Bakterijos gali mobilizuoti nematodų gaudymo grybus, kad sunaikintų nematodus gamtos komunikacijos

Bakterijos gali mobilizuoti nematodų gaudymo grybus, kad sunaikintų nematodus gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Bendruomenės ekologija
  • Mikrobų ekologija

Anotacija

Natūraliose buveinėse bakterijas sunaikina bakterijiniai nematodai; tačiau jie nėra tiesiog pasyvūs grobiai. Čia mes pranešame apie gynybinį mechanizmą, kurį naudoja tam tikros bakterijos, norėdamos mobilizuoti nematodų gaudymo grybus, kad sunaikintų nematodus. Šios bakterijos išskiria karbamidą, dėl kurio Arthrobotrys oligospora grybelis keičiasi gyvenimo būdu iš saprofitinės į nematodų plėšrūnės formą; šiai plėšriai formai būdingos specializuotų ląstelių struktūrų arba „spąstų“ formavimasis. Bakterijos reikšmingai skatina nematodų pašalinimą iš A. oligospora . Sutrikusi genų, susijusių su karbamido pernešimu ir metabolizmu A. oligospora, organizme, pašalinamas karbamido sukeltas spąstai. Be to, karbamido metabolitas amoniakas funkcionuoja kaip signalo molekulė grybelyje, kad inicijuotų gyvenimo būdo pasikeitimą ir sudarytų spąstų struktūras. Mūsų išvados pabrėžia daugybinių plėšrūnų ir grobio sąveikų svarbą grobio gynybos mechanizmuose.

Įvadas

Natūraliose ekosistemose bakterijų bendruomenės vaidina svarbų vaidmenį keičiant maistinių medžiagų apykaitą, pirminį gaminimąsi ir skilimą 1 . Bakterijas taip pat daug sunaudoja bakteriniai nerviniai nematodai, esantys komposte, dirvožemyje ir vandens sistemose 1, 2 . Taigi, ne tik konkuruodamos dėl maistinių medžiagų, bakterijos patiria nemažą nematodų grobio slėgį. Norėdami užkirsti kelią grobikiškiems metazoanų priešams, bakterijos sukūrė įvairius gynybos mechanizmus 3 . Pirma, daugelis bakterijų gali gaminti ir išskirti toksinus. Pavyzdžiui, bakterija Pseudomonas fluorescens išskiria antrinius metabolitus, kad atstumtų nematodus 4, o P. aeruginosa gamina fenazino junginius ir cianidą, kad sunaikintų nematodus 5, 6 . Antra, tarpląstelinių proteazių sekrecija prisideda prie bakterijų Vibrio cholerae ir Bacillus nematocida nematodų toksiškumo nematodų atžvilgiu 7, 8 . Trečia, morfologinis prisitaikymas, kurį sukelia bakterijos, taip pat yra bendras gynybos mechanizmas. Pavyzdžiui, bakterijos Yersinia pestis formavimasis bioplėvele gali užkirsti kelią nematodų (ir kitų plėšrūnų) prarūgimui arba sumažinti jų įsiskverbimą 9, 10 . Šios specifinės strategijos suteikia tam tikroms bakterijoms pranašumą prieš jų nematodų plėšrūnus.

Šie bakterijų gynybos mechanizmai savo ruožtu sukuria atrankinį nematodų spaudimą, sukeldami plėšrūnų ir grobio ginklavimosi varžybas. Pavyzdžiui, nematodai išsivystė siekdami išvengti toksiškų / patogeninių bakterijų ir netoksiškų bakterijų pašaro, kad palaikytų jų augimą ir dauginimąsi 11 . Šiuo metu išsamiausi duomenys apie nematodų elgesį su bakterijomis yra gauti iš modelinio nematodo Caenorhabditis elegans 12 . Nors C. elegans turi gana paprastą nervų sistemą, jo jutimo neuronai gali aptikti daugybę aplinkos užuominų. Susidūręs su bakterijų patogenais, C. elegans vengia elgesio ir išsiskiria 13, 14, 15 . Esant netoksiškoms bakterijoms, C. elegans gali jas atpažinti ir medžioti kaip maisto šaltinius. Vis dėlto neaišku, ar egzistuoja prieštaringos reakcijos strategijos šioms netoksiškoms bakterijoms.

Natūralioje aplinkoje nematodų gaudymo grybeliai gali įstrigti ir užmušti nematodų. Šie grybai turi dvi gyvenimo būdo fazes: saprofitinį ir plėšrųjį 16, 17 . Nesant nematodų, šie grybai gyvena kaip saprofitai. Susidūrę su nematodais, šie grybeliai patenka į plėšriųjų gyvūnų stadiją, gamindami specializuotus plėšriuosius prietaisus nematodams gaudyti ir naikinti. Ankstesni tyrimai parodė, kad nematodai gamina signalines medžiagas, skatinančias spąstų formavimąsi šiuose grybuose 18, tačiau šių medžiagų cheminė sudėtis iš esmės nežinoma. Neseniai atliktas tyrimas pranešė, kad askarozidai, konservuoti signalinių molekulių, plačiai biosintetinamų tarp nematodų 19, šeima, sukelia spąstų susidarymą nematodų gaudymo grybuose 20 . Be askarozidų, difuziniai junginiai iš karvių mėšlo taip pat parodė, kad keičiasi nematodų gaudymo grybelis Arthrobotrys oligospora , kuris gamina trijų matmenų (3D) lipnius tinklus 21, gyvenimo būdo pokyčius.

Mes iškėlėme hipotezę, kad difuziniai komponentai iš karvių mėšlo gali būti bakterinės kilmės. Mes pranešame, kad karbamidas, išsiskiriantis iš bakterijų, sukelia gyvenimo būdo pasikeitimą grybelio A. oligospora organizme nuo saprofitinės iki prieštaringos stadijos. Amoniakas, karbamido skilimo produktas, savo ruožtu tarnauja kaip signalo molekulė, inicijuojanti šį gyvenimo būdo pakeitimą. Šios išvados yra ryškus kelių plėšrūnų ir grobio sąveikų pavyzdys, kurios vaidina svarbų vaidmenį keičiant sudėtį ir populiacijos dinamiką gamtoje.

Rezultatai

Karvių mėšle esančios bakterijos gali sukelti spąstų susidarymą

Remdamiesi ankstesniu stebėjimu, mes nustatėme, kad šviežias karvių mėšlas sukėlė spąstų susidarymą A. oligospora vandens agaro lėkštelėse (1a pav.). Tačiau autoklavuoti mėšlo mėginiai sukėlė mažiau spąstų nei švieži mėginiai (papildomas 1 pav.). Kadangi bakterijos sudaro didelę karvių mėšlo biotos dalį, šie rezultatai leidžia manyti, kad aktyvūs bakterijų metabolitai, esantys karvių mėšle, gali būti spąstų formavimosi induktoriai A. oligospora . Norėdami išbandyti šią idėją, pirmiausia nustatėme specifines bakterijas karvių mėšle, kurios gali sukelti spąstų susidarymą A. oligospora . Šviežio mėšlo vandeninė suspensija buvo nuosekliai praskiesta 10 kartų sterilizuotame vandenyje ir paskleista ant maistinio Luria-Bertani sultinio (LB) agaro. Po 1 dienos inkubacijos atsirado įvairios bakterijų kolonijos ir subkultūros būdu buvo ištirtos ir išanalizuotos 126 atsitiktinės kolonijos (pavadintos CD1 iki CD126). 16S rRNR geno analizė 126 izolatus suskirstė į 18 genų (1 papildoma lentelė). Iš šių izoliatų supernatantai iš 55 izoliatų LB sultinio terpėje galėjo sukelti spąstų susidarymą A. oligospora . Trys Stenotrophomonas maltophilia izoliatai (CD8, CD52 ir CD103) buvo veiksmingiausi induktoriai. Priešingai, likusių 71 izoliato supernatantai nesukėlė spąstų susidarymo. Šie rezultatai rodo, kad kai kurie bakterijų izoliatai, gauti iš karvių mėšlo, gali sukelti spąstų susidarymą A. oligospora .

Image

a ) Spąstų susidarymas A. oligospora apylinkėse prie karvių mėšlo. Karvės mėšlas (rudas plotas plokštelės apačioje) buvo dedamas ant vandens agaro lėkštelės. Pridėjus A. oligospora konidijas 2 cm atstumu nuo mėšlo, susidarė spąstai (rodyklė). ( b ) ArkaA pašalinimas visiškai panaikino karbamido gamybą atitinkamai S. maltophila CD52 LB terpėje ir MM. Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. *** P <0, 001 palyginti su CD52 ( t- testas). c ) Karbamido koncentracijos įtaka spąstų susidarymui A. oligospora po 72 val. ( d ) arcA ekspresija S. maltophila buvo sukelta pridedant nematodų LB terpėje ir MM. Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. ** P <0, 01, palyginti su kontrole (0 h; t- testas). e ) S. maltophila supernatanto karbamido kiekį padidino nematodai. Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. ** P <0, 01, palyginti tik su laukinio tipo (WT) ( t- testas). ( f ) lankoA ištrynimas reikšmingai slopino S. maltophila sukelto spąstų susidarymą A. oligospora . Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. ** P <0, 01, palyginti su CD52 ( t- testas).

Visas dydis

Karbamido kaip spąstų induktoriaus identifikavimas A. oligospora

Iš 55 izoliatų, galinčių sukelti spąstų susidarymą A. oligospora , trys S. maltophilia izoliatai (CD8, CD52 ir CD103) buvo veiksmingiausi. Norint nustatyti junginį (-ius), išskiriamą iš bakterijų, kurios sukėlė spąstus A. oligosporoje , ekstraktas, gautas iš S. maltophilia CD52 fermentacijos supernatanto LB terpėje, buvo išskirtas silikageliu G kolonoje ir Sephadex LH-20 kolonėlės chromatografijoje. Junginys kandidatas buvo gautas izoliuojant pagal aktyvumą ir toliau identifikuotas kaip karbamidas naudojant masės spektrometriją, branduolinio magnetinio rezonanso ir elementų analizę (papildomas 2a – c pav.; 1b pav.). Karbamidas taip pat rastas S. maltophilia CD52 fermentacijos supernatante mažai maistingoje medžiagoje (MM; 1b pav.). Šie rezultatai rodo, kad S. maltophilia CD52 gamina karbamidą tiek maistingose ​​medžiagose, tiek medžiagose, kuriose trūksta. Be to, karbamidas buvo rastas fermentacijos supernatantuose iš kitų 54 izoliatų, kurie rodė spąstus sukeliantį aktyvumą, bet ne iš likusių 71 izoliato (1 papildoma lentelė).

Stebėjimas, kad bakterijų išskiriamas karbamidas gali sukelti grybelinių spąstų susidarymą, dar buvo patvirtintas analizuojant komercinio aukšto grynumo karbamidą vandens agaro lėkštelėse. Po 72 valandų inokuliacijos, karbamidas reikšmingai sukėlė spąstų susidarymą A. oligospora priklausomai nuo dozės ir pasiekė didžiausią spąstų susidarymo indukciją esant 300 mg l – 1 (1c pav.). Įdomu tai, kad esant didelei 1500 mg l – 1 koncentracijai, karbamidas visiškai panaikino spąstų susidarymą (1c pav.). Neseniai Hsueh ir kt. 20 įrodė, kad C. elegans gaminami askarozidai gali sukelti spąstų susidarymą nematodų gaudymo grybuose. Tačiau gaudyklės indukcija askarozidais buvo visiškai slopinama terpėje, kurioje yra 0, 5% (5000 mg l −1 ) (NH4) 2 SO4. Taigi mūsų ir Hsueh et al tyrimų rezultatai. 20 atitinka hipotezę, kad spąstų susidarymas yra slopinamas azoto turinčiomis sąlygomis. Tada mes nustatėme, ar karvės mėšlas išsiskiria iš karbamido, ir nustatėme, kad karbamido koncentracija karvių mėšlo eksudacijoje yra 151 mg l −1 . Be to, karvės mėšlo eksudacija žymiai sukėlė spąstų susidarymą A. oligospora (papildomas 3 pav.).

Bakterijose karbamidas susidaro daugiausia per arginino katabolizmą, kai paskutinėje karbamido ciklo stadijoje arginase paverčia argininą į ornitiną ir karbamidą 22 . Atsitiktiniu būdu atrinkome tris karbamidą gaminančias (CD52, CD82 ir CD101) ir tris ne karbamidą gaminančias bakterijas (CD1, CD93 ir CD102), kurios buvo identifikuotos rūšių lygiu, ir išbandėme, ar tariamieji ArAA genai, koduojantys arginasees genų egzistuoja šios bakterijos ir ar jos yra ekspresuojamos. Tariamus arcA genus mes amplifikavome atitinkamai iš genominės DNR ir mRNR, naudodami PGR, naudodami du išsigimusius pradmenis. Amplifikuoti fragmentai buvo gauti iš visų bakterijų genominės DNR (papildomas 4 pav.). DNR seka parodė, kad šiuose fragmentuose yra arcA genai. Priešingai, amplifikuoti fragmentai buvo gauti tik iš trijų karbamidą gaminančių bakterijų, bet ne iš karbamidą gaminančių bakterijų mRNR (papildomas 4 pav.). Rezultatai leidžia manyti, kad arcA genai tam tikromis sąlygomis gali būti indukuoti šiose ne karbamidą gaminančiose bakterijose.

Norėdami nustatyti, ar arginazė reikalinga karbamidui gaminti S. maltophila CD52, mes ištrynėme arcA geną iš šio kamieno (papildomas 5a, b pav.). Kaip ir tikėtasi, fermentacijos supernatante iš SMA arcA mutanto nebuvo rasta karbamido (1b pav.). Mes nustatėme, kad arcA išraiška S. maltophila CD52 buvo žymiai padidinta per 7 valandas po sąlyčio su nematodu C. elegans tiek LB terpėje, tiek MM (1d pav.). Nuosekliai, karbamido lygis supernatante taip pat pastebimai padidėjo po 10 val. Po ekspozicijos C. elegans LB terpėje (1e pav.). Galiausiai, arcA ištrynimas žymiai sumažino S. maltophila CD52 sugebėjimą sukelti spąstų susidarymą A. oligospora (1f pav.). Šie rezultatai rodo, kad iš bakterijų pagamintas karbamidas skatina spąstų susidarymą A. oligospora .

Norėdami ištirti, ar karbamidas gali sukelti spąstų susidarymą kituose nematodų gaudymo grybuose, mes ištyrėme reagavimą į karbamidą papildomose grybų šeimos, Orbiliaceae, Ascomycota, rūšyse. Šie grybai gali gaminti įvairias gaudyklių struktūras, įskaitant 3D klijų tinklus, lipnias rankenėles, lipnias kolonas ir sutraukiančius žiedus (2 papildoma lentelė). Mes nustatėme, kad karbamidas sukėlė spąstų struktūras 7 iš 31 rūšių išbandytomis sąlygomis (2 pav.). Tikėtina, kad likusios 24 rūšys reaguoja į kitas dar nenustatytas signalines molekules. Faktas, kad šių rūšių gaudyklių struktūros apima didžiąją dalį spąstų rūšių, rodo, kad reagavimas į karbamidą yra paplitęs, bet neišsaugotas tarp nematodų gaudymo grybų.

Image

Orioniaceae šeimos Ascomycota šeimos nematodų gaudymo grybų ITS regionų Bajeso kilmės išvados filogenezė. Kaip palikuonis naudojamas pluoštinis grybas Neurospora crassa . Spąstai yra kintamos srovės, lipnios kolonos; AK, lipnios rankenėlės; AN, lipnūs tinklai ir CR, sutraukiantys žiedai.

Visas dydis

Karbamido įsisavinimas yra nepaprastai svarbus formuojant spąstus A. oligospora

Pranešama, kad daug grybelių vežėjų, pasižyminčių dideliu karbamido specifiškumu, yra 23, 24, 25 . Iš A. oligospora ATCC24927 (nuoroda 17) genomo mes nustatėme du spėjamus karbamido pernešėjų genus utp79 ir utp215 (AOL_S00079g183r ir AOL_s00215g323r). Filogenetinės analizės parodė, kad šie du karbamido pernešėjai iš A. oligospora buvo suskirstyti į dvi atskiras grupes (papildomas 6 pav.). Norėdami nustatyti, ar Utp79 ir Utp215 yra aktyvūs karbamido pernešėjai A. oligospora , mes pašalinome abu genus homologinės rekombinacijos būdu (papildomas 7a – c pav.). AoΔ utp215 mutanto padermės kolonijų augimas buvo panašus kaip laukinio tipo padermėse bulvių dekstrozės agare (PDA) arba kukurūzų miltų agare (CMA), tuo tarpu AoΔ utp79 mutanto padermė augo lėčiau nei laukinio tipo padermė PDA, bet ne CMA (papildomas 8 pav.). Tada mes išmatuojome karbamido sunaudojimą, naudodami [ 13C, 15 N2] -karbamidą kaip atsekamąjį elementą. Sutrikdžius utp79, [ 13 C, 15 N 2 ] karbamido vartojimas buvo visiškai panaikintas, o utp215 sutrikimas parodė tik iš dalies sumažėjusį [ 13 C, 15 N 2 ] karbamido vartojimą (3a pav.). Svarbu tai, kad utp79 sunaikinimas visiškai užblokavo karbamido sukeltą spąstų susidarymą, tuo tarpu spąstų susidarymas buvo tik iš dalies slopinamas AoΔ utp215 mutante (3b pav.). Šie rezultatai rodo, kad karbamidas turi būti gabenamas į grybelines ląsteles, kad tarpininkautų spąstų susidarymui A. oligospora , daugiausia per Utp79.

Image

( a ) [13C, 15 N2] -Ureato įsisavinimas buvo visiškai panaikintas Ao utp79 mutante . „ Utp215“ sutrikimas tik iš dalies sutrikdė [ 13C , 15 N2] -karbamido įsisavinimą A. oligosporoje . ( b ) utp79 pašalinimas pašalino karbamido sukeltus spąstus A. oligospora . Priešingai, utp215 trynimas iš dalies slopino karbamido sukeltų spąstų susidarymą. c ) karbamido kaupimasis A. oligospora metu ištrynus karbamidą1. Išmatuotas [ 13 C, 15 N2] karbamido įsisavinimas WT ir AoA ure1 mutantų padermėse. ( d ) karbamido pašalinimas visiškai užblokavo karbamido sukeltų spąstų susidarymą A. oligospora. Tačiau amoniakas išgelbėjo spąstų susidarymą Ao utp79 ir AoA ure1 mutantuose . e ) Amoniako sukeltų spąstų formavimas (matuojamas po 72 h). Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. * P <0, 05, o *** P <0, 001 palyginti su WT ( t- testas).

Visas dydis

Karbamido metabolitas amoniakas veikia pasroviui, kad sukeltų spąstus

Paprastai viena karbamido molekulė paverčiama dviem amoniako molekulėmis ir viena anglies dioksido molekulėmis. Iš A. oligospora 17 genomo buvo paimtas ir išanalizuotas spėjamas ureazės genas, būtent ure1 (AOL_s00080g26r) (papildomas 9 pav.). Ištrynėme ure1 ir nustatėme, kad AoA ure1 mutanto padermė augo lėčiau nei laukinio tipo padermė PDA ir CMA (papildomi 7d ir 8 pav.). Ure1 pašalinimas sąlygojo reikšmingą tarpląstelinį [ 13C , 15 N2] karbamido kaupimąsi A. oligospora (3c pav.). Tačiau padidėjusi tarpląstelinio karbamido koncentracija (iki 300 mg l −1 ) nesugebėjo sukelti spąstų susidarymo AoA ure1 mutante (3d pav.). Šie duomenys rodo, kad karbamido skilimo produktas (-ai) yra nepaprastai svarbus, norint sukelti spąstus.

Toliau mes ištyrėme, kuris iš dviejų karbamido skilimo produktų yra signalo molekulė, skatinanti spąstų susidarymą A. oligospora . Skirtingai nei Candida albicans ir Cryptococus neoformans, kur anglies dioksidas buvo veiksmingas sukeliant morfologinius pokyčius 26, 27, anglies dioksidas įvairiose koncentracijose (1, 2, 5 ir 5%) nesugebėjo sukelti spąstų susidarymo A. oligospora . Priešingai, amoniakas veiksmingai sukėlė spąstų susidarymą laukinio tipo kamiene (3d pav.). Panašiai kaip atsakas į karbamidą, spąstais susidarantys A. oligospora reaguoja į amoniaką priklausomai nuo dozės ir pasiekė didžiausią spąstų susidarymo indukciją esant 250 μg, tuo tarpu esant 625 μg koncentracijai amoniakas slopino spąstų susidarymą (3e pav.) . Be to, pridėjus amoniako tiek „AoΔ utp79“, tiek „AoA ure1“ mutantų padermėms, buvo atkurtas jų spąstų susidarymas (3d pav.), Rodantis , kad karbamido skilimo produktas amoniakas yra signalas, sukeliantis spąstų susidarymą.

Karbamidas skatina A. oligospora patogeniškumą

Buvo pranešta, kad nematodų išskiriami askarozidai gali sukelti spąstų susidarymą nematodų gaudymo grybuose 20 . Mes paklausėme, ar bakterijų / karbamido ir nematodų / askarozidų sukeltos spąstai turi tą patį kelią A. oligospora . Norėdami atsakyti į šį klausimą, nustatėme, ar nematodas sukelia spąstų susidarymą AoA ure1 mutante . Mes nustatėme, kad spąstų skaičius AoA ure1 mutante buvo panašus į laukinio tipo kamieno spąstų skaičių esant nematodams (4a pav.).

Image

a ) Spąstų skaičius WT ir AoA ure1 mutantų padermėse, kai yra nematodų. Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. b ) Karbamidas skatino nematodų sukeltus spąstus WT padermėje. Duomenys išreikšti kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. ** P <0, 01, palyginti su kontrole (be karbamido; t- testas). c ) Karbamidas sumažino nematodų išgyvenamumą po A. oligospora (AO) infekcijos. ** P <0, 01 palyginti su AO be karbamido ( t- testas).

Visas dydis

Toliau mes nustatėme karbamido poveikį nematodų sukeltų spąstų susidarymui. Nematodai ir karbamidas (100 mg l- 1 ) sukėlė spąstų susidarymą A. oligospora atitinkamai 16, 20 ir 48 val. (4b pav.). Nors karbamido pridėjimas nesutrumpino spąstų susidarymo pradžios laiko, tačiau žymiai padidino nematodų sukeltų spąstų skaičių (4b pav.). Karbamidas ir nematodai kartu padidino spąstų skaičių tris kartus, palyginti su vien tik karbamidu ar nematodais. Taigi nematodas ir karbamidas turėjo sinergetinį poveikį spąstų formavimuisi. Tuo tarpu mes nustatėme, kad karbamidas žymiai paspartino nematodų, kuriuos sukelia A. oligospora, pašalinimą (4c pav.). Šie rezultatai rodo, kad signalizuojančios bakterijos / karbamidas sukelia spąstų formavimąsi mechanizmu, kuris skiriasi nuo nematodų / askarozidų signalizacijos kelio.

Trišaliai santykiai dirvožemyje

Norėdami ištirti ryšį tarp bakterijų, nematodų ir nematodų gaudymo grybelių dirvožemyje, pirmiausia nustatėme kirminų dauginimąsi keturiose grupėse, turinčiose S. maltophilia CD52, SmA arcA mutantą, B. amyloliquefaciens CD1 ir CD1 bei karbamidą (5 mg). ), atitinkamai. B. amyloliquefaciens CD1 yra ne karbamido gaminanti bakterija, išskirta iš karvių mėšlo (1 papildoma lentelė). Kaip ir tikėtasi, nematodų skaičius panašiai padidėjo per 72 ir 96 valandas, nesant A. oligospora (5a pav.). Toliau mes nustatėme šių bakterijų poveikį A. oligospora –nematodo sąveikai. Esant A. oligospora dirvožemiui, iš anksto užkrėstiems CD1 ir karbamidu ar CD52, kirminų skaičius pradėjo reikšmingai mažėti po 72 val., O beveik visi kirminai mirė po 96 h (5b pav.). Priešingai, dirvožemyje, kuriame yra SmA arcA mutantas ir A. oligospora , nematodų skaičius padidėjo 1, 8 karto per 72 val. Ir pradėjo mažėti po 96 h. Panašūs rezultatai buvo gauti iš dirvos, iš anksto inokuliuotos CD1 ir A. oligospora (5b pav.). Kartu mūsų rezultatai rodo, kad karbamidą gaminančios bakterijos skatina nematodų pašalinimą iš A. oligospora .

Image

a ) Dirvožemyje, kuriame nėra A. oligospora , kirminų skaičius nuolat didėjo esant S. maltophila CD52, SmA arcA mutantui, ne karbamidą gaminančiai bakterijai B. amyloliquefaciens CD1 ir CD1 ir karbamidui (5 mg). ( b ) Dirvožemyje, kuriame yra A. oligospora , kirminų išgyvenamumas buvo žymiai mažesnis esant S. maltophila CD52 ir CD1 bei karbamidui nei tie, kuriuose buvo SmA arcA mutantas arba B. amyloliquefaciens CD1. Duomenys išreiškiami procentiniu pokyčiu, palyginti su kontrole (0 h). c ) Dirvožemyje be A. oligospora visose keturiose grupėse buvo panašus bakterijų skaičius, jei buvo kirminų. ( d ) Dirvožemyje, kuriame yra A. oligospora , CD52 ir CD1 (CD1 plius karbamido grupė) skaičius buvo daug didesnis nei Sm ΔarcA mutanto ir CD1 (tik CD1 grupė), esant kirminams. ( e, f ) Spąstų skaičius plokštelėse, kuriose yra CD52 ir CD1 bei karbamido, buvo žymiai didesnis nei plokštelėse, kuriose yra Sm ΔarcA mutanto ir CD1, jei nėra ( e ) ar nėra ( f ) kirminų. * P <0, 05, ** P <0, 01 ir *** P <0, 001, CD52, palyginti su SmΔ arcA arba CD1 + karbamidu, palyginti su CD1 ( t- testas).

Visas dydis

Toliau mes nustatėme kolonijas sudarančius bakterijų vienetus dirvožemyje. Mes nustatėme, kad visose keturiose grupėse buvo panašus bakterijų skaičius, jei buvo tik kirminai (5c pav.). CD52 ar CD1 (CD1 plius karbamido grupė) skaičius buvo daug didesnis nei Sm ararcA mutanto arba CD1 (tik CD1 grupė), esant kirminams ir A. oligospora (5d pav.). Kadangi sunku apskaičiuoti spąstų skaičių dirvožemyje, panašius eksperimentus atlikome agaro lėkštelėse. Jei nematodų nėra, plokštelių, kuriose yra CD52 ar CD1 ir karbamido, gaudyklių skaičius palaipsniui didėjo ir aukščiausią lygį pasiekė per 72 valandas (5e pav.). Nors spąstus sukėlė Sm ΔarcA mutantas, spąstų skaičius buvo žymiai mažesnis nei tas, kurį sukėlė CD52 ar CD1 ir karbamidas. CD1, priešingai, nesukėlė spąstų susidarymo. Tuo tarpu esant kirminams, spąstų skaičius plokštelėse, turinčiose arba CD52, arba CD1, ir karbamidą, buvo žymiai didesnis nei plokštelėse, turinčiose SmΔ arcA mutantą arba CD1 be karbamido (5f pav.). Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad karbamidą gaminančios bakterijos mobilizuoja nematodų gaudymo grybelį A. oligospora ir suteikia apsaugą nuo jų nematodų plėšrūnų.

Karbamidas lengvai pasklinda dirvožemyje

Įrodyta, kad augalų išskiriami lakieji lakūnai gali pritraukti plėšrūnus vabzdžius iš didelių atstumų 28, 29, 30, 31 . Nepralenkiamas karbamidas, priešingai, greičiausiai veiks kaip mažo nuotolio signalo molekulė. Norint ištirti, ar karbamidas pasklinda drėgname smėlyje, į smėlio pripildyto indo vietą buvo įpilta 5 mg karbamido. Kas 30 min. Mėginiai buvo imami 8 cm atstumu nuo šios vietos mažu skylių pradurtuvu ir analizuojami skysčių chromatografijos – masės spektrometrijos (LC-MS) būdu. Karbamidas buvo aptiktas per pirmąsias 30 minučių po įterpimo į smėlį. Karbamido kiekis pasiekė aukščiausią lygį per 120 min., O sumažėjo iki bazinio lygio po 180 min. (Papildomas 10 pav.). Panašu, kad greitas karbamido pasklidimas drėgname smėlyje yra tinkamas kaip žemės signalas.

Diskusija

Būdami pagrindiniai dirvožemio ekosistemos komponentai, bakterijiniai nematodai ir bakterijos sąveikauja tarpusavyje ir yra sukūrę daugybę skirtingų pusiausvyros palaikymo mechanizmų 1, 2, 3 . Tačiau mažai žinoma apie mechanizmus, kuriais nepatogeninės bakterijos apsisaugo nuo nematodų ganytojų. Mūsų rezultatai rodo, kad tam tikros bakterijos gali mobilizuoti nematodus gaudančius grybus, kad sumažintų grobuonies slėgį gaminant ir išleidžiant karbamidą. Karbamido metabolitas amoniakas funkcionuoja kaip signalo molekulė, kuri paspartina nematodų gaudymo grybelių perėjimą nuo saprofitinio prie ankstyvojo gyvenimo būdo, o tai yra būtina nematodų fiksavimui (6 pav.).

Image

Kai ganosi nematodai, bakterijos padidina karbamido gamybą ir išsiskyrimą padidindamos arginazės ekspresiją. Po to išskiriamą karbamidą per šlapalo pernešėją imasi nematodų gaudymo grybų grybiena, o galiausiai ureazė katabolizuoja į amoniaką grybeliuose. Amoniakas savo ruožtu inicijuoja gyvenimo būdo keitimą, kad sudarytų spąstų struktūras. Tuo tarpu nematodų išskiriami askarozidai nežinomais baltymais pernešami į nematodų gaudymo grybų micelijas ir tiesiogiai sukelia spąstų susidarymą. Bakterijų / karbamido ir nematodų / askarozidų perduoti signalizacijos keliai turi reikšmingą sinergetinį poveikį spąstų susidarymui, dėl to nematodai gali būti užfiksuoti ir žūti.

Visas dydis

Buvo pranešta apie netiesioginį gynybos nuo plėšrūnų mechanizmą augaluose 28, 29, 30, 31 ir vabzdžiuose 32, 33 . Kai įkando žolėdžiai vabzdžiai, vabzdžių pažeisti lapai ir šaknys išskiria daug lakiųjų chemikalų. Šios cheminės medžiagos pritraukia ir parazitinius, ir grobuoniškus vabzdžius, kurie yra natūralūs žolėdžių augintojų priešai, todėl jie gali rasti žolėdžių augintojus ir juos užpulti 28 . Lygiai taip pat termitas ( Coptotermes formosanus ) savo išmatomis naudoja savo lizdo struktūrą, užtikrinančią mitybą palaikant Streptomyces bakterijos 32 augimą. Streptomyces savo ruožtu slopina Metarhizium anisopliae , entomopatogeninio grybelio, augimą, suteikdamas reikšmingą naudą termitams. Taigi tokia įvairių rūšių sąveika greičiausiai labai dažna natūraliose ekosistemose.

Skirtingai nuo lakiųjų medžiagų, kurias išskiria mėsėdžiai, pritraukiantys didelius atstumus 28, 29, 30, 31, bakterijos išskiria nelakųjį karbamidą kaip tarpinį pranešimą, skirtą susisiekti su netoliese esančiais grybais. Aukštas karbamido tirpumas ir greita difuzija daro jį tinkamu molekuliniu signalu žemėje. Kadangi karbamido pernešimas yra ypač svarbus norint sukelti spąstus A. oligospora , atrodo, kad karbamidas veikia tarpląsteliniu būdu. Patekęs į ląsteles, karbamidas ureazės būdu metabolizuojamas į anglies dioksidą ir amoniaką. Mūsų atradimas atskleidžia, kad karbamido apykaitoje esantis amoniakas, o ne anglies dioksidas, veikia kaip pasroviuose esanti molekulė, sukelianti nematodų gaudymo grybų gyvenimo būdo pakeitimą. Kaupiami įrodymai parodė, kad tiek amoniakas, tiek anglies dioksidas gali būti naudojami kaip signalo molekulės vykstant morfogenetiniams pokyčiams grybelių karalystėje. Pavyzdžiui, amoniakas veikia kaip signalas skatinti ląstelių metabolizmo perprogramavimą, kolonijų diferenciaciją ir perėjimą nuo pseudohifalinės prie mielių pavidalo formų mielių rūšyse S. cerevisiae ir C. mogii 34, 35 . Tuo tarpu žinoma, kad anglies dioksidas, suskaidytas iš karbamido, tarpininkauja pereinant nuo mielių prie hypha formos C. albicans makrofaguose 26 ir skatina kapsulių gamybą C. neoformans 27 . Anglies dioksidas suaktyvina C. albicans mielių ir hipų jungimąsi , aktyvuodamas nuo cAMP priklausomą baltymo kinazės A kelią 26 . Šiuo metu reikia ištirti molekulinius mechanizmus, kuriais amoniakas kontroliuoja šiuos grybelių morfogenezinius pokyčius.

Remdamiesi genomine ir proteomine analize, mes anksčiau pasiūlėme spąstų susidarymo modelį, kurį sukėlė nematodų sukėlėjas nematodų gaudymo grybelyje A. oligospora . Pagal šį modelį nematodai suaktyvina daugybę signalų perdavimo būdų, apimančių įvairius ląstelinius procesus, tokius kaip energijos metabolizmas, ląstelės sienos biosintezė, ląstelių dalijimasis, glicerolio kaupimasis ir peroksisomų biogenezė. Neseniai Hsueh ir kt. 20 nustatė, kad C. elegans gaminami askarozidai sukelia spąstų susidarymą nematodų gaudymo grybuose. Tačiau mūsų rezultatai rodo, kad nematodai gali sukelti spąstų susidarymą AoA ure1 mutante , o tai reiškia, kad nematodų sukeltų spąstų formavimas nepriklauso nuo amoniako. Taigi, bakterijų / karbamido ir nematodų / askarozidų perduoti signalizacijos keliai naudoja skirtingus mechanizmus, kad inicijuotų gyvenimo būdo pakeitimą nematodų gaudymo grybuose. Įdomu tai, kad karbamido taikymo pakanka nematodų sukeltų spąstų skaičiui padidinti, kas rodo, kad tarp dviejų signalizacijos kelių yra reikšmingas sinergetinis poveikis spąstų susidarymui (6 pav.). Be to, signalizuojančios bakterijos / karbamidas skatina A. oligospora dirvožemyje pašalinti nematodus. Šie rezultatai rodo, kad šios bakterijos ir nematodų gaudymo grybeliai užmezga abipusiai naudingus ryšius, todėl nematodai iš bakterijų medžiotojo paverčiami auka. Vaidmenų pasikeitimai plėtojant plėšrūnų ir grobio sąveiką suteikia naujų įžvalgų ir papildo mūsų supratimą apie natūralių ekosistemų mikrobų bendrijų sudėtį ir populiacijos dinamiką.

Metodai

Spąstų susidarymo indukcija karvių mėšlu

Šviežias karvių mėšlas buvo surinktas iš galvijų fermos Yunnan žemės ūkio universitete, Kunmingas, Kinija. A. oligospora Fres. (ATCC24927) buvo gautas iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC). Spąstų susidarymo A. oligospora indukcija šviežiu arba autoklavuotu mėšlu buvo išbandyta anksčiau aprašytu metodu 21, su kai kuriomis modifikacijomis. Trumpai tariant, karvės mėšlas (5 g) praskiedžiamas 5 ml vandens ir dedamas ant vandens agaro, esančio maždaug 2, 5 cm atstumu nuo 90 mm skersmens plokštelės krašto. Po 7 dienų išankstinio inkubavimo 25 ° C temperatūroje 200 μl konidinės suspensijos, kurios koncentracija buvo ~ 5 × 104 konidijų viename mililitre, buvo paskirstyta ant plokštelės ir inkubuota 25 ° C temperatūroje. Spąstai buvo stebimi ir įvertinami naudojant šviesos mikroskopą.

Spąstų susidarymo indukcija bakterijomis

Iš viso 5 g šviežio mėšlo mėginio buvo įpilama į 50 ml sterilaus vandens ir gerai išmaišoma. Šviežio mėšlo vandeninė suspensija buvo nuosekliai praskiesta 10 kartų sterilizuotame vandenyje ir paskirstyta LB agaro lėkštelėmis. Po 1 dienos inkubacijos 30 ° C temperatūroje buvo imamos skirtingos kolonijos, pavadintos CD1 - CD126, kad būtų gautos grynos kultūros. Šios kolonijos buvo kultivuojamos 50 ml LB terpėje 30 ° C temperatūroje 4 dienas ir surinkti fermentacijos supernatantai. Du šimtai mikrolitrų kiekvieno supernatanto, sumaišyto su penkiasdešimt mikrolitrų konidialios A. oligospora suspensijos, kurios koncentracija yra ~ 5 x 104 konidijų viename mililitre, buvo paskirstyta vandens agaro plokštelėje ir inkubuota 25 ° C temperatūroje 72 valandas. Gaudyklių skaičius buvo suskaičiuotas per 10 mažo galingumo šviesos mikroskopo laukų ir nurodomas kaip vidutinis skaičius viename stebėjimo lauke.

Iš karvių mėšlo išskirtų bakterijų identifikavimas

Bakterijų genomo DNR buvo išskirta naudojant komercinį DNR išskyrimo rinkinį (Bioteke, Pekinas, Kinija). Bakterijoms identifikuoti 16S rRNR genų sekos buvo amplifikuotos universaliaisiais bakterijų pradmenimis 8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′) ir 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ′). PGR produktai buvo išgryninti naudojant Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit (Bioteke). 16S rRNR genai buvo sekuojami ir analizuojami naudojant BLAST algoritmą (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Aktyviojo junginio išskyrimas ir identifikavimas

Po to, kai S. maltophilia CD52 buvo auginamas 5 l LB terpėje sukamajame purtiklyje 30 ° C temperatūroje 4 dienas, fermentacijos supernatantas buvo surenkamas ir sukoncentruotas iki galutinio 1 l tūrio. Po to supernatantas buvo ekstrahuotas tokiu pat kiekiu n- butanolio. N- butanolio ekstraktas sukoncentruotas iki sausumo rotaciniame garintuve, o liekana (10, 4 g) ištirpinama metanolyje. Kolonėlės chromatografija buvo atlikta naudojant G silikagelio kolonėlę, išplaunant etilo acetatu / metanoliu (60: 1–1: 1), gaunant frakcijas A1 – A30. Vėliau šios frakcijos buvo patikrintos dėl jų sugebėjimo sukelti spąstų susidarymą A. oligospora . Aktyvioji frakcija A 3 (1, 62 g) buvo toliau atskirta ir išgryninta Sephadex LH-20 kolonėlėje (600 g), eliuuojant metanoliu, kad būtų gautos frakcijos A 3–1 – A 3–10 . Mes nustatėme, kad tik frakcija A 3–2 gali sukelti spąstų susidarymą. Tada aktyvioji frakcija A 3–2 (923 mg) vėl buvo išgryninta Sephadex LH-20 (200 g), išplaunant metanoliu, kad būtų gautas vienintelis kandidatas veikliojo junginio (426 mg). BMR eksperimentas buvo atliktas naudojant „Bruker Avance III-600“ BMR spektrometrus, naudojant vidinį standartą tetrametilsilaną („Bruker Corporation“, Fällanden, Šveicarija). Elektros purškimo jonizacijos masės spektrometrijos profiliai buvo užregistruoti „Finnigan LCQ-Advantage“ masių spektrometru („Thermo Electron Corp.“, San Chosė, CA, JAV). Elementų analizė buvo matuojama naudojant VARIO ELII elementų analizatorių (Elementar Analysensysteme GmbH, Hanau, Vokietija).

Karbamido aptikimas supernatantuose

S. maltophilia CD 52 ir SmA arcA mutantų padermės buvo auginamos 100 ml LB terpėje 30 ° C temperatūroje 4 dienas. Fermentacija buvo ekstrahuota tokiu pat kiekiu n- butanolio. N- butanolio ekstraktai sukoncentruoti iki sausumo sukamajame garintuve ir likučiai ištirpinami 10 ml metanolio. Karbamidas buvo nustatytas naudojant LC-MS su Waters Series HPLC 2695 (Waters Corp., Milford, MA, JAV) su masės detektoriumi „Thermo Finnigan LCQ Advantage“ (jonų gaudyklė; Thermo Electron Corp.). Prietaiso sąlygos buvo optimizuotos taip: purškimo įtampa, 5, 3 kV; kapiliarų įtampa, 3, 00 V; kapiliarų temperatūra, 250 ° C. Mėginiai buvo atskirti naudojant BDS HYPERSIL 5 μm porų dydį 4, 6 mm × 250 mm kolonoje (Thermo Electron Corp.) su izokratine eliuacija (5% metanolio), srautu 200 μl min –1 . LC-MS analizėje kaip išorinis standartas buvo naudojamas karbamidas (Sigma, St Louis, MO, JAV), kurio m / z 61 [M + H] + . Karbamido sulaikymo laikas buvo 15.00–16.10 min.

Spąstų susidarymo skatinimas karbamidu

Tiriant nematodų gaudymo grybelių spąstus indukuojant karbamidu, 200 μl konidinės suspensijos, kurios koncentracija ~ 5x104 konidijų viename mililitre, buvo paskleista ant vandens agaro plokštelės. Inkubavus su karbamidu (0–1 500 mg l – 1 ) 72 valandas, spąstai buvo suskaičiuoti per šviesos mikroskopą. Į amoniako tyrimus 25% amoniako tirpalo (Shantou Xilong Chemical, Guangdong, Kinija) buvo dedama į vieną dviejų skyrių 90 mm skersmens Petri lėkštelės ir 100 μl konidinės suspensijos, kurios koncentracija ~ 5 × 10 4, skyrių. Konidijos mililitre buvo paskirstytos atitinkamai ant kito skyriaus, kuriame buvo vandens agaras. Plokštės buvo nedelsiant apvyniotos „Bemis ParafilmM“ sandarinimo plėvele („Bemis Flexible Packaging“, Neenah, WI, JAV), kad būtų išvengta lakiųjų medžiagų išsiskyrimo. Inkubuojant 72 valandas 25 ° C temperatūroje, spąstai buvo užfiksuoti šviesos mikroskopu. Kiekviename tyrime buvo atliktos trys plokštelės, o visi eksperimentai buvo atlikti tris kartus. Gaudyklių skaičius buvo suskaičiuotas 10 mažo galingumo šviesos mikroskopo laukų ir nurodomas kaip vidutinis skaičius viename stebėjimo lauke.

Spėjamų arcA genų amplifikacija

Bakterijų genominė DNR buvo ekstrahuota naudojant DNR išskyrimo rinkinį (Bioteke). Bendra RNR iš bakterijų buvo išskirta naudojant RNAiso Plus (Takara, Dalianas, Kinija). Tariami arcA genai buvo amplifikuoti iš genomo DNR ir mRNR, naudojant PGR. Pradmenys, naudojami amplifikuoti arcA genus, buvo šie: CD1F, 5′-ACCCGCACAGGACAACATA-3 ′, CD1R, 5′-GGAACCGCTCACTCTCAAT-3 ′; CD93F, 5′-CAGGAATAACATCACCACAGT-3 ′, CD93R, 5′-TGAAGCGGATATTGCCATAC-3 ′; CD102F, 5′-ATCCAAGCACTATGAAAAC-3 ′, CD102R, 5′-GGAGAATAACCACCAATGT-3 ′; CD52F, 5′-TCCCATTTCCGTATCCC-3 ′, CD52R, 5′-CCACGCCACCACTTCATC-3 ′; CD82F, 5′-ACTTCCAGCCGTATGACAG-3 ′, CD82R, 5′-ATTCACAACCGTTCGCATAG-3 ′; CD101F, 5′-ATCTCGGCGTCATCTGGTA-3 ′, CD101R, 5′-CGTCGTTCGGATCAAGTCC-3 ′. 16S rRNR geno pradmenys buvo šie: 533F, 5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3 ′, 907R, 5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3 ′.

ArkaA ištrynimas S. maltophilia

S. maltophilia CD52 arcA išmušimo vektorius buvo sukonstruotas naudojant genų pakeitimo vektorių pSUP202. Trumpai tariant, 925 bp fragmentas, apimantis visą arcA geno kodavimo sritį, buvo amplifikuotas iš S. maltophilia CD52 padermės genominės DNR, naudojant PGR, naudojant pradmenis arcAF (5′-GAATTCATGGCCATCCCATCTCCGTATC-3 ′), turinčius „ Bam HI“ endonukleazės atpažinimo vietą ir arcAR (5′-AAGCTTGCATCAGCGTGGACTTGCCGAAC-3 ′), kuriame yra Hind III atpažinimo vieta. Fragmentas buvo įterptas į pMD-18T vektorių klonuojant T / A, gaunant pMD-arcA. 1, 614 bp ilgio tetraciklino (Tc) fragmentas, amplifikuotas iš pRK415 plazmidės pradmenimis 415TcF (5′-CTGCAGAGTTTGCGTGTCGTCAGAC-3 ′), turinčiais Pst I atpažinimo vietą ir 415TcR (5′-GCATGCTCCTTACTGGGCTTTCTCA-3 ’, atpažįstančio STR). Fragmentas buvo įterptas į pMD-18T vektorių klonuojant T / A, gaunant pMD-Tc. PMD-arcA ir pMD-Tc plazmidės buvo suskaidytos atitinkamai Pst I / Sph I. Tc Pst I / Sph I fragmentas buvo klonuotas į arcA esančią Pst I / Sph I atotrūkio vietą , gaunant pMD-arcA-Tc vektorių. Atsižvelgiant į arcA-Tc fragmento dydį, artimą pMD-18T vektoriaus dydžiui, pMD-arcA-Tc plazmidė buvo suskaidyta Dra I. Tada fragmentas buvo suskaidytas Bam HI / Hind III ir klonuotas į pSUP202. Galutinė pSUP-arcA-Tc plazmidė buvo įvesta į Escherichia coli S17-1 (λpir), naudojant elektroporacijos programą, kai impulsų krūvis yra 2, 5 kV, o impulsų trukmė - 6 ms. Tada plazmidė buvo mobilizuota į S. maltophilia CD52 konjugacijos būdu.

Transkonjugantai buvo atlikti LB agare, papildytame 50 μg ml −1 tetraciklino, 100 μg ml −1 ampicilino ir 50 μg ml −1 kanamicino. Atsparios kolonijos buvo parinktos į LB sultinį, papildytą 50 μg ml −1 tetraciklino, ir po to inkubuojamos per naktį 30 ° C temperatūroje. Iš tetraciklinams atsparių kolonijų DNR buvo išskirtos ir patvirtintos naudojant PGR. Pradiniai PGR buvo arcAF ir arcAR.

Kiekybinė realaus laiko PGR analizė

Visa RNR iš S. maltophilia CD52 buvo išskirta naudojant RNAiso Plus (Takara). Pagal gamintojo instrukcijas atlikta atvirkštinė transkripcija remiantis RNR, ekstrahuota naudojant „PrimeScript RT“ reagentų rinkinį su „gDNA Eraser“ („Perfect Real Time“; Takara). A real time-PCR analysis was performed with the Roche LightCycler 480 System (Roche Applied Science, Penzberg, Germany) using SYBR Premix-Ex Tag GC (Takara). The primers used for PCR were as follows: arcA : 5′-GTCGCTGGACATCGTTGAG-3′ (F), 5′-CGTGGACTTGCCGAACAG-3′ (R); rpoD : 5′-GGGCGAAGAAGGAAATGGTC-3′ (F), 5′-CAGGTGGCGTAGGTGGAGAA-3′ (R).

Deletion of genes in A. oligospora

To delete utp79 , two fragments (1, 500 and 1, 583 bp) were amplified with PCR using utp79-5F/utp79-5R and utp79-3F/utp79-3R, respectively. For deletion of utp215 , two fragments (both of 1, 674 bp) were amplified with PCR using utp215-5F/utp215-5R and utp215-3F/utp215-3R, respectively. For deletion of ure1 , two fragments (both of 2, 387 bp) were amplified with PCR using ure1-5F/ure1-5R and ure1-3F/ure1-3R. The sequences of these primers were as follows: utp79-5F, 5′-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCAAAGCCGTTTATCAAGAAC-3′, utp79-5R, 5′-ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACAGAATACCAGAACCGAGACC-3′; utp79-3F, 5′-CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACGTCAACTCCGTTATCAATCT-3′, utp79-3R, 5′-CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCATCCATCTAACCCCTCTTT-3′; utp215-5F, 5′-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCGGTTGGCAAAGATAAGCAG-3′, utp215-5R, 5′-ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACAGGCGGAGTGAGTGTAGTCG-3′; utp215-3F, 5′-CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACGATGTTTCGGCTGGTCTCGT-3′, utp215-3R, 5′-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTGTTGGATTTTGGGATAGGT-3′; ure1-5F, 5′-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCATTATCGTCTCAACTACCC-3′, ure1-5R, 5′-ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACTATTCATTTTATTTGTCCGC-3′; ure1-3F, 5′-CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACTTGTGGGTTGGTTTCTATG-3′, ure1-3R, 5′-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTGCTCTTTTCTTGCTTTCT-3′. The deletion cassettes were constructed by double crossing-over homologous recombination according to the method described previously 36, 37 . The primers used for PCR were as follows: utp79F, 5′-CAGGAACCAATCCAAAGAGC-3′, utp79R, 5′-CAACCCAATAAAGTCGCACG-3′; utp215F, 5′-GCTGTGGTTCACTACCTTAC-3′, utp215R, 5′-ACACCCATCATCAAGTAGAG-3′; ure1F, 5′-AGTCGTAGCATTCGTCCCAG-3′, ure1R, 5′-ACCGTTCATCACCCCATTTC-3′.

Uptake of [ 13 C, 15 N 2 ]-urea

About 200 μl of conidial suspension of A. oligospora with a concentration of ~1 × 10 6 conidia per ml was grown in potato dextrose broth medium. After 6 days, the mycelia were washed and re-suspended in water. [ 13 C, 15 N 2 ]-Urea uptake was determined using MM containing 0.2 mg ml −1 [ 13 C, 15 N 2 ]-urea (Sigma) at 25 °C, pH 6.8. After incubation for 30 and 120 min, mycelium was collected. The resulting mycelial pellet (100 mg) was washed with PBS five times. The pellet was ground with liquid nitrogen and extracted using 2 ml methanol. The extracts were then condensed to 100 μl. [ 13 C, 15 N 2 ]-Urea was determined with LC-MS. For LC-MS quantification, [ 13 C, 15 N 2 ]-urea with m/z 64 [M+H] + was used as an external standard. The retention time of [ 13 C, 15 N 2 ]-urea was 15.00–16.10 min. A calibration curve was constructed using known concentrations of urea ranging from 200 ng ml −1 to 10 mg ml −1 . Each solution of 10 μl (2–100 ng) was injected on the column. All assays were performed in duplicates. Experimental data were calibrated and quantified using the Xcalibur Software (Thermo Finnigan). The calibration curves were constructed based on peak areas of the calibrated standards. Concentrations of all analytes were calculated from their peak areas against the calibration curves. The limit of detection for each analyte was determined as three times the signal-to-noise ratio. Recovery percent for each analyte in each matrix was obtained as the calculated concentration divided by the actual concentration.

Induction of trap formation by nematodes

For analysis of trap formation induced by the nematode C. elegans , 200 μl of conidial suspension with a concentration of ~5 × 10 4 conidia per ml was inoculated on water agar. After 2 days of growth, 80–100 adult nematodes were added to A. oligospora mycelia in the presence or absence of urea (100 mg l −1 ). After 16 h, mycelia were observed at time intervals under light microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

Interaction among bacteria, nematodes and fungi

Plates (35 mm) were first filled with sterilized soil (3 g). Bacterial suspension (500 μl; OD600=0.1), ~300 synchronized L3 C. elegans larvae or 100 μl of urea (50 mg ml −1 ), was added to each plate in the presence or absence of 200 μl conidia of A. oligospora (5 × 10 4 conidia per ml). After inoculation for 24 h at 25 °C, the soil samples were collected at 24-h intervals. The soil samples were suspended in 10-ml sterile water. To count worm numbers, 1 ml of suspension of each treatment was taken and the number of worms was counted under a light microscope. To count colony-forming unit of bacteria, the suspension of each treatment was serially diluted by 10-folds in sterilized water and spread over LB agar plates. After 1 day of incubation at 30 °C, bacterial colonies were counted.

For measurement of traps in the presence of nematodes and bacteria, 200 μl conidia of A. oligospora (5 × 10 4 conidia per ml) were pre-inoculated in water agar plates for 36 h. Then, 200 μl bacterial suspension (OD600=0.1) or 100 μl of urea (50 mg ml −1 ) with and without 60 synchronized L3 C. elegans larvae were added to water agar plates. After inoculation at 25 °C for 24 h, the traps were observed and scored using a light microscope at the indicated time points.

Urea diffusion measurements

The diffusion of urea was determined by the method described by Rasmann et al. 30, with some modifications. Briefly, a glass dish (30 cm in diameter, 8 cm deep) was filled with a 3-cm layer of moist sand (10% water). With a micropipette, 5 mg of urea in 100 μl of water was placed 1 cm deep in the sand at the centre of the dish. At a distance of 8 cm from this spot, the samples were taken by a small hole puncher (0.8 cm in diameter and 1 cm deep) every 30 min. The urea in the sand was analysed with LC-MS.

Statistika

Differences in gene expression, trap formation, urea content and nematode number were assessed by the Student's t- test. Data were analysed using the SPSS11.0 software (SPSS Inc.).

Papildoma informacija

How to cite this article : Wang, X. et al. Bacteria can mobilize nematode-trapping fungi to kill nematodes. Nat. Bendruomenė. 5:5776 doi: 10.1038/ncomms6776 (2014).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-10 and Supplementary Tables 1-2

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.