Nuo bakų priklausomas mitochondrijų amplifikacijos etapas prisideda prie smac mimetinės / gliukokortikoidų sukeltos nekroptozės | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Nuo bakų priklausomas mitochondrijų amplifikacijos etapas prisideda prie smac mimetinės / gliukokortikoidų sukeltos nekroptozės | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Vaikų vėžys

Anotacija

Nekroptozė yra užprogramuota ląstelių žūties forma, kuri kritiškai priklauso nuo RIP3 ir MLKL. Tačiau mitochondrijų indėlis į nekroptozę vis dar menkai suprantamas. Šiame tyrime mes išsiaiškinome, kad mitochondrijų pasipiktinimai vaidina kritinį vaidmenį Smac mimetiko / deksametazono (Dexa) sukeltoje nekroptozėje, nepriklausomai nuo mirties receptorių ligandų. Mes parodėme, kad Smac mimetikai BV6 ir Dexa bendradarbiauja sukeldami nekrotinę ląstelių mirtį ūmios limfoblastinės leukemijos (VIS) ląstelėse, kurioms trūksta kaspazės aktyvacijos dėl nesant kaspazės-8 ekspresijos ar farmakologinio slopinimo, kurį sukelia kaspazės inhibitorius zVAD.fmk, nes genetinis nutildymas arba RIP3 ar MLKL farmakologinis slopinimas reikšmingai išgelbėjo BV6 / Dexa sukeltą nekroptozę. Be to, RIP3 arba MLKL išmuštų pelių embrionų fibroblastai (MEF) yra apsaugoti nuo BV6 / Dexa / zVAD.fmk sukeltos ląstelių mirties. Priešingai, antagonistiniai antikūnai prieš mirties receptorių ligandus TNFα, TRAIL ar CD95 ligandus neišgelbėja nuo BV6 / Dexa sukeltos ląstelių mirties. Kinetiniai tyrimai atskleidė, kad gydymas BV6 / Dexa prieš ląstelių mirtį sukelia hiperpolarizuotą mitochondrijų membranos potencialą (MMP), po to prarandamas MMP, reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba, Bak aktyvacija ir sutrinka mitochondrijų kvėpavimas. Svarbu tai, kad „Bak“ numušimas žymiai sumažina BV6 / Dexa sukeltą MMP praradimą ir atitolina ląstelių žūtį, bet ne ROS susidarymą, tuo tarpu ROS naikikliai silpnina Bak aktyvaciją, tai rodo, kad ROS gamyba vyksta prieš BV6 / Dexa tarpininkaujant „Bak“ aktyvacijai. Nuoseklus gydymas BV6 / Dexa sukelia Bak baltymo oksidacinius tiolio pakeitimus. Įdomu tai, kad RIP3 ar MLKL numušimas ar išmušimas apsaugo VISAS ląsteles ar MEF nuo BV6 / Dexa sukeltos ROS susidarymo, Bak aktyvacijos, MMP kritimo ir mitochondrijų kvėpavimo sutrikimo, parodydami, kad šie mitochondriniai įvykiai priklauso nuo RIP3 ir MLKL. Taigi mitochondrijos gali pasitarnauti kaip BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės amplifikacijos žingsnis. Šie atradimai suteikia naujų įžvalgų apie mitochondrijų disfunkcijų vaidmenį nekroptozės metu ir turi svarbių reikšmių kuriant naujus gydymo metodus, siekiant įveikti VISŲ apoptozės atsparumą.

Pagrindinis

Apoptozė yra viena iš geriausiai apibūdinamų reguliuojamos ląstelių mirties formų, kuriai paprastai būdingas kaspazių, kaip ląstelių mirties efektoriaus molekulių, aktyvavimas. 1 Be apoptozės, nekroptozė neseniai buvo nustatyta kaip kita užprogramuotos ląstelių mirties forma, apimanti serino / treonino kinazių receptorių sąveikaujantį baltymą (RIP) 1 ir RIP3 ir pseudokinazės mišrios linijinės kinazės domeno (MLKL) aktyvaciją. pagrindinės signalizacijos molekulės. 2, 3, 4, 5, 6, 7 - naviko nekrozės faktoriaus α (TNF α ) tarpininkaujama nekroptozė - prototipinis signalinis kelias į nekroptozinių ląstelių žūtį, dėl kurio susidaro RIP1-RIP3 turintis baltymų kompleksas, vadinamas nekrozoma. Nekrozomų susidarymas suaktyvina MLKL dėl RIP3 tarpininkaujamo fosforilinimo, kuris skatina MLKL oligomerizaciją ir jo perkėlimą į lipidų membranas, įskaitant plazminę membraną, kur MLKL sutrikdo membranos vientisumą, sudarydamas poras, dėl kurių susidaro nekrotitinės ląstelės. 9, 10 Kaspazės-8 sąlygotas RIP1 skilimas slopina nekroptozę; 11 reiškia, kad kaspazės-8 slopinimas palengvina nekroptozės sukėlimą. Nors mitochondrijos buvo susijusios su nekrozė daugelyje ląstelių sistemų, taip pat yra įrodymų, kad mitochondrijos gali būti nereikalingos, 12, 13 rodo, kad mitochondrijų indėlis į nekroptozę gali priklausyti nuo konteksto.

Antiapoptotiniai baltymai, tokie kaip apoptozės inhibitoriai (IAP), blokuoja užprogramuotą ląstelių mirtį. 14 su X susijęs IAP (XIAP) slopina apoptozę daugiausia blokuodamas kaspazės aktyvaciją, tuo tarpu ląsteliniai IAP (cIAP) 1 ir cIAP2 baltymai, turintys išties įdomų naujo geno (RING) domeną su E3 ubikvitino ligazės aktyvumu, skatina su K63 susietą RIP1 polikvitiminaciją, sukelianti branduolinio faktoriaus kappaB (NF-κB) aktyvaciją ir slopindama ląstelių mirties signalus. 14 IAP baltymai yra ekspresuojami nepaprastai dideliu mastu sergant įvairiomis vėžinėmis ligomis, o tai buvo susiję su blogais rezultatais ir atsparumu gydymui. 14 Atliekant recidyvuojančią arba padidėjusios rizikos VIS, dažniausiai piktybinio naviko, gydymo nesėkmė yra susijusi su nepalankiomis ilgalaikio išgyvenimo prognozėmis 15, 16 ir dažnai dėl netinkamų ląstelių žūties visose ląstelėse, nes citotoksinių vaistų antileukeminis aktyvumas terapija kritiškai priklauso nuo VISŲ ląstelių sugebėjimo užprogramuoti ląstelių mirtį. 17, 18

Norėdami antagonizuoti IAP baltymus, pastaraisiais metais buvo sukurti mažų molekulių inhibitoriai, tokie kaip Smac mimetikai, neutralizuojantys XIAP ir sukeliantys autoubiquitination bei proteasominį CIAP baltymų skilimą. Tai lemia nekanoninių NF- κB signalų aktyvavimą, NF- κB taikinių genų, tokių kaip TNF α ir TNF α, inicijuotų ląstelių žūtį, esant Smac mimetikams. 20, 21, 22 Kai slopinamas kaspazės-8 aktyvumas, Smac mimetikų stimuliuojamas CIAP baltymo išeikvojimas skatina nekrozominio komplekso susidarymą. 8

Anksčiau pranešėme, kad Smac mimetikas BV6 jautrus visoms ląstelėms in vitro ir in vivo dėl gliukokortikoidų sukeltos apoptozės. 23 Tačiau šiuo metu nežinoma, ar šio Smac mimetiko / gliukokortikoidų derinio antileukeminį poveikį riboja apoptozės kelių defektai. Todėl šiame tyrime mes ištyrėme klausimą, ar BV6 / Dexa gydymas kartu gali sukelti ne apoptozinę ląstelių mirtį apoptozei atspariose VIS ląstelėse, ir, jei taip, kokie molekuliniai mechanizmai yra susiję.

Rezultatai

Bendras BV6 / Dexa gydymas sukelia neapoptozinę ląstelių mirtį apoptozei atspariose VIS ląstelėse

Anksčiau pranešėme, kad Smac mimetikai sinergizuojasi su gliukokortikoidais, kad sukeltų apoptozę ikiklinikiniuose in vitro ir in vivo ALL modeliuose. 23 Norėdami ištirti, ar šis kombinuotas gydymas gali sukelti neapoptozinę ląstelių mirtį apoptozei atspariose VISose ląstelėse, mes ištyrėme Smac mimetiko BV6 derinį su Dexa, esant plataus spektro kaspazės inhibitoriui zVAD.fmk. Pažymėtina, kad pridedant zVAD.fmk nepavyko apsaugoti trijų iš keturių tirtų VISŲ ląstelių linijų (ty Tanoue, Jurkat, KOPN-8; 11) nuo ląstelių žūties atliekant BV6 / Dexa gydymą, tuo tarpu zVAD.fmk reikšmingai sumažino BV6 / Dexa sukeltos ląstelės mirtis Reh ląstelėse (1a pav.). Įdomu tai, kad pagrindinių nekroptozės ir apoptozės signalizacijos komponentų analizė atskleidė RIP3 ir MLKL ekspresiją tose trijose ląstelių linijose (ty, Tanoue, Jurkat ir KOPN-8; 11), kuriose negydant apoptozės ląstelės žuvo, gydydamos BV6 / Dexa. zVAD.fmk buvimas, tuo tarpu Reh ląstelėms, kurios buvo atsparios BV6 / Dexa / zVAD.fmk sukeltai ląstelių žūčiai, trūksta RIP3 baltymo ekspresijos (1b paveikslas, palyginti 1a paveikslą). Taip pat mes sužinojome, kad Tanoue ląstelėse iš esmės trūksta kaspazės-8 baltymo ekspresijos (1b pav.), O gydymas BV6 / Dexa nepadidino kaspazės-8 ekspresijos šiose ląstelėse (papildomas 1A paveikslas).

Image

Image

Gydymas BV6 / Dexa sukelia neapoptozinę ląstelių mirtį apoptozei atspariose VIS ląstelėse. a ) VISOS ląstelės 24 valandas buvo apdorotos BV6 ir (arba) 200 μM Dexa, esant arba 20 μM zVAD.fmk neturint (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6; KOPN-8; 11: 1 μM BV6; Reh: 300 nM BV6). Ląstelių mirtis buvo nustatyta atliekant FSC / SSC analizę ir srauto citometriją. Parodytas bent trijų bandymų, padarytų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05; NS, nereikšminga. ( b ) RIP3, MLKL ir kaspazės-8 baltymų lygis buvo įvertintas atliekant Western blot analizę, β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė, žvaigždutė rodo netikslią juostą. c ) Ląstelės 18 valandų (Tanoue) arba 12 h (Jurkat) buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir 200 μM Dexa, esant arba neturint 20 μM zVAD. fmk. Tanoue ląstelių gydymas HDAC inhibitoriumi JNJ-26485815 buvo teigiama kontrolė (PC). Ląstelių mirtis buvo nustatyta dažant aneksiną-V / PI ir parodytos aneksino-V ir (arba) PI teigiamos arba neigiamos ląstelės (A, aneksinas-V; P, PI). Parodyti bent trijų bandymų, padarytų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD. ( d ) Ląstelės 24 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, esant arba neturint 20 μM zVAD.fmk. Apoptozė buvo nustatyta kiekybiškai nustatant PI dažytų branduolių DNR suskaidymą, naudojant srauto citometriją. Parodytas bent trijų bandymų, padarytų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05

Visas dydis

Norėdami įvertinti apoptozinę ir neapoptozinę ląstelių mirtį, kartu stebėjome fosfatidilserino ekspoziciją plazmos membranoje, naudodami „Annexin-V“, kartu dažydami propidium jodidą (PI). Tanoue ląstelėse BV6 / Dexa daugiausia padidino dvigubai teigiamų aneksino-V / PI ląstelių kiekį net nesant zVAD.fmk (1c paveikslas), rodantis, kad šis derinys sukelia neapoptozinę ląstelių mirtį, jei nėra zVAD .fmk, kas atitinka kaspazės-8 ekspresijos stoką Tanoue ląstelėse (1b paveikslas). Gydymas histono deacetilazės (HDAC) inhibitoriumi JNJ-26485815 buvo naudojamas kaip teigiama apoptozės ląstelių mirties kontrolė (1c pav.). Jurkat ląstelėse pridėjus zVAD.fmk prie BV6 / Dexa apdorotų ląstelių, padidėjo dvigubai teigiamų aneksino-V / PI ląstelių procentas, kartu sumažėjus aneksino-V vienkartinių teigiamų ląstelių (1c paveikslas). Tai rodo, kad, esant zVAD.fmk, ląstelių mirtis nuo apoptozinių tampa nekrotitinėmis. Kontroliniai eksperimentai patvirtino, kad BV6 / Dexa gydymas kartu su BVP / Dexa yra labai mažas arba jo visai nėra (1B paveikslas); stimuliacija TNF α ir BV6 buvo teigiama kontrolė. Toliau mes analizavome DNR suskaidymą kaip kitą tipišką apoptozės ląstelių mirties požymį. BV6 / Dexa apdorojimas lėmė nežymų DNR suskaidymo padidėjimą, kai Tanoue ląstelėse nebuvo zVAD.fmk (1d paveikslas, 1C papildomas paveikslas), pabrėžiant, kad šios ląstelės miršta neapoptotiškai, nesant zVAD.fmk, kadangi „zVAD.fmk“ panaikino BV6 / Dexa sukeltą DNR suskaidymą Jurkat ląstelėse (1d paveikslas, papildomas 1D paveikslas).

Iš viso šis eksperimentų rinkinys rodo, kad BV6 / Dexa bendrasis gydymas sukelia ne apoptozinę ląstelių mirtį, kai slopinamos kaspazės (ty dėl to, kad nėra kaspazės-8 ekspresijos ar zVAD.fmk). Kaip genetinį modelį parinkome kaspazės-8 trūkumą turinčias Tanoue ląsteles, o zVAD.fmk-apdorotas Jurkat ląsteles kaip farmakologinį modelį vėlesniems tyrimams, siekiant ištirti BV6 / Dexa sukeltų nepoptozinių ląstelių mirties molekulinius mechanizmus.

BV6 / Dexa sukeltas ląstelių žūtis slopinant kaspazę priklauso nuo RIP3 ir MLKL

Anksčiau buvo pranešta, kad kaspazės slopinimas sukelia perėjimą nuo apoptozinių prie nekrotinių ląstelių mirties. Kadangi RIP1 / RIP3 nekrozomos kompleksas yra centrinė signalizacijos platforma nekroptozėje, mes ištyrėme, ar BV6 / Dexa derinys skatina indikaciją nekrozomoje, kai slopinama kaspazė. Iš tiesų, nustatant padidėjusį BV6 / Dexa gydymą, mes nustatėme padidėjusią RIP1 ir RIP3 sąveiką (2a paveikslas), tuo tarpu vieni BV6 ar Dexa nesugebėjo sukelti nekrozų susidarymo (papildomas 2A paveikslas). Norėdami nustatyti, ar visos ląstelės miršta per nekroptozę, mes slopinome pagrindinius nekroptozės kelio elementus. Svarbu tai, kad genetinis RIP3 arba MLKL nutildymas, naudojant dvi nepriklausomas siRNR sekas, žymiai apsaugojo VISAS ląsteles nuo BV6 / Dexa sukeltos ląstelių mirties (2b – e pav.). Panašiai, farmakologinis RIP3 slopinimas dabrafenibu arba MLKL necrosulfonamide (NSA) reikšmingai sumažino BV6 / Dexa sukeltą ląstelių mirtį (papildomi 2B ir C paveikslai). Norėdami patvirtinti RIP3 ir MLKL kaip kritinius BV6 / Dexa sukeltų ląstelių mirties tarpininkus, mes taip pat naudojome RIP3 arba MLKL nokautinius MEF. Remiantis mūsų duomenimis, gautais iš visų ląstelių, BV6 / Dexa sukeltų ląstelių žūtis esant zVAD.fmk reikšmingai sumažėjo esant RIP3 ar MLKL trūkumui turinčiuose MEF (2f – i pav.). Apsauginis poveikis esant RIP3 arba MLKL trūkumui turinčiuose MEF buvo panašus į BV6 / Dexa / zVAD.fmk ir BV6 / TNF α /zVAD.fmk tarpininkaujamą ląstelių mirtį, kuri buvo naudojama kaip gerai apibūdinamas nekroptotinis dirgiklis (papildomi 2D ir 2 paveikslai). E). Be to, BV6 / Dexa gydymas sukėlė padidėjusį MLKL fosforilinimą, kai buvo užblokuota kaspazės aktyvacija (papildomas 2F paveikslas). Iš viso šis eksperimentų rinkinys patvirtina, kad BV6 / Dexa bendras gydymas sukelia nekroptozinių ląstelių mirtį, kai užblokuojama kaspazės aktyvacija.

Image

Image

BV6 / Dexa sukeltas ląstelių žūtis slopinant kaspazę priklauso nuo RIP3 ir MLKL. ( a ) Ląstelės 6 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM ; Jurkat: 5 μM ), 200 μM Dexa ir 20 μM zVAD.fmk. RIP3 imuninis nusėdimas buvo atliekamas naudojant anti-RIP3 antikūnus, o nurodytų baltymų aptikimas buvo atliktas Western blot būdu. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( b - e ) VISOS ląstelės buvo laikinai transfekuotos dviem skirtingais siRNR, nukreipiančiais į RIP3 ( b ir c ) arba MLKL ( d ir e ) arba kontrolinę siRNR. RIP3 ( b ) arba MLKL ( d ) baltymų ekspresija buvo tiriama atliekant Western blot analizę, β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Ląstelės 24 valandas buvo gydomos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk ( c ir e ). Ląstelių mirtis buvo nustatyta atliekant FSC / SSC analizę ir srauto citometriją. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; *, P <0, 05. ( f ir g ) RIP3 - / - arba MLKL - / - nokautas MEF buvo įvertintas RIP3 ( f ) arba MLKL ( g ) baltymų lygiu atlikus vakarinį blotinimą, β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. ( h ir i ) RIP3 - / - ( h ) arba MLKL - / - ( i ) MEF buvo 24 valandas gydomi 5 μM BV6 ir (arba) 200 μM Dexa, esant 20 μM zVAD.fmk ir ląstelių mirtis buvo nustatyta kiekybiškai įvertinant PI teigiamas ląsteles, naudojant ImageXpress Micro XLS sistemą. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05

Visas dydis

Mirties receptorių ligadai yra nepakeičiami BV6 / Dexa sukeltai nekroptozei

Kadangi autokrininiai / parakrininiai signalai per mirties receptorius ir jų ligandai buvo įtraukti į Smac mimetikos sukeltą nekroptozę, 24 mes ištyrėme mirties receptorių ligandų poreikį, panaudodami antagonistinius antikūnus, kad būtų užkirstas kelias ligando ir receptoriaus sąveikai. Tačiau TNF α blokuojantis antikūnas Enbrel nesugebėjo apsaugoti ląstelių nuo BV6 / Dexa sukeltos ląstelių mirties, tuo tarpu Enbrel slopino TNF α / BV6 sukeltą ląstelių mirtį, kuri buvo naudojama kaip teigiama kontrolė (papildomi 3A ir B paveikslai). Panašiai, su naviko nekrozės veiksniu susijęs apoptozę sukeliantis ligandas (TRAIL) - arba CD95 ligandą blokuojantys antikūnai neišgelbėjo ląstelių nuo BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės, nors jie užkirto kelią TRAIL arba CD95 ligandų sukeltam ląstelių mirimui (papildomi paveikslai) 3C – F). Šie rezultatai rodo, kad BV6 / Dexa sukelta nekroptozė įvyksta nepriklausomai nuo mirties receptorių ligandų.

Bendras BV6 / Dexa gydymas skatina mitochondrijų pasipiktinimą prieš ląstelių mirtį

Kadangi mes nustatėme, kad mirties receptorių ligadai yra nereikalingi, tada paklausėme, ar mitochondrijos įvykiai prisideda prie BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės. Norėdami išspręsti šį klausimą, mes lygiagrečiai stebėjome ląstelių mirties kinetiką ir mitochondrijų funkcijų pokyčius. Įdomu tai, kad gerokai prieš maždaug 8–12 h prasidėjusią ląstelių mirtį (3a pav.), Gydymas BV6 / Dexa žymiai padidino ląstelių procentą, kai hiperpolarizuota MMP labai ankstyvaisiais laiko momentais, iki 3 h (3b pav.), po to labai sumažėjo MMP (3c pav.). Taip pat mes pastebėjome reikšmingą ROS produkcijos padidėjimą gyvybingose ​​ląstelėse, kol jie nepasiduoda ląstelių mirčiai, naudodami fluorescencinius dažus CellROX, kurie pirmiausia aptinka superoksido radikalus (3d pav.). Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant „MitoSOX“ - fluorescencinį zondą, kuris selektyviai nustato mitochondrijų superoksidą 25 (3e pav.). Be to, gydymas BV6 / Dexa iš esmės slopino mitochondrijų kvėpavimą gyvybingose ​​ląstelėse, kurios nereagavo į sudėtingą V inhibitoriaus oligomiciną, tokiu būdu nurodydamas deguonies sunaudojimo procentą, kuris naudojamas ATP gamybai, ir nei atjungiklio FCCP, kuris atskleidžia maksimalų ląstelių kvėpavimo pajėgumą (pav. 3f). Iš viso šis eksperimentų rinkinys rodo, kad gydymas BV6 / Dexa nekrottozės metu prieš ląstelių žūtį turi mitochondrijų funkcijas.

Image

Image

Bendras BV6 / Dexa gydymas skatina mitochondrijų pasipiktinimą prieš ląstelių mirtį. ( a ) Ląstelės nurodytais laiko momentais buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. Ląstelių mirtis buvo nustatyta atliekant FSC / SSC analizę ir srauto citometriją. Parodytas trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD. ( b ir c ) Ląstelės nurodytais laiko momentais buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. MMP buvo įvertintas TMRM dažymo ir srauto citometrijos metodais. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05; ** P <0, 01. ( d ir e ) Ląstelės buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. ROS susidarymas buvo nustatytas dažant CellROX po nurodytų laiko taškų ( d ) arba MitoSOX dažyme po 4 h ( e ) ir srauto citometrijoje. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05. ( f ) Ląstelės buvo 6 valandas apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. Kvėpavimas buvo nustatytas deguonies matuoklio sistema (bazinis kvėpavimas ir kvėpavimas pridedant nurodytas oligomicino arba FCCP koncentracijas). Parodytas trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ir SD

Visas dydis

BV6 / Dexa sukeltas MMP ir Bak aktyvumo praradimas prisideda prie ląstelių mirties kinetikos

Kadangi Baxas ir Bakas yra žinomi kaip kritiniai mitochondrijų įvykių reguliatoriai ląstelių mirties metu, 26 mes toliau tyrėme, ar jie suaktyvėja BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu. Kadangi Tanoue ir Jurkat ląstelės ekspresuoja ne visai arba tik nedidelį Bax kiekį (papildomas 4A paveikslas), mes sutelkėme savo tyrimus į Bak. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad Dexa ir BV6 veikė kartu, skatindami Bak aktyvaciją abiejose VISIose ląstelių linijose (4a pav.). Pro- ir antiapoptotinių Bcl-2 baltymų stebėjimas parodė, kad BV6 / Dexa sukeltas Bak aktyvinimas nebuvo susijęs su pakitusiais Bcl-2, Bcl-x L, Mcl-1 ar Bim ekspresijos lygiais (papildomas 4B paveikslas). Norėdami patikrinti Bak funkcinį tinkamumą, mes jį nutildėme naudodami dvi nepriklausomas siRNR sekas. Svarbu tai, kad Bako numušimas reikšmingai sumažino BV6 / Dexa tarpininkaujamą nekroptozę, kuri buvo prarasta po ilgo gydymo (4b ir c paveikslai, papildomas 4C paveikslas). Be to, „Bak“ nutildymas žymiai sumažino BV6 / Dexa stimuliuojamą MMP praradimą (4d pav.), Tuo tarpu jis neapsaugojo nuo ROS susidarymo (4e paveikslas). Norėdami ištirti, ar Bak priklausomybė būdinga VISI, išplėtėme savo tyrimą, įtraukdami papildomus vėžio ląstelių tipus. Bak numušimas žymiai sumažino BV6 / Dexa medijuojamų ląstelių mirtį ir ūminės mieloidinės leukemijos bei storosios žarnos karcinomos ląstelėse (papildomi 4D ir E paveikslai). Šie radiniai rodo, kad Bakas prisideda prie BV6 / Dexa sukeltos MMP praradimo kinetikos ir nekroptozinių ląstelių mirties.

Image

BV6 / Dexa sukeltas MMP praradimas ir ląstelių žūtis priklauso nuo Bak. ( a ) Ląstelės 6 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. Bak aktyvacija buvo nustatyta IP, naudojant aktyvų konformacijai specifinį antikūną. Balto baltymo ekspresija buvo analizuojama atliekant Western blot analizę. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( b ) VISOS ląstelės buvo laikinai transfekuotos dviem skirtingais siRNR, nukreipiančiais į Bak, arba kontrolinę siRNR. Balto baltymo ekspresija buvo analizuojama atliekant Western blot analizę. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( c ) Ląstelės 24 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. Ląstelių mirtis buvo nustatyta atliekant FSC / SSC analizę ir srauto citometriją. Parodyti bent trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05. ( d ) Ląstelės 6 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. MMP praradimas buvo nustatytas TMRM dažymo ir srauto citometrijos metodu. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05. ( e ) Ląstelės 4 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, Jurkat ląstelės papildomai buvo apdorotos 20 μM zVAD.fmk. ROS susidarymas buvo nustatytas naudojant CellROX dažymą ir srauto citometriją. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; NS, nereikšminga

Visas dydis

ROS gamyba reikalinga BV6 / Dexa sukeltai Bak aktyvacijai, MMP praradimui ir ląstelių mirčiai

Mūsų išvados, rodančios, kad BV6 / Dexa sukeltos ROS produkcija nepakinta Bak knockdown ląstelėse (4e pav.) Rodo, kad Bak yra nepakeičiamas ROS gamybai. Norėdami ištirti, ar reikalinga ROS gamyba Bak aktyvinimui, stebėjome Bak aktyvaciją, kai yra ROS valikliai, naudojant MnTBAP, ląstelėms pralaidų superoksido dismutazės (SOD) mimetiką ir peroksinitritų kaupiklį, 27 ar α- tokoferolį, vitamino E darinį. Įdomu tai, kad pridėjus MnTBAP arba α- tokoferolio, kurie abu žymiai sumažino ROS gamybą (papildomas 5A paveikslas), susilpnėjo BV6 / Dexa stimuliuojama Bak aktyvacija (5a paveikslas). Tai rodo, kad gydant BV6 / Dexa, Bak aktyvinimas vyksta priklausomai nuo ROS. Todėl mes paklausėme, ar reaguojant į BV6 / Dexa, Bakas daro oksidacines modifikacijas. Norėdami išspręsti šį klausimą, stebėjome oksidacines Bak baltymo tiolio modifikacijas, naudodamiesi BIAM jungiklio tyrimu. Įdomu tai, kad BV6 / Dexa gydymas žymiai padidino oksiduoto Bak kiekį, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis (5b paveikslas). Gydymas auranofinu, tioredoksino reduktazės inhibitoriumi, buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė oksidacinio streso stimuliuojamo tiolio modifikavimui (5b pav.). Peroksiredoksinas 3 (Prx3), kaip padidėjusios ROS produkcijos žymeklis, parodė didesnį tiolio oksidacijos lygį abiem atvejais (5b pav.). Be to, kad susilpnėja Bak aktyvinimas, MnTBAP arba α- tokoferolis reikšmingai sumažino BV6 / Dexa sukeltą MMP praradimą ir ląstelių žūtį (5c ir d paveikslai). Šis eksperimentų rinkinys rodo, kad ROS gamyba reikalinga Bak aktyvinimui, MMP praradimui ir ląstelių mirčiai BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu.

Image

ROS gamyba reikalinga BV6 / Dexa sukeltai Bak aktyvacijai, MMP praradimui ir ląstelių mirčiai. a ) Ląstelės 6 valandas buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir 200 μM Dexa, esant arba neturint 100 μM MnTBAP arba 100 μM α- tokoferolio, Jurkat. ląstelės buvo papildomai apdorotos 20 μM zVAD.fmk. Bak aktyvacija buvo nustatyta imunoprecipitacija, naudojant aktyvų konformacijai specifinį antikūną. Balto baltymo ekspresija buvo analizuojama atliekant Western blot analizę. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( b ) Tanoue ląstelės 4 valandas buvo gydomos 3 μM BV6 ir 200 μM Dexa, 40 min. gydymas 2 μM auranofinu buvo teigiama ROS sukelto oksidacinio modifikavimo kontrolė. Bak oksidaciniai tiolio modifikacijos (oksiduoti) buvo analizuojami BIAM jungiklio metodu. Oksiduotas Prx3 tarnavo kaip oksidacinio streso žymeklis. Bendras Bak ir Prx3 baltymų kiekis gydymo metu nepakito. c ) Ląstelės 24 val. buvo apdorotos BV6 (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6) ir (arba) 200 μM Dexa, esant arba neturint 100 μM MnTBAP arba 100 μM α - tokoferolio., Jurkat ląstelės buvo papildomai apdorotos 20 μM zVAD.fmk. Ląstelių mirtis buvo nustatyta atliekant FSC / SSC analizę ir srauto citometriją. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05. ( d ) Ląstelės 8 valandas buvo apdorotos BV6 ir 200 μM Dexa tirpalu (Tanoue: 3 μM BV6; Jurkat: 5 μM BV6), esant 100 μM MnTBAP arba 100 μ M α- tokoferolio, Jurkat, ar jo nėra. ląstelės buvo papildomai apdorotos 20 μM zVAD.fmk. MMP praradimas buvo įvertintas TMRM dažymo ir srauto citometrijos metodais. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05

Visas dydis

RIP3 ir MLKL reikalingi Bak aktyvacijai ir mitochondrijų pasipiktinimui BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu

Toliau mes ištyrėme, ar mitochondrijų įvykiai BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu yra susiję su pagrindiniais nekroptiniais signalizacijos mechanizmais, tokiais kaip RIP3 ir MLKL. Svarbu tai, kad RIP3 arba MLKL sunaikinimas užkirto kelią BV6 / Dexa stimuliuojamo Bak aktyvacijai apoptozei atspariose VISose ląstelėse (6a pav.). Panašiai RIP3 arba MLKL trūkumas slopino Bax aktyvaciją gydant BV6 / Dexa MEF (6b pav.). Be to, RIP3 ar MLKL numušimas ar ištrynimas apsaugojo VISAS ląsteles ir MEF nuo BV6 / Dexa sukelto MMP praradimo, ROS susidarymo ir mitochondrijų kvėpavimo sutrikimo (6c – h paveikslai, papildomas 6 paveikslas). Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad RIP3 ir MLKL reikalingi Bak aktyvacijai ir mitochondrijų pasipiktinimui BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu.

Image

Image

RIP3 ir MLKL reikalingi Bak aktyvacijai ir mitochondrijų pasipiktinimui BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu. Tanoue ląstelės buvo laikinai transfekuotos dviem skirtingais siRNR, nukreipiančiais į RIP3, MLKL arba kontrolinę siRNR, ir 6 valandas buvo apdorotos 3 μM BV6 ir 200 μM Dexa. MEF buvo valomos 12 valandų 5 μM BV6 ir 200 μM Dexa, esant 20 μM zVAD.fmk. ( a ir b ) Bak ( a ) arba Bax ( b ) aktyvacija buvo nustatyta imunoprecipitacija, naudojant aktyvius konformacijai specifinius antikūnus. Bak, Bax, RIP3 ir MLKL baltymų ekspresija buvo tiriama atliekant Western blot analizę. β- aktinas tarnavo kaip įkrovos kontrolė. ( c ir d ) MMP praradimas buvo nustatytas TMRM dažymo ir srauto citometrijos ( c ) arba „ImageXpress Micro XLS“ sistemos ( d ) pagalba. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05. ( e ir f ) ROS susidarymas buvo nustatytas naudojant CellROX dažymą ir srauto citometriją ( e ) arba „ImageXpress Micro XLS“ sistemą ( f ). Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05. ( g ir h ) Kvėpavimas buvo nustatytas naudojant „Oxygraph“ sistemą. Parodyti trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ir SD; * P <0, 05

Visas dydis

Diskusija

Kadangi nekroptozė tik neseniai buvo nustatyta kaip užprogramuota ląstelių žūties forma, pagrindiniai signalizacijos keliai dar nėra iki galo išaiškinti. Šiame tyrime mes sužinojome, kad, nepriklausomai nuo mirties receptorių ligando signalizacijos, mitochondrijų pasipiktinimai turi lemiamą reikšmę nekroptozės modelyje, kurį sukelia bendras gydymas Smac mimetiku BV6 ir gliukokortikoidu Dexa - deriniu, kuris dar nebuvo aprašytas anksčiau, kad sukeltų. nekroptozė. Mes nustatėme, kad BV6 / Dexa sukelia nekrotinę ląstelių mirtį, kai kaspazės aktyvacija yra blokuojama dėl kaspazės-8 ekspresijos stokos arba dėl farmakologinio slopinimo, kurį sukelia zVAD.fmk, nes genetinis RIP3 ar MLKL slopinimas ar farmakologinis slopinimas apsaugo VISAS ląsteles nuo BV6. / Deksa sukelta nekroptozė. Visuotinę šio nekrotinio modelio svarbą pabrėžia tai, kad BV6 / Dexa / zVAD.fmk sukeltas nekroptozė panašiai sutrinka RIP3 ar MLKL nokautuotuose MEF.

Mitochondrijos sustiprina BV6 / Dexa sukeltą nekroptozę

Keletas eksperimentinių įrodymų linijų pabrėžia svarbų mitochondrijų disfunkcijų vaidmenį BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu, nepriklausomai nuo signalizacijos per mirties receptorių ligandus. Pirma, mūsų kinetiniai tyrimai atskleidė, kad gerokai anksčiau nei ląstelės miršta dėl ląstelių mirties. BV6 / Dexa gydymas sukelia mitochondrijų disfunkcijas, įskaitant MMP hiperpolarizaciją, po kurios seka MMP praradimas, ROS gamyba, Bak aktyvacija ir mitochondrijų kvėpavimo sutrikimas, parodant, kad šie mitochondriniai įvykiai prisideda prie nekrozinės ląstelių mirties indukcija.

Antra, mes nustatėme, kad Bakas yra pagrindinis reguliatorius, kuris aktyvuojamas BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu ir reikalingas nekroptozinių ląstelių mirties kinetikai, nes Bako numušimas žymiai atitolina BV6 / Dexa sukeltų ląstelių mirties kinetiką. Bak aktyvinimas greičiausiai įvyks paskui ROS produkciją, nes ROS kaupikliai slopina BV6 / Dexa stimuliuojamą Bak aktyvaciją, tuo tarpu Bak duslinimas neapsaugo ląstelių nuo BV6 / Dexa stimuliuojamos ROS produkcijos. Be to, mes nustatėme oksidacines Bak baltymo tiolio modifikacijas apdorojant BV6 / Dexa, pabrėždami, kad ROS gamyba prisideda prie Bak aktyvacijos. ROS gamyba ir Bak aktyvinimas greičiausiai skatina MMP išsisklaidymą, nes Bak numušimas ar ROS šalintuvai sumažina MMP praradimą BV6 / Dexa.

Trečia, BV6 / Dexa stimuliuojama ROS generacija skatina nekrozinį signalizavimą ir ląstelių žūtį, nes ROS neutralizavimas skirtingų ROS kaupiklių dėka sumažina Bak aktyvaciją, MMP praradimą ir ląstelių mirtį.

Ketvirta, visi šie mitochondrijų pakitimai vyksta nuo RIP3 ir MLKL priklausomai, nes genetinis RIP3 ar MLKL sunaikinimas visose ląstelėse arba RIP3 ar MLKL išmetimas MEF sumažina BV6 / Dexa tarpininkaujamą ROS gamybą, Bak aktyvaciją, MMP praradimą. ir mitochondrijų kvėpavimo sutrikimas.

Penkta, mitochondrijų pasipiktinimas įvyksta nepriklausomai nuo mirties receptoriaus ligando signalizacijos, nes antagonistiniai antikūnai prieš mirties receptorių ligandus TNF α , TRAIL ar CD95 ligandą neišgelbėja BV6 / Dexa sukeltos ląstelių mirties. Visi šie įrodymai rodo, kad mitochondrijų pakitimai yra susieti su pagrindiniais nekrozinės signalizacijos komponentais RIP3 ir MLKL BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu ir gali būti naudojami kaip amplifikacijos žingsnis.

Bak kaip kritinis BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės reguliatorius

Nors žinomi tokie Bcl-2 šeimos baltymai kaip mirtis, tokie kaip Bax ir Bak, kurie reguliuoja apochtozės mitochondrijų kelią, 26 jų vaidmuo nekroptozės metu dar nėra pakankamai aiškus. Pranešama, kad tiek Bax, tiek Bak, arba, alternatyviai, tik Bak eliminacija apsaugo ląsteles nuo uždegimo sukeltos nekroptozės, kurią sukelia TNF α / cikloheksimidas/zVAD.fmk. 28, 29, 30 Palyginimui, šiame tyrime parodyta, kad BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės pasireiškia nepriklausomai nuo TNF α ar kitų mirties receptorių ligandų. Tai rodo, kad daugiadomenis Bcl-2 šeimos baltymas Bax ir Bak gali turėti bendrą vaidmenį reguliuojant nekroptozę, reaguojant į įvairius dirgiklius. Nekrotinių ląstelių mirties metu nustatyta, kad Bax ir Bak, kaip išorinės membranos komponentai, skatina mitochondrijų patinimą ir plyšimą atidarius mitochondrijų pralaidumo pereinamąsias poras (MPTP), palengvindami išorinės membranos pralaidumą. 31 MPTP, kanalo, esančio vidinėje mitochondrijų membranoje, sudarytoje iš ciklofilino D, ANT, VDAC, atidarymas sukelia MMP išsisklaidymą, mitochondrijų kvėpavimo sutrikimą, tolesnį ROS susidarymą ir galiausiai mitochondrijų patinimą ir plyšimą. 32

Nors šiame tyrime mes nustatėme, kad Bak yra pagrindinis BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės reguliatorius, Bax gali turėti įtakos kitoms ląstelių rūšims, nes VISOS ląstelių linijos, kurias mes panaudojome, turi labai mažą Bax baltymo kiekį. Pvz., Nustatyta, kad stabilus per didelę oligomerizaciją sukėlusios Bax mutantų formos ekspresija slopina TNF α /zVAD.fmk sukeltą nekrozę MEF. 30 Taip pat gali dalyvauti kiti mitochondriniai baltymai, tokie kaip ciklofilinas D, nes įrodyta, kad MEF, kuriems trūksta ciklofilino D, yra atsparūs TNF α sukeltai nekroptozei. 2, 30

ROS prisideda prie nekrozinės signalizacijos ir ląstelių mirties

ROS generavimas buvo susijęs su indėliu į nekroptozę, nors ROS šaltinis (-iai) ir vaidmenys iš esmės nėra žinomi. 12, 13 duomenys rodo, kad ROS gamyba BV6 / Dexa sukeltos nekroptozės metu bent iš dalies gali pasireikšti mitochondrijose, nes ROS gamybą nustato MitoSOX, mitochondrijų superoksido selektyvusis zondas, ir kadangi ROS šalikliai, galintys neutralizuoti mitochondrijas ROS suteikia apsaugą nuo BV6 / Dexa sukeltų ląstelių mirties. Oksidacinis stresas buvo susijęs su daugiadomėdžių Bcl-2 baltymų, tokių kaip Bax, dimerizacijos skatinimu ir jo perkėlimu į mitochondrijas. 33 Remiantis nuostata, kad ROS kaupimasis prisideda prie Bak aktyvacijos, šiame tyrime mes nustatėme tiolo Bak baltymo modifikacijas prasidėjus BV6 / Dexa tarpininkaujamai nekroptozei ir parodėme, kad Bak aktyvacija vyksta nuo ROS. Be to, siekiant palengvinti MPTP atidarymą buvo numanoma pernelyg didelė ROS generacija, dėl kurios MMP išsisklaido ir galiausiai sutrinka mitochondrijų funkcijos. 32 Nuosekliai mes parodome šiame tyrime, kad ROS naikikliai gelbėja ląsteles nuo BV6 / Dexa sukeltos MMP kritimo. Anksčiau mes parodėme, kad ROS skatina RIP1 / RIP3 nekrozomos stabilizaciją BV6 / TNF α sukeltos nekroptozės metu, tokiu būdu inicijuodama teigiamo grįžtamojo ryšio amplifikacijos kilpą. 34 ROS generavimo reikalavimas dėl nekroptozinių ląstelių žūties buvo įrodytas ir kituose prototipiniuose nekroptozės modeliuose, ty TNF α tarpininkaujant nekroptozei L929 ląstelėse ar monocituose. 35, 36

Nors šie tyrimai pabrėžia, kad ROS prisideda prie įvairių dirgiklių sukeltos nekroptozės, kiti tyrimai patvirtino, kad mitochondrijų ROS yra būtinos nekrozės ląstelių mirčiai. Pavyzdžiui, buvo pranešta, kad Parkino sukeltas mitochondrijų išsekimas apsaugo nuo TNF α sukeltos ROS susidarymo, bet ne dėl nekrotitinės ląstelių mirties. 37 Iš viso šie duomenys rodo, kad ROS ir mitochondrijų poreikis nekroptozei gali priklausyti nuo ląstelių konteksto.

Mitochondrijų disfunkcijos atsirado pasroviui nuo RIP3 ir MLKL

Mūsų tyrimas rodo, kad mitochondrijų disfunkcijos gali pasitarnauti kaip amplifikacijos žingsnis BV6 / Dexa tarpininkaujant nekroptozei, susietai su pagrindine nekroptozės signalizacijos įranga, nes įvyko BV6 / Dexa stimuliuojama ROS gamyba, Bak aktyvacija, MMP praradimas ir mitochondrijų kvėpavimo sutrikimas. priklausomai nuo RIP3 ir MLKL. Anksčiau buvo pranešta, kad ROS susidarymas nekroptozės metu priklauso nuo RIP3 3, 4, o RIP3 sąveikauja su glutamato dehidrogenaze 1, mitochondrijų matricos fermentu. 4 Taip pat buvo aprašyta, kad RIP1 ir RIP3 lokalizuojasi mitochondrijose, sukeliant nekroptozę 30, 38, 39, ir siūloma, kad nekrozų perkėlimas į mitochondrijomis susijusias membranas būtų būtinas norint signalizuoti apie nekroptozę. 40 Tačiau mechanistinės detalės, kaip RIP kinazės ir MLKL gali paveikti mitochondrijų funkcijas nekroptozės metu, dar nėra išspręstos, todėl dar liko neišspręstas klausimas, ar nekroptozės metu jos tiesiogiai ar netiesiogiai kontroliuoja mitochondrijų funkcijas.

Apibendrinant, mūsų išvados sustiprina dabartinį mitochondrijų vaidmens nekroptozėje supratimą, parodydamos, kad mitochondrijos įvykiai yra sustiprinantis žingsnis. Be to, mūsų tyrimas turi reikšmės kuriant naujus gydymo metodus, siekiant įveikti VISŲ atsparumą apoptozei, sukeliant nekroptozę. Neseniai sužinojome, kad Smac mimetikas BV6 jautrus visoms ląstelėms in vitro ir in vivo dėl gliukokortikoidų sukeltos apoptozės. 23 Čia parodome, kad gydymas BV6 / Dexa kartu sukelia nekroptozę visose ląstelių linijose, kurios ekspresuoja RIP3 baltymą. Kadangi pranešta, kad dauguma ląstelių, gautų dėl piktybinių navikų, įskaitant ūminę leukemiją, užima RIP3, 41 ūminė leukemija gali būti jautri terapinei nekroptozės indukcijai. Taigi, Smac mimetikai ir gliukokortikoidai gali pasiūlyti naują metodą, kaip sukelti nekroptozę, kaip alternatyvią užprogramuotų ląstelių mirties VIS.

Medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra ir chemikalai

VISOS ląstelių linijos buvo gautos iš DSMZ (Braunšveigas, Vokietija) ir užaugintos RPMI 1640 terpėje (Life Technologies, Inc., Eggenstein, Vokietija), įamžinti MEF buvo laikomi DMEM GlutaMAX-I terpėje (Life Technologies, Inc.). Terpė buvo papildyta 10% vaisiaus veršelio serumu; Biochrom, Berlynas, Vokietija), 1 mM piruvato (Invitrogen, Karlsruhe, Vokietija), 1% penicilino / streptomicino ir 25 mM HEPES (Invitrogen). „Smac“ mimetiką BV6, kuris neutralizuoja XIAP, cIAP1 ir cIAP2, 20, maloniai pateikė „Genentech, Inc.“ (Pietų San Franciskas, Kalifornija, JAV). Kaspazės inhibitorius zVAD.fmk buvo gautas iš Bachem (Heidelbergas, Vokietija), Enbrel iš Pfizer (Berlynas, Vokietija), TNF α iš Biomol (Hamburgas, Vokietija), dabrafenibas ir JNJ-26485815 iš Selleckchem (Hiustonas, TX, JAV), NSA iš Toronto Research Chemicals Inc. (Šiaurės Jorkas, CA), anti-CD95 ligando antikūnas iš BD Pharmingen (Heidelbergas, Vokietija), anti-TRAIL (mAb 2E5) iš Enzo Life Sciences (Lörrach, Vokietija). CD95 ligandą maloniai pateikė „Apoxis“ (Lozanoje, Šveicarijoje). Chemikalus įsigijo Sigma-Aldrich (Steinheim, Vokietija) arba Carl Roth (Karlsruhe, Vokietija), jei nenurodyta kitaip.

Ląstelių mirties nustatymas

Ląstelių žūtis buvo įvertinta atliekant priekinės / šoninės sklaidos (FSC / SSC) analizę ir srauto citometriją (FACS Canto II; BD Biosciences, Heidelbergas, Vokietija) arba išanalizavus plazmos membranos pralaidumą PI dažymu, kaip aprašyta anksčiau, naudojant srauto citometriją 42 arba ImageXpress Micro XLS. „Widefield“ didelio turinio analizės sistema (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV). Apoptozinė ir nekrozinė ląstelių mirtis buvo diferencijuota naudojant aneksiną-V / PI dažymą („Roche Diagnostics“, Manheimas, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas.

BaMP ir Bako MMP, ROS susidarymo, mitochondrijų kvėpavimo ir aktyvavimo nustatymas

Bax ir Bak aktyvinimas buvo nustatytas imunoprecipitacija (IP), kaip aprašyta anksčiau. 43 Trumpai tariant, ląstelės buvo lizuotos CHAPS lizės buferiu (10 nmol / l HEPES, pH 7, 4; 150 nmol / l NaCl; 1% CHAPS). Nuo penkių šimtų iki 1000 μg baltymų buvo imuninis nusėdimas ir inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje su 2 μg / ml pelės anti-Bak antikūnais (Ab-1; Calbiochem) arba anti-Bax antikūnais (6A7, Sigma-Aldrich) ir 10 μl. visos pelės IgG Dynabeads (Dako, Hamburgas, Vokietija), plaunamas CHAPS lizės buferiu ir analizuojamas Western blot analize naudojant triušio anti-Bak antikūną arba anti-Bax antikūną. To determine MMP, cells were incubated with TMRM (50 nM; Invitrogen) for 30 min at 37 °C and immediately analyzed by flow cytometry or ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System. To analyze ROS production, cells were incubated at 37 °C for 30 min with 1 μ M CellROX (Invitrogen), which primarily detects superoxide radicals according to the manufacturer's instructions, or for 10 min with 5 μ M MitoSOX (Invitrogen), which detects mitochondrial superoxide, 25 and immediately analyzed by flow cytometry or ImageXpress Micro XLS system. Mitochondrial respiration was measured using the Oxygraph-2k system from Oroboros (Innsbruck, Austria) as described previously. 44

Western blot analizė

Western blot analysis was performed as described previously 45 using the following antibodies: rabbit anti-RIP3 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), rabbit anti-MLKL (GeneTex, Irvine, CA, USA, for human or Sigma-Aldrich for mouse), mouse anti-caspase-8 (Enzo Life Sciences), rabbit anti-Prx3 (Abcam, Cambridge, MA, USA), rabbit anti-Bak (BD Biosciences, rabbit anti-Bax (Millipore, Darmstadt, Germany), mouse anti- β -actin (Sigma-Aldrich) or mouse anti-GAPDH (Biotrend, Cologne, Germany) as loading control and secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Enhanced chemiluminescence was used for detection (Amersham Bioscience, Freiburg, Germany). Alternatively, secondary antibodies labeled with IRDye infrared dyes were used for fluorescence detection (Odyssey Imaging System, LI-COR Bioscience, Bad Homburg, Germany).

Genų nutildymas

Gene silencing by small interfering RNA (siRNA) was performed using Neon Transfection System (Invitrogen) as previously described 34 using 80 nM SilencerSelect siRNAs against RIP3 (#1: s21740, #2: s21741), MLKL (#1: s47087, #2: s47088), Bak (#1 s1880, #2 s1881) or non-targeting control siRNA (no. 4390843). Cells were treated at 48 h after transfection with siRNAs.

BIAM switch assay

After treatment, cells were collected by centrifugation and resuspended in 2 ml medium. Free thiols were blocked by addition of 50 mM N -ethylmaleimide (NEM) as alkylating reagent for 5 min at room temperature in the dark. After washing proteins were precipitated in ice-cold 20% (w/v) TCA, protein pellets were washed first in 10% TCA and finally in 5% TCA. 46 Proteins were resolved in 200 μ l NEM-DB (8 M Urea, 5 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM Tris/HCL, pH 8.5, 25 mM NEM) and incubated at 850 rpm for 1 h at 37 °C in the dark. Proteins were precipitated by ice-cold acetone overnight at −20 °C, collected by centrifugation, washed in acetone, resuspended in 100 μ l DTT-DB (8 M Urea, 5 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM Tris/HCL, pH 8.5, 3 mM DTT) and incubated at 850 rpm for 5 min at 37 °C in the dark followed by addition of 100 μ l BIAM-DB (8 M Urea, 5 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM Tris/HCL, pH 8.5, 10 mg/ml BIAM (EZ-Link Iodoacetyl-PEG2-Biotin, ThermoFisher Scientific)) and incubation at 850 rpm for 1 h at 37 °C in the dark. Proteins were precipitated by ice-cold acetone overnight at −20 °C, collected by centrifugation, washed and resuspended in 100 μ l lysis buffer (5 mM EDTA, 50 mM Tris/HCL pH 8.5, 1% Triton-X-100, 1% SDS) for 30 min on ice. Using 500 μ g protein, affinity purification was performed by agarose streptavidin beads overnight at 4 °C on a wheel. After washing and collection of beads proteins were eluted by sample buffer and analyzed by western blotting.

Statistinė analizė

Statistical significance was assessed by Student's t -Test (two-tailed distribution, two-sample unequal variance).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

VISOS

ūminė limfoblastinė leukemija

CIAP

cellular IAP

Dexa

Dexamethasone

FSC/SSC

forward/side scatter

HDAC

histono deacetilazė

IAP

Inhibitor of Apoptosis

MEF

pelių embrioniniai fibroblastai

MLKL

mixed lineage kinase domain-like

MMP

mitochondrijų membranos potencialas

MPTP

mitochondrijų pralaidumo pereinamosios poros

NEM

N -ethylmaleimide

NF- κ B

Nuclear Factor kappaB

NSA

necrosulfonamide

PI

propidium jodidas

ŽIEDAS

tikrai įdomus naujas genas

RIP

Receptor-Interacting Protein

ROS

reaktyviosios deguonies rūšys

siRNR

maža trukdanti RNR

TNF

naviko nekrozės faktorius

PRIEKABA

tumor-necrosis-factor-related apoptosis-inducing ligand

XIAP

X-linked IAP

Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento ląstelių mirties ir diferenciacijos svetainėje (//www.nature.com/cdd)