Bax nukreipimas į mitochondrijas vyksta per nuo uodegos inkaro ir nuo jo priklausomus mechanizmus ląstelių mirtis ir diferenciacija

Bax nukreipimas į mitochondrijas vyksta per nuo uodegos inkaro ir nuo jo priklausomus mechanizmus ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Anotacija

Bax yra Bcl-2 šeimos narys, kuris kartu su Bak reikalingas išorinės mitochondrijų membranos (OMM) permeabilizacijai. Baksas nuo Bak skiriasi tuo, kad jis daugiausia citozolinis sveikose ląstelėse ir asocijuojasi su OMM tik po apoptozinio signalo. Kaip Baxas bus nukreiptas į OMM, vis dar diskutuojama, atsižvelgiant tiek į C galinio uodegos inkarą, tiek į N galinę išankstinę seką. Dabar galutinai parodome, kad „Bax“ neturi N-terminalo importo sekos, tačiau turi C-terminalo inkarą. Izoliuotas Bax N galas negali nukreipti heterologinio baltymo į OMM, tuo tarpu C galas gali. Be to, jei C galas yra užblokuotas, Bax nesugeba nukreipti į mitochondrijas gavęs apoptozinį stimulą. Zebrinė žuvis Bax, kuriai būdingas didelis aminorūgščių homologiškumas su žinduolių Bax C-gale, bet ne N-gale, gali išgelbėti defektyvų Bax / Bak-deficitinių ląstelių mirties fenotipą. Įdomu tai, kad mes pastebime, kad Bax mutantai, kurie patys negali nukreipti į mitochondrijas ar sukelti apoptozę, yra verbuojami į aktyvuoto laukinio tipo Bax grupes ant apoptozinių ląstelių OMM. Panašu, kad tai Bax aktyvacijos amplifikacija ląstelių mirties metu, nepriklausanti nuo įprasto uodegos inkaro tarpininkavimo.

Pagrindinis

Bcl-2 baltymų šeima yra svarbūs vidinio apoptozės kelio reguliatoriai. 1 Pagrindinė šių baltymų veikimo vieta yra išorinė mitochondrijų membrana (OMM), kur jie reguliuoja faktorių, įskaitant citochromą c, ir antrąjį mitochondrijų kaspazių aktyvatorių (Smac) / Diablo, išsiskyrimą iš tarpląstelinės erdvės į citozolį, inicijuodami kaspazę. aktyvacija. Prox-apoptotiniai Bcl-2 šeimos baltymai „Bax“ ir „Bak“ pasižymi dideliu sekų panašumu ir yra būtini ląstelėms OMM permeabilizuoti. 2 Atsižvelgiant į šį panašumą, stebėtina, kad Baxo ir Bako reglamentai labai skiriasi. Bakas nuolat veikia OMM, tuo tarpu Baxas daugiausia yra neaktyvus sveikų ląstelių citozolio monomeras. 3, 4 Gavęs apoptozinį signalą, Baxas persikelia į mitochondrijas, kur, kaip manoma, oligomerizuojasi į aktyvią transmembraninę porą. 5, 6, 7, 8, 9, 10

Dauguma mitochondrijų baltymų yra nukreipti į vertimą pagal paskirtį. 11 Šis nukreipimas yra sudėtingas procesas, kurio metu kiekvienas baltymas turi adresavimo signalą, kad specialiai pasiektų numatytą mitochondrijų skyrių. Daugelyje baltymų, importuotų į mitochondrijas, yra N-galinė išankstinė seka, kurią atpažįsta bendrosios importo poros (GIP) komponentai, susidedantys iš translokacinės išorinės membranos (TOM) ir translokacinės vidinės membranos (TIM) kompleksų. 11 Jie apima atitinkamai OMM ir vidinę mitochondrijų membraną. N-galinėse išankstinėse sekose yra amfipatinis α- spiralė, tačiau tiksli seka, supanti aminorūgštis ir, ar ji suskaidoma, nustato mitochondrijų skyrių, į kurį pristatomas baltymas.

Kita nukreipimo signalo klasė yra C-terminalo uodegos inkaras. 12 Bendras uodegoje pritvirtintų baltymų bruožas yra vidutiniškai hidrofobinis transmembraninis domenas (TMD), kurį iš abiejų pusių riboja bazinės aminorūgštys. 13, 14 Bcl-2 baltymai Bak, Bcl2, Bcl-X L, Bcl-w ir Mcl-1 turi C kriterijus atitinkančias sekas. 15 „ Bax“ turi hidrofobinę uodegą, kurios pagrindiniame aminorūgštyje yra tik C galas. Nepaisant to, Bax siekia OMM, galbūt siūlydamas kitiems regionams nustatyti jos mitochondrijų lokalizaciją. Neseniai buvo pasiūlyta, kad „Bax C“ galas nėra uodegos inkaras, bet jo N gale yra TOM komplekso taikymo seka. 17, 18, 19, 20, 21, atvirkščiai, kitose ataskaitose teigiama, kad Bax translokacijai apoptozės metu reikalingas C-galinis inkaras. 22, 23, 24 dienomis

Atsižvelgiant į prieštaringus įrodymus dėl N ir C galų vaidmenų Bakso funkcijoje, mes ištyrėme kiekvieno, kaip mitochondrijų taikymo sekos, santykinį indėlį. Mes parodome, kad Bax nukreipimas į mitochondrijas vyksta dviem skirtingais etapais. Pirmasis įvyksta tik per C-terminalo uodegos inkarą ir yra privalomas žingsnis nuo Bax priklausomos apoptozės. OMM permeabilizacijos metu atsiranda antroji „Bax“ pritraukimo į mitochondrijas banga, kuri nepriklauso nuo uodegos inkaro. Šiai antrajai bangai reikalingas aktyvuotas Bax arba Bak, kad būtų OMM, ir tai gali reikšti apoptozinių porų formavimosi sustiprėjimą. Atskiriant šias dvi fazes svarbu suprasti, kaip reguliuojama Bax translokacija.

Rezultatai

Bax C terminalo blokavimas panaikina jo proapoptozinę funkciją, užkertant kelią jo pritraukimui į mitochondrijas.

Daugybė publikacijų pranešė, kad skirtingai nuo kitų daugiadomenių Bcl-2 baltymų, Bax nukreipimą į OMM lemia ne C-galo inkaro seka, o N-galo importo seka. 17, 18, 19, 20, 21 Norėdami tai tiesiogiai patikrinti, mes sukūrėme konstruktus, skirtus ekspresuoti Bax, pažymėtą N arba C gale, geltonu fluorescuojančiu baltymu / žaliu fluorescenciniu baltymu (YFP / GFP). Mes samprotavome, kad jei būtų reikalingas membranos taikymas, pridėjus GFP, ši funkcija būtų panaikinta.

Mes paklausėme, ar YFP-Bax ar Bax-GFP atkūrė „Bax / Bak“ dvigubo išmušimo fibroblastų (DKO ląstelių) jautrumą staurosporinui. Vien YFP-Bax, Bax-GFP arba YFP buvo laikinai ekspresuojami DKO ląstelėse, kurios vėliau buvo apdorojamos staurosporinu įvairų laiką (1a pav.). Nė vienoje iš ląstelių prieš gydymą staurosporinu reikšmingos apoptozės nebuvo. Po gydymo staurosporinu YFP-Bax ekspresuojančios ląstelės po 30 min parodė reikšmingą apoptozę. Nei YFP, nei Bax-GFP reikšmingai nepadidino DKO ląstelių jautrumo staurosporinui. Kai ištyrėme YFP, YFP-Bax ir Bax-GFP tarpląstelinį pasiskirstymą, mes pastebėjome, kad visi jie buvo difuziniai visoje neapdorotų ląstelių citoplazmoje (1b paveikslas). Po gydymo staurosporinu tik YFP-Bax parodė punkcijos pasiskirstymą, susijusį su mitochondrijų žymeniu (mitochondrijų šilumos šoko baltymas 70, mtHsp70).

Image

Blokuodamas Bax C galą, blokuojamas jo apoptozinis potencialas DKO ląstelėse. ( a ) DKO ląstelės buvo laikinai transfekuotos YFP, YFP-Bax ir Bax-GFP ir įvairiais laikotarpiais buvo apdorotos vien tik nešikliu (DMSO) arba 10 μM staurosporinu. Apoptozė buvo įvertinta pagal ląstelių, ekspresuojančių vien YFP arba pažymėtų Bax, branduolinę morfologiją. Duomenys buvo lyginami dvipusio ANOVA būdu, o reikšmingos P vertės buvo pažymėtos žvaigždute, o n / s žymimos nereikšmingomis. Klaidų juostos rodo standartinę vidurkio paklaidą, o duomenys rodo tris nepriklausomus eksperimentus. ( b ) DKO ląstelės, išaugintos ant dangtelių, buvo laikinai transfekuotos, kaip ir anksčiau, ir 4 valandas buvo apdorotos DMSO arba staurosporinu (STS), po to jos buvo fiksuotos ir imuniniu būdu išlaikytos mtHsp-70. Branduoliai buvo dažyti Hoechst

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme YFP-Bax ir Bax-GFP pasiskirstymą anoikio metu epitelio ląstelėse. Anoikis leidžia analizuoti Bax įdarbinimą ir jo aktyvavimą laikinai. Vien tik 9, 24 YFP-Bax, Bax-GFP ar YFP buvo laikinai ekspresuojamos FSK-7 pieno liaukų epitelio ląstelėse, kurios 30 min arba 4 h buvo atskirtos nuo tarpląstelinės matricos (ECM) (2a pav.). Prilipusiose ląstelėse visi trys baltymai buvo pasiskirstę citoplazmoje. Kaip mes jau anksčiau parodėme, YFP-Bax persiskirstė į mitochondrijas per 30 minučių, praradus ECM kontaktą, tuo tarpu YFP ir Bax-GFP išliko citozoliniai. Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad po 4 valandų atsiribojimo, Bax-GFP parodė punkcijos pasiskirstymą, panašų į YFP-Bax, bet tik tose epitelio ląstelėse, kurios turėjo apoptozinius branduolius. YFP liko citozolinis apoptozinėse ląstelėse. Norėdami išsiaiškinti, ar „Bax-GFP“ FSK-7 ląstelėse nebuvo kokių nors pro-apoptozinių funkcijų, kiekybiškai įvertinome apoptozę, praradę ECM prisijungimą (2b paveikslas). Kaip jau buvo įrodyta, per didelis YFP-Bax raiškos epitelio ląstelių jautrumas anoikiams. Tačiau Bax-GFP išraiška nejautrino FSK-7 ląstelių anoikams. Panašus „Bax-GFP“ ir „YFP-Bax“ ekspresijos lygis buvo pastebėtas atlikus imunoblotus (2b paveikslas). Pakeisdamas proliną 168 alaninu (P168A) Bax C gale, jis neleidžia nukreipti į OMM ir panaikina jo apoptozinį aktyvumą. 23, 24 klausėme, ar „Bax-P168A“ taip pat galėtų persiskirstyti mirusių epitelio ląstelių mitochondrijose. FSK-7 ląstelės, ekspresuojančios YFP, YFP-Bax, Bax-GFP arba YFP-BaxP168A, buvo atskirtos nuo ECM 4 val. Visų Bax konstruktų ląstelėse su apoptoziniais branduoliais buvo stebimas punkcijos pasiskirstymas (2c paveikslas). Kadangi FSK-7 ląstelės ekspresuoja endogeninį Bax, buvo įmanoma, kad pastebėtas Bax-GFP ir YFP-BaxP168A įsisavinimas priklausė nuo funkcinio Bax buvimo.

Image

YFP-Bax ir Bax-GFP imunologinis šalinimas anoikio metu. ( a ) Fsk-7 ląstelės, pereinančiai ekspresuojančios YFP, YFP-Bax arba Bax-GFP, įvairiu laiku atskirtos nuo ECM, o jų tarpląstelinė lokalizacija įvertinta imunofluorescencijos būdu. Branduoliai buvo dažyti Hoechst, o mitochondrijos - mtHsp-70. Atkreipkite dėmesį į visų konstruktų citozolinį pasiskirstymą lipniose ląstelėse. Atminkite, kad po 30 min atskyrimo tik YFP-Bax turi punkcijos pasiskirstymą, kuris lokalizuotas kartu su mtHsp-70. Bax-GFP išlieka citozolinis ir nėra lokalizuotas su mtHsp-70. Po 4 valandų atsiribojimo, Bax-GFP lokalizuojasi mitochondrijose ląstelėse, turinčiose apoptozinius branduolius. ( b ) Anoikio tyrimas Fsk-7 ląstelėse, pereinančiai ekspresuojančiose YFP, YFP-Bax ir Bax-GFP. Fsk-7 ląstelės buvo paliktos priklijuotos arba atskirtos ir įvairiais laikais palaikomos ant poli-HEMA. Apoptozė buvo kiekybiškai įvertinta pagal branduolio morfologiją. Tik YFP-Bax ląstelėms jautrė apoptozę. Duomenys buvo lyginami dvipusio ANOVA būdu, o reikšmingos P vertės buvo pažymėtos žvaigždute, o n / s žymimos nereikšmingomis. Klaidų juostos rodo standartinę vidurkio paklaidą, o duomenys rodo tris nepriklausomus eksperimentus. c ) YFP, YFP-Bax, YFP-BaxP168A ir Bax-GFP imunolokalizavimas laikinai perkeltose Fsk-7 ląstelėse, atskirtose nuo ECM 4 h

Visas dydis

Visi šie duomenys leidžia manyti, kad, norint Bax skatinti apoptozę, reikalingas C galas. Vis dėlto, nors atrodo, kad „Bax-GFP“ neturi jokio apoptozinio aktyvumo, jis gali persiskirstyti į mitochondrijas po epitelio ląstelių mirties.

Bax N gale nėra mitochondrijų taikymo sekos

Mes sukūrėme daugybę YFP / GFP konstrukcijų, kad būtų galima tiesiogiai patikrinti, ar Bax N ar C galuose yra mitochondrijų adresų sekos (3a pav.). Kaip kontrolė, žinoma N-galo mitochondrijų importo seka iš apoptozę sukeliančio faktoriaus buvo sujungta į GFP (AIFMLS-GFP). 25 C-galo inkarui mes panaudojome anksčiau aprašytą konstrukciją YFP-XT, susidedantį iš YFP, sulydyto su Bcl-X L C-galo inkaru. 9 Kai AIFMLS-GFP ir YFP-XT buvo laikinai ekspresuojamos FSK-7 ląstelėse, jos buvo lokalizuotos kartu su mtHsp70, tuo tarpu vien GFP buvo citozolinė (3b pav.). Konstrukcija, sudaryta iš numanomo Bax uodegos inkaro, YFP-BaxBH2TMD, puikiai lokalizuota su mtHsp70. Priešingai, „BaxNT / α 1-GFP“, turintis siūlomą N-galo signalo seką, buvo paskirstytas visame citozolyje. YFP-BaxΔTMD, pašalinus uodegos inkarą, sudarė didelius agregatus, nesusijusius su mitochondrijomis. YFP-BaxBH1 / 2TMD, kuriame yra ne tik uodegos inkaras, bet ir centrinis hidrofobinis α -5-spiralė, susidarė agregatai, primenantys Bakso grupes, aptinkamas apoptozinių ląstelių mitochondrijomis.

Image
Image

Baxo N galas neturi mitochondrijų kreipimosi signalo. a ) Baxo ir jo spiralinių domenų schema. Rodyklės rodo prolino liekanas (13 ir 168), kurios mutavo į alaniną. Taip pat parodytos įvairios sutrumpintos „Bax“ formos, pažymėtos arba YFP, arba GFP, kurios buvo sugeneruotos siekiant įvertinti santykinį N ir C galų indėlį į taikymą. Skaičiai nurodo aminorūgštis, įtrauktas į kiekvieną. ( b ) Kelios YFP ir GFP konstrukcijos buvo sukurtos įvertinti Bakso N-galo indėlį į mitochondrijų taikymą. Kaip kontrolė, GFP buvo sulietas žinomas apoptozę sukeliančio faktoriaus (AIFMLS) N-galo importo seka. Ccl Bcl-XL galas buvo sulietas su YFP kaip C-terminalo nukreipimo (YFP-XT) kontrolė. Sukurtos sutrumpintos Bax formos: α 1-spiralė (BaxNT α 1-GFP), Bax, turinti tik BH2 ir transmembraninius domenus (YFP-BaxBH2 / TMD), Bax atėmus TMD (YFP-BaxΔTMD) ir Bax, sudarančius BH1, BH2 ir TMD (YFP-BaxBH1 / 2 / TMD). Fsk-7 ląstelės buvo auginamos ant dangtelių, laikinai transfekuotos ir imuniniu būdu išlaikytos mtHsp-70. c ) įvairių YFP ir GFP pažymėtų baltymų lokalinė ląstelė po ląstelių. Fsk-7 ląstelės, laikinai perkeltos pažymėtais baltymais, buvo subfrakcionuotos į citozolinę ir neapdorotą mitochondrijų frakciją. Baltymų lizatai buvo atskirti SDS-PAGE metodu ir imuniniu būdu nustatyti GFP. Frakcija buvo patikrinta atlikus citozolinio žymens (APAF-1) ir mitochondrijų žymens (mtHsp-70) imunologinį žymėjimą. ( d ) Fsk-7 ląstelės buvo laikinai transfekuotos įvairiais pažymėtais baltymais, tada subfrakcionuota į citozolį ir neapdorotą mitochondrijų frakciją. Izoliuota mitochondrijų frakcija ekstrahuojama 0, 1 M natrio karbonatu, o tirpi frakcija (jautri karbonatams) atskiriama nuo netirpios (atsparios karbonatams) frakcijos. Visos frakcijos, įskaitant bendrą alikvotą, buvo išskaidytos SDS-PAGE ir imunologiškai paimtos į GFP

Visas dydis

Mes taip pat ištyrėme šių delecijų mutantų pasiskirstymą biocheminio frakcionavimo būdu (3c paveikslas). Ląstelės, ekspresuojančios nurodytas konstrukcijas, buvo padalintos į tirpias ir sunkias membranos frakcijas, išanalizuotos SDS-PAGE ir imunoblotai nustatyti GFP, apopotinį proteazę aktyvinantį faktorių 1 (APAF-1) (citozolinis žymeklis) ir mtHsp70. Visos konstrukcijos, kurios fluorescencijos būdu lokalizavosi su mtHsp70, buvo rastos membranos frakcijoje. Tiek atskirai YFP, tiek BaxNT / α 1-GFP buvo išskirtinai citozoliniai. YFP-Bax buvo paskirstytas tarp abiejų frakcijų. Dvi konstrukcijos, kurios sudarė agregatus (YFP-BaxΔTMD ir YFP-BaxBH1 / 2TMD), buvo aptiktos sunkiojoje membranos frakcijoje, tai rodo, kad vien biocheminio frakcionavimo nepakanka norint nustatyti, ar baltymas nukreiptas į mitochondrijas. Norint nustatyti, ar Baxo konstrukcijos įterptos į membraną, sunkiosios membranos frakcijos buvo ekstrahuojamos karbonato buferyje (3d pav.). Citozolinis (supernatantas) kartu su jautriomis karbonatams ir karbonatams atspariomis membranos frakcijomis buvo imunoblotuotas. Visos YFP-Bax konstrukcijos, susijusios su membranos frakcija FSK-7 ląstelėse, buvo atsparios karbonatų ekstrakcijai.

Šie duomenys kartu rodo, kad Baxo C galas yra būtinas ir pakankamas mitochondrijų taikymui. Priešingai, mūsų duomenys rodo, kad Bakso N gale nėra mitochondrijų taikymo sekos.

Nepaisant skirtingos N-galinės sekos, „Zebrafish Bax“ siekia žinduolių ląstelių mitochondrijas

Nuotolinių rūšių baltymų homologų sekos išsaugojimo regionai gali išryškinti funkcinius domenus. Zebrafish genome yra daugumos Bcl-2 šeimos baltymų homologai. 26 Mes pažymėjome, kad zebrafish Bax (zfBax) parodė lokalizuotas sritis, kuriose identiškos yra žinduolių Bax sekos (4a pav.). Visų pirma, zfBax parodė stiprią sekos identiškumą C gale, bet ne N gale. Atsižvelgiant į C galų panašumą, mes paklausėme, ar zfBax gali veikti žinduolių ląstelėse.

Image
Image

Nepaisant skirtingos N-galinės sekos, zebra žuvis Bax (zfBax) lokalizuojasi žinduolių mitochondrijose. a ) Zebrinės žuvies Bax aminorūgščių sekos palyginimas su pelės ir žmogaus Bax. Atkreipkite dėmesį į aukštą zebros žuvų Bax homologijos laipsnį su žinduolių Bax C terminale. ( b ) DKO ląstelės buvo laikinai transfekuotos YFP-zfBax, YFP-Bax ir YFP ir po to apdorotos vien tik nešikliu arba 10 μM staurosporinu, po kurio jos buvo imuniškai apsaugotos nuo mtHsp-70. ( c ) DKO ląstelės buvo laikinai transfekuotos YFP-Bax, YFP-zfBax, o Bax-GFP buvo apdorotos vien tik nešikliu arba 10 μM staurosporinu, po kurio jie buvo imunizuoti, kad būtų aktyvios kaspazės-3 ( d ) DKO ląstelės, pereinančiai ekspresuojančios YFP- „Bax“ sintezės, turinčios pelių ir zfBax BH2TMD ir TMD sritis, buvo imunizuotos dėl mtHsp70

Visas dydis

YFP-zfBax, YFP-Bax ar YFP buvo ekspresuojami laikinai DKO MEF. Jie buvo apdoroti DMSO arba staurosporinu. YFP-zfBax buvo citozolinis DMSO apdorotose ląstelėse, tačiau po gydymo staurosporinu tapo punktualus ir nesiskyrė nuo pelių YFP-Bax (4b paveikslas). Be to, „zfBax“ išgelbėjo apoptozės trūkumą DKO ląstelėse, kurias parodė apoptoziniai branduoliai ląstelėse po gydymo staurosporinu (4b paveikslas) ir aktyvuotos kaspazės-3 buvimas (4c paveikslas).

Atsižvelgiant į sekos panašumą su žinduolių Bax, mes paklausėme, ar zfBax C galas yra mitochondrijų inkaro seka. ZfBax TMD ir BH2 ​​/ TMD seka buvo išreikšta kaip YFP susiliejimas DKO MEF, taip pat lygiavertės pelių sekos. Ląstelės buvo imuniškai apsaugotos nuo mtHsp70 (4d pav.). ZfBax C termino pasiskirstymas po ląstelėmis nesiskyrė nuo pelių konstrukcijų, parodydamas konstitucinę lokalizaciją su mitochondrijomis. Šie duomenys patvirtina hipotezę, kad iš tolimų stuburinių rūšių Bax yra konservuotas C-galo uodegos inkaras. Mes taip pat išreiškėme YFP-BaxBH2TMD, turinčią P168A mutaciją, kuri parodė, kad blokuoja viso ilgio Bax ryšį su mitochondrijomis. Sutikdamas su ankstesniais duomenimis, kurie nurodė, kad šis prolinas yra už uodegos inkaro, YFP-BaxBH2TMDP168A yra konstituciškai lokalizuotas OMM.

„Bax C-terminalo“ inkaras formuoja kompleksus po perkėlimo į mitochondrijas

Norėdami nustatyti, ar Bax oligomerizacija turėjo reikšmės mitochondrijų taikymui, mes panaudojome dvimatį mėlynojo natyvaus poliakrilamido elektroforezę (2D BN-PAGE). Endogeninio Bax 2D BN-PAGE analizė parodė, kad lipniose ląstelėse citozolinis baltymas buvo išskirtinai monomerinis (5a pav.). Po atjungimo buvo rastas mitochondrinis Baxas, kurio molekulinis svoris buvo maždaug 200 kDa. YFP-Bax buvo rastas didelės molekulinės masės kompleksuose, identiško dydžio kaip endogeniniame Bax (5b paveikslas). YFP, analizuotas BN-PAGE, buvo monomerinis.

Image

Baxas yra 200 kDa komplekse, atskirtas nuo ECM. a ) Neapdorotos mitochondrijos ir citozolis iš adhezinių ir atskirtų Fsk-7 ląstelių buvo tiriamos 3–15% BN-PAGE tirpinant 1% CHAPS, 0, 5 M aminokaproinės rūgšties. BN-PAGE juostos (40 μg baltymų kiekvienoje juostoje) buvo supjaustytos į 16 mažų gabalėlių ir kiekviena dalis virta SDS mėginio buferyje. Endogeninis Bax buvo aptiktas atlikus imunoblotus su antikūnu 5B7. ( b ) Mitochondrijų frakcija iš laikinai transfekuotų 293T ląstelių, išreiškiančių nurodytas YFP-Bax konstrukcijas, buvo išskirtos ir paveiktos BN-PAGE, kaip aprašyta a punkte.

Visas dydis

C-galo inkariniai baltymai gali būti nukreipti į mitochondrijas ir ER per sąveiką su chaperone baltymais ar receptoriais12, ir jie taip pat gali oligomerizuotis membranoje. Norėdami paklausti, ar Bakso uodegos inkaras sąveikavo su chaperonais, mes ištyrėme Bax C-terminalo YFP susiliejimų natūrinius molekulinius svorius. YFP-XT, YFP-BaxTMD, YFP-BaxBH2TMD ir YFP-zfBaxBH2TMD buvo ekspresuoti 293T ląstelėse; mitochondrijos, išskirtos ir analizuotos BN-PAGE. Įdomu tai, kad YFP-Bax uodegos inkaro konstrukcijos, kaip ir YFP-XT, taip pat asocijavosi su didelės molekulinės masės kompleksais mitochondrijose. YFP-BaxBH2TMDP168A migravo tokiu pat būdu, kaip ir kiti BaxBH2TMD konstruktai. Taigi prolinas 168 pats savaime nėra uodegos inkaro dalis ir gali reguliuoti jo veikimą tik per visą ilgį „Bax“. Šie duomenys rodo, kad minimalios Bax ir Bcl-X L uodegos inkarų sekos gali sąveikauti su kitais baltymais, esančiais mitochondrijose. Iš tiesų, kaip įrodyta, Bcl-X L formuoja dimerus tiek su savimi, tiek su Bax per savo C-galinį domeną. 28

Nuo uodegos inkaro nepriklausomas Bax stiprinimas, nukreiptas į mitochondrijas

Apoptozės metu Baksas formuoja didelius agregatus mitochondrijose. 29 Bax mutantai, kurie negali nukreipti į mitochondrijas ar inicijuoti apoptozę DKO ląstelėse, vis dar buvo verbuojami į šias OMS grupes FSK-7 ląstelėse, kurios ekspresuoja endogenines Bax ir Bak. Mes hipotezuojame, kad nefunkcinių Bax mutantų taikymą mitochondrijoms lėmė endogeninis Baxas OMM. Norėdami tai išbandyti, mes išreiškėme DKO ląstelėse YFP-Bax, Bax-GFP, YFP-BaxP13A, YFP-BaxP168A arba dvigubai mutantais YFP-BaxP13 / 168A. Mes parodėme prolino 13-alanino pakeitimą pagreitinti nuo Bax priklausomą mitochondrijų išorinės membranos permeabilizaciją (MOMP) po mitochondrijų translokacijos. Tačiau Cartron ir kt. 17, 19 pasiūlė, kad ta pati mutacija atskleidžia siūlomą N-galo taikinio seką, sukeliančią konstitucinę mitochondrijų asociaciją. Ląstelės 2 valandas buvo apdorotos DMSO arba staurosporinu (6a pav.). Kaip pranešta anksčiau, tiek YFP-Bax, tiek YFP-BaxP13A sukėlė apoptozę ir DKO ląstelėse sudarė punkcinius spiečius. Po gydymo staurosporinu 24 YFP-BaxP168A ir Bax-GFP išliko citozoliniai. Kai kurios DKO ląstelės patiria apoptozę (maždaug 5%), greičiausiai per nuo mitochondrijų nepriklausomą mechanizmą. Net tose DKO ląstelėse, kuriose yra apoptozinių branduolių, YFP-BaxP168A išliko citozolinis (6b pav.). Sutikdamas su ankstesniais atradimais, YFP-BaxP13 / 168A taip pat liko citozolinis (6a pav.).

Image

Įdiegus WT-Bax į DKO ląsteles, apoptozės metu įdarbinamos naujos, nukreipiančios netinkamas Bax formas į mitochondrijas. ( a ) DKO ląstelės, laikinai ekspresuojančios YFP-Bax, YFP-P13ABax, YFP-P168ABax arba YFP-P13 / 168ABax, buvo apdorotos vien tik nešikliu (DMSO) (viršuje) arba 10 μM staurosporinu 4 valandas (STS). ( b ) YFP-BaxP168A imunodekalizavimas DKO kontrolinėse ir STS apdorotose ląstelėse. Parodytas santykinis ląstelių, turinčių apoptozinę branduolio morfologiją, procentas, palyginti su sveiku branduoliu. ( c ) DKO ląstelės, pereinamai kartu ekspresuojančios mRFP-Bax su YFP-Bax, YFP-BaxP13A, YFP-Bax168A arba YFP-BaxP13 / 168A, buvo apdorotos vien tik nešikliu (DMSO) arba 10 μM STS 4 valandas. Ląstelės, ekspresuojančios tik mRFP-Bax, YFP kanale nerodė jokio signalo ( d ). DKO ląstelės, pereinamai ekspresuojančios mRFP-BaxP168A kartu su YFP-Bax, YFP-BaxBH3mut arba GFP-Bak, buvo gydomos vien tik nešikliu (DMSO) arba 10 μM STS 4 val. ( e ) DKO ląstelės, pereinamai kartu ekspresuojančios Bax-GFP su mRFP-BaxWT, buvo valomos tik nešikliu (DMSO) arba 10 μM STS 4 h, esant arba neturint zVADfmk.

Visas dydis

Toliau mes kartu išreiškėme kiekvieną iš Bax-GFP, YFP-Bax, YFP-BaxP13A, YFP-BaxP168A ar YFP-BaxP13 / 168A kartu su monomeriniu raudonai fluorescenciniu baltymu-Bax (mRFP-Bax) laukiniu tipu (WT). „mRFP-BaxWT“ atkūrė DKO jautrumą apoptozei tokiu pat būdu, kaip ir „YFP-Bax“ (duomenys neparodyti). Ląstelės buvo apdorotos DMSO arba staurosporinu 4 valandas ir palygintas YFP ir mRFP pasiskirstymas (6c paveikslas). DMSO apdorotose ląstelėse YFP-Bax mutantai ir mRFPBaxWT buvo citozoliniai. Gydant staurosporinu DKO ląstelėse, Bax-GFP, YFP-BaxP168A ir YFP-BaxP13 / 168A buvo pasodintos į mitochondrijas ląstelėse, ekspresuojančiose mRFP-BaxWT. Kaip ir FSK-7 ląstelėse, kuriose atliekamas anoikis, bet kurio iš P168A Bax mutantų pasikartojimas buvo stebimas tik tose ląstelėse, kuriose buvo apoptoziniai branduoliai. Mes pakartojome eksperimentą su „mRFP-BaxP168A“, išreikštu kartu su GFP-Bak arba YFP-Bax, turinčiu nefunkcinį BH3 domeną (YFP-BaxBH3mut, L63E / G67E). YFP-BaxBH3mut iš esmės nukreiptas į mitochondrijas, tačiau negali sukelti citochromo c išsiskyrimo (mūsų nepaskelbti duomenys). Po gydymo staurosporinu, GFP-Bak pasamdė mRFPBaxP168A, tuo tarpu YFP-BaxBH3mut to nepadarė (6d paveikslas).

Galiausiai mes paklausėme, ar nefunkcinio Bax įdarbinimas buvo pasroviui po kaspazės aktyvacijos. DKO ląstelės, kurios kartu išreiškia Bax-GFP ir mRFP-BaxWT, buvo apdorotos DMSO arba staurosporinu, esant arba neturint zVAD-fmk. „Bax-GFP“ buvo įtrauktas į mitochondrijas mRFP-Bax ekspresuojančiose ląstelėse, net jei kaspazės aktyvumas buvo slopinamas (6e pav.).

Šie duomenys kartu rodo, kad Bax mutantai, kuriems trūksta mitochondrijų taikymo, vis dar yra verbuojami į mitochondrijų grupes apoptozės metu.

Diskusija

Bakso translokacija apoptozės metu iš esmės yra mitochondrijų taikymo problema. Dauguma mitochondrijų baltymų yra persodinami citozolyje ir įvairiais mechanizmais importuojami į tinkamą mitochondrijų skyrių. 11, 12 „Bax“ naudojamas mechanizmas išlieka prieštaringas, nes prieštaringi duomenys rodo N-galinę išankstinę seką arba C-terminalo uodegos inkarą. Šiame dokumente parodome, kad Bax iš pradžių CM terminalo uodegos inkaras nukreiptas į OMM ir neįtraukiama N-terminalo išankstinė seka. „Bax“ taikymas pagal uodegos inkarą yra būtinas jo veikimui. Vėliau „Bax“ agregatai susiformuoja pasitelkdami ir suaktyvindami kitas „Bax“ molekules iš citozolio, kuriai nereikia funkcinio uodegos inkaro. Vietoj to, šiai antrajai bangai reikalingi funkciniai daugiadomeniai proapoptotiniai baltymai OMM. Per šią antrąją taikymo bangą tiek Baxas, tiek Bakas sugebėjo įdarbinti citozolinį Baxą.

Dauguma daugiadomenių Bcl-2 baltymų turi funkcines uodegos inkaro sekas; 15 Tremblais ir kt. tvirtino, kad Baxas to nedaro. 20 Pakeisdami Bcl-X L uodegos inkaro seką Bax C-galo 20 aminorūgštimis, jie parodė, kad susidariusi chimera nebuvo nukreipta į mitochondrijas. Svarbiausias uodegos inkaro funkcijos taškas yra sekos N-galo į TMD kiekis. 14 Nors Bax neturi pagrindinių likučių toje vietoje, ši šoninė seka vis dar yra svarbi. Schinzel ir kt. 23 nurodė, kad norint nukreipti heterologinį baltymą į mitochondrijas, reikia mažiausiai 23 „Bax C“ galo aminorūgštys. Kai jie ekspresuoja 22 arba 21 aminorūgšties GFP-BaxTMD chimerą, baltymas išliko citozolinis. Mes parodome, kad ne tik Bax C terminalas gali nukreipti YFP į mitochondrijas, bet ir gali sudaryti baltymų kompleksus OMM, panašaus dydžio kaip tie, kuriuose yra viso ilgio Bax.

Kitas argumentas, pateiktas dėl uodegos inkaro nebuvimo Bakse, buvo tas, kad C-galo 22 aminorūgščių delecija neužkerta kelio pritraukti į mitochondrijas apoptozės metu. 19 Tai galima paaiškinti Bax aktyvacijos sustiprinimu, apie kurį pranešame. Funkcinis Bax arba Bak mitochondrijose gali paskatinti tolesnį Bax pritraukimą iš citozolio, naudodamas mechanizmą, atskirą nuo pradinio taikinio, priklausančio nuo uodegos inkaro. Amplifikacija vyksta MOMP metu arba po jo, nes mes pastebėjome punkcinius Bax-GFP ir YFP-BaxP168A tik ląstelėse su apoptoziniais branduoliais. Anksčiau buvo parodyta „Bax“ ir „Bak“ aktyvacijos amplifikacija in vitro. 30, 31 Aktyvuotas Bax ant liposomų paskatino tolesnį tirpaus Bax aktyvavimą ir įdarbinimą. Atsižvelgiant į šiuos tyrimus kartu, duomenys rodo, kad kai mitochondrijų Bax ar Bak aktyvacija viršija tam tikrą ribą, tai sukelia tolesnio Bax aktyvavimo grandininę reakciją, kuri gali negrįžtamai paskatinti MOMP.

Buvo pasiūlyta, kad Bax turi N-galinio signalo seką. 18 Šios sekos nukreipia baltymus į mitochondrijas per TOM / TIM GIP. Siūloma importo seka neatsiranda ties kraštiniu Bax N galu, bet tampa veikiama, jei pašalinamos pirmosios 20 aminorūgščių. Daugeliu atvejų translokacijos į mitochondrijas metu Bax proteolizė nevyksta. Be to, jei nukreipimo seka būtų N gale, galima tikėtis, kad Bax-GFP atkurs jautrumą DKO ląstelių staurosporinui. „Bax-GFP“ nesugebėjo išgelbėti apoptozės DKO ląstelėse, tuo tarpu YFP-Bax padarė išvadą, kad natūralus C galas yra būtinas, o veikiamas N galas nėra. Prognozuojama, kad nei žinduolių Bax, nei „zfBax“ N galiniame gale nebus mitochondrijų importo sekos, kai jas analizuos „MitoProt“ (nepaskelbti stebėjimai). Be to, N Baxo galas visiškai neturėjo galimybės nukreipti GFP į mitochondrijas. Taigi, mūsų duomenys nepalaiko N-terminalo importo sekos buvimo.

Balionai, pritvirtinti prie uodegos, skiriasi nuo į N galą nukreiptų membranų baltymų tuo, kad nukreipimas turi įvykti atsiribojus nuo ribosomos. Įrodyta, kad šiam įdėjimui po transliacijos reikia chaperono baltymų, kad būtų užmaskuotas hidrofobinis TMD citozolyje. 32, 33, skirtingai nuo garsiausių uodegos tvirtinimų baltymų, Bax nėra konstituciškai nukreiptas į OMM, o vietoj to persikelia reaguodamas į apoptozinius dirgiklius. Tirpalo monomerinio Bax struktūra rodo, kad α- spiralė 9, uodegos inkaro TMD, yra paslėpta hidrofobiniame griovelyje baltymo paviršiuje. Taigi „Bax“ gali veikti kaip savo paties pavaduotojas. Youle ir bendradarbiai 22 nustatė, kad skirtingos mutacijos C-galo α- spiralėje gali slopinti Baxo taikymą arba paskatinti. Be to, mutavęs prolinas 168, esantis tiesiai prieš uodegos inkarą, užkerta kelią Bax translokacijai tiek staurosporino sukeltos ląstelės mirties, tiek anoikio metu ir panaikino jo apoptozinį aktyvumą. 23, 24 Modelis, sukurtas atsižvelgiant į mitochondrijų taikymą į Bax, atsirandantis tada, kai aktyvuotas tik BH3 baltymas, toks kaip tBid, paskatino uodegos inkarą perorientuoti iš paviršiaus griovelio, kai prolinas 168 yra prie vyrio, jį eksponuodamas. Tačiau BMR struktūra rodo, kad energija, reikalinga hidrofobinei uodegai išleisti į vandeninę aplinką, yra per didelė, kad būtų galima paaiškinti siūloma Bax / tBid BH3 domeno sąveika. Kitas scenarijus yra tas, kad uodegos inkaras atsiskleidžia arti lipidų dvisluoksnio sluoksnio. Taigi Bax taikymas gali atsirasti prieš TMD perorientavimą ir gali prireikti mitochondrijų receptorių. Mitochondriniai baltymai reikalingi tam, kad Bax oligomerizuotųsi mitochondrijose, bet ne sintetinėse liposomose, 35, 36 ir dviejuose naujausiuose pranešimuose nustatyta Bax ir TOM baltymų sąveika. 21, 37 Tyrimas, kuriame buvo naudojamos mitochondrijos iš mielių, kurios buvo apdorotos proteazėmis, kad pašalintų GIP, arba gautos iš įvairių TOM baltymų mutantų, parodė, kad funkcinio GIP nereikia nuo Bax priklausomo MOMP. 38 Tačiau kitas tyrimas, kuriame naudojami panašūs mielių mutantai, padarė priešingą išvadą, o funkcinio Tom40 arba Tom22 praradimas slopino Bax sukeltą citochromo c išsiskyrimą. TOM baltymų vaidmuo neatmeta C-galo inkaro, nes amfipatinė spiralė iš abiejų galų gali nukreipti baltymą į GIP receptorius. Hmi1p, DNR helikazė, turi C-galinę seką, kuri nukreipia ją į mitochondrijų matricą per GIP. Lieka tik išsiaiškinti, ar Bax yra nukreiptas per receptorius, tačiau neseniai atliktas tyrimas, tiriantis įvairius mitochondrijų uodegos inkarų baltymus, padarė išvadą, kad jie naudoja bendrą mechanizmą. 39 Bax nukreipimas iš esmės nesiskiria nuo kitų uodegos inkarų baltymų. Kaip „Bax“ uodegos inkaras suaktyvinamas po apoptozinio signalo, vis dar išlieka pagrindinis šio baltymo reguliavimo klausimas.

Žodynas

APAF-1

apopotinį proteazę aktyvinantis 1 faktorius

BN-PAGE

melsvojo poliakrilamido elektroforezė

DKO

dvigubas nokautas

ECM

tarpląstelinė matrica

GFP

žali fluorescenciniai baltymai

GIP

bendrosios importo poros

MOMP

mitochondrijų išorinės membranos permeabilizacija

mRFP

monomerinis raudonas fluorescencinis baltymas

mtHsp70

mitochondrijų šilumos šoko baltymas 70

OMM

išorinė mitochondrinė membrana

poli-HEMA

poli-2-hidroksietilmetakrilatas

SMAC

antrasis kasochozių mitochondrijų aktyvatorius

TIM

translokacinės vidinės membranos

TMD

transmembraninis domenas

TOM

translocase outer membane

YFP

geltonas fluorescencinis baltymas

zVADfmk

benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethane