B-ląstelių proliferacinė leukemija ir lėtinė limfocitinė leukemija turi išskirtinius genų ekspresijos parašus | leukemija

B-ląstelių proliferacinė leukemija ir lėtinė limfocitinė leukemija turi išskirtinius genų ekspresijos parašus | leukemija

Anonim

B ląstelių proliferacinė leukemija (B-PLL) yra reta liga, kuriai būdinga splenomegalija, nėra limfadenopatijos, ryški limfocitozė, kai prolimfocitai sudaro daugiau kaip 55% cirkuliuojančių limfoidinių ląstelių, blogas atsakas į gydymą ir trumpas išgyvenimas. Pirmą kartą aprašytas 7-ojo dešimtmečio pradžioje, 1 B-PLL pripažįstamas kaip konkretus subjektas PSO klasifikacijoje. 2 Lėtinės limfoleukemijos (LLL), kai> 10% ir <55% prolimfocitų (CLL / PL), biologiniai ypatumai skiriasi nuo B-PLL. Nors imunofenotipas B-PLL skiriasi nuo CLL, trečdalis B-PLL atvejų išreiškia CD5. 2 Chromosomų anomalijos apima TP53 geno delecijas / mutacijas, kurios gali paaiškinti jo agresyvią eigą. 3 CD38 ir ZAP-70 raiška ir imunoglobulino sunkiosios grandinės kintamo regiono (IgVH) genų mutacinė būklė yra nevienalytė 4 ir, skirtingai nei CLL, jie neturi prognostinio poveikio; IgVH geno šeimos vartojimas B-PLL skiriasi nuo CLL, CLL / PL ar kitų limfomų. 4 Nepaisant to, diskutuojama apie B-PLL kaip atskiro subjekto egzistavimą. Todėl mes ištyrėme mikrotraumos analizę, kuri pasirodė esanti naudinga klasifikuojant limfoproliferacinius sutrikimus, B-PLL genominį profilį ir palygino ją su CLL, kad paaiškintų jų ryšį, nustatytų diferencijuotai išreikštus nuorašus, kurie gali būti naudingi diagnostikos ir terapijos srityse, ir suprasti B-PLL patogenezę.

Iš 10 de-novo B-PLL ir 10 neapdorotų CLL atvejų atrinkome retrospektyviai saugotus kraujo mononuklearines ląsteles, turinčias> 95% piktybinių ląstelių. Remiantis PSO, diagnozė buvo nustatyta atsižvelgiant į klinikinius požymius, limfocitų morfologiją ir imunofenotipą. 2

Tiriant B-PLL, t (11; 14) fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) buvo neigiama visais atvejais, išskyrus vieną (# 1449), kuri buvo perklasifikuota kaip leukeminės mantijos ląstelių limfoma (MCL); 5 del (17p) rasta 7/10. Trimis LLL atvejais padidėjo prolimfocitų kiekis nuo 11 iki 13% (CLL / PL). FISH aptiko del (17p) per 2/10. Paciento klinikiniai ir biologiniai duomenys yra apibendrinti papildomoje S1 lentelėje ir papildomoje informacijoje S1.

Mikro matricų eksperimentus atliko MRC geneservice (JK HGMP išteklių centras), naudodamas Affymetrix Human U133PLUS2 GeneChip matricą. Išsamų mėginių paruošimo ir mikrotraumų apdorojimo protokolą galima rasti internete (www.affymetrix.com).

Neprižiūrima analizė, naudojant keturis skirtingus algoritmus (vidutinis susiejimas, visiškas ryšys-koreliacijos atstumas, vidutinis sąryšio-koreliacijos atstumas, lankstus β-Euklido atstumas) ir prižiūrima analizė, naudojant mikrotraumos duomenų reikšmingumo analizę (SAM) 6 ir mikrorajono prognozės analizę (PAM) 7. buvo atliktas. Kolmogorovo – Smirnovo statistikos (WKS) svertinė versija dar labiau patikslino diferencijuojamus nuorašus; pasirinktų B-PLL genų sąrašui buvo atlikta funkcinės anotacijos analizė, naudojant DAVID duomenų bazę (//david.abcc.ncifcrf.gov), remiantis genų ontologijos terminais, ir tame pačiame genų sąraše - genų rinkinio praturtinimo analizė buvo atlikta naudojant programinę įrangą GOEAST (//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/index.php). Mikro matricos ir statistiniai metodai išsamiai aprašyti papildomoje informacijoje S1.

Visi keturi neprižiūrimi hierarchinio grupavimo algoritmai atkuriamai padalijo mėginius į dvi vienarūšes atskiras grupes, atitinkančias B-PLL ir CLL-CLL / PL diagnozes (1a pav.) ( P reikšmė - 0, 00001 pagal Fisherio tikslų testą). Dauguma genų (∼ 77%), išskiriančių šias dvi ligas, parodė> 2 kartus didesnį išraišką tarp grupių.

Image

a ) Hierarchinis grupavimas. Neprižiūrimas hierarchinis grupavimas padalijo mėginius į dvi vienarūšes atskiras grupes, atitinkančias B-PLL ir CLL diagnozes. Byla Nr. 1449 (perklasifikuota kaip MCL) ir bylos Nr. 1758, Nr. 1759 ir Nr. 1760 (CLL / PL) yra išryškintos. b ) Termografas parodo 642 zondų rinkinius, gautus iš Kolmogorovo – Smirnovo statistikos svertinės versijos, kuri susiaurino pradinį SAM genų sąrašą iki tų nuorašų, kurie geriausiai skyrė diagnostikos klases. Santykiniai genų ekspresijos lygiai vaizduojami spalvų skalėje: raudona, aukščiausia ekspresijos lygis; mėlynas, žemiausias išraiškos lygis. Parodyta diagnozė, morfologija, p53 ir CD5 raiška.

Visas dydis

SAM analizė nustatė 5951 skirtingai išreikštus nuorašus tarp CLL ir B-PLL: 4916 buvo per daug išreikšti B-PLL (kartų pokytis nuo 25 iki 1, 3) ir 1035 - CLL (kartų pasikeitimas nuo 43, 9 iki 1, 24). Iš jų 3254 skirtingai išreikšti nuorašai tarp CLL ir B-PLL parodė melagingų atradimų procentą <1%. Dauguma transkriptų (83%) buvo per daug ekspresuoti B-PLL ir dalyvavo ląstelių proliferacijoje / ląstelių cikle ( c-MYC , CDK4 , RB1 , p21, TGFBR3 ), apoptozė ( CASP1 ), ląstelių metabolizmas, transkripcijos reguliavimas ( TCF12). , SMARCA2 , SMARCA4 ), transliacija, baltymų sintezė, signalo perdavimas, adhezijos molekulės ( JAM3 , LPXN ), imuninis atsakas ir paviršiaus antigenai (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Dėl per didelės c-MYC ekspresijos domimasi B-PLL patogeneze. C-myc onkoproteinas skatina ląstelių dauginimąsi ir apoptozę, nukreipdamas daug genų. 8 c-MYC sukeltas proliferacija gali būti atjungta nuo c-MYC sukeltos apoptozės įvairiais mechanizmais: BCL2 , TP53 ar BIM aberacijomis, kurios išjungia apoptozės programas; c-MYC alelių mutacijos, kurios nesugeba efektyviai slopinti Bcl2 funkcijos; AKT per daug ekspresija, kuri gali slopinti su c-MYC susijusią apoptozę.

B-PLL atveju p53 baltymo aktyvumą dažnai sutrikdo TP53 geno delecijos / mutacijos 3, kaip matyti iš septynių mūsų atvejų. Be to, AKT genas buvo sureguliuotas. Taigi, per didelis c-MYC ir AKT ekspresija kartu su TP53 pažeidimu gali atlikti pagrindinį vaidmenį B-PLL patogenezėje, skatinant apoptozės slopinimą ir ląstelių dauginimąsi. Nors molekulinis pažeidimas, susijęs su c-MYC ekspresija, nežinomas, pranešta apie B-PLL atvejus, rodančius c-MYC perkėlimą, 9, 10, 11, 12, 13, 14, įskaitant pacientą šiame tyrime (Nr. 1456). 10

Tarp genų, dalyvaujančių signalo perdavime, didelis transkriptų rinkinys, kartu su tirozino kinaze ( SYK , FYN , BLK , JAK1 , JAK3 , CSK , HKC ) arba serino-treonino kinazės aktyvumu ( AKT1 , MAP4K1 , PRKCB1 , PRKACB , STK11 )., per daug išreikštas B-PLL, nurodant galimus novatoriškų gydymo būdų tikslus.

Genai, per daug išreikšti CLL, priklausė TGF-β keliui, ląstelių metabolizmui, transkripcijos reguliatoriams, signalo perdavimui, paviršiaus antigenams, citokinų receptoriams ir imuniniam atsakui (papildoma S2 lentelė); tarp jų IL4R , 15 BCL2 , ciklinas D2 , p-selektinas . 16, 17

WKS statistika susiaurino pradinį genų sąrašą iki 642 zondo rinkinių, kurie geriausiai išskaidė diagnostikos klases (1b paveikslas). Funkcinių anotacijų analizė tų B-PLL, naudojant DAVID programinę įrangą, išryškino reikšmingą genų, priskirtų šioms kategorijoms, praturtėjimą: mitochondrijų aktyvumas, oksidoreduktazės aktyvumas, ląstelių proliferacija, metabolizmas, RNR perdirbimas, baltymų sintezė, signalo perdavimas ir citoskeletas ( P < 0, 05). GOEAST programinės įrangos genų rinkinio praturtinimo analizė patvirtino DAVID nustatytų funkcinių kategorijų (ty mitochondrijų aktyvumas, oksidoreduktazės aktyvumas, citoskeleto organizacija, metabolizmas, baltymų biosintezė) svarbą. Be to, atliekant šią analizę buvo parinktas WNT kelias ( P = 0, 012), RAS kelias ( P = 0, 013), JUN kinazės aktyvumas ( P = 0, 004), pavaizduotas B-PLL, taip pat genai, reaguojantys į DNR žalą (< 0, 001) (duomenys nepateikti).

Mėginiams, suskirstytiems į a priori apibrėžtas kategorijas, buvo taikoma PAM analizė, naudojama kaip klasės numatymo įrankis: CLL-CLL / PL palyginti su B-PLL, CD5 + palyginti su CD5– ir buvimas ar nebuvimas del (17p). Tvirtą klasės prognozę buvo galima atlikti tik analizuojant CLL-CLL / PL ir B-PLL diagnozes. Priešingai, palyginimas tarp CD5 + ( n = 13) ir CD5− ( n = 7) ir atvejų su ( n = 9) ar be ( n = 11) del (17p), neparodė patikimos klasės prognozės.

PAM analizė nustatė 46 genus, kurie efektyviausiai atskyrė abi ligas (2 lentelė). Genai, išskirtinai išreikšti B-PLL, palyginti su CLL, apima: c-MYC ; paviršiaus antigenai CD20 ir CD1d; adhezijos molekulės JAM3 ir LPXN ; neigiami ląstelių ciklo reguliatoriai, PHB ir NME1 ; genai, dalyvaujantys: proteasomų kataliziniame aktyvume , PSMB9 , PSMB10 ; B-ląstelių brendimas ir diferenciacija, EBF , NOTCH2 , TPD52 ; B-ląstelių receptoriaus signalo perdavimas, BANK-1 . Būdingiausi CLL nuorašai buvo kostimuliuojanti molekulė CTLA4 / CD152 ir transkripcijos faktorius LEF1, kurie, kaip teigiama, prisideda prie apoptozinio defekto. 18

Pilno dydžio lentelė

Buvo abejojama, ar B-PLL yra atskiras subjektas. 11 Kadangi neįtraukėme kitų leukeminių limfomų, negalime tvirtai išspręsti šios temos. Tačiau kai kurie genai, per daug išreikšti B-PLL, buvo aprašyti limfomose (ty su blužnies kraštinės zonos limfoma susijusi BTK , LPXN , 19 NOTCH2 , AKT1 16 arba su MCL susijusi IkBkB , 20 CDK4, SMARCA4 16 ) arba buvo įtraukti keliuose, kurie, kaip žinoma, panaikinti įvairiose 19, 20, 21, 22 limfomose - c-myc keliuose ( C-MYC , MAX , STAT6 , IRF2 , įvairūs hsp), NF-κB ( IkBkB , MALT1 ), Ras / MAP- kinazė ( MAP4K1 , MAP4K4 , DUSP22 , HRAS ), PI3K / AKT ( AKT1 , PRKACB ), proteasomų aktyvacijos kelias ( PSMB9 , PSMB10 ) (visi su keičiamu raukšle nuo 2 iki 14).

B-PLL su t (11; 14), užfiksuota iki 20% atvejų, neseniai buvo klasifikuojami kaip splenomegalinės leukemijos MCL. 5 Vienas iš mūsų atvejų (Nr. 1449), iš pradžių apibūdintas kaip B-PLL, o vėliau perklasifikuojamas kaip MCL remiantis t (11; 14), neprižiūrimos analizės metu buvo klasifikuotas su kitu B-PLL. Tai yra vienintelis ciklų D1 ir c-MYC per daug ekspresijos atvejų serijos atvejis, retas atradimas, aprašytas blastoidiniame MCL variante. Nors vienas atvejis negali padaryti tvirtų išvadų, galime manyti, kad leukeminė MCL forma turi B-PLL genomo profilį, atspindintį padidėjusį progresą ląstelių ciklo metu.

Mūsų tyrimas pirmą kartą apibūdina B-PLL, reto limfoproliferacinio sutrikimo, genų ekspresijos profilį. Mes oficialiai parodome, kad B-PLL ir CLL-CLL / PL yra biologiškai skirtingos ligos, kiekviena iš jų turi specifinį ir homogeninį genomo požymį, ir pateikia naujų įžvalgų apie B-PLL patogenezę ir apie galimus naujų gydymo būdų molekulinius taikinius.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildomas dokumentas

  2. 2.

    Papildoma S1 lentelė

  3. 3.

    Papildoma S2 lentelė

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento Leukemijos svetainėje (//www.nature.com/leu)