Blokuodamas vegf / caveolin-1 signalus, padeda apsaugoti inkstų fasudilį streptozotocino sukeltų žiurkių, sergančių diabetu, atveju | acta pharmaologica sinica

Blokuodamas vegf / caveolin-1 signalus, padeda apsaugoti inkstų fasudilį streptozotocino sukeltų žiurkių, sergančių diabetu, atveju | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

RhoA / ROCK signalizacija vaidina svarbų vaidmenį sergant diabetine nefropatija, o ROCK inhibitorius fasudilis nefroprotezuoja eksperimentinę diabetinę nefropatiją. Šiame tyrime mes ištyrėme molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiami fasudilio apsauginiai veiksmai žiurkių diabetinės nefropatijos modelyje.

Metodai:

Streptozotocino (STZ) sukeltos žiurkės, sergančios cukriniu diabetu, kurioms 8 mėnesius buvo skiriamas peroralinis fasudilis arba teigiamos kontrolės vaistas enalaprilis. Gydymo metu buvo įvertinti metaboliniai parametrai ir kraujospūdis. Po žiurkių eutanazijos buvo paimti inkstų mėginiai histologiniams ir molekuliniams biologiniams tyrimams. VEGF, VEGFR1, VEGFR2 ir fibronektino ekspresija bei Src ir caveolin-1 fosforilinimas inkstuose buvo įvertinti naudojant RT-PCR, Western blot ir imunohistochemijos tyrimus. Ryšys tarp VEGFR2 ir caveolin-1 buvo išanalizuotas imunodecipitacijos būdu.

Rezultatai:

Lėtinis fasudilio (30 ir 100 mg · kg –1 · d – 1 ) arba enalaprilio (10 mg / kg, du kartus per parą) vartojimas reikšmingai sumažino glomerulų sklerozę ir albuminuriją diabetu sergančioms žiurkėms. Be to, gydymas fasudiliu užkirto kelią VEGF, VEGFR1, VEGFR2 ir fibronektino reguliavimui bei padidėjusiam VEGFR2 ir caveolin-1 ryšiui inkstų žievėje ir iš dalies blokavo Src aktyvaciją ir caveolin-1 fosforilinimąsi tirozinu 14 inkstuose, tuo tarpu enalaprilis. gydymas neturėjo įtakos VEGFR2 / Src / caveolin-1 signalizacijos keliui.

Išvada:

Fasudil apsaugo nuo STZ sukeltos diabetinės nefropatijos, blokuodamas VEGFR2 / Src / caveolin-1 signalizacijos kelią ir fibronektino padidėjusį reguliavimą. Taigi VEGFR2 gali būti potencialus terapinis taikinys gydant diabetinę nefropatiją.

Įvadas

Diabetinė nefropatija yra viena rimčiausių mikrovaskulinių cukrinio diabeto komplikacijų. Dabartinis diabetinės nefropatijos gydymas apima gliukozės ir kraujospūdžio kontrolės optimizavimą nukreipiant renino ir angiotenzino sistemą (RAS) į angiotenziną konvertuojančio fermento (AKF) inhibitorius ir (arba) angiotenzino II receptorių blokatorius. Nepaisant šių priemonių, inkstų pažeidimas progresuoja daugeliui pacientų. Todėl reikalingos naujos strategijos, o kai kurie naujausi tyrimai rodo, kad perspektyvus 1, 2, 3, 4, 5 požiūris yra mažo G-baltymo RhoA ir jo pasroviuose esančio efektoriaus, su Rho susijusios kinazės (ROCK), slopinimas.

„RhoA“ yra geriausiai ištirtas „Rho GTPase“ šeimos narys. „RhoA“ elgiasi kaip „molekulinis jungiklis“, kuris keičiasi nuo neaktyvios, su BVP susijusios būsenos iki aktyvios, su GTP susijusios būsenos 6 . ROCK yra pagrindinis „RhoA“ efektorius. RhoA / ROCK signalizacija reguliuoja daugybę ląstelių funkcijų, įskaitant kraujagyslių susitraukimą, aktino citoskeleto pertvarkymą, ląstelių morfologiją, judrumą, adheziją ir proliferaciją. Naujausi tyrimai parodė, kad RhoA / ROCK signalizacija yra svarbi diabetinės nefropatijos priežastis 9, 10 . Fasudilis, santykinai specifinis ROCK inhibitorius, turi nefroprotekcinį poveikį eksperimentinės diabetinės nefropatijos metu 11, 12, 13 . Tarp galimų mechanizmų yra cukrinio diabeto sukeltas inkstų TGF-β, CTGF ir tarpląstelinės matricos (ECM) baltymų ekspresijos padidėjimas, dėl kurio lėčiau glomerulosklerozė ir intersticinė fibrozė vystosi. Taip pat gali būti naudojami hemodinaminiai mechanizmai ir anti-proteinurinis poveikis. Fasudilis taip pat slopina kitas kinazes, tokias kaip baltymo kinazės C izoformos 14, kurios gali prisidėti prie nefroprotekcinių veiksmų. Tačiau mechanizmai, pagrindžiantys RhoA / ROCK signalizacijos aktyvavimą diabetinės nefropatijos metu, išlieka nežinomi, todėl molekulinius fasudilio mechanizmus reikėtų apibūdinti išsamiau.

Citokinų kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF) yra svarbus normalus inkstų funkcijos reguliatorius 15 . Neseniai buvo įrodyta, kad VEGF yra padidėjęs gliukozės kiekis mesangialinėse ląstelėse ir reguliuojamas diabetinės nefropatijos patogenezėje. Padidėjęs VEGF susijęs su glomerulų hipertrofija, proteinurija ir ECM gamyba 16, 17, 18 . Pengas ir kt. Parodė, kad VEGF transkripcijos padidėjimą mezangialinėse ląstelėse, kurias sukėlė gliukozė, užkirto kelią Rho inhibitorius Y-27632, nurodydamas, kad VEGF padidėjęs reguliavimas galbūt priklauso nuo RhoA / ROCK signalizacijos 10 . Yra žinomi trys VEGF receptoriai: su VEGFR1 / fms susijusi tirozino kinazė 1 (Flt1), VEGFR2 / kinazės įterpimo domeno receptorius (KDR) ir Neuropilin-1 19 . VEGF sužadina savo biologines funkcijas aktyvuodamas specifinius transmembraninius receptorius (VEGFR1 ir VEGFR2), turinčius vidinį tirozinkinazės aktyvumą 20 . Neuropilinas-1 neturi tirozinkinazės aktyvumo. Duomenų apie VEGF signalizacijos kelių vaidmenį diabetinės nefropatijos metu yra nedaug. Šiame tyrime buvo atkreiptas dėmesys į galimus VEGF ir jo receptorių (VEGFR1 ir VEGFR2) slopinimo fasudiliu slopinimo mechanizmus streptozotocino (STZ) sukeltų diabetinių žiurkių inkstų žievėje. Fasudilio poveikis buvo lyginamas su AKF inhibitoriumi enalapriliu, kuris yra žinomas terapinis agentas tiek klinikinei, tiek eksperimentinei diabetinei nefropatijai gydyti.

medžiagos ir metodai

Diabetinis žiurkių modelis

Pagal oficialias Kinijos bendruomenės gairių rekomendacijas buvo atlikti bandymai su 200–225 g sveriančiomis „Sprague-Dawley“ žiurkėmis (gyvūnų centras, Wuhano universitetas, Kinija). Diabetas buvo sukeltas 55 mg / kg STZ (Sigma, St Louis, Misūris, JAV) injekcijomis uodegos venomis. Kontrolinėms žiurkėms ( n = 10) buvo sušvirkštas vienodas tūris citrato buferio. Hiperglikemija (gliukozės kiekis kraujyje> 20 mmol / L) buvo patvirtinta (2 d. Po injekcijos) atspindžio matuokliu („One Touch“, „Lifescan“, „Milpitas“, Kalifornija, JAV). Diabetinės žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į penkias grupes: negydyto, mažo dozės fasudilio (10 mg · kg –1 · d – 1 ; Sigma), vidutinės dozės fasudilio (30 mg · kg –1 · d – 1 ), didelės dozės. fasudilis (100 mg · kg –1 · d – 1 ) ir enalaprilis (10 mg / kg du kartus per parą; Merck, Darmštatas, Vokietija) atliekant intragastrinį mankštą (ig). Gydymas tęsėsi 8 mėnesius. Visos žiurkės galėjo laisvai patekti į įprastą laboratorinį maistą ir vandenį. Diabetinės žiurkės taip pat vartojo mažų dozių insuliną, jei to prireikė, kad būtų išvengta ketonurijos, įvertinus matuokliu (Bayer Multistix), bet palaikant hiperglikemiją> 20 mmol / L. Visų žiurkių, sergančių cukriniu diabetu, gliukozės kiekis kraujyje buvo stebimas kas savaitę. Šlapimo mėginiai 24 valandas buvo renkami metaboliniuose narvuose 1, 3 ir 8 mėnesius. Sistolinis kraujospūdis kas mėnesį buvo nustatomas uodegos manžetės metodu. Po anestezijos sukėlimo suleidus natrio pentobarbitalį (50 mg / kg, ip), iš aortos buvo paimtas kraujas, inkstai pašalinti. Inkstų mėginiai buvo greitai išgriebti, pasverti, užšaldyti skystame azote ir laikomi –80 ° C temperatūroje. Inkstų hipertrofija buvo įvertinta pagal inkstų ir kūno svorio santykį (mg / g) eutanazijos metu. Kai kurie mėginiai buvo fiksuoti imunohistochemijos ar perdavimo elektronų mikroskopijos tikslais.

Biocheminė analizė ir morfologiniai tyrimai

Gliukozės kiekį kraujyje, serumo ar šlapimo kreatinino kiekį ir albumino kiekį šlapime nustatė Wuhano universiteto Zhongnano ligoninės klinikinės laboratorijos skyrius. Ccr (ml · min –1 · 100 g kūno svorio –1 ) = šlapimo kreatininas × šlapimo tūris (ml · min –1 ) / kreatinino kiekis serume 100 g kūno svorio. Atliekant morfologinius tyrimus, išpjaustyti inkstai buvo fiksuoti 10% formalino, dehidratuoti per rūšinį etanolio kiekį, įterpti į parafiną, supjaustyti 4 μm storio riekelėmis ir pritvirtinti ant stiklinių stiklelių. Kai kurie skyriai buvo dažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E), kad būtų galima stebėti audinių morfologiją. Kai kurios fiksuotos sekcijos buvo nudažytos periodiniu rūgšties-Schiffo (PAS) reagentu. Trumpai tariant, parafinuotos sekcijos buvo oksiduojamos 0, 5% periodinės rūgšties tirpale 5 minutes ir dažytos Schiff reagente 15 minučių. Po 5 minučių plovimo drungname vandentiekio vandenyje, sekcijos buvo dehidratuotos per rūšinį etanolio kiekį. Galiausiai dangtelio stikleliai buvo uždedami ant stiklinių stiklelių su montavimo terpe (neutraliu balzamu), ir skaidrės buvo stebimos šviesos mikroskopu.

Glomerulosklerozės balas

Iš viso atsitiktinai iš 2–3 skaidrių (PAS dažytos sekcijos) buvo parinkti 50 pilno dydžio glomerulų ir įvertinti 400 kartų padidinimu. Glomerulinė sklerozė buvo įvertinta eksperimentuotojo, kuris nebuvo aklas gydymo grupėms) taip: 0 = nėra sklerozės, 1 = 25% glomerulų srities, 2 = 50%, 3 = 75%, 4 = 100% 21 . Skyriai buvo įvertinami apžiūrint. Kiekvienai glomerulai buvo priskiriamas balas, o šios vertės buvo suveržiamos, kad būtų gautas kiekvienos grupės galutinis balas.

Imunohistochemija

Inkstų žievės žievės pjūviai, formuojami fiksuotuose parafino pavidalu (4 μm), buvo reguliariai deparafinuoti ir rehidratuoti distiliuotame vandenyje. Pirmiausia deparafinuoti skyriai buvo paimti šilumos indukuotu antigenu, inkubuojant citrato buferiniame tirpale (pH 6) 20 min., Esant 95 ° C, atvėsinti iki kambario temperatūros ir plauti PBS. Tada šios sekcijos 10 minučių buvo apdorotos 3% H2O2, kad būtų užblokuotas endogeninės peroksidazės aktyvumas. Po skalavimo sekcijos buvo užblokuotos 3% BSA tirpalu PBS ir buvo inkubuotos su monokloniniu anti-žiurkių VEGFR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Dalasas, Teksasas, JAV) arba monokloniniu anti-žiurkės VEGFR2 (1: 100, Santa Cruz). Biotechnologijos) 4 ° C temperatūroje per naktį. Po to sekcijos buvo inkubuojamos antriniame antikūnyje 30 min. Po plovimo PBS, sekcijos buvo nudažytos 3, 3'-diaminobenzidino tirpalu (DAB). Branduolio dažymas buvo atliekamas hematoksilinu. Nebuvus pirminio antikūno, atlikta neigiama kontrolė. Teigiamą dažymą (tamsiai rudą) du tyrėjai kiekybiškai įvertino padidindami didelę galią (× 400), naudodami vaizdų analizės programinę įrangą „Image-Pro Plus 7.0“. Duomenys išreiškiami kaip vidutinis slenksčio ploto intensyvumas.

Perdavimo elektronų mikroskopija

Nedidelis inksto žievės gabalas buvo paimtas perdavimo elektronų mikroskopijai (TEM). Audinys buvo pritvirtintas 2, 5% gliutaraldehido, po to pritvirtintas 1% osmio tetroksidu ir nudažytas visuotinai 2% vandeniniu uranilacetatu. Tada mėginiai buvo apdoroti EM įrenginyje Wuhan universitete ir apžiūrimi naudojant HT7700 perdavimo elektronų mikroskopą (Hitachi, Tokijas, Japonija) esant 40–80 kV įtampai. Rūsio membranos storis buvo įvertintas ant periferinių kilpų, kurios buvo fotografuotos atsitiktine tvarka, padidinant 10 000 kartų. Apskaičiuotas harmoninis matavimų 80–100 taškų, kertančių tinklelį nuo 1–2 glomerulų, vidurkis.

Baltymų ekstrahavimas ir Western blot

Inkstų žievės arba glomerulos buvo homogenizuotos lizės buferyje, o baltymai buvo ekstrahuojami, kaip skelbta anksčiau 22 . Trumpai tariant, ląstelės buvo lizuotos buferiniame tirpale, kuriame yra 50 mmol / L Tris, pH 7, 4, 150 mmol / L NaCl, 1% Triton X-100, 10% glicerolio, 5 mmol / L EDTA, 100 μmol / L natrio vanadato, 1 mmol / l. L β-glicerofosfatas, 1 mmol / L natrio fluoridas, 2 μg / ml leupeptino, 10 μg / ml aprotinino ir 1 mmol / L PMSF. Lizatai buvo surinkti ir centrifuguoti 10 000 x g greičiu 10 min. 4 ° C temperatūroje, kad susikauptų ląstelių nuosėdos. Supernatantas (50 μg) buvo atskirtas SDS-PAGE, ir Western blotinimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau 22 . Pirminius antikūnus sudarė monokloninis VEGFR1 (1: 500, „Santa Cruz Biotechnology“), monokloninis VEGFR2 (1: 500, „Santa Cruz Biotechnology“), monokloninis fibronektinas (1: 5000, „BD Biosciences“, San Chosė, Kalifornija, JAV), monokloninis fosfo-MYPT. „Thr853“ (1: 1000, ląstelių signalizacijos technologija, „Danvers“, MA, JAV), monokloninis fosfokaveolin-1 Y14 (1: 1000, „BD Biosciences“), polikloninis fosfo-Src Y416 (1: 1000, ląstelių signalizacijos technologija) ir monokloninis β -aktinas (1: 5000, „Sigma“).

Imuninis nusėdimas

Inksto žievės buvo lizuojamos lizės buferiu su 60 mmol / L N -oktilo-gliukopiranozido, kaip skelbta anksčiau 22 . Po išaiškinimo vienodi lizatų kiekiai buvo inkubuojami per naktį su 2 μg pirminio antikūno, besisukančio 4 ° C temperatūroje, po to po 25 μL baltymo G-agarozės suspensijos 1, 5 h 4 ° C temperatūroje. Imuniniai krituliai buvo plaunami, suspenduojami 2x mėginio buferyje, virinami ir analizuojami imant imunoblotus.

Kiekybinis realaus laiko PGR

Kiekybinė polimerazės grandininė reakcija (qPCR) buvo atlikta su RNR, ekstrahuota iš inksto žievės. Visa RNR buvo išskirta naudojant TRIzol reagentą pagal gamintojo instrukcijas (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, JAV). cDNR buvo transkribuota atvirkščiai, naudojant atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Promega, Madisonas, JAV). Kiekybinis PGR buvo atliktas dviem egzemplioriais, naudojant MiniOpticon (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, JAV). Kiekvieno genų rinkinio neigiamos cDNR kontrolės buvo įtrauktos į visas PGR reakcijas, siekiant nustatyti užteršimą. Termociklo programa buvo nustatyta kaip 10 minučių 94 ° C temperatūroje, po to sekė 30 ciklų, veikiant 94 ° C temperatūroje 30 s, 60 ° C 30 s ir 72 ° C 1 minutę. Kiekvieno geno ekspresijos lygis buvo apskaičiuotas naudojant ΔCt metodą β-aktino atžvilgiu.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant vienpusę ANOVA, po kurios sekė Tukey sąžiningai reikšmingo skirtumo (HSD) testai post hoc analizei (SPSS 17.0 „Windows“). P <0, 05 buvo laikomas reikšmingu. Eksperimentai buvo pakartoti kelis kartus, o pasikartojimų skaičius pateiktas paveikslo legendose ( n ).

Rezultatai

Fasudilio poveikis metaboliniams parametrams ir kraujospūdžiui

Visų gyvūnų grupių metaboliniai parametrai yra apibendrinti 1 lentelėje. Diabetinėms žiurkėms buvo didesnė gliukozės koncentracija plazmoje, padidėjo inkstų hipertrofija (inkstų ir kūno svorio santykis) ir sumažėjo kūno svoris. Faudilio ir enalaprilio vartojimas neturėjo įtakos gliukozės koncentracijai plazmoje, kūno svoriui ar inkstų hipertrofijai žiurkėms, sergančioms diabetu. Fasudilis ir enalaprilis neturėjo įtakos žiurkių, sergančių diabetu, kraujospūdžiui. Sergantiesiems cukriniu diabetu serumo kreatinino (2 lentelė) ir kreatinino klirenso (3 lentelė) 1 mėnesį buvo žymiai padidėjęs, palyginti su kontroliniais. Mažų dozių fasudilio (10 mg / kg) ir enalaprilio vartojimas neturėjo jokio poveikio. Vidutinės dozės (30 mg / kg) ir didelės dozės fasudilio (100 mg / kg) dozės pagerino serumo kreatinino ir kreatinino klirensą sergančioms žiurkėmis. 3 ar 8 mėnesį tarp grupių kreatinino ir kreatinino klirenso skirtumų nebuvo. Padidėjęs albuminų išsiskyrimas, būdingas ankstyvosios diabetinės nefropatijos požymis, buvo pastebėtas diabetu sergančių asmenų grupėje ir užkirstas kelias gydant vidutinėmis ar didelėmis fasudilio dozėmis (4 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Fasudilio poveikis inkstų morfologijai ir ECM baltymams

Palyginti su kontrolinėmis grupėmis, STZ sukeltų diabetu sergančių žiurkių glomerulinė PAS teigiamos matricos kaupimasis buvo reikšmingas (1A pav.). Padidėjusi glomerulų sklerozė buvo pastebėta diabetu sergančių asmenų grupėje, o sklerozei buvo užkirstas kelias vidutinės ir didelės dozės fasudilio grupėse, bet ne mažų dozių fasudilio grupėje (1B pav.). Diagnozuotosioms žiurkėms padidėjo glomerulų pagrindinės membranos (GBM) storis (1C paveikslas, 1D pav.). Kontroliniams gyvūnams glomerulų podocitų pėdų procesai yra reguliariai išdėstomi statmenai rūsio membranai. Cukrinio diabeto grupėje podocitų pėdos procesai pasirodė sulieti arba ištrinti (strėlės) išilgai GBM paviršiaus (1 pav. D). Gydymas vidutinės ar didelės dozės fasudiliu sumažino GBM sustorėjimą ir podocitų pėdų procesą.

Image

ROCK inhibitorius fasudilis pagerina diabetinės nefropatijos glomerulų pažeidimus in vivo . (A) Glomerulų histopatologinė analizė, naudojant periodinį rūgščių-šifų (PAS) dažymą. Kiekvienos grupės glomerulų tipinės mikrofotografijos parodytos originaliu 400x padidinimu. (B) Buvo įvertintas glomerulų matricos kaupimasis ir balai buvo suskirstyti po gydymo grupei pagal medžiagų ir metodų išdėstytą klasifikavimo schemą ( b P <0, 05, palyginti su kontroline grupe). (C) Glomerulinės bazinės membranos (GBM) storis buvo stebimas atliekant perdavimo elektronų mikroskopiją (TEM), duomenys apibendrinti brūkšninėje diagramoje ( b P <0, 05, palyginti su kontrole). (D) Reprezentatyvios GBM mikrofotografijos rodomos 10 000 kartų padidinimu. Juodos rodyklės žymi židinius pėdos proceso srityje. F10, F30 ir F100: SD žiurkės, gydomos 10, 30 ir 100 mg / kg fasudilio per parą.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Mes įvertinome inkstų žievės ROCK aktyvaciją kiekvienoje grupėje atliekant Western blot analizę fosfo-MYPT Thr853. Didesnį ROCK aktyvavimą diabetinėje inkstų žievėje užkerta kelią vidutiniškai ir didelėmis fasudilio dozėmis. Nors buvo tendencija mažėti ROCK aktyvacijai vartojant enalaprilį, tai nebuvo reikšminga (2A pav.). Be to, gydant vidutinėmis ir didelėmis dozėmis fasudiliu, fibronektino padidėjimas diabeto inkstų žievėje buvo užkirstas kelias, o veiksmingumas buvo panašus į enalaprilio (2B paveikslas). Šie rezultatai patvirtina, kad inkstų sužalojimams būdinga glomerulosklerozė ir ECM kaupimasis STZ sukeltų diabetinių žiurkių organizme (kaip tikėtasi). ROCK slopinimas, vartojant daugiau nei 30 mg / kg fasudilio, galėtų palengvinti žiurkių, sergančių diabetu, inkstų pažeidimus.

Image

ROCK inhibitorius fasudilis apsaugo nuo MYPT fosforilinimo ir fibronektino padidėjimo diabeto inkstuose. (A) MYPT fosforilinimas (Thr 853) buvo nustatytas atliekant Western blot analizę kaip inkstų žievės ROCK aktyvumo rodiklį ( b P <0, 05, palyginti su kontrole). (B) Fibronektino (FN) baltymų lygis buvo tiriamas atliekant Western blot analizę inkstų žievės homogenatuose, naudojant aktyvinimą kaip kontrolinį krūvį ( b P <0, 05, palyginti su kontrole). Viršutiniame skydelyje parodyti tipiniai blotimai tiek A, tiek B, o žemiau pateiktoje diagramoje apibendrinti visų gyvūnų duomenys.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Fasudilio poveikis VEGF reguliavimui ir jo receptoriams diabetiniuose inkstuose

VEGF ir jo receptoriai vaidina pagrindinį vaidmenį diabetinės nefropatijos patogenezėje. Tačiau nebuvo išspręsta, ar Rho inhibitoriai neleidžia reguliuoti VEGF ir VEGF receptorių. Pirmiausia nustatėme VEGF inkstų žievės išraišką. VEGF mRNR ir baltymų lygis padidėjo žiurkėms, sergančioms diabetu, palyginti su kontrolinėmis grupėmis. Šiuos lygius atstatė vidutinio ir didelio dozės fasudilis (3A, 3B pav.). Inkstų žievėje nustatyta VEGF receptoriaus baltymo ekspresija. VEGFR1 ir VEGFR2 imunohistochemija žievės pjūviuose parodė stiprų VEGFR1 ir VEGFR2 dažymą žiurkių, sergančių diabetu, glomeruluose ir kanalėlėse, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (4A pav.). Vidutinės ir didelės dozės fasudilis neleido sureguliuoti VEGFR1 ir VEGFR2, o enalaprilis nepaveikė VEGFR1 ir VEGFR2 dažymo žiurkių inkstų žievėje. Tada mes nustatėme VEGFR1 ir VEGFR2 baltymų lygius atlikdami Western blot analizę (4B paveikslas). Vidutinės ir didelės dozės fasudilis slopino padidėjusį VEGFR1 ir VEGFR2 baltymų kiekį diabeto inkstų žievėje, atsižvelgiant į imunohistochemijos rezultatus.

Image

ROCK inhibitoriaus fasudilis sumažina VEGF genų ir baltymų ekspresiją diabeto inkstuose. (A) VEGF geno ekspresija buvo nustatyta inksto žievės mėginiuose realiojo laiko PGR. (B) VEGF baltymų lygis inkstų žievėje buvo įvertintas atliekant Western blot analizę, o aktyvinimas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Duomenys parodomi kaip raukšlės indukcija, palyginti su kontroline ( b P <0, 05, palyginti su kontrole).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę
Image

ROCK inhibitorius fasudilis apsaugo nuo VEGFR1 ir VEGFR2 padidėjimo diabeto inkstuose. (A) Parodytos reprezentatyvios VEGFR1 ir VEGFR2 mikrofotografijos (400 ×). Inkstų žievės VEGFR1 ir VEGFR2 kompiuterinė analizė, išreikšta ploto procentais ( b P <0, 05, palyginti su kontrole). (B) VEGFR1 ir VEGFR2 baltymų kiekis inkstų žievėje buvo įvertintas atliekant Western blot analizę, o aktyvinimas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė ( b P <0, 05, palyginti su kontrole).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Fasudilio poveikis VEGF receptorių ir caveolin-1 asociacijai diabeto inkstuose

Ankstesni mūsų duomenys parodė, kad caveolin-1 ir VEGFR2 ryšys buvo susijęs su VEGF sukeltos fibronektino padidėjusiu reguliavimu mesangialinėse ląstelėse. Šis ryšys taip pat padidėjo diabetinių žiurkių inkstų žievėje, nors tiek VEGFR1, tiek VEGFR2 receptorių baltymų kiekis padidėjo žiurkėms, sergančioms diabetu 23 . Čia mes įvertinome fasudilio poveikį asociacijai tarp VEGFR2 ir caveolin-1, imuniniu būdu nusodindami caveolin-1 iš inkstų žievės. Padidėjusiam VEGFR2 ir caveolin-1 ryšiui diabetu sergančioms žiurkėms buvo išvengta vidutinio ir didelio dozės fasudilio, bet ne enalaprilio (5 pav.). Šie duomenys rodo, kad VEGFR2 / caveolin-1 signalizacijos kelią greičiausiai blokuoja ROCK slopinimas diabetinės nefropatijos metu.

Image

Diabetinių inkstų faudilis slopina VEGFR2 ryšį su caveolin-1. Iš inksto žievės homogenizuotų medžiagų buvo tikimasi, kad caveolin-1 buvo imuninis, o jo ryšys su VEGFR2 buvo įvertintas Western blot tyrimu ( b P < 0, 05, palyginti su kontrole).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Fasudilio poveikis Src ir caveolin-1 fosforilinimui diabetiniuose glomeruluose

Src šeimos kinazės yra vienintelės žinomos caveolin-1 Y14 kinazės 24, 25, o mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad TGF-β ir VEGF sukeltos Src aktyvacijos sąlygojo caveolin-1 fosforilinimas Y14, po kurio seka fibronektino sintezė mesangialinėse ląstelėse 23, 26 . Kadangi fasudilis užkirto kelią VEGF reguliavimui diabetiniuose inkstuose, mes ištyrėme fasudilio poveikį Src ir caveolin-1 fosforilinimo lygiams. Mes ištyrėme Y416 auto-fosforilinimą Src, kuris rodo padidėjusį Src aktyvumą, ir caveolin-1 fosforilinimą Y14 glomeruluose, atlikdami imunoblotus. Fosforilinto Src ir caveolin-1 reikšmingai padidėjo glomerulų izoliatuose, palyginti su kontroliniais. Gydymas vidutinėmis ir didelėmis fasudilio dozėmis iš dalies blokavo Src ir caveolin-1 fosforilinimą; enalaprilis neturėjo jokio poveikio (6A, 6B pav.). Šie rezultatai leidžia manyti, kad teigiamas fasudilio poveikis yra susijęs su padidėjusio Src kinazės aktyvumo ir paskesnio caveolin-1 fosforilinimo sukietėjimu diabetinėms žiurkėms.

Image

Src aktyvaciją ir caveolin-1 fosforilinimą Y14 diabetiniuose glomeruluose iš dalies blokuoja ROCK inhibitoriaus fasudilis. (A) Y416 fosforilintas Src (pSrc Y416) glomerulų izoliatuose buvo įvertintas Western blot metodu. (B) Y14-fosforilintas caveolin-1 (pCav-1 Y14) glomerulų izoliatuose buvo įvertintas Western blot metodu. ( b P <0, 05, palyginti su kontroline. e P <0, 05, palyginti su diabeto grupe).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Diabetinė nefropatija yra pagrindinė inkstų ligos galutinės stadijos priežastis, kuriai būdingas GBM sustorėjimas, mezanialinis išsiplėtimas ir glomerulų hipertrofija ankstyvosiose stadijose, po kurių eina ECM kaupimasis, glomerulosklerozė ir tubulointersticinė fibrozė. Naujausi tyrimai parodė, kad gydymas fasudiliu, ROCK inhibitoriumi, užkerta kelią eksperimentinei diabetinei nefropatijai, slopindamas signalizacijos kelius, susijusius su angiotenzinu II, TGF-β ir ECM kaupimu 9, 10, 27 . Tačiau kol kas nebuvo išspręsta, ar fasudilis blokuoja VEGF signalizaciją. Mes nustatėme anksčiau nepripažintą fasudilio poveikio apsaugą užtikrinantį mechanizmą, užkertant kelią VEGF ir jo receptorių reguliavimui, VEGFR2 / caveolin-1 asociacijai ir sustiprėjusiai fibronektino sintezei STZ sukeltos diabetinės nefropatijos metu.

Diabetu sergančioms žiurkėms išsivystė inkstų hipertrofija, lengva albuminurija ir progresuojanti glomerulosklerozė. Lėtinis gydymas vidutinėmis (30 mg / kg) ir didelėmis (100 mg / kg) dozėmis fasudiliu palengvino inkstų sužalojimus, nedaro įtakos kraujospūdžiui ir gliukozei, o tai atitinka ankstesnius tyrimus 10, 12 . Nors vidutinės dozės fasudilio grupėje kraujospūdis mažėjo, ši tendencija nebuvo reikšminga. Komers et al pranešė, kad ūmus fasudilio vartojimas sumažino tiek kontrolinių, tiek diabetinių žiurkių kraujo spaudimą 28 . Tačiau hipertenzija yra dažniausiai pasitaikantis nepageidaujamas reiškinys, susijęs su VEGFR-tirozino kinazės inhibitoriais, o ROCK slopinimas slopina sunitinibo (VEGF antagonisto) sukeltą hipertenziją 29 . Norint nustatyti, ar fasudilis turi specifinį vaidmenį kontroliuojant kraujospūdį, reikia papildomų tyrimų. Mažos dozės (10 mg / kg) fasudilis šiame tyrime neturėjo jokio poveikio, kuris skiriasi nuo ankstesnių tyrimų 4, 27 ir gali būti susijęs su gyvūnų modelių, gydymo laikotarpių ir protokolų skirtumais.

Šiame tyrime mes įvertinome fasudilio poveikį serumo kreatinino ir kreatinino klirensui per visą ligos eigą ir išplėtėme ankstesnius rezultatus, kurie nebuvo ištirti anksčiau. Pirmą mėnesį diabetu sergančioms žiurkėms padidėjo kreatinino ir kreatinino klirensas serume, o tai pagerino vidutinis ir didelis dozių fasudilis, bet ne enalaprilis. Mūsų duomenys parodė, kad fasudilis gali pagerinti sustiprintą GFR labai ankstyvoje nefropatijos stadijoje. 3 ar 8 mėnesį tarp grupių nebuvo stebėtas kreatinino ar kreatinino klirenso skirtumas, o tai sutinka su ankstesniais tyrimais 5, 27 .

Inkstuose VEGF ir jo receptoriai yra plačiai ekspresuojami įvairių tipų ląstelėse 30, 31 . VEGF vaidina pagrindinį vaidmenį diabetinės nefropatijos patogenezėje, nes turi moduliacinį poveikį glomerulų hipertrofijai, proteinurijai ir ECM gamybai. 32, 33, 34 . Tačiau apie fasudilio poveikį VEGF reguliavimui mažai žinoma. Šis tyrimas parodė, kad fasudilis slopina VEGF padidėjusį reguliavimą žiurkės diabeto inkstų žievėje. Panašiai Pengas ir kiti 10 įrodė, kad Rho inhibitorius Y-27632 užkerta kelią dideliam gliukozės sukeltam VEGF transkripcijos reguliavimui mezangialinėse ląstelėse. Šie rezultatai rodo, kad VEGF reguliavimas tikriausiai priklauso nuo RhoA / ROCK signalizacijos. Atsižvelgdami į šiuos stebėjimus, mes taip pat įvertinome fasudilio poveikį dviejų VEGF receptorių, VEGFR1 ir VEGFR2, baltymų lygiams, atlikdami imunohistochemiją ir Western blot analizę žiurkių diabetinei inkstų žievei. Padidėjusį VEGFR1 ir VEGFR2 baltymų kiekį diabetikams slopino vidutinės ir didelės dozės fasudilis, palaikantis galimą fasudilio vaidmenį užkertant kelią VEGF signalų perdavimui.

Nors VEGF signalizavimas suaktyvinamas diabetinės nefropatijos metu, mažai žinoma apie skirtingų VEGF receptorių funkcijas. VEGF 165, biologiškai aktyviausia VEGF izoforma, daugiausia signalizuoja per VEGFR2, nors VEGF 165 taip pat gali „išlaikyti“ VEGFR1, kuris turi ribotą signalizacijos potencialą 35 . VEGFR2 buvo lokalizuotas caveolae keliose ląstelių linijose, o caveolae buvo įtrauktos į VEGF sukeltą ERK2 / 1 signalizaciją ir pralaidumą kraujagyslių endotelio ląstelėse 36, 37 . Caveolae yra specializuoti plazminės membranos mikrodomenai, morfologiškai apibūdinami kaip 50–100 nm omega formos invagacijos pagal elektroninės mikroskopijos 38, 39 stebėjimus. „Caveolin-1“ veikia kaip pastolių baltymas, tiesiogiai sąveikaudamas su įvairiomis signalizacijos molekulėmis ir caveolėse integruoja specifinius transmembraninius signalizacijos kelius, įskaitant VEGF signalą 40, 41 . Ankstesni mūsų tyrimai parodė, kad VEGFR2 / caveolin-1 asociacija vaidina svarbų vaidmenį kaupiant ECM mesangialinėse ląstelėse 23 . Naujausi tyrimai parodė, kad selektyvi VEGFR2 stimuliacija paspartina progresuojančią inkstų ligą 42 . Taigi mes ištyrėme fasudilio poveikį asociacijai tarp VEGFR2 ir caveolin-1 diabetinėje inkstų žievėje. Padidėjusiam VEGFR2 ir caveolin-1 ryšiui diabetikams buvo užkirstas kelias vidutinės ir didelės dozės fasudilio, kuris rodo, kad VEGFR2 / caveolin-1 signalizacijos kelią tikriausiai užkerta ROCK slopinimas diabetinei nefropatijai.

Anksčiau mes įrodėme, kad VEGFR2 / caveolin-1 asociaciją tarpininkauja caveolin-1 / Src asociacija, Src aktyvacija ir tolesnis caveolin-1 fosforilinimo modifikavimas ant tirozino 14 per Src kinazę VEGF sukeltos matricos padidinto mezangialinių ląstelių 23 metu . Src aktyvinimas taip pat vyksta pelių, sergančių STZ sukeltu I tipo diabetu, inkstuose. Src inhibitorius PP2 apsaugo nuo albuminų susidarymo, glomerulų matricos baltymų kaupimosi, GBM sustorėjimo ir podocitų išeikvojimo 43 . Todėl šiame tyrime ištirtas fasudilio poveikis Src / caveolin-1 signalų perdavimui. Vidutinės ir didelės dozės fasudilis iš dalies slopino Src aktyvaciją ir caveolin-1 fosforilinimą Y14. Tai rodo, kad fasudilio renoprotekcinis poveikis bent iš dalies yra slopinamas Src kinazės aktyvacija ir caveolin-1 fosforilinimas žiurkėms diabetu. AKF inhibitorius enalaprilis yra veiksmingas ankstyvosios diabetinės nefropatijos 44 prevencijai, tačiau jis negali blokuoti VEGFR2 / Src / caveolin-1 signalų.

Apibendrinant, šio tyrimo rezultatai pateikia įrodymų apie ROCK inhibitoriaus fasudilio renoprotekcinius mechanizmus, susijusius su VEGF / Src / caveolin-1 signalų perdavimu, kurie gali būti potencialus terapinis taikinys gydant diabetinę nefropatiją.

Autoriaus indėlis

Jing JIN ir Chao PENG atliko eksperimentus; Su-zhen WU ir Hong-min CHEN surinko ir išanalizavo duomenis; Bai-fang ZHANG suprojektavo eksperimentus ir paruošė rankraštį.