurtas sukeliant autofagiją. Mūsų rezultatas parodė, kad švitinimas pažeidė MSC osteogeninį ir adipogeninį diferenciacijos potencialą - tai atitiko ankstesnį tyrimą. 36

Autofagija yra svarbi palaikant tarpląstelinę homeostazę. Viena vertus, autofagija pašalina toksiškus ir pažeistus ląstelių komponentus. Kita vertus, šis procesas sukuria naujus pirmtakus makromolekulių sintezei. Neseniai įrodyta, kad HSC palaikymui reikalinga autofagija. 22, 37. Autoriai parodė, kad ATG7 - / - kraujodaros kamieninės ir progenitorinės ląstelės žymiai sukaupė daugiau abejotinų mitochondrijų, padidėjusį mitochondrijų superoksido kiekį, DNR pažeidimus ir apoptozę. Jie taip pat įrodė, kad šios ląstelės nesudarė antrinių kolonijų in vitro . Autofagijos, kaip „kamieno“ stipriklio, svarba buvo dar labiau sustiprinta atlikus tyrimą, rodantį, kad autofagija reikalinga suaugusiųjų žmogaus kamieninių ląstelių atsinaujinimui ir diferenciacijai. Salemi ir kt. 38 parodė, kad autofagijos blokados metu epidermio kamieninės ląstelės, dermos kamieninės ląstelės ir HSC prarado savarankiško atsinaujinimo ir diferenciacijos gebėjimus. Mūsų rezultatai parodė, kad pirminis autofagijos aktyvumas MSC yra labai žemas. Vis dėlto, norint sukelti autofagiją in vitro, pakako skirti rapamicino arba badauti be serumo . Mūsų duomenys rodo, kad autofagija turi adaptyvią sistemą, kuri padeda MSC įveikti švitinimo stresą. Kai ląstelės yra veikiamos IR, vyksta skilimo reakcijos ir susidaro įvairios ROS. 39 Ląstelėms apsaugoti nuo oksidacinio streso buvo sukurti įvairūs gynybos mechanizmai, tokie kaip antioksidantų padidėjęs reguliavimas, specifinių baltymų pašalinimas naudojant ubikvitino-proteasomos sistemą ir pažeistų baltymų bei organelių pašalinimas autofagijos būdu. 40, 41 Kai ROS yra aukšto citotoksinio lygio, galimas autofagijos vaidmuo riboja oksidacinį pažeidimą, pasiekiant citotoksinį lygį, ir palaiko energijos homeostazę. Jang ir kt. 42 žmonės pranešė, kad maža deguonies niša kaulų čiulpuose riboja ROS susidarymą, todėl padidėja HSC apsauga ir padidėja savęs atsinaujinimo galimybė. ROS lygio padidėjimas švitintuose MSC parodytas 4 paveiksle. Taip pat nustatėme, kad švitintose MSC DNR pažeidimai dažnesni. Todėl darome prielaidą, kad dėl švitinimo padidėjęs ROS lygis sukelia DNR pažeidimą, todėl sunaikina MSC kamieną ir daugiapotencialą.

Daugiausia ROS ląstelėse generuoja mitochondrijų kvėpavimo grandinė. 43 ROS išskiriama mitochondrija gali veikti kaip signalinės molekulės, reguliuojančios įvairias ląstelių funkcijas, įskaitant ląstelių išgyvenimą ar senėjimą. Genetiškai modifikuoti pelių modeliai pateikė daugybę įrodymų apie svarbų autofagijos vaidmenį mitochondrijų vientisumui ir ROS kontrolei. Pavyzdžiui, AMPK ir ULK1 (Atg1 homologas) išmuštos kepenys rodo p62 kaupimąsi ir trūkumų turinčią mitofagiją. 46 Pasroviui nuo Atg1, FIP200 (Atg17 homologas) išmuštos kepenys rodo reikšmingą mitochondrijų masės ir ROS padidėjimą. 37 Ubikvitinti baltymai ir ROS kaupiasi pelėse ar ląstelėse, kuriose yra Atg5 ir Atg7. 47, 48, 49, 50 Autofagija yra gerai žinoma mitochondrijų kokybės valdyme, nes degraduoja pažeistos mitochondrijos. 51 MMP sumažėjimas gali atspindėti pažeistų mitochondrijų kaupimąsi. Taigi mes įvertinome mitochondrijų ROS ir MMP pagal FACS ir imunofluorescenciją. Rezultatai parodė autofagijos indukciją švitintose MSC, sumažinant mitochondrijų ROS susidarymą ir palaikant MMP. Šie duomenys rodo, kad autofagija gali pakenkti trūkumų turinčioms mitochondrijoms, užkirsti kelią pernelyg dideliam ROS susidarymui, kuris galėtų sukelti DNR pažeidimą, ir apsaugoti MSC nuo švitinimo traumos.

Pateikiame įrodymų, kad švitinimas pakenkia MSC kamienui, sukeldamas ROS kaupimąsi. Autofagija gali pašalinti ROS ir sumažinti DNR žalą švitintose MSC. Šie rezultatai rodo, kad autofagija yra apsauginis MSC kamieno mechanizmas, kai jie yra veikiami švitinimo. Autofagiją sukeliantys agentai gali būti naudojami kaip kandidatai kamieninėms ląstelėms apsaugoti nuo švitinimo sužalojimų.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma paveikslo legenda

Žodynas

ASC

suaugusių kamieninių ląstelių

ATG

su autofagija susijęs homologas

CFU-F

klonius formuojantis vienetas-fibroblastas

CQ

chlorokvinas

FBS

vaisiaus galvijų serumas

HSC

kraujodaros kamieninės ląstelės

IR

jonizuojanti radiacija

LC3

su mikrotubuliais susijęs baltymas-1 lengvoji grandinė 3

3-MA

3-metiladeninas

MMP

mitochondrijų membranos potencialas

MSC

mezenchiminės kamieninės ląstelės

NAC

N- acetilcisteinas

ROS

reaktyviosios deguonies rūšys

Papildoma informacija pridedama prie šio pranešimo ląstelių mirties ir ligų svetainėje (//www.nature.com/cddis)