Bf02, rekombinantinis tnfr2 sulietas baltymas, palengvina adjuvantinį artritą, reguliuodamas žiurkių limfocitus | acta pharmaologica sinica

Bf02, rekombinantinis tnfr2 sulietas baltymas, palengvina adjuvantinį artritą, reguliuodamas žiurkių limfocitus | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti BF02 terapinį poveikį adjuvantiniam artritui (AA) žiurkėms ir reguliuojantį BF02 poveikį T limfocitų funkcijai.

Metodai:

SD žiurkėms buvo įšvirkšta viena Freder adjuvanto emulsijos injekcija į odą dešinėje užpakalinėje metatarsalinėje kojos dalyje. Po AA atsiradimo žiurkėms kas 3 d. Buvo švirkščiamas BF02 (1, 3 arba 9 mg / kg, sc) iš viso 15 dienų. Intragastrinis metotreksato vartojimas (MTX, 0, 5 mg / kg, kas 3 d., Iš viso 15 d.) Buvo laikomas teigiamu kontroliniu vaistu. Vaistų poveikiui AA žiurkėms įvertinti buvo naudojamas artrito indeksas, sutinusių sąnarių skaičius, kulkšnies sąnario histopatologija, blužnies histopatologija ir letenų rentgenografija. T limfocitų funkcija buvo įvertinta matuojant T limfocitų citokinų lygius, IL17 ir TNF-α mRNR ekspresijos lygius ir T limfocitų pogrupių procentinę dalį.

Rezultatai:

AA žiurkėms pasireiškė puikus antrinis uždegiminis atsakas, lydimas žymiai aukštesnių IL-1, IL-6, TNF-α, IL-17, LTα, RANKL ir MMP-13. IL17 ir TNF-α mRNR raiška taip pat buvo žymiai didesnė nei normalių žiurkių. Padidėjo CD3 + CD4 + ir CD4 + CD25 + T limfocitų procentas, tuo tarpu CD4 + CD62L + ir CD4 + CD25 + FoxP3 + T limfocitų procentas sumažėjo. AA žiurkių gydymas BF02 (9 mg / kg) arba MTX reikšmingai sumažino artrito indeksą, patinusių sąnarių skaičių ir bendrą artrito vertinimą. Be to, tiek BF02 (9 mg / kg), tiek MTX reikšmingai slopino T limfocitų proliferaciją ir blokavo aukščiau paminėtą T limfocitų citokinų lygio nukrypimą, IL17 ir TNF-α mRNR raišką bei T limfocitų pogrupių procentinę dalį.

Išvada:

BF02 daro AA žiurkėms terapinį poveikį reguliuodamas T limfocitus.

Įvadas

Reumatoidinis artritas (RA) yra lėtinė progresuojanti daugiafaktorinės etiologijos uždegiminė liga ir sisteminis sutrikimas, kuriam būdingas sinovitas, su juo vėliau sunaikinant ir deformuojant sąnarius 1, 2 . Citokino TNF-α yra pagrindinė uždegiminės kaskados dalis. Jis turi pleiotropinį poveikį, sukeliantį imuninį atsaką, galingą moduliacinį poveikį daugeliui ląstelių ir humoralinio imuniteto aspektų 3 . Sinovito metu daugybė imuninių ląstelių, išskiriančių daugybę uždegiminių citokinų, tokių kaip IL-1, IL-6 ir TNF-α, įsiskverbia į sinoviją. TNF-α vaidina pagrindinį vaidmenį RA ligos procese, nes skatina sinovinius fibroblastus daugintis ir gaminti augimo faktorius, proteazes ir adhezijos molekules 4 . Prie TNF-α jungiasi du receptoriai: TNFR1 ir TNFR2. Tiek priešuždegiminiai, tiek užprogramuoti ląstelių mirties keliai daugiausia tarpininkauja TNFR1. Įrodyta, kad TNFR2 skatina ląstelių aktyvaciją, migraciją ir proliferaciją suaktyvindamas NF-κB 5 kelią. TNFR1 ir TNFR2 yra ekspresuojami skirtingose ​​ląstelėse ir audiniuose. T limfocitai išreiškia abu receptorius, ypač TNFR2 yra gausiau. TNF-α skatina T limfocitus daugintis, aktyvinti ir sekretuoti priešuždegiminius citokinus, tokius kaip IL-1 ir IL-6, prisijungdamas prie TNFR2 6 .

TNF-α antagonistai atskleidė savo puikų veiksmingumą RA 7 patogenezėje. Šiuo metu galimi trys TNF-α antagonistai: adalimumabas, visiškai žmogaus monokloninis antikūnas; infliksimabas, chimerinis monokloninis antikūnas 8 ; ir etanerceptas, rekombinantinis žmogaus TNF-α receptorių: IgG Fc (rhTNFR: Fc) sulietas baltymas. rhTNFR: Fc sumažina RA simptomus, užkerta kelią progresuojančiam sąnarių sunaikinimui arba sulėtina jį ir yra ideali teigiama kontrolė RA tyrimuose 9, 10 .

BF02 taip pat yra anti-TNF-α vaistas. Tai yra rekombinantinis tirpus žmogaus suliejimo baltymas, pagamintas suliejus TNFR2 ir IgG Fc dalį. BF02 gryninimas ir sintezė buvo geresnis nei etanerceptas. Todėl BF02 koncentracija buvo aukšta, taip pat efektyviai sumažėjo izomerų susidarymas.

Žiurkės imunizuojamos termiškai užmuštu Bacillus Calmette Guerin (BCG) skystu parafinu ir vėliau išsivysto AA per mechanizmą, į kurį įtraukiami šilumos šoko baltymai. Žiurkių AA turi kai kuriuos bruožus su žmogaus RA 11 . Todėl AA yra plačiausiai naudojamas RA patogenezės tyrimams ir naujų vaistų RA gydymui atrankos modelis. T limfocitų indėlis į AA patogenezę yra gerai žinomas. Šio darbo tikslas buvo ištirti terapinį BF02 poveikį AA žiurkėms ir reguliuojantį BF02 poveikį T limfocitų funkcijai. Mūsų rezultatai rodo, kad gydymas BF02 slopina progresuojantį uždegimą, mažina T limfocitų proliferaciją ir reguliuoja citokinų ir T limfocitų pogrupių disbalansą. Šie rezultatai rodo, kad nenormalus T limfocitų aktyvumas vaidina lemiamą reikšmę AA patogenezėje ir kad T limfocitų funkcijos reguliavimas BF02 gali būti vienas iš mechanizmų, kuriais jis veikia terapinį poveikį AA žiurkėms.

medžiagos ir metodai

Gyvūnai

Patinų „Sprague-Dawley (SD) žiurkės, sveriančios 150 ± 20 g, buvo įsigytos iš„ B&K Co, Ltd “(SCXK [HU] 2008-0016, Šanchajus, Kinija). Gyvūnai buvo laikomi kambaryje, kuriame kontroliuojama aplinkos temperatūra (22 ± 2 ° C) ir drėgmė (50% ± 10%), su maistu ir vandeniu ad libitum . Visus eksperimentus patvirtino Anhui medicinos universiteto (Hefei, Kinija) Klinikinės farmakologijos instituto Tyrimų su gyvūnais etikos peržiūros komitetas.

Vaistai ir reagentai

„Concanavalin A“ (ConA) buvo gautas iš „Sigma Chemical Co“, JAV; „Dulbecco“ modifikuota „Eagle“ terpė (DMEM) buvo gauta iš „Gibco Co“, JAV; [3H] -TdR buvo gautas iš Šanchajaus taikomosios fizikos instituto, Kinijos mokslų akademijos; anti-pelių PE-CD3, FITC-CD4, PE-CD25, PE-CD62L, PEcy5-Foxp3 + antikūnai buvo gauti iš „eBioscience, Inc“ (San Diegas, CA, JAV). Pradmenis sintezuoja „Sangon Biotech (Shanghai) Co, Ltd.“. „TRIzol“ ir „Platinum SYBR Green“ buvo nupirkti iš bendrovės „Invitrogen Co.“. Fermentais sujungto imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkiniai IL-1, IL-6, TNF-α, LTα, IL- 17, RANKL, MMP-13 buvo nupirkti iš „Research & Development (R&D) Co, Ltd“ (JAV).

BF02: 16, 2 mg / vnt (Nr. 20110518), tirpaus žmogaus naviko nekrozės faktoriaus receptoriaus sulietą baltymą, pateikė Suzhou Jinmeng Biotechnology Co, Ltd (Kinija); metotreksatas (MTX): 2, 5 mg / vnt (Nr. 20110106) buvo nupirktas iš Šanchajaus CP Xinyi Pharmaceutical Co, Ltd (Kinija); IgG-Fc: 5 mg / ml (Nr. 20110120) tiekė Suzhou Jinmeng Biotechnology Co, Ltd (Kinija).

AA indukcija

Visas Freundo adjuvantas (FCA) buvo paruoštas sustabdant termiškai nužudytą BCG skystame parafine 10 mg / ml. Žiurkės AA modelis buvo sukeltas įšvirkštus 0, 1 ml FCA emulsijos į odą į dešinę užpakalinę metatarsalinę kojos padą.

AA gydymas

Remiantis išsamiu letenų patinimo, artrito indekso ir visuotinio artrito įvertinimu, gyvūnai atsitiktine tvarka buvo suskirstyti į septynias grupes ( n = 12 vienai grupei): normalioji grupė, pavyzdinė grupė, trys BF02 grupės (kurioms gauta 1, 3 arba 9 mg / kg poodinės injekcijos kas 3 d., Iš viso 15 d.), MTX grupė (kuri vartojo 0, 5 mg / kg kūno svorio intragastriškai kas 3 d. Iš viso 15 d.) Ir neigiamos kontrolės IgG- Fc grupė (kuriai po oda švirkščiama po 9 mg / kg dozę kas 3 d., Iš viso 15 d.). Po artrito atsiradimo AA žiurkėms buvo sušvirkšta BF02, MTX arba IgG-Fc. Normalioms ir modelinėms žiurkėms po oda tuo pačiu metu buvo duodamas vienodas fiziologinio tirpalo tūris.

Artrito įvertinimas

Po 7 dienos po imunizacijos žiurkės buvo vertinamos kas 3–4 d., Atsižvelgiant į tris klinikinius parametrus: visuotinį artrito vertinimą, artrito indeksą ir patinusių sąnarių skaičių.

Visuotinis artrito įvertinimas žiurkių AA buvo pagrįstas simptomais keliuose regionuose, tokiuose kaip ausis, nosis, uodega ir letena. Aukščiau paminėti kaupiamieji balai buvo naudojami kaip bendras artrito įvertinimas, o maksimalus balas buvo 8 kiekvienai žiurkei 12 .

Artrito indeksas: Artrito sunkumas kiekvienoje letenoje buvo įvertintas naudojant makroskopinę balų skalės sistemą nuo 0 iki 4 13 . Kaip poliartrito indeksas buvo naudojamas kaupiamasis trijų letenų, sergančių antriniu artritu, balas, kurio didžiausia vertė yra 12.

Patinusių sąnarių skaičius: kiekvienai letenai buvo įvertinti penki falangos sąnariai ir viena kulkšnis ar riešas, patinusių sąnarių skaičius; taigi, didžiausias kiekvienos žiurkės patinusių sąnarių skaičius buvo 24 trims antrinio artrito kojoms ir vienai pirminiam artrito kojytei.

Trys aukščiau paminėti artrito įvertinimo parametrai buvo įvertinti naudojant dydžius 0, 7, 11, 15, 19, 22, 25, 28, 32 ir 35.

Radiologinis letenų tyrimas

Po imunizacijos žiurkės buvo paaukotos 35 d. Buvo pašalintos žiurkių priekinės ir užpakalinės kojos, kaulų struktūros ištirtos ir išanalizuotos rentgeno spinduliais. Radiologiniam tyrimui buvo naudojama ši balų skaičiavimo sistema: 0 balų, nėra kaulų pažeidimų; 1 balas, audinių patinimas ir edema; 2 balas, sąnario erozija ir deformacija; ir 3 balas - kaulų erozija ir osteofitų formavimasis. Didžiausias galimas vienos žiurkės balas buvo 9.

Histologinis tyrimas

Po imunizacijos žiurkės buvo paaukotos 35 d. Antrinės užpakalinės letenėlės buvo pašalintos, pritvirtintos 10% formalino, nuvalytos 5% skruzdžių rūgštimi ir įmerktos į parafiną. Serijiniai parafino skyriai buvo dažomi hematoksilinu ir eozinu ir tiriami mikroskopu. Patologiniai pokyčiai buvo įvertinti dėl sinovijos hiperplazijos, ląstelių infiltracijos, pannoso susidarymo ir kremzlės erozijos apakintomis sąlygomis 14 .

Atliktas blužnies dažymas hematoksilinu ir eozinu. Blužnyje buvo įvertinti penki komponentai: limfinės apvalkalo ląstelių tankis, limfoidinio folikulo hiperplazija, kraštinė zona, raudonoji minkštimas ir bendras gemalo centrų (GC) skaičius kiekviename skyriuje. Klasifikavimo schemą sudarė eilinės kategorijos nuo „0“ (jokio efekto) iki „3“ (stiprus poveikis) 15, 16 .

T limfocitų proliferacijos tyrimas

Po imunizacijos AA žiurkės buvo paaukotos 35 d. Užkrūčio liauka buvo pašalinta steriliomis sąlygomis ir surinkti timocitai. Ląstelės buvo suspenduotos su limfocitus skiriančia terpe ir tris kartus plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS). Ląstelių suspensijos, gautos aukščiau aprašytu metodu (100 μL) ir ConA (100 μL, kai koncentracija 3 mg / l), buvo dedamos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių koncentracija 1 × 107 ląstelės / ml, DMEM su 10% FBS., trimis egzemplioriais, ir tada 48 valandas inkubuojami 37 ° C (SHEL LAB Co) su 5% CO 2 . Šešios valandos iki inkubacijos pabaigos į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 20 μL [3H] -TdR. Radioaktyvumas buvo matuojamas skysčio scintiliacijos skaitikliu (Beckman Co). Rezultatai buvo apibūdinti kaip trijų egzempliorių skaičiaus vidurkis.

IL-1, IL-6, IL-17, TNF-α, LTα, RANKL ir MMP-13 tyrimas serume

D 35 dienomis žiurkės buvo paaukotos, o serumas buvo paimtas iš veninio kraujo. Serumas buvo atskirtas nuo kraujo, centrifuguojant 2000 kartų per minutę 20 minučių, ir laikomas iki –80 ° C. IL-1, IL-6, IL-17, TNF-α, LTα, RANKL ir MMP-13 koncentracija serume buvo matuojama naudojant ELISA rinkinius. Rezultatai buvo išreikšti kaip dviejų šulinių vidurkis.

TNF-α mRNR ir IL-17 mRNR tyrimas naudojant kiekybinį realaus laiko PGR (qPCR)

Visa RNR buvo ekstrahuota iš T limfocitų, naudojant TRIzol reagentą, pagal gamintojo instrukcijas. PGR reakcijoms 10 μL SYBR Green buvo pridėta prie 2 μL cDNR su 50 nmol / L pradmenimis 20 μL reakcijos metu, o PGR sąlygos buvo 95 ° C 30 s, po to sekė 40 ciklų 95 ° C. 5 s ir 60 ° C 30 s. Lydymosi kreivė buvo atlikta nuo 60 ° C iki 95 ° C. Kad neigiama kontrolinė medžiaga būtų pakeista cDNR, buvo naudojamas sterilus distiliuotas vanduo. IL-17 5′-up-stream-ACTACCTCAACCGTTCCACTTCA-3 ′, downstream 5′-TGTGCCTCCCAGATCACAGA-3 ′. TNF-α srautas 5′-TTCTCATTCCTGCTCGTGG-3 ′, žemyn srautas 5′ – TCCTCCGCTTGGTGGTTT-3 ′. GAPDH 5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3 ′ aukštyn srautas, 5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3 ′ srautas žemyn. GAPDH ekspresijos lygiai buvo naudojami normalizuojant genų ekspresiją kiekviename eksperimente. Tiek tikslinis, tiek normalus genų PGR efektyvumas pirmiausia buvo nustatyti GAPDH, siekiant įsitikinti, kad normalizuojantys genai yra priimtini, ir patikrinti pradmenų efektyvumą. QPCR buvo atliktas 2 kartų praskiedimo seka iš sujungto cDNR rinkinio, o slenkstinė Ct vertė buvo nubraižyta atsižvelgiant į log cDNR skiedimą 17 . Išraiškos pokyčiai buvo apskaičiuoti naudojant 2- ΔΔCt metodą ir išreikšti kaip kartos pokytis per kontrolę.

T limfocitų blužnies pogrupių tyrimas

Po imunizacijos 35 dieną, žiurkės buvo paaukotos. Blužniai buvo pašalinti, o splenocitai buvo surinkti. Ląstelės buvo išgrynintos, suspenduotos su limfocitus skiriančia terpe ir tris kartus plaunamos PBS. Į kiekvieną fluorescenciniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiavimo mėgintuvėlį buvo įpilta 50 μL splenocitų suspensijos ir 10 μL CD3-PE / CD4-FITC, CD25-PE / CD4-FITC ir CD62L-PE / CD4-FITC antikūnų derinių.

Mėginiai švelniai sumaišomi, inkubuojami 20 min. 4 ° C temperatūroje ir analizuojami srauto citometrijos metodu. Duomenys buvo analizuojami naudojant „CellQuest ™“ analizės programinę įrangą.

CD4 + CD25 + Foxp3 + T limfocitų tyrimas blužnyje

Norėdami aptikti Foxp3 ekspresiją, blužnies ląstelės buvo analizuojamos trijų spalvų tarpląstelinio srauto citometrija, naudojant FITC-CD4, PE-CD25 ir PEcy5-Foxp3 + antikūnus. Po imunizacijos 35 dieną, žiurkės buvo paaukotos. Blužniai buvo išstumti, o splenocitai buvo surinkti įprastiniu metodu. 500 μL splenocitų suspensija buvo inkubuota su FITC-CD4 turinčiu antikūnu ir su PE-CD25 specifiniu antikūnu 20 minučių 4 ° C temperatūroje. Po fiksavimo ląstelės buvo permeabiluojamos 45 minutes 4 ° C temperatūroje, naudojant komerciškai prieinamą perm / plovimo rinkinį. Po permeabilizacijos ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 100 µL PBS ir inkubuojamos 30 minučių su PEcy5-Foxp3 + antikūnu. Ląstelės buvo du kartus plaunamos šaltu PBS ir pakartotinai suspenduojamos PBS srauto citometrijai nustatyti. Duomenys buvo analizuojami naudojant „CellQuest ™“ analizės programinę įrangą.

Statistinė analizė

Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± vidurkio standartinė paklaida (SEM). Duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS 11.5 versijos statistinį paketą. Skirtumai tarp grupių buvo įvertinti naudojant vienpusį ANOVA ir LSD testą. P vertės, mažesnės nei 0, 05, buvo laikomos statistiškai reikšmingomis.

Rezultatai

BF02 poveikis artrito visuotiniam vertinimui, artrito indeksui ir patinusių sąnarių skaičiui

Antrinis artritas prasidėjo d 11 dieną po imunizacijos. AA žiurkių užpakaliniai kojos iš pradžių išsipūtė 18 valandą po imunizacijos; priekinės kojos lėtai išsipūtė, o patinimas pasiekė aukščiausią tašką nuo d 20 iki d 28. Nuo d 22 iki d 25 BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) sumažino bendrą AA žiurkių artrito vertinimą, palyginti su normaliomis žiurkėmis. ( P <0, 01) (1A pav.). Nuo d 19 iki d 35, BF02 (9 mg / kg) sumažino artrito indeksą ( P <0, 01) (1B paveikslas). Po imunizacijos d 19 d., Patinusių sąnarių skaičius padidėjo kiekvienoje grupėje, palyginti su normalia grupe, o BF02 gydymo grupės patinusių sąnarių skaičius pastebimai sumažėjo, palyginti su modeline grupe ( P <0, 05). Nuo d 22 iki d 25 po imunizacijos BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) aiškiai sumažino patinusių sąnarių skaičių ( P <0, 01). IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio patinusių sąnarių skaičiui (1C paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad BF02 vartojimas susilpnino artrito laipsnį ir slopino žiurkių AA progresavimą.

Image

BF02 poveikis artrito visuotiniam vertinimui, artrito indeksui ir patinusių sąnarių skaičiui. Antrinis ligos artritas prasidėjo d 11 dieną po imunizacijos, o didžiausias jo pasireiškimas buvo nuo d 20 iki d 28. (A) BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) galėtų žymiai sumažinti bendrą artrito vertinimą. žiurkėms, kurių AA yra nuo d 22 iki d 25. (B) BF02 (9 mg / kg) gali akivaizdžiai slopinti artrito indeksą AA žiurkėms nuo d 19 iki d 35. (C) Padidėjusių sąnarių skaičius (SJC) padidėjo kiekvienoje grupėje, palyginti su palyginti su normalia grupe, ir BF02 gydymo grupė turėjo ryškių pokyčių, palyginti su modeline grupe. Po vakcinacijos nuo 22 iki d25 dienos BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) galėjo sumažinti SJC, palyginti su modelių grupe, o IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio SJC. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis radiologiniam kojų tyrimui

Palyginti su normaliomis žiurkėmis, AA žiurkių rentgenogramos parodė minkštųjų audinių patinimą, kaulų eroziją ir siaurą sąnario ertmę. Iš BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) gydytų žiurkių rentgenogramos parodė, kad švelnėja minkštųjų audinių patinimas, kaulų erozija ir siaura sąnario ertmė. Žiurkių modelių rentgenogramos buvo aukštesnės nei įprastų žiurkių. BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) sumažino aukštus rentgenogramos rodmenis ( P <0, 05); tačiau IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio rentgenogramos rezultatams (2A, 2B paveikslas).

Image

BF02 poveikis letenų radiologiniam tyrimui. (A) AA modelio grupės rentgenografija parodė minkštųjų audinių patinimą, kaulų eroziją ir siaurą sąnario ertmę, palyginti su įprasta grupe. (B) BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) galėjo žymiai sumažinti padidėjusius rentgenogramos rodmenis, o IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio rentgenografo rezultatams. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis kulkšnies sąnario histopatologijai

AA žiurkių kulkšnių sąnarių histopatologija parodė kelis sinovijos hiperplazijos sluoksnius su pannusu, kremzlės erozija ir uždegiminėmis ląstelių infiltracijomis. Palyginti su normalia grupe, AA žiurkėms padidėjo sinovijos hiperplazijos, ląstelių infiltracijos, pannuso, kremzlės ir kaulų erozijos balai. Priešingai, vartojant BF02, šie anomalijos sumažėjo ( P <0, 05). AA žiurkėms, gydomoms BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg), pasireiškė tik minimalus uždegimas ir patologiniai pokyčiai: kaulų erozija ir skilimas buvo mažai aptiktas; taip pat akivaizdžiai sumažėjo uždegiminių ląstelių infiltracija; ir aukšti pannuso balai buvo sumažinti (3B pav.). IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio.

Image

BF02 poveikis kulkšnies sąnario histopatologijai. (A) Palyginti su įprasta grupe, modelių grupėje buvo pastebima sinovijos hiperplazija, ląstelių infiltracija, pannoso formavimasis, kaulų erozija ir uždegimas (dažymas HE, × 40). (B) BF02 (9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) parodė tik minimalų uždegimą ir patologinius pokyčius: kaulų erozija ir skilimas buvo mažai aptiktas, taip pat akivaizdžiai sumažėjo uždegiminių ląstelių infiltracija, padidėjo pannuso rodikliai. . IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis blužnies histopatologijai

AA žiurkėms buvo pastebėtas baltųjų minkštimų proliferacija, gemalo centrai ir raudonosios pulpos hiperemija. BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) reikšmingai palengvino šiuos anomalijas skirtingais laipsniais (4A pav.). Ląstelių tankio limfinės apvalkalo, limfoidinio folikulo hiperplazijos, ribinės zonos ir raudonosios minkštimo vertės buvo žymiai didesnės AA žiurkėms nei įprastoms žiurkėms. BF02 (9 mg / kg) sumažino ląstelių tankio limfinės apvalkalo, limfoidinio folikulo hiperplazijos, ribinės zonos ir raudonosios minkštimo ( P <0, 01) balus (4B pav.). IgG-Fc grupėje reikšmingų pokyčių nepastebėta.

Image

BF02 poveikis blužnies histopatologijai. (A) AA žiurkėse padaugėjo baltųjų minkštimų, atsirado gemalo centrai ir raudonosios pulpos hiperemija, infiltruoti blužniai su uždegiminėmis ląstelėmis (dažymas HE, × 40). BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) reikšmingai palengvino šiuos nenormalius pokyčius. (B) BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) sumažino ląstelių tankio limfinės apvalkalo, limfoidinių folikulų hiperplazijos, ribinės zonos ir raudonosios minkštimo balus. IgG-Fc grupėje reikšmingų pokyčių nebuvo. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. c P <0, 01 palyginti su normalia grupe. e P <0, 05, f P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Šie rezultatai rodo, kad BF02 turėjo terapinį poveikį žiurkių AA. Ar terapinis BF02 poveikis tiriamiesiems gyvūnams buvo susijęs su T limfocitų funkcijos reguliavimu? Atsakant į šį klausimą, toliau buvo tiriamas BF02 poveikis T limfocitų proliferacijai, citokinams ir pogrupiams.

BF02 poveikis T limfocitų proliferacijai

Rezultatai parodė, kad ConA sukeltas T limfocitų proliferacija modelių grupėje padidėjo, palyginti su normalia grupe ( P <0, 05). BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) sumažino T limfocitų proliferaciją AA žiurkėms, palyginti su normaliomis žiurkėmis ( P <0, 05). IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio T limfocitų proliferacijai (5 paveikslas).

Image

BF02 poveikis T limfocitų proliferacijai. Rezultatai parodė, kad ConA sukeltas T limfocitų proliferacija AA grupėje padidėjo. BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) galėtų sumažinti T limfocitų proliferaciją. IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio T limfocitų proliferacijai. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. b P <0, 05 palyginti su normalia grupe. e P <0, 05, f P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis IL-1, IL-6, IL-17, TNF-α, LTα, RANKL ir MMP-13 serume

Rezultatai parodė, kad IL-1, IL-6, IL-17, LTα, TNF-α, MMP-13 ir RANKL koncentracija serume padidėjo žiurkių AA grupėje, palyginti su normalia grupe. Įvedus BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg), akivaizdžiai sumažėjo IL-1, IL-6, IL-17, LTα, TNF-α ir MMP-13 gamyba. BF02 (9 mg / kg) taip pat sumažino RANKL lygį. IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio citokinų kiekiui (6A – 6D pav.).

Image

BF02 poveikis TNF-α, IL-1, IL-6, IL-17, LTα, RANKL ir MMP-13 lygiams AA serume. Rezultatai parodė, kad (A) IL-1 ir IL-6, (B) TNF-α ir IL-17, (C) LTα ir RANKL bei (D) MMP-13 lygis padidėjo modelių grupėje, palyginti su normali grupė. Įvedus BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg), žymiai sumažėjo IL-1, IL-6, IL-17, LTα, TNF-α ir MMP-13 gamyba. BF02 (9 mg / kg) gali sumažinti RANKL lygį. IgG-Fc neturėjo akivaizdaus poveikio citokinų kiekiui. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su normalia grupe. e P <0, 05, f P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis IL-17 ir TNF-α mRNR raiškai užkrūčio liaukoje

Rezultatai parodė, kad IL-17 ir TNF-α mRNR ekspresija padidėjo AA žiurkėms ir kad BF02 (9 mg / kg) sumažino šių mRNR raišką ( P <0, 01) (7 paveikslas).

Image

BF02 poveikis IL-17 ir TNF-α mRNR raiškai T limfocituose. (A) IL-17 ir (B) TNF-α mRNR lygis padidėjo AA T limfocituose. BF02 gydytų žiurkių IL-17 ir TNF-α ekspresijos mRNR raiškos reikšmingai sumažėjo. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis T limfocitų pogrupiams blužnyje

T limfocitų pogrupiai buvo ištirti srauto citometrija. CD3 + CD4 + ir CD4 + CD25 + T limfocitų procentas ir skaičius AA žiurkėse buvo didesnis nei normalių žiurkių. CD4 + CD62L + T limfocitų skaičius buvo mažesnis AA žiurkėms nei normalioms žiurkėms. BF02 (1, 3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) sumažino CD4 + CD25 + T limfocitų procentinę dalį. BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) taip pat atstatė CD4 + CD62L + T limfocitų (kurių AA žiurkėse yra mažai) procentą iki normalaus lygio, tuo tarpu BF02 (1, 3 ir 9 mg). / kg) neturėjo akivaizdaus poveikio CD3 + CD4 + T limfocitų procentinei daliai (8 paveikslas).

Image

BF02 poveikis T limfocitų pogrupiams blužnyje. Remiantis srauto citometrijos analize, modelių grupėje blužnyje buvo didesnis CD3 + CD4 + ir CD4 + CD25 + T limfocitų procentas nei įprastoje grupėje. CD4 + CD62L + T limfocitai sumažėjo modelių grupėje. BF02 (1, 3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) gali slopinti CD4 + CD25 + T limfocitų procentinę dalį. Be to, BF02 (3 ir 9 mg / kg) ir MTX (0, 5 mg / kg) galėtų atkurti sumažėjusį CD4 + CD62L + T limfocitų procentą.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

BF02 poveikis CD4 + CD25 + FoxP3 + T limfocitams AA žiurkių blužniuose

Palyginti su normalia grupe, AA grupėje CD4 + CD25 + FoxP3 + T limfocitų procentas buvo akivaizdžiai mažesnis. BF02 (9 mg / kg) atkūrė CD4 + CD25 + FoxP3 + T ląstelių procentinę dalį iki normalaus lygio ( P <0, 05) (9 paveikslas).

Image

BF02 poveikis CD4 + CD25 + FoxP3 + T limfocitų blužniui AA žiurkėms. Palyginti su normalia grupe, modelių grupėje CD4 + CD25 + FoxP3 + T limfocitų procentas akivaizdžiai sumažėjo. BF02 (9 mg / kg) galėtų atkurti sumažėjusį CD4 + CD25 + FoxP3 + T ląstelių procentą. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SEM iš 12 gyvūnų kiekvienoje grupėje. c P <0, 01 palyginti su normalia grupe. e P <0, 05, palyginti su modelių grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

RA yra lėtinis ir sisteminis autoimuninis sutrikimas, kuriam būdingas skausmas, patinimas, kelių sąnarių sustingimas ir uždegiminių ląstelių infiltracija 18, 19 . AA yra klasikinis gyvūnų modelis tiriant RA patologiją ir vaistų terapiją RA. Žmogaus RA 20 būdingos tokios AA savybės kaip sąnario patinimas, limfocitų infiltracija ir kremzlės irimas.

Šiame tyrime nustatyta, kad ankstyvieji priešuždegiminiai vietinio uždegiminio atsako komponentai buvo pirminiai žiurkių AA simptomai. Ligos metu išsipūtė antriniai užpakaliniai letenos ir atsirado „artritiški“ ausų, mazgų ir uodegos pagrindų „artrito“ vamzdeliai, kartu sumažėjęs AA žiurkių fizinis aktyvumas ir svorio kritimas.

BF02 reikšmingai slopino antrinį užpakalinių kojų patinimą, sumažino artrito indeksą ir sumažino sąnarių ir blužnies histopatologinius sužalojimus. Be to, BF02 sumažino AA žiurkių letenų radiologinių pokyčių mastą. Šie duomenys rodo, kad BF02 turi terapinį poveikį AA žiurkėms.

T ląstelių vaidmuo RA patogenezėje yra gerai žinomas. Aktyvuotos T ląstelės, randamos RA pacientų sinoviniame skystyje, gali tiesiogiai suaktyvinti makrofagus, sinoviocitus ir osteoklastus, vykdydamos ląstelių tarpusavio sąveiką 21 . Manoma, kad RA ligos procesas priklauso nuo trimolekulinio komplekso, kurį sudaro antigeniniai peptidai, T ląstelių receptoriai ir HLA-DR4 22 . T ląstelės susijungia su kompleksu ir tampa aktyvios. Aktyvuotos T ląstelės pradeda išskirti citokinus, tokius kaip TNF-α, IL-1, IL-6, IL-17, LTα, RANKL ir MMP-13.

TNF-α turi pleiotropinį poveikį, sukeliantį imuninį atsaką, galingą moduliacinį poveikį daugeliui ląstelių ir humoralinio imuniteto aspektų 23, 24 . TNF-α vaidina svarbų vaidmenį RA 25 ir gali turėti įtakos ankstesnėms autoimuninio proceso stadijoms, tokioms kaip T ląstelių aktyvacija ir diferenciacija į efektorių pogrupius. Be to, TNF-α dalyvauja aktyvinant sinovinius fibroblastus. LTα yra priešuždegiminis citokinas, kurį daugiausia gamina T ir B limfocitai ir kuris tarpininkauja daugybei įvairių uždegiminių reakcijų 26, 27 . LTα turi reikšmingą homologiją su TNF-α, kuri specifiškai jungiasi su TNFR1 ir TNFR2 28 . RANKL yra TNF šeimos narys, yra osteoprotegerino ligadas ir veikia kaip pagrindinis osteoklastų diferenciacijos ir aktyvacijos veiksnys 29 . RANKL ekspresuoja T pagalbinės ląstelės ir manoma, kad jis dalyvauja dendritinių ląstelių brendime. IL-17 taip pat yra priešuždegiminis citokinas, vaidinantis svarbų vaidmenį autoimuniniame eksperimentiniame artrite, sunkinantis sinovijos uždegimą ir sąnarių sunaikinimą 30, 31 . Be to, šis sustiprintas IL-17 signalizavimas padidina priešuždegiminių taikinių, tokių kaip IL-6 32, 33, ekspresiją. IL-6 ir IL-1 yra pagrindiniai uždegiminiai citokinai, ir yra įtikinamų įrodymų, kad audinių sunaikinimą ir sąnarių uždegimą reguliuoja IL-1 ir IL-6 34 . IL-6 skatina B ir T ląstelių diferenciaciją ir aktyvaciją, taip pat imunoglobulino gamybą. Šie pagrindiniai uždegiminiai citokinai sukelia uždegimą ir išskiria MMP-13, kuris skaido II tipo kolageną ir dalyvauja formuojant pannus 35 . Šis tyrimas parodė, kad T limfocitų proliferacija buvo padidinta ir kad TNF-α, LTα, RANKL, IL-17, IL-1, IL-6 ir MMP-13 lygis AA žiurkių serume žymiai padidėjo. BF02 slopino T limfocitų proliferaciją ir sumažino padidėjusį aukščiau minėtų citokinų kiekį. Apibendrinant, šie rezultatai rodo, kad BF02 vaidina priešuždegiminį poveikį AA, sumažindamas IL-1, IL-6, IL-17, LTα, TNF-α, RANKL ir MMP-13 lygį.

Norėdami pateikti papildomą išvadą, mes taip pat išmatuojome TNF-α ir IL-17, kurie vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant T ląstelių funkciją, mRNR raišką. Mūsų tyrime AA žiurkėms buvo nustatytas didesnis IL-17 mRNR ir TNF-α mRNR lygis nei normalioms žiurkėms. Šis rezultatas atitiko TNF-α ir IL-17 lygio funkcijas serume. Bendrai tariant, BF02 žemyn reguliuoja priešuždegiminius citokinus, rodo, kad jis gali reguliuoti T ląstelių funkciją.

Automatiškai reaguojančios CD4 + ląstelės vaidina pagrindinį vaidmenį RA 36 . AA žiurkių T ląstelių analizė parodė CD3 + CD4 + ir CD4 + CD25 + T ląstelių padidėjimą. Tačiau CD4 + CD62L + (analogiškų naiviems) T ląstelių procentas sumažėjo. Be to, BF02 sumažino T ląstelių aktyvaciją ir aukščiau reguliavo naivių T ląstelių aktyvaciją, tačiau neturėjo akivaizdaus poveikio CD3 + CD4 + ląstelių procentinei daliai. Šie rezultatai rodo, kad BF02 reguliavo T ląstelių imuninį atsaką, slopindamas CD4 + T ląstelių diferenciaciją ir aktyvaciją, užuot sumažinęs CD4 + T ląstelių skaičių. CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg ląstelės kontroliuoja APC ir efektorinių T ląstelių atsaką periferijoje, tiesiogiai sąveikaudamos su šiomis ląstelėmis arba per priešuždegiminius citokinus 37, ir vaidina svarbų vaidmenį ribojant uždegimą ir reguliuojant adaptyvųjį imunitetą 38 . Mūsų rezultatai rodo, kad CD4 + CD25 + Foxp3 + T limfocitų procentas buvo mažesnis AA grupėje ir kad BF02 sugebėjo atkurti CD4 + CD25 + Foxp3 + T limfocitų procentą.

Šiuo metu RA gydomas etanerceptas. Tačiau 25–38% pacientų nerodo atsako, kurį iš dalies gali lemti nepakankamas šio baltymo afinitetas TNF-α 39, 40 . Be to, prie nepageidaujamų etanercepto reakcijų priskiriama infekcija ir su infekcija nesusijusios nepageidaujamos reakcijos, tokios kaip navikai, širdies nepakankamumas ir nervų sistemos pažeidimai 41 . Palyginti su etanerceptu, BF02 koncentracija buvo didesnė, o šalutinių produktų susidarymas buvo mažesnis, naudojant BF02. Todėl nepageidaujamų BF02 reakcijų gali būti mažiau.

Taigi, šis tyrimas rodo, kad nenormalus T limfocitų aktyvumas vaidina lemiamą vaidmenį AA patogenezėje ir kad BF02 turi terapinį poveikį žiurkių AA, kaip rodo mažėjantis artrito indeksas, patinusių sąnarių skaičius ir artritas. letenų rentgeno spinduliai, kulkšnies sąnario histopatologija ir blužnies histopatologija. Terapinis poveikis gali būti susijęs su BF02 gebėjimu žemyn reguliuoti priešuždegiminius citokinus ir aukščiau reguliuoti reguliuojančias T ląsteles, blokuodamas TNF-α funkciją.

Autoriaus indėlis

Wei WEI, Ling-ling ZHANG ir Qing-tong WANG sukūrė tyrimus; Šan Šanio daina, Bei HUANG, Yu-jing WU, Jing-jing FU, Yun-fang ZHANG, Yan CHANG, Jing-yu CHEN, Hua-xun WU, Di WANG ir Ling-ling ZHANG atliko tyrimus; Šan Šano daina, Yu-jing WU ir Ling-ling ZHANG išanalizavo duomenis; ir Shan-shan SONG parašė darbą.