Biocheminis šilumnešių gėlių termoreguliacijos pagrindas mokslinės ataskaitos

Biocheminis šilumnešių gėlių termoreguliacijos pagrindas mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Augalų fiziologija
  • Kvėpavimas

Anotacija

Gyvūnų termoreguliacija (homeotermija) apima sudėtingą mechanizmą, apimantį viso kūno šiluminius receptorius ir integraciją į pagumburį, kuris kontroliuoja drebulį sukeliančią ir nesibaigiantį termogenezę. Kai kurių senovės augalų sėklinių augalų gėlės rodo panašų fiziologinio termoreguliacijos laipsnį, tačiau skirtingais būdais. Čia parodyta, kad kaukolės ( Symplocarpus renifolius ) homeoterminiuose prieskoniuose kvėpavimo kontrolė pasiekiama nustatant greitį nustatančias biochemines reakcijas, kurių metu bendra termodinaminės aktyvacijos energija rodo neigiamą vertę. Be to, NADPH gamyba, katalizuojama mitochondrijų izocitrato dehidrogenazės vykstant cheminei endoterminei reakcijai, vaidina svarbų vaidmenį priešbalansinėje reakcijoje. Mes siūlome, kad homeoterminė kaukolių nuo kopūstų kontrolė būtų vadinama Le Châtelier principu žinomu cheminės pusiausvyros įstatymu.

Įvadas

Fiziologinis temperatūros reguliavimas paprastai vyksta paukščiams ir žinduoliams, kai jų šilumos išsiskyrimo lygis padidėja, kai mažėja aplinkos temperatūra, taigi kūno temperatūra palaikoma santykinai pastoviu lygiu 1 . Nuo 1972 m. Panašus termoreguliacija buvo demonstruojamas kai kurių augalų termogeninėse gėlėse (pvz., Philodendron 2, Symplocarpus 3, Nelumbo 4, 5 ir Dracunculus 6 ). Nors šios termoreguliacinės gėlės yra šiek tiek homeoterminės, padidėja šilumos gamyba esant žemesnei aplinkos temperatūrai, kad gėlių temperatūra būtų visiškai pastovi. Pavyzdžiui, sakralinių lotoso žiedų šerdies temperatūra sumažėja 0, 9 ° C, aplinkos temperatūrai sumažėjus 10, 0 ° C 5 . Kaukolės kopūstų prieskoniai nėra tokie tikslūs: pusiausvyra 17, 6 ° C, kai oro temperatūra yra 5 ° C, ir 27, 6 ° C, kai oras yra 30 ° C; taigi kvėpavimo greitis didėja mažėjant gėlių audinių temperatūrai ir pasiekia maksimalią temperatūrą 15 ° C 7 . Tačiau jei audinių temperatūra sumažėja žemiau 15 ° C, staiga sumažėja kvėpavimas. Maksimalios kvėpavimo temperatūrą mes vadiname „perjungimo temperatūra“, nes žemiau jos termostatas yra išjungtas 7, 8 . Viršijus įjungimo temperatūrą, kvėpavimo dažnis yra atvirkščiai susijęs su temperatūra ir visiškai grįžtamu būdu, o tai netikėta biologinėse sistemose. Nors buvo pasiūlyta, kad kvėpavimo takai, kuriuos veikia mitochondrijų alternatyvi oksidazė (AOX) ir citochromo c oksidazė (COX), vaidina augalų termogenezę 9, 10, 11, šiuo metu nežinomas mechanizmas, sukeliantis atvirkštinį ryšį. Šiame tyrime mes iškėlėme hipotezę, kad kapotų kopūstų kvėpavimas kontroliuojamas termodinamine pusiausvyra, kai bendra aktyvacijos energija yra keičiama keičiant audinių temperatūrą.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Norėdami patikrinti savo hipotezę, pritaikėme modifikuotą Arrhenius modelį 12, 13, kad nustatytume bendrą kvėpavimo aktyvacijos energiją ( E o ) nepažeistame termogeniniame kaukolės kapsaite. Pirmiausia išanalizavome kvėpavimo greitį, gautą atliekant terminio užkimšimo eksperimentus 7 lauke, kur dirbtinai buvo užtikrinamas Spadix temperatūrų diapazonas ir išmatuotas kvėpavimo greitis esant pusiausvyrai. Modifikuoti Arrhenius brėžiniai pateikė geresnį duomenų palyginimą nei klasikiniai Arrhenius brėžiniai (1a pav. Ir papildomi S1 ir S2 pav.). Be to, dinaminius E o pokyčius įvairiose temperatūrose galėtume apskaičiuoti naudodami „perjungimo temperatūrą“ 15 ° C kaip pamatinę temperatūrą ( T REF ) ir kitus modelio parametrus (1b pav. Ir papildoma S1 lentelė). Keturių nepriklausomų tarpelių E o vertės sumažėjo, pakilus temperatūrai, ir aplink jungimosi temperatūrą buvo matomas susikirtimo taškas. Svarbu tai, kad E o vertės kvėpavimo kontrolės diapazone buvo neigiamos, o kvėpavimo dažnis mažėjo didėjant temperatūrai (1b pav.). Chemijoje vyrauja empirinė neigiamos aktyvacijos energijos reikšmė, kai padidėjus temperatūrai sumažėja cheminių reakcijų greitis. Pavyzdžiai apima anijoninės polimerizacijos 14 sklidimą ir triptofano pagrindu sudarytas, bifunkcines, tiokarbamido katalizuojamas asimetrines Manničiaus reakcijas 15 . Priešingai, mes neradome pranešimų apie neigiamą aktyvavimo energiją biologinėse sistemose, o keliuose straipsniuose nurodomi nuo temperatūros priklausomi E o pokyčiai teigiamų augalų kvėpavimo verčių diapazone 16, 17, 18 . Svarbu tai, kad neigiama chemijos aktyvacijos energija reiškia sudėtingą cheminę reakciją, kurioje vyrauja pusiausvyros reakcijos 19 . Būtent greitas grįžtamasis etapas apima egzotermines ir endotermines reakcijas, vykstančias prieš nestabilių tarpinių junginių susidarymą, ir ši greitį ribojanti reakcija nustato visą reakcijos greitį. Siūlome, kad neigiama aktyvacijos energija homeoterminiuose kapotų kopūstuose galėtų būti gaminama per biochemines pusiausvyros reakcijas, apimančias grįžtamąsias reakcijas, kurias katalizuoja ląstelių dehidrogenazės, ir greitį nustatančią reakciją, katalizuojamą mitochondrijų galinių oksidazių AOX ir COX (2 pav.).

Image

a ) Atskirų spadixų kvėpavimo dažnio kreivė, naudojant modifikuotą Arrhenius modelį. Duomenys gauti iš Seymour ir kt . 7 b ) Temperatūros ir E o priklausomybės nuo kvėpavimo dažnio atskiruose prieskoniuose nustatymas. Standartinė temperatūra ( T REF ), naudojama analizei atlikti, yra 15 ° C.

Visas dydis

Image

Modelis apima vieną pirmaujančią pusiausvyros reakciją (k 1 ir k 1 ′) ir vieną paskutinį deguonies suvartojimo žingsnį per mitochondrijų galines oksidazes (AOX ir COX) (k 2 ). Kiekvienos cheminės reakcijos aktyvavimo energija nurodoma taip: egzoterminė reakcija su reakcijos konstantomis k 1 (RH 2 → R + 2H + + 2e - ) ir k 2 (1/2 O 2 + 2H + + 2e - → H 2) O) išreiškiami atitinkamai Ea ir E a . Endoterminė reakcija, kurios reakcijos konstanta k 1 '(R + 2H + + 2e - → RH 2 ), žymima kaip E a ' .

Visas dydis

Mūsų modelyje yra trys aktyvacijos energijos: dvi - grįžtamosioms pusiausvyros reakcijos pakopoms ( Ea - egzoterminei krypčiai ir E a '- endoterminei krypčiai) ir viena - galutinei egzoterminei reakcijai ( E a ″). Santykiniai aktyvacijos energijų dydžiai lemia, ar bendra aktyvacijos energija yra teigiama, ar neigiama. Šiuo atveju E o išreiškiama taip:

Image

Jei Ea + E a ″ E a ′, įjungimo energija yra teigiama, o greitis didėja esant temperatūrai. Vis dėlto įsivaizduojama, kad Ea + E a ″ < E a ′, tokiu atveju aktyvavimo energija yra neigiama, o greitis mažėja didėjant temperatūrai. Tai reiškia, kad akivaizdus atvirkštinės reakcijos greitis didėja esant temperatūrai ir mažina pastovią elektronų koncentraciją, todėl aukštesnėje temperatūroje sumažėja kvėpavimo dažnis.

Norėdami išsiaiškinti, ar mūsų išankstinės pusiausvyros reakcijos modelis veikia izoliuotose kapotų kopūstų mitochondrijose, mes atlikome in vitro kvėpavimo takų analizę keturiose skirtingose ​​temperatūrose (intervale nuo 8 ° C iki 37 ° C) ir palyginome E o pokyčius. su E o pokyčiais nepaliestuose skyduose (3 pav.). Kadangi citratas yra viena gausiausių organinių rūgščių termoreguliaciniuose Dracunculus vulgaris 20 vyriškuose audiniuose ir kadangi mūsų atlikta analizė su izoliuotomis mitochondrijomis parodė, kad nuo NADP + priklausoma izocitratinė dehidrogenazė (ICDH) yra pagrindinis fermentas, kuris katabolizuoja izocitratą (kurį gavo aconitazė naudojant citratas kaip substratas; papildomas S3 pav.), mes sutelkėme dėmesį į išankstinę pusiausvyros reakciją, tarpininkaujamą ICDH ir II tipo rotenono nejautrią vidinę NADPH dehidrogenazės (NDA) mitochondrijose (3 pav. ir papildomą S3 pav.). Buvo atliktas neigiamas kvėpavimo kontrolės eksperimentas su II tipo rotenonui nejautria išorine NADH dehidrogenaze (NDB). Kadangi mūsų eksperimentinėje sistemoje nėra dehidrogenazių, leidžiančių NAD + paversti NADH už mitochondrijų ribų , in vitro išankstinės pusiausvyros reakcijos neįvyko. Duomenys galutinai atitinka modifikuoto Arrhenijaus modelio antros eilės polinomines lygtis (3a, b pav.). NDB tarpininkaujantis deguonies suvartojimas naudojant NADH kaip substratą niekada neatskleidė neigiamos aktyvacijos energijos. Priešingai, naudojant NADPH-NDA / ICDH deguonies suvartojimą buvo neigiama aktyvacijos energija, nors temperatūra, kurioje E o buvo lygi nuliui (22, 3 ° C), buvo aukštesnė, nei ji buvo nepažeistuose prieskoniuose (15, 2 ° C; 3c pav.). Kadangi fermentinis NADP + -ICDH aktyvumas padidėjo esant temperatūrai (Q 10 = 2, 0; papildomas S3b pav.), Atvirkštinė endoterminė reakcija, sukelianti NADPH, būtų stimuliuojama aukštesnėje temperatūroje, todėl pusiausvyra pasislinktų, kad padidėtų santykis. [NADPH] / [NADP + ] (papildomas S4 pav.). Čia reikėtų pažymėti, kad esant naujai pusiausvyrai, kur yra didesnis [NADPH] / [NADP + ] santykis, [ubiquinone (UQ)] / [ubiquinol (UQH 2 )] santykis taip pat būtų didesnis, taigi, , deguonies suvartojimo norma tarpininkaujant galinėms oksidazėms ilgainiui sumažėtų (papildomas S4 pav.). Šie rezultatai rodo, kad pusiausvyra keičiasi su temperatūros pokyčiais, kad neutralizuotų temperatūros pokyčius ir atkurtų naują pusiausvyrą. Toks elgesys atitinka chemijos dėsnį, žinomą kaip Le Châtelier principas. Gerai žinoma, kad šis principas turi praktinį poveikį tik termodinamiškai grįžtamosioms reakcijoms, o mūsų rezultatai aiškiai rodo, kad išankstinės pusiausvyros reakcijos, kuriose yra egzoterminės ir endoterminės grįžtamosios reakcijos, gali būti atkurtos in vitro, naudojant išgrynintas mitochondrijas iš termogeninio kaukolės audinio. .

Image

a ) Kvėpavimo dažnio nepaliestų smaigalių kreivė, naudojant modifikuotą Arrhenius modelį. Duomenys gauti iš Seymour ir kt . 7 b ) Atskirtų mitochondrijų kvėpavimo dažnio kreivės pritaikymas, naudojant modifikuotą Arrhenius modelį. Duomenys yra gauti iš mitochondrijų kvėpavimo, kuriuos valdo NADP + -ICDH ir NDA (NADPH-NDA / ICDH; žalia) ir NAD + -NDB (NADH-NDB; šviesiai mėlyna). Kvėpavimo dažnis buvo nustatytas esant pastoviai 8 ° C, 15 ° C, 23 ° C arba 30 ° C temperatūrai, kvėpuojant per NADPH-NDA / ICDH, ir esant 15 ° C, 23 ° C, 30 ° C arba 37 ° C per NADH. -NDB (n = 6). ( c ) Nepažeistų purslų ir mitochondrijų kvėpavimo temperatūros E o reakcijos nustatymas. Pavaizduoti nepažeistų skiltelių (raudonos), pavienių mitochondrijų (NADPH-NDA / ICDH (žalia) ir NADH-NDB (šviesiai mėlyna)) E vertės pokyčiai (n = 6). E o susikirtimo taškai parodomi skiltelėms ir NADPH-NDA / ICDH atitinkamai 15, 2 ° C ir 22, 3 ° C.

Visas dydis

2 pav. Pateiktas modelis taip pat prognozuoja, kad nuo temperatūros priklausomi E a pokyčiai lemia temperatūrą, kurioje E o tampa lygi nuliui. Būtent, pertvarkius 1 lygtį, E a ″, AOX ir COX tarpininkavimo kelių aktyvacijos energija, išreiškiama taip.

Image

Čia reikėtų pažymėti, kad

Image
2 lygtis visada yra vienoda bet kokiomis temperatūros sąlygomis, nes ji turi tą pačią aktyvacijos energiją grįžtamosiose prieš pusiausvyros reakcijos pakopose (2 pav.). Todėl mes bandėme išsiaiškinti, ar AOX ar COX tarpininkavimo keliai vienodai prisideda prie perjungimo temperatūros nustatymo. Tuo tikslu mes atlikome tą patį in vitro mitochondrijų kvėpavimo testą ir išmatuojome NADPH-NDA / ICDH tarpininkaujamo deguonies suvartojimą esant specifiniams inhibitoriams (KCN AOX keliui ir n- propilo galatas COX keliui) (Papildomas 5 pav.). Abiejų eksperimentų duomenys vėlgi tinka modifikuotam Arrhenius modeliui (papildomas 5a pav.), Kuris AOX ir COX keliams apskaičiavo nulinę E o, esant atitinkamai 16, 1 ° C ir 24, 9 ° C (papildomas 5b pav.). Šie rezultatai verčia manyti, kad AOX sąlygotas kvėpavimo takas daro didžiausią įtaką perjungimo temperatūrai nepažeistose vietose. Tolesnė dinaminio E o reakcijos į temperatūrą analizė ( δ ) neparodė statistiškai reikšmingo skirtumo tarp AOX ir COX sukeliamų kvėpavimo takų, kuriuos lemia didesnis AOX sukelto kvėpavimo duomenų kitimas (4 pav.) .

Image

Buvo išanalizuotos deguonies sunaudojimo, susijusio su AOX ir COX, δ reikšmės (n = 3). ns: nereikšmingas.

Visas dydis

Galiausiai mes nustatėme piruvato poveikį δ AOX sukeltame mitochondrijų kvėpavime, nes piruvatas yra žinomas kaip teigiamas alosterinis AOX 9, 21 moduliatorius. Mūsų analizėje AOX talpos NAPDH-NDA / ICDH- ir NADH-NDB-tarpininkaujant deguonies vartojimui parodė atitinkamai neigiamas ir teigiamas δ reikšmes ( 5 pav.). Toks priešingas jautrumas temperatūrai rodo, kad pirmiausia skiriasi mechanizmo struktūros skirtumai tarp NAPDH-NDA / ICDH ir NADH-NDB tarpininkaujamo deguonies suvartojimo greičio, nors jie turi tą patį AOX tarpininkaujamą kvėpavimo kelią nuo ubichinolio. Svarbu tai, kad kiekvieno gydymo metu nerasta jokio statistiškai reikšmingo piruvato poveikio δ reikšmėms (5 pav.). Todėl mažai tikėtina, kad AOX aktyvavimo būsena reguliuoja dinaminę E o temperatūros reakciją (jautrumą temperatūrai) izoliuotose mitochondrijose. Kaip alternatyva, kaip parodyta šiame tyrime, termodinamiškai grįžtamos prieš pusiausvyros reakcijos pusiausvyros poslinkiai, kaip parodyta šiame tyrime, gali turėti įtakos homeoterminių kaukolių su kopūstų termosensija.

Image

NADPH-NDA / ICDH ir NADH-NDB tarpininkaujamo deguonies sunaudojimo AOX talpos δ reikšmės buvo nustatytos nesant (-) ar esant (+) piruvatui (n = 3). ns: nereikšmingas.

Visas dydis

Apibendrinant galima teigti, kad kapotų kopūstų dalis gali būti laikoma cheminiu reaktoriumi, savo homeoterminiam reguliavimui naudojant neigiamą aktyvacijos energiją. Kadangi bendrą kvėpavimo suaktyvinimo energiją paprasčiausiai lemia santykiniai priešbalansinės reakcijos aktyvacijos energijos dydžiai, mūsų siūlomas modelis būtų pakankamai tvirtas, kad atitiktų didelius kvėpavimo audinių temperatūros kreivių formos ir padėties skirtumus kitose termoreguliacinėse dalyse. gėlės, kurių perjungimo temperatūra yra skirtinga 7 . Apskritai, temperatūros poveikis kitoms ląstelių biocheminėms pusiausvyroms gali atitikti Le Châtelier principą - ne tik augalų termogenezę, bet ir kitus biologinius reiškinius, tokius kaip žinduolių nesibaigiantį termogenezę ar karščiavimo hipertermiją, kurie gali naudoti tą patį mechanizmą bent iš dalies palaikyti šiluminę homeostazę. .

Metodai

Augalinės medžiagos

Termogeniniai kapotų kopūstų prieskoniai buvo naudojami terminiam prispaudimui ir kvėpavimo analizei, kaip aprašyta anksčiau 7 . Mitochondrijoms valyti, termogeniniai kaukolių gabaliukai buvo surinkti iš natūralių populiacijų, auginamų šlapžemėje, esančioje Kanegasaki mieste, Iwate prefektūroje, Japonijoje, nuo 2014 m. Kovo pabaigos iki balandžio vidurio ir Nishiwaga, Iwate prefektūroje, Japonijoje, 26 d. 2014 m. Gegužė. Surinkti prieskoniai 6–18 val. Buvo laikomi 4 ° C temperatūroje iki mitochondrijų gryninimo.

Kvėpavimo veiklos analizė pagal Arrhenius ir modifikuotas-Arrhenius lygtis

Kvėpavimo dažnis, išmatuotas ankstesniame mūsų tyrime 7, ir mitochondrijų kvėpavimo dažnis, išmatuotas šiame tyrime, buvo naudojami analizėms, pagrįstoms Arrhenius 22 ir modifikuotais Arrhenius modeliais 12, 13 . Kvėpavimo takų duomenų rinkinių kreivėms pritaikyti buvo naudojamas modifikuotas Arrheniuso modelis, kurio parametrai (ln R REF, E o ( T REF ) ir δ ( T REF )) buvo nustatyti pagal antrosios eilės polinominę funkciją taip , kaip nurodyta 12, 13 .

Image

Kvėpavimo dažnis ir aktyvacijos energija (kJ · mol −1 ) esant etaloninei temperatūrai ( T REF ) yra atitinkamai pavaizduoti ln R REF ir E o ( T REF ). Jautrumas temperatūrai išreiškiamas δ ( T REF ) ir yra lygus grafiko, rodančio ryšį tarp E o ir temperatūros, nuolydžiui, o r yra dujų konstanta (8, 314 J · K −1 · mol −1 ). T Term nurodo temperatūros terminą:

Image
.

E o vertė apskaičiuojama pagal modifikuotą Arrhenius modelį taip.

Image

Mitochondrijų valymas ir kvėpavimo analizė

Florets buvo atskirtos nuo skylių ir panaudotos mitochondrijų paruošimui. Gryninimas buvo atliktas, kaip anksčiau pranešta 23, išskyrus tai, kad pradėjus šlifuoti, buvo pridedami proteazės inhibitoriai (cOmplete ULTRA tabletės (Roche) arba 10 μM E-64 ir 0, 5 mM 4- (2-aminoetil) benzensulfonilfluorido hidrochloridas). žiedynai.

Deguonies sunaudojimo procentai buvo nustatyti naudojant šviežiai paruoštas mitochondrijas, kaip aprašyta anksčiau 20, 21 . Mitochondrinis kvėpavimas citratu kaip substratu buvo matuojamas bandymo buferyje 21, kuriame yra 10 mM citrato, 0, 5 mM ADP, 10 mM malonato ir 0, 1 mM rotenono, esant 8 ° C, 15 ° C, 23 ° C ir 30 ° C temperatūrai. Kvėpavimo tyrimams su substratu NADH buvo pridedama 1 mM NADH, 0, 5 mM ADP ir 0, 1 mM rotenono į 21 tiriamąjį buferį 15 ° C, 23 ° C, 30 ° C ir 37 ° C temperatūroje. AOX tarpininkauto kelio pajėgumai buvo nustatyti kaip KCN nejautrus (0, 5 mM) ir n -propilgalato jautrus (0, 1 mM) kvėpavimas. Kur nurodyta, buvo pridėta piruvato (10 mM). COX talpos taip pat buvo nustatytos kaip jautrus KCN (0, 5 mM) ir nejautrus n -propilgalato garams (0, 1 mM). Išgrynintų mitochondrijų baltymų koncentracijos buvo nustatytos kaip mūsų ankstesnėje ataskaitoje 24 . Mitochondrijos buvo laikomos –80 ° C temperatūroje ir buvo naudojamos fermentų tyrimams.

Fermentų tyrimai

Fermentinis mitochondrijų aconitase ir NAD + - arba NADP + -ICDH aktyvumas buvo nustatytas atitinkamai naudojant Aconitase Assay Kit (Abcam) ir Izocitrate Dehydrogenase Assay Kit (Abcam) 15 ° C, 23 ° C ir 30 ° C temperatūroje.

Statistinė analizė

Duomenys buvo išanalizuoti dvipusio Studentų t- testo, naudojant „Microsoft Excel“ programinę įrangą (2013, „Windows“). P vertės <0, 05 buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. Rezultatai pateikiami kaip vidurkiai ± SD.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Umekawa, Y. et al . Biocheminis šiluminių gėlių termoreguliacijos pagrindas. Mokslas. Rep. 6, 24830; „doi“: 10.1038 / srep24830 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.