Biologinių hbv rta181t mutantų palyginimas su sutrumpintomis arba pakeistomis hbsag ekspresijomis in vitro ir in vivo modelių sistemose | mokslinės ataskaitos

Biologinių hbv rta181t mutantų palyginimas su sutrumpintomis arba pakeistomis hbsag ekspresijomis in vitro ir in vivo modelių sistemose | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Hepatitas B

Anotacija

Ilgalaikio antivirusinio gydymo metu pasirenkama hepatito B viruso (HBV) polimerazės rtA181T mutacija. Kadangi polimerazės genas visiškai sutampa su apvalkalo (S) genu, HBV rtA181T mutacija taip pat vykdo sW172 mutacijas. Šiame tyrime mes ištyrėme, ar nėra biologinių skirtumų tarp rtA181T / sW172 * (koduojančio sutrumpinto HBsAg) ir rtA181T / sW172L (koduojančio pakeistą HBsAg) mutantų. Ląstelių eksperimentuose buvo pastebėtas nežymus viruso replikacijos sumažėjimas abiejuose dviejuose mutantuose, palyginti su laukinio tipo padermėmis, tačiau supernatanto HBsAg ir HBV DNR lygis rtA181T / sW172 * buvo žymiai mažesnis nei rtA181T / sW172L transfekuotose ląstelėse. Atlikdami eksperimentus su gyvūnais, nustebome atradę, kad viruso replikacija rtA181T / sW172 * mutante padidėjo ir išliko žymiai ilgiau nei rtA181T / sW172L mutante, tuo tarpu reikšmingo skirtumo tarp rtA181T / sW172L ir laukinio tipo padermių nepastebėta. Palyginti su laukinio tipo padermėmis, HBsAg ir HBcAg kaupėsi ląstelėse rtA181 / sW172 *, bet ne rtA181 / sW172L mutantų padermėse. Svarbu tai, kad mes taip pat nustatėme, kad sutrumpintas HBsAg gali padidinti HBV šerdies promotoriaus aktyvumą, tačiau pakeistas HBsAg negalėjo. Apibendrinant galima pasakyti, kad aukščiau paminėtų dviejų rtA181T mutantų savybės reikšmingai skyrėsi, todėl mums svarbu ir svarbu atskirti sW172 * sutrumpintą mutaciją nuo sW172L pakeistos mutacijos.

Įvadas

Nucleos (t) ide analogai (NA) buvo plačiai naudojami gydant lėtinį hepatitą B (CHB), o tai žymiai pagerina ilgalaikius pacientų rezultatus. Kadangi visi turimi NA selektyviai nukreipia HBV DNR polimerazės atvirkštinės transkriptazės (RT) domeną, HBV-RT srities mutacijos buvo natūraliai tikrinamos ilgalaikio NA naudojimo metu 1 . Šių mutantų atsiradimas neišvengiamai lems viruso proveržį vartojant antivirusinius agentus, o kitoms NA taip pat gali nepavykti pasiekti antivirusinio efekto dėl kryžminio atsparumo reiškinio 2, 3, 4, 5 .

Kaip mes žinome, HBV DNR turi labai kompaktišką kodavimo organizaciją su keturiais iš dalies sutampančiais atvirais skaitymo rėmeliais (ORF), įskaitant ORF P, X, S ir C 6 . Tarp jų ORF P, koduojantis polimerazės RT domeną, visiškai sutampa su ORF S, koduojančiu HBV paviršiaus baltymus. Taigi kiekviena mutacija, vykstanti RT regione, reiškia galimus pokyčius S regione. Svarbu tai, kad kai kurios iš šių mutacijų gali pakeisti viruso biologines savybes, tokias kaip replikacijos ir patogeniškumo pokyčiai 7 .

Pastarąjį dešimtmetį lamivudinas (LAM) ir adefoviro dipivoksilas (ADV) buvo plačiai naudojami Kinijoje. Tačiau dėl žemo genetinio barjero HBV rtA181T / V mutacijos pasirenkamos ilgalaikio LAM ar ADV gydymo metu, ypač pacientams, turintiems didelį virusų kiekį 8 . Kaip mes žinome, HBV rtA181T mutantas yra A → T mutacija P geno 181 padėtyje RT srityje. Teoriškai jo sutampančiame S gene turėtų būti dviejų tipų mutacijos 172 aminorūgštyje, įskaitant rtA181T / sW172L (TGG CTC → TTA CTC) mutantus, koduojančius pakeistą HBsAg baltymą, ir rtA181T / sW172 * (TGG CTC → TGA CTC), mutantus koduojančius. HBsAg baltymas. Ir abi dvi mutacijos paprastai aptinkamos kaip mišri populiacija su laukinio tipo HBV. Taigi, norint išsamiai suprasti HBV rtA181T mutantus, reikia ištirti tiek sW172L, tiek sW172 * mutantų biologines savybes.

Neseniai HBV rtA181T / sW172 * mutantas buvo labai susirūpinęs, o atsiradus šiam mutantui buvo pranešta apie padidėjusią kepenų ląstelių karcinomos riziką LAM ar ADV gydytiems pacientams 9, 10 . Mūsų išankstinis tyrimas taip pat atskleidė, kad HBV rtA181T / sW172 * mutantas turi dominuojantį HBsAg sekrecijos defektą ir viruso DNR replikacijos padidėjimą pelės modelio kepenų audinyje su HBV replikacija 11 . Tačiau verta paminėti, kad šio mutanto viruso replikacijos pokyčiai skirtinguose in vitro ląstelių tyrimuose yra nenuoseklūs. Pavyzdžiui, Dr.Hiromi Yatsuji paskelbtas rezultatas parodė, kad tarp rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L 12 replikacijos gebėjimų pastebimas skirtumas nebuvo; tuo tarpu kiti du in vitro tyrimai parodė sumažintą rtA181T / sW172 * mutanto replikaciją 13, 14 . Taigi, norėdami geriau ir išsamiau suprasti HBV rtA181T mutanto savybes, mes sukūrėme šį tyrimą, norėdami ištirti skirtingų sutampančių S geno mutacijų (sW172L ir sW172 *) įtaką rtA181T mutanto DNR replikacijai ir viruso baltymo ekspresijai, ne tik in vitro . kultivuojamos HepG2 ląstelės, bet ir in vivo pelių modelyje.

Rezultatai

HBV replikacija ir virusinių baltymų ekspresija HepG2 ląstelėse in vitro

Palyginti su laukinio tipo pHBV4.1 transfekuotomis ląstelėmis, tiek supernatanto HBsAg, tiek HBV DNR lygis žymiai sumažėjo pHBV-rtA181T / sW172 * transfekuotose ląstelėse, bet ne taip akivaizdu pHBV-rtA181T / sW172L transfekuotose ląstelėse (1A ir C pav.) ). Tačiau, kalbant apie supernatanto HBeAg titrą, reikšmingo skirtumo tarp laukinio tipo pHBV4.1, pHBV-rtA181T / sW172 * ar pHBV-rtA181T / sW172L transfekuotų ląstelių nebuvo (1 pav. B). Tarp HBV DNR replikacijos tarpinių tarpinių ląstelių buvo šiek tiek sumažėjęs, palyginti su pHBV-rtA181T / sW172 * ir pHBV-rtA181T / sW172L, palyginti su laukinio tipo pHBV4.1 transfekuotomis ląstelėmis (2 pav.).

Image

HepG2 ląstelės buvo laikinai perkeltos atitinkamai 10 μg pHBV4.1, pHBV-rtA181T / sW172 * ir pHBV-rtA181T / sW172L. Ląstelių supernatantas buvo surinktas praėjus 3 dienoms po plazmidės transfekcijos. ( A ) HBsAg lygis ląstelių supernatante; ( B ) HBeAg lygis ląstelių supernatante; ( C ) HBV DNR lygis ląstelių supernatante. Taip pat buvo parodyti kintamųjų vidutiniai ir standartiniai nuokrypiai, kurie buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų. P vertės buvo nustatytos naudojant Mann-Whitney U testą.

Visas dydis

Image

HepG2 ląstelės buvo laikinai perkeltos atitinkamai 10 μg pHBV4.1, pHBV-rtA181T / sW172 * ir pHBV-rtA181T / sW172L. Ląstelės buvo surinktos praėjus 3 dienoms po transfekcijos. ( A ) HepG2 ląstelių HBV DNR replikacijos tarpiniai junginiai buvo aptikti atliekant Southern blotinimą: 1: pHBV4.1 2 grupė: pHBV-rtA181T / sW172 * 3 grupė: pHBV-rtA181T / sW172L grupė. ( B ) Kiekybinė HBV DNR replikacijos tarpinių produktų analizė. Taip pat buvo parodyti vidutiniai ir standartiniai HBV DNR nuokrypiai, o HBV DNR replikacijos tarpinių medžiagų lygis pHBV4.1 grupėje per 72 valandas po transfekcijos buvo apibrėžtas kaip 1.

Visas dydis

Virusinių baltymų ir HBV DNR lygio serume lygis pelių in vivo

Laukinio tipo pHBV4.1 injekuotoms pelėms HBsAg koncentracija serume galėjo būti nustatyta nuo pirmosios dienos, o didžiausia - 3 dieną po injekcijos. Nuo 5 dienos po injekcijos HBsAg kiekis serume sumažėjo. Panaši dinaminio pokyčio tendencija taip pat pastebėta pelėms, į kurias buvo įšvirkšta pHBV-rtA181T / sW172L, nors HBsAg lygis buvo santykinai mažesnis nei laukinio tipo pHBV4.1 įšvirkštų pelių. Tačiau HBsAg lygis buvo ypač žemas pelėms, įšvirkštusioms pHBV-rtA181T / sW172 *, ir smailės nepastebėtos (3 pav. A). Kalbant apie HBeAg koncentraciją serume, akivaizdžių skirtumų tarp laukinio tipo pelių ir dviejų mutantų, kuriems švirkščiamos pelės, nebuvo nei 1, nei 3 dieną. Įdomu, kad nuo 5 iki 15 dienos HBeAg lygis kraujo serume, esant pHBV-rtA181T / sW172 * sušvirkštų pelių buvo žymiai didesnės nei laukinių tipo pHBV4.1 arba pHBV-rtA181T / sW172L injekuotų pelių (3B pav.).

Image

Pelėms hidrodinamiškai buvo sušvirkšta atitinkamai 10 μg pHBV4.1, pHBV-rtA181T / sW172 * ir pHBV-rtA181T / sW172L, ir jos buvo aukojamos skirtingais laiko momentais. ( A ) HBsAg lygis pelių serume; ( B ) HBeAg lygis pelių serume; ( C ) HBV DNR lygis pelių serume. Taip pat buvo parodyti kintamųjų vidutiniai ir standartiniai nuokrypiai, kurie buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų. P vertės buvo nustatytos naudojant Mann-Whitney U testą.

Visas dydis

HBV DNR serumo lygis HBV replikacijos plazmidėje įpuršktose pelėse taip pat parodytas 3C pav. Laukinio tipo pHBV4.1 serumo HBV DNR tyrimo rezultatai buvo 4, 27 ± 0, 16, 6, 85 ± 0, 15, 6, 24 ± 0, 35, 4, 71 ± 0, 44, 3, 89 ± 0, 05, 4, 02 ± 0, 08 log10 kopijų / ml 1, 3, 5 dieną. Atitinkamai 7, 10, 15; rtA181T / sW172 * mutantų padermės serumo HBV DNR tyrimo rezultatai buvo 4, 11 ± 0, 26, 4, 17 ± 0, 42, 3, 46 ± 0, 52, 3, 47 ± 0, 07, 3, 30 ± 0, 05, 2, 90 ± 0, 24 log10 kopijų / ml 1, 3, 5 dieną, Atitinkamai 7, 10, 15; rtA181T / sW172L mutanto padermės serumo HBV DNR tyrimo rezultatai buvo 4, 03 ± 0, 27, 6, 91 ± 0, 19, 6, 25 ± 0, 40, 5, 13 ± 0, 04, 3, 88 ± 0, 12, 3, 76 ± 0, 21 log10 kopijų / ml 1, 3, 5, 7 dieną. Atitinkamai, 10, 15. Tarp laukinio tipo pHBV4.1 ir pHBV-rtA181T / sW172L įšvirkštų pelių HBV DNR lygio skirtumų nebuvo. Tačiau HBV DNR serumo lygis pHBV-rtA181T / sW172 * įšvirkštų pelių organizme buvo žymiai mažesnis nei laukinio tipo pHBV4.1 arba pHBV-rtA181T / sW172L įšvirkštų pelių.

Tarpinių virusų replikacijos lygiai kepenų audinyje in vivo

Tarp HBV replikacijos plazmidės įšvirkštų pelių kepenų audinių HBV DNR replikacijos lygiai buvo parodyti 4 pav. Laukinio tipo pHBV4.1 įšvirkštų pelių kepenyse HBV DNR replikacijos tarpiniai produktai nebuvo aptinkami 1 dieną. 3 dieną ir sumažėjo nuo 5 dienos. O tarpinių HBV DNR replikacijos lygiai buvo nuo 10 iki 15 dienos labai žemi. Panašūs radiniai buvo pastebėti ir pelėms, įšvirkštusioms į pHBV-rtA181T / sW172L, nors atrodo, kad silpnėja jų raiška. palyginti su laukinio tipo pHBV4.1. Tačiau HBV DNR replikacijos tarpinių medžiagų lygis pHBV-rtA181T / sW172 * įšvirkštų pelių organizme išliko aukštas 15 dienų, o tai žymiai skiriasi nuo laukinio tipo pHBV4.1 arba pHBV-rtA181T / sW172L įšvirkštų pelių lygio.

Image

Pelėms hidrodinamiškai buvo sušvirkšta atitinkamai 10 μg pHBV4.1, pHBV-rtA181T / sW172 * ir pHBV-rtA181T / sW172L, ir jos buvo aukojamos skirtingais laiko momentais. ( A ) Pelių kepenų HBV DNR replikacijos tarpiniai produktai buvo aptikti atliekant Southern blot analizę. ( B) Kiekybinė HBV DNR replikacijos tarpinių produktų analizė. Tarpinių HBV DNR replikacijos lygių lygis pHBV4.1 grupėje praėjus 3 dienoms po užkrėtimo buvo apibrėžtas kaip 1. Taip pat buvo parodyti vidutiniai HBV DNR lygiai ir standartinis nuokrypis nuo trijų nepriklausomų analizių, o P vertės buvo nustatytos naudojant Mann-Whitney U testą.

Visas dydis

HBsAg ir HBcAg ekspresijos lygiai kepenų audinyje in vivo

Laukinio tipo pHBV4.1 arba pHBV-rtA181T / sW172L sušvirkštų pelių kepenų audinyje HBsAg dažančių ląstelių skaičius pasiekė savo piką 3 dieną, sumažėjo nuo 5 dienos ir tapo mažai nuo 10 iki 15 dienos. žymiai padidėjo HBsAg dažančių ląstelių skaičius pHBV-rtA181T / sW172 * injekuotose pelėse, be to, HBsAg dažymo signalo stiprumas nuo 3 dienos iki 15 dienos taip pat buvo žymiai didelis (5A pav.). Verta paminėti, kad HBcAg ekspresijos schema buvo panaši į HBsAg ekspresiją laukinio tipo ar mutantinės HBV replikacijos plazmidės injekuotų pelių kepenų audiniuose (5 pav. B).

Image

Reprezentatyvūs HBsAg ( A ) ir HBcAg ( B ) raiškos imunohistochemijos nustatymo pelių kepenų audinių skyriuose vaizdai. Pelių kepenų sekcijos 1, 3, 5, 7, 10 ir 15 dieną po transfekcijos buvo aptiktos naudojant specifinius antikūnus. Teigiamos išraiškos buvo nudažytos rudai (100 x originalus padidinimas).

Visas dydis

Laukinio tipo HBsAg ir mutantų HBsAg įtaka promotoriaus reguliavimo funkcijai

Palyginti su neigiamomis kontrolinėmis pcDNA3.1 transfekuotomis ląstelėmis, santykinis CpLUC luciferazės aktyvumas padidėjo 40% pcDNA-HB (sW172 *) transfekuotose ląstelėse; tačiau nei pcDNA-HBs (wt), nei pcDNA-HBs (sW172L) transfekuotose ląstelėse nepastebėta jokių pokyčių (6A pav.). Verta paminėti, kad tarp pcDNA-HBs (wt), pcDNA-HBs (sW172L) ir pcDNA-HBs (sW172L) transfekuotų ląstelių nebuvo nei PS1pLUC, nei SpLUC, nei XpLUC santykinio luciferazės aktyvumo (6 pav. 6B). ). Šie rezultatai parodė, kad vienintelis sutrumpintas HBsAg galėjo sustiprinti HBV C promotoriaus aktyvumą, o laukinio tipo HBsAg ir pakeistas HBsAg negalėjo.

Image

( A ) santykinį CpLUC luciferazės aktyvumą; ( B ) santykinis PS1pLUC luciferazės aktyvumas; ( C ) santykinis SpLUC luciferazės aktyvumas ( D ), santykinis XpLUC luciferazės aktyvumas. Taip pat buvo parodyti vidutiniai ir standartiniai santykinės luciferazės aktyvumo nuokrypiai, kurie buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų. P vertės buvo nustatytos naudojant Mann-Whitney U testą.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime buvo tiriamas skirtingų rtA181T (rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L) mutacijų poveikis viruso DNR replikacijai ir baltymų ekspresijai tiek in vitro , tiek in vivo . Pagrindinės šio tyrimo išvados buvo: (1) HBsAg ir HBV DNR lygis ląstelių supernatante ir kraujo serume HBV rtA181T / sW172 * mutante buvo ženkliai mažesnis nei HBV rtA181T / sW172L mutante arba laukinio tipo HBV; (2) HBV DNR RI lygiai HBV rtA181T / sW172 * mutantuose buvo aukštesni ir patvaresni nei HBV rtA181T / sW172L mutantuose ir laukinio tipo HBV; (3) reikšmingai didesnis HBsAg ir HBcAg kiekis HBV rtA181T / sW172 * mutanto kepenyse, palyginti su HBV rtA181T / sW172L mutantu ir laukinio tipo HBV; (4) HBV C promotoriaus aktyvumą padidina sutrumpintas HBsAg, o ne pakaitinis arba laukinio tipo HBsAg. Taigi akivaizdu, kad HBV rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L mutantai turi skirtingas biologines savybes.

Gerai žinoma, kad visą HBV virijoną sudaro ikosaedrinė nukleokapsido šerdis ir išorinis lipidinis apvalkalas, ir tik subrendęs nukleokapsidas, apgaubtas paviršinių baltymų, gali patekti į 15 serumą. Įrodymai parodė, kad buvo trys apvalkalo baltymai (įskaitant mažą, vidutinį ir didelį HBsAg), kurie yra pritvirtinti kaip transmembraniniai baltymai ir kurie gali tiesiogiai ar netiesiogiai paveikti HBV 16 biologines savybes. Kaip minėjome aukščiau, rtA181T / sW172L (TGG CTC → TTA CTC) mutantų viruso padermės kodai pakeičia pakeistą HBsAg baltymą ir rtA181T / sW172 * (TGG CTC → TGA CTC) mutantų viruso padermės kodus, apipjaustytus HBsAg baltymus. Taigi, mes spėliojome, kad DNR replikacijos ir baltymo sekrecijos skirtumai tarp rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L mutantinių virusų padermių turėtų būti glaudžiai susiję su skirtinga HBsAg raiška.

Šiame tyrime HBsAg ląstelių supernatantas ir kraujo serume buvo skirtingi tarp HBV rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L padermių. Kadangi mutacijos negali tiesiogiai paveikti baltymų sintezės, žemas HBsAg kiekis ląstelių supernatante ir kraujo serume rtA181T / sW172 * mutantiniame viruso kamiene turėtų būti tiesioginis HBsAg susilaikymo kepenų ląstelėse rezultatas. Kitaip tariant, HBsAg, koduojančio rtA181T / sW172L mutanto padermę (pakeistą HBsAg), būtų galima paprastai išskirti arba pernešti į ląstelių išorę, tačiau HBsAg, koduojančio rtA181T / sW172 * mutantų padermę (apipjaustytą HBsAg), nepavyko. Kaip minėta anksčiau, virusų surinkimas ir sekrecija buvo neatsiejami nuo HBsAg dalyvavimo. Taigi viruso dalelių surinkimas ir sekrecija gali skirtis tarp HBV rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L mutantų padermių. Dėl rtA181T / sW172L mutantinių padermių pakeistų HBsAg atsiradimas neturi įtakos viruso dalelių, kurios gali būti panašios į laukinio tipo HBsAg, surinkimui ir sekrecijai. Tačiau rtA181T / sW172 * mutantų padermėms apipjaustytas HBsAg turėjo reikšmingų baltymo erdvinės struktūros pokyčių, o pastarasis neišvengiamai pakenks viruso dalelių surinkimui ir sekrecijai iš viduląstelinių į tarpląstelinius skysčius. Tai gali paaiškinti žemesnį HBV DNR lygį ląstelių supernatante ir kraujo serume HBV rtA181T / sW172 * mutantų padermėse, palyginti su HBV rtA181T / sW172L mutantų ir laukinio tipo viruso padermėmis. Verta paminėti, kad kepenų ląstelėse esantys antigenai gali stimuliuoti ilgalaikį imuninį atsaką, o adaptyvusis imuninis atsakas turėtų būti atsakingas už viruso klirensą ir ligos patogenezę HBV infekcijos metu 17 . Taigi, norint geriau suprasti supjaustytą HBsAg sulaikymo kepenų ląstelėse patogeninį vaidmenį, būtina atlikti papildomus tyrimus.

Ankstesniuose tyrimuose mes pranešėme, kad rtA181T / sW172 * mutanto padermės HBV DNR RI lygis visada buvo didesnis ir išsilaikė ilgiau, palyginti su laukinio tipo HBV. Tačiau šiame tyrime panašių išvadų nepastebėta rtA181T / sW172L mutanto padermėje. Tiesą sakant, sutrumpinto ir pakeisto HBsAg funkcijos reguliuojant HBV Cp gali paaiškinti šią painiavą, nes sutrumpintas HBsAg gali pakeisti HBV Cp, o pakeisti HBsAg ir laukinio tipo HBsAg negalėjo. Yra žinoma, kad Cp sutampa su HBx baltymą koduojančia seka, kuri veikia kaip viruso genų transkripcinis trans-aktyvatorius ir reguliuoja 3, 5 kb HBV mRNR transkripciją. Pastarasis ne tik koduoja HBcAg, HBeAg ir DNR polimerazę, bet ir įtraukia viruso replikaciją kaip atvirkštinės transkripcijos šabloną (pregenominę RNR) 18 . Tiesą sakant, HBV rtA181T / sW172 * pgRNR lygis buvo 1, 2 karto didesnis nei laukinio tipo pgRNR lygis (duomenys nenurodyti). Verta paminėti, kad mūsų ankstesnis tyrimas pranešė, kad nedidelis HBV pgRNR padidėjimas gali reikšmingai padidinti HBV DNR replikacijos lygį 18 . Taigi Cp aktyvumas tiesiogiai paveikė HBV transkripciją ir replikaciją 19 .

HBsAg aptikimas atliekamas atlikus antikūnų tyrimus, taikomus 'determinantui', labai homologiškam HBsAg regionui, kuris taip pat naudojamas kaip pagrindinis hepatito B vakcinų taikinys 20 . 'A' determinanto atpažinimas pagal anti-HBs priklauso nuo jo 3D struktūros, kuri taip pat priklauso nuo 'a' determinanto 21 briaunų esančių regionų aminorūgščių sekos. Kadangi HBsAg geno mutacijos sW172L ir sW172 * nėra 'a' determinanto viduje, šiuo metu komerciniai antikūnai pakeistam ar apipjaustytam HBsAg yra veiksmingi. Be to, HBsAg imunohistocheminiai rezultatai kepenų audinyje taip pat patvirtino įprastų antikūnų efektyvumą nustatant pakeistą ir sutrumpintą HBsAg.

Reikia pastebėti, kad vien in vitro eksperimento nepakanka, kad būtų galima visiškai atskleisti skirtumus tarp HBV rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L mutantinių padermių. Šiame tyrime šiek tiek skiriasi HBV rtA181T / sW172 * mutanto padermės HBV DNR RI in vitro ir in vivo eksperimentuose. Kai kurie kiti in vitro eksperimentai taip pat pranešė apie sumažėjusį viruso HBV rtA181T / sW172 * 13 replikaciją. Tačiau HBV rtA181T / sW172 * mutanto padermės HBV DNR RI lygis in vivo padidėjo. Kaip minėjome aukščiau, apipjaustyto HBsAg susilaikymas ląstelėse gali būti glaudžiai susijęs su HBV replikacijos pokyčiais. In vitro eksperimento stebėjimo laikas yra palyginti trumpas, apipjaustyto HBsAg kiekis ląstelėse in vitro gali būti mažesnis nei eksperimento in vivo , dėl kurio HBV replikacija gali skirtis tarp in vitro ir in vivo . Be to, mikroaplinkos ir sąlygų skirtumas tarp in vitro ir in vivo modelių taip pat gali turėti įtakos viruso replikacijos lygiui. Taigi, norint geriau suprasti biologines HBV mutantų savybes, reikalingi ir būtini duomenys iš atitinkamo gyvūno modelio su HBV replikacija.

Apibendrinant, tai yra pirmasis tyrimas, tiriantis HBV biologinių charakteristikų skirtumus tarp rtA181T / sW172 * ir rtA181T / sW172L mutantinių padermių. Mūsų rezultatai parodė, kad rtA181T / sW172L mutanto atsiradimas neturi akivaizdaus poveikio biologinėms HBV savybėms; o rtA181T / sW172 * mutanto atsiradimas gali sukelti HBsAg susilaikymą kepenų ląstelėse, sutrikdyti viruso dalelių sekreciją iš kepenų ląstelių ir sustiprinti viruso replikaciją kepenų ląstelėse. Remiantis šiais reikšmingais skirtumais, kai klinikinėje praktikoje aptikome HBV rtA181T mutantą, mums būtina ir svarbu atskirti sW172 * apipjaustytą mutaciją nuo sW172L pakeistos mutacijos.

Medžiagos ir metodai

Studiju dizainas

Šis tyrimas gautas etikos patvirtinimo iš Sičuano universiteto laboratorinių gyvūnų etikos komiteto, o visi bandymai su gyvūnais buvo atlikti laikantis atitinkamų gairių ir taisyklių. Šį tyrimą sudarė dvi dalys. Pirmoje dalyje buvo palygintas DNR replikacijos pajėgumas ir viruso baltymo ekspresija tarp skirtingų sutampančių S geno mutacijų (sW172L ir sW172 *) rtA181T mutanto padermės replikacijai ir baltymų ekspresijai in vitro ir in vivo HBV replikacijos sistemose. Norėdami užbaigti šį eksperimentą, buvo sukurtos mutantinės plazmidės pHBV-rtA181T / sW172L ir pHBV-rtA181T / sW172 *, sudarytos atitinkamos in vitro ir in vivo HBV replikacijos modeliai.

Antroje dalyje buvo įvertintas pakeistų, apipjaustytų ir laukinio tipo HBsAg baltymų poveikis HBV geno promotoriaus aktyvumui. Norėdami baigti šį eksperimentą, buvo sukurtos pcDNA-HBs (sW172L), pcDNA-HBs (sW172 *) ir pcDNA-HBs (wt) HBsAg eukariotų ekspresijos plazmidės, taip pat buvo HBV promotoriaus geno plazmidės ir dvigubos luciferazės reporterio tyrimo sistema. naudotas.

Plazmidės konstrukcija

Laukinio tipo pHBV4.1 yra HBV replikacijai tinkama plazmidė, kurioje yra 1, 3 HBV genomo kopijos (pagal potipį) ir kuri gali apdoroti visišką replikaciją tiek in vitro, tiek in vivo . Taigi jis gali būti naudojamas tiriant HBV 18 replikacijos biologines savybes ir paliktas mūsų laboratorijoje. Jis yra pajėgus HBV transkripcijai, replikacijai ir ekspresijai tiek in vitro, tiek in vivo . PHBV-rtA181T / sW172L ir pHBV-rtA181T / sW172 * mutantų plazmidės buvo gautos atliekant į vietą nukreiptą mutagenezę, naudojant šabloną laukinio tipo pHBV4.1. Abi dvi mutantinės plazmidės yra pajėgios HBV transkripcijai ir replikacijai. O plazmidė pHBV-rtA181T / sW172L galėtų ekspresuoti pakeistą HBsAg, o pHBV-rtA181T / sW172 * galėtų ekspresuoti apipjaustytą HBsAg.

Taip pat buvo sukurta daugybė HBsAg eukariotų ekspresijos plazmidžių (įskaitant pcDNA-HB (sW172L), pcDNA-HB (sW172 *) ir pcDNA-HB (wt)), kai pakeisti, apipjaustyti ir laukinio tipo HBsAg koduojantys genai (1176 bp). buvo atitinkamai klonuoti į eukariotų ekspresijos plazmidę pcDNA3.0, naudojant šabloną naudojant atitinkamą pHBV-rtA181T / sW172L, pHBV-rtA181T / sW172 * ir pHBV4.1. Visos šios plazmidės buvo galutinai identifikuotos ribojančių fermentų skaidymu ir seka.

In vitro ir in vivo HBV replikacijos modelių sukūrimas

HBV replikacijos ląstelių modelio su minėtomis plazmidėmis (įskaitant laukinio tipo pHBV4.1, mutantinius pHBV-rtA181T / sW172L arba pHBV-rtA181T / sW172 *) konstravimui, šiame tyrime buvo panaudotos HepG2 ląstelės, kurios buvo augintos RPMI-1640 terpė, papildyta 10% galvijų vaisiaus seruma 37 ° C, 5% CO 2 . Ir HepG2 ląstelės buvo laikinai transfekuotos 10 μg laukinio tipo arba mutantinių plazmidžių, naudojant komercinį X-tremeGENE HP DNR transfekcijos reagentą (Roche, Vokietija). O ląstelių supernatantas ir ląstelės buvo surinktos praėjus 3 dienoms po trumpalaikio transfekcijos.

Norėdami sukurti HBV replikacijos pelių modelį, iš Sičuano universiteto laboratorinių gyvūnų centro buvo įsigytos specifinės 18–20 g svorio BALB / c pelės (6–8 savaičių), kurių patogenų nėra (SPF). Kaip jau pranešėme anksčiau, pelėms per uodegos veną buvo įšvirkšta 10 μg HBV plazmidės DNR (laukinio tipo arba mutantinės HBV replikacijos plazmidės) į 2, 0 ml druskos tirpalo per 5–8 sekundes (hidrodinamikos pagrįsta in vivo transfekcija). Pelės (mažiausiai trys pelės kiekvienoje grupėje) buvo paaukotos po 1, 3, 5, 7, 10 ir 15 dienų DNR injekcijos, o serumas ir kepenų audiniai buvo surinkti. Serumas buvo laikomas –20 ° C temperatūroje ELISA analizei, o kepenų audiniai buvo laikomi formaline, kad būtų galima dažyti imunohistochemiškai, arba prieš – HCV DNR replikacijos tarpinių produktų analizę –70 ° C temperatūroje. Šiame tyrime in vitro ir in vivo eksperimentai buvo kartojami tris kartus.

HBV antigenų ir HBV DNR nustatymas

Šiame tyrime HBsAg buvo kiekybiškai įvertintas naudojant chemiliuminescenciją (Abbott Laboratories, Amerika), tuo tarpu HBeAg buvo aptiktas naudojant fermentais sujungtus imunosorbentų tyrimų rinkinius (Shanghai Shiye Kehua Company, Kinija) ląstelių kultūros supernatantuose HepG 2 ląstelėse ir pelių serume. Absorbcija buvo matuojama mikrotitravimo plokštelių skaitytuve, matuojant dviejų bangų ilgį (450/645 nm). Be to, realaus laiko PGR (qPCR) technologija taip pat buvo naudojama HBV DNR aptikti HepG2 ląstelių ląstelių kultūros supernatantuose ir pelių serume, naudojant diagnostinį rinkinį (Da An Gene, Guangdžou, Kinija).

Imunohistocheminis dažymas buvo atliktas norint nustatyti intrahepatinius HBsAg ir HBcAg formalino fiksuotuose ir parafino turinčiuose kepenų audiniuose pagal gamintojo protokolą, naudojant specifinius antikūnus prieš HBsAg (pelių anti-HBs, Thermol) ir HBcAg (triušio anti-HBc)., NEOMARKERS).

Tarpinių virusų replikacijos nustatymas

Virusinės DNR replikacijos tarpinių medžiagų išskyrimui ląstelės lizuojamos ir DNR filtrų hibridizacijos analizės buvo atliktos naudojant 30 μl viruso DNR replikacijos tarpinių junginių, kaip aprašyta anksčiau. Užšaldyti kepenų audiniai buvo mechaniškai susmulkinti į skystą azotą, o HBV DNR replikacijos tarpiniai produktai buvo išskirti iš šimto dvidešimt mikrogramų kepenų audinio miltelių, kaip aprašyta anksčiau. Šie HBV DNR replikacijos tarpiniai produktai buvo praskiesti iki 30 μL TE buferiu.

Visi viruso replikacijos tarpiniai produktai buvo analizuojami Southern blot, kaip aprašyta anksčiau. Membranos buvo hibridizuotos su digoksigeninu pažymėtu (Roche Applied Science) HBV genomo DNR, siekiant nustatyti HBV sekas. Tarpinių virusų replikacijos lygiai buvo apskaičiuoti naudojant „Quantity One“ programinę įrangą pagal gamintojo instrukcijas (Bio-Rad).

HBV promotoriaus veiklos analizė

Transfekcijos, naudojant luciferazės reporterio geno konstrukciją, buvo atliktos 6 šulinėlių plokštelėse, kuriose buvo maždaug 3 x 104 HepG2 ląstelių viename ml. Transfekuotą DNR mišinį sudarė 5 μg HBV promotoriaus geno plazmidės (CpLUC arba PS1pLUC arba SpLUC arba XpLUC) ir 0, 5 μg HBsAg eukariotų ekspresijos plazmidės (pcDNA-HBs (wt) arba pcDNA-HBs (sW172 *) arba pcDNA-HBs). sW172L)) arba neigiamos kontrolės plazmidė pcDNA3.1. Be to, plazmidė PRL-SV40 taip pat buvo kartu transfekuota ir naudojama kaip vidinė kontrolė transfekcijos efektyvumui.

Visi ląstelių lizatai buvo paruošti iš ląstelių, surinktų per 40 - 48 valandas po transfekcijos. Liuciferazės tyrimas buvo atliktas naudojant 10 μl transfekuotų ląstelių lizatų, naudojant dvigubos luciferazės reporterio analizės sistemą, kaip nurodė gamintojas. Firefly liuciferazės aktyvumo ir Renilla luciferazės aktyvumo santykiai buvo apskaičiuoti kaip santykinis luciferazės aktyvumas (F / R). Santykiniai plazmidės pcDNA3.1 luciferazės aktyvumo lygiai buvo apibrėžti kaip 1.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Zhou, L.-Y. et al . HBV rtA181T mutantų su sutrumpinta arba pakeista HBsAg ekspresija biologinių charakteristikų palyginimas in vitro ir in vivo modelių sistemose. Mokslas. 6 rep. , 39260; „doi“: 10.1038 / srep39260 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.