„naujojo“ gripo viruso patekimo inhibitorių, turinčių mažesnį toksiškumą ląstelėms, „blokas“ | mokslinės ataskaitos

„naujojo“ gripo viruso patekimo inhibitorių, turinčių mažesnį toksiškumą ląstelėms, „blokas“ | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Kombinatorinės bibliotekos
  • Vaistų kūrimas

Anotacija

Gripo A virusas (IAV) kelia didelę grėsmę visuomenės sveikatai ir ekonominiam vystymuisi, todėl atsiranda vaistams atsparių ar labai virulentiškų padermių. Todėl būtina sukurti veiksmingus anti-IAV vaistus, turinčius skirtingą veikimo būdą, palyginti su šiuo metu turimais vaistais. Čia parodome naują antivirusinių peptidų klasę, pagamintą konjuguojant du žinomus trumpus antivirusinius peptidus: 1 dalį (pavadintą Jp su ARLPR seka) ir 2 dalį (pavadintą Hp su KKWK seka). Nauji peptidai buvo sukurti hibridizuojant šiuos du domenus atitinkamai C- ir N-galuose. Anti-IAV patikros rezultatai nustatė, kad C20-Jp-Hp buvo stipriausias peptidas, kurio IC50 vertė buvo 0, 53 μM, palyginti su A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) paderme. Įdomu tai, kad šie nauji peptidai pasižymi mažesniu toksiškumu žinduolių ląstelėms ir aukštesniais terapiniais rodikliais nei jų prototipai. Be to, buvo išsamiai ištirtas C20-Jp-Hp veikimo mechanizmas.

Įvadas

A gripo virusai (IAV) yra vienas iš pagrindinių ūminių žmogaus kvėpavimo takų ligų sukėlėjų, atsakingų už sezonines epidemijas ir pasikartojančias gripo pandemijas, keliančias didelę grėsmę žmonių sveikatai ir ekonominiam vystymuisi. Kol kas yra tik dvi vaistų grupės, skirtos gripo A viruso infekcijai gydyti: matricinio baltymo 2 (M2) inhibitoriai, tokie kaip amantadinas ir rimantadinas, ir neuraminidazės (NA) inhibitoriai, tokie kaip oseltamiviro ir zanamiviro 1 . Šie kliniškai vartojami vaistai yra blokuojami A gripo viruso M2 baltymo protonų kanalo aktyvumui arba prisijungdami prie NA, kad slopintų viruso jaunimąsi 2 . Tačiau atsiradus vaistams atsparioms viruso padermėms, skubiai reikia naujų antivirusinių strategijų, nukreiptų į kitus viruso baltymus ar ląstelių veiksnius, susijusius su gripo viruso gyvenimo ciklu 3 .

Kalbant apie gripo A viruso gyvenimo ciklą, hemagglutinino (HA) sukeliamas viruso patekimas yra pirmasis virusinės infekcijos žingsnis. HA yra virusinis paviršiaus glikoproteinas, susidedantis iš dviejų subvienetų: HA1 ir HA2, sujungtų vieninteliu disulfidiniu ryšiu. Įvykus virusui, HA1 subvienetas yra atsakingas už viruso prisijungimą prie sialio rūgšties turinčių receptorių ant šeimininkų ląstelių, o HA2 subvienetas yra skirtas suliejimui, kuris vėliau sukelia virusinę endocitozę 4, 5, 6 . Atsižvelgiant į kritinį HA vaidmenį virusinės infekcijos procese, HA, įskaitant HA1 ir HA2 subvienetus, yra potencialus antivirusinių vaistų įsikišimo taikinys, tokiu būdu blokuodamas viruso patekimą į šeimininko ląsteles 7 .

Iš fage rodomų atsitiktinių peptidų bibliotekų Teruhiko Matsubara ir jo bendradarbiai nustatė C18-ARLPR N-stearoilo lipopeptidą, kuris galėjo slopinti gripo A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) ir A / Aichi replikaciją. / 2/68 (H3N2), kai IC50 vertės yra atitinkamai 1, 9 ir 1, 6 μM 8 . Buvo nustatyta, kad šio peptido struktūra yra sialio rūgšties mimika, taigi ji jungiasi su sialio rūgšties surišimo vieta HA1 HA subvienete. Todėl šis peptidas gali būti naudojamas kaip pagrindinis junginys naujoviškam antivirusiniam vaistui atrasti.

Ankstesniame savo darbe 9, naudodamiesi H5N1 pseudovirusais pagrįstu didelio našumo atrankos metodu, mes atradome C12-Hp peptidą kaip pagrindą anti-IAV vaistų kūrimui. Eksperimento duomenys ir doko modeliavimas pasiūlė, kad vietoj sąveikos su HA1 jungimosi su sialio rūgštimi vieta, C12-Hp gali sąveikauti su HA2 subvienetu, kad būtų užkirstas kelias viruso susiliejimui su ląstelėmis-šeimininkėmis. Tolesni struktūros ir aktyvumo santykio tyrimai parodė, kad padidėjus šio lipido grandinės ilgiui, padidėjo lipidų grandinės ilgis ir antivirusinis aktyvumas bei šio peptido selektyvumo indeksas (SI) (iš kurių C20 riebalų rūgštimis pakeistas giminingumas (C20-Hp)). Didžiausia galia prieš patikrintus viruso štamus. Nepaisant to, palyginti maža 20 SI vertė sumažino jos taikymą 9 .

Norint padidinti kandidato selektyvumo indeksą, tradicinis metodas yra platus struktūros ir aktyvumo santykio tyrimas arba racionalus modifikavimas, pagrįstas ligando ir receptoriaus sąveikos 3D struktūrinėmis analizėmis 10, 11 . Šiame darbe mes stengiamės pasirinkti skirtingą kelią, naudodami du funkcinius peptidus kaip „blokus“ ir padėdami juos atitinkamai C ir N galuose 12 . Kad šie domenai būtų lankstesni, mes atitinkamai sujungiame juos su -GGG- linkeriu ir be jo, tokiu būdu sukurdami hibridizuotų peptidų biblioteką. Šiomis didelėmis pastangomis tikimės, kad bus sukurti nauji antivirusiniai peptidai, turintys modifikuotas biologines savybes.

Siekdami šio tikslo, šiame darbe mes panaudojome ARLPR (pažymėto kaip Jp) peptidą kaip vieną 8 domeną, o KKWK (pažymėtą kaip Hp) kaip kitą domeną 9 . Tokiu būdu buvo sukurta nedidelė kombinatorinė peptidų biblioteka, kurioje yra šie du domenai (1 lentelė). Dėl to antivirusinio aktyvumo patikrinimas prieš A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) gripo padermę parodė, kad naujasis C20-Jp-Hp peptidas pasižymi aukščiausiu antivirusiniu aktyvumu ir geriausiu selektyvumu. Be to, mechanizmo tyrimas parodė, kad šie peptidai buvo pristatomi kaip nauja viruso „įėjimo blokatorių“ grupė, slopindami HA2 subvieneto konformacinius pokyčius ir blokuodami viruso patekimą į šeimininko ląsteles. Šiame dokumente pateikiami ne tik nauji antivirusiniai vaistai, kurie yra „įėjimo inhibitoriai“, bet ir žada perspektyvų metodą kuriant naujus antivirusinius agentus, pasižyminčius dideliu selektyviu indeksu. Čia pateikiame ataskaitą apie šių peptidų dizainą, antivirusinį aktyvumą ir veikimo būdą.

Pilno dydžio lentelė

Rezultatai

Nauji viruso „įėjimo blokatoriai“ buvo sukurti konjuguojant du funkcinius peptidų domenus

Naujas viruso „įėjimo inhibitorius“ buvo sukonstruotas sujungiant du funkcinius Jp ir Hp „blokus“ atitinkamai C ir N galuose. Buvo pranešta, kad peptidas Jp (seka: ARLPR) imituoja sialio rūgšties struktūrą ir jungiasi prie sialio rūgšties surišimo vietos HA1 8 subvienete, tuo tarpu Hp (seka: KKWK) buvo siūloma sąveikauti su HA2 subvienetu, kad būtų užkirstas kelias viruso susiliejimui su šeimininku. ląstelės membrana 9 . Kad šie du domenai būtų lankstesni, be to, kad juos tiesiogiai sujungėme, mes juos taip pat konjugavome su trumpu peptidų jungikliu, turinčiu tris glicino liekanas.

Ankstesnis mūsų darbas parodė, kad KKWK antivirusinis stiprumas buvo stipriai susijęs su lipidų grandinės ilgiu, todėl padarėme išvadą, kad kuo ilgesnė lipidų grandinė, tuo didesnis anti-IAV aktyvumo ir selektyvumo indeksas. Atitinkamai geriausias antivirusinis aktyvumas buvo peptidas KKWK, konjuguotas su C20 riebalų rūgštimi. Remdamiesi šia pažanga, mes kaip lipidų uodegas pasirinkome C16, C18 ir C20 riebalų rūgštis ir atitinkamai jas konjugavome prie naujai sugeneruotų peptidų N-galų, kaip parodyta 1 lentelėje.

Šių naujų sekų palyginimas rodo, kad C20-Jp-Hp atrodo griežtesnis ir kompaktiškesnis nei C20-Jp-GGG-Hp, o pastarasis yra labiau atsipalaidavęs ir lankstesnis, o tai gali būti susiję su jų antivirusinio aktyvumo skirtumais, kaip parodyta 1A, B pav.

Image

( A) Jp-Hp ir Jp-GGG-Hp peptidų spiralinio rato projekcija su užtemdytais hidrofobiniais likučiais. ( B) Numatytos Jp-Hp ir Jp-GGG-Hp 3D struktūros. 3D struktūros skaičiavimas buvo pagrįstas žiniatinklio įrankiu, nurodytu adresu: //bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/PEP-FOLD/; ( C ) yra pasirinktų peptidų trimatė struktūra, kurioje galimi intramolekuliniai ryšiai tarp argnino guanidinio grupės ir triptofano indolo žiedo buvo stebimi peptiduose C20-Jp-Hp (I) ir C20-Hp-Jp (III), tuo tarpu šios sąveikos nebuvo kituose peptiduose. Visų ( A – C) peptidų skaičius nuo I iki VI reiškia peptidus Jp-Hp (I), Jp-GGG-Hp (II), Hp-Jp (III), Hp-GGG-Jp (IV)., Atitinkamai ALLSA-Hp (V) ir Hp-ALLSA (VI).

Visas dydis

Peptidas C20-Jp-Hp rodo stiprų antivirusinį poveikį plataus gripo A viruso padermėms.

Toliau mes panaudojome citopatinio poveikio (CPE) slopinimo testą, norėdami įvertinti šių peptidų antivirusinį poveikį prieš A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) gripo padermę. Kaip parodyta 1 lentelėje, su C20 lipidų grandine konjuguoti peptidai pasižymėjo geriausiu aktyvumu tiriamo viruso štamo atžvilgiu, iš kurių stipriausias buvo C20-Jp-Hp, kurio IC50 vertė buvo 0, 53 μM, didesnė nei jo C18-Jp prototipas. ir C20-Hp. Mūsų nuostabai, peptidai, kurių sudėtyje yra -GGG-, parodė silpnesnį aktyvumą nei jų giminingieji junginiai, neturintys jungties.

Norint patvirtinti antivirusinį šių peptidų poveikį, naudojant tą patį CPE tyrimo metodą, buvo pasirinkti keli stiprūs peptidai, norint išbandyti kitų gripo viruso padermių, įskaitant A / Aichi / 2/68 (H3N2), A / FM /, grupę. 1/47 (H1N1) pelėms pritaikytas štamas ir neuraminidazės inhibitoriams atsparus A / Puerto Rico / 8/34 štamas su NA-H274Y mutacija 13 . Be to, buvo atrinkti trys klinikiniai 690 (H3 potipis), 699 (H3 potipis) ir B gripo virusas, šiuo metu cirkuliuojantys Kinijos Guangdongo provincijoje. 2 lentelės duomenys parodė, kad C20-Jp-Hp vis dar buvo stipriausias peptidas nuo visų tirtų padermių, įskaitant vaistams atsparų NA-H274Y mutacijos štamą ir kliniškai reikšmingus virusus 690, 699 bei gripo B virusus (2 lentelė). IC50 vertės svyruoja nuo 0, 5 iki 2, 0 μM, parodant perspektyvų taikymą kuriant anti-IAV terapiją.

Pilno dydžio lentelė

Padidėjęs C20-Jp-Hp anti-IAV aktyvumas susijęs su Jp struktūra (ARLPR)

Norėdami pasverti Jp domeno (ARLPR) indėlį į antivirusinį C20-Jp-Hp poveikį, mes susintetinome du ALLSA-Hp ir Hp-ALLSA peptidus, pakeisdami Jp domeną ALLSA pešiojamu peptidu, tada išbandėme jų aktyvumą. prieš gripo virusus, kaip parodyta 2 lentelėje. Todėl C20-ALLSA-Hp ir C20-Hp-ALLSA antivirusinis aktyvumas buvo artimas C20-Jp-GGG-Hp ir C20-Hp-GGG-Jp, tuo tarpu silpnesnis nei C20 -Jp-Hp ir C20-Hp-Jp (2 lentelė).

Skirtingas anti-IAV aktyvumas tarp C20-Jp-Hp ir C20-ALLSA-Hp, taip pat tarp C20-Jp-Hp ir C20-Jp-GGG-Hp suintrigavo mus tolesniam tyrimui. Tuomet atitinkamai apskaičiavome šių peptidų sterinę struktūrą naudodamiesi žiniatinklio baltymų analizės įrankiu, esančiu //bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD/, ir pažiūrėjome jų 3D struktūras naudojant „Pymol“ programinę įrangą ( //www.pymol.org/). Rezultatai, parodyti 1 pav. C, rodo, kad tiek C20-Jp-Hp, tiek C20-Hp-Jp pasireiškė galima molekulinė sąveika tarp argnino guanidinio grupės ir triptofano indolo žiedo, kur π-π sąveika, taip pat Gali įvykti vandenilio jungimasis, nors šios sąveikos nebuvo kitose molekulėse. Šis skirtumas gali būti susijęs su palyginti didesniu C20-Jp-Hp ir C20-Hp-Jp antivirusiniu aktyvumu nei kiti, o tai padės mums atlikti tolesnius struktūrinius pakeitimus (1 pav. C). Taigi galima daryti išvadą, kad konjuguotų peptidų antivirusiniam aktyvumui nebūtinai turi būti Jp domenas. Tačiau dėl to, kad susidaro palanki erdvinė struktūra, kurią lemia Jp domeno argnino liekanos, C20-Jp-Hp ir C20-Hp-Jp antivirusinis aktyvumas gali būti sustiprintas, palyginti su kitomis giminingomis medžiagomis.

Peptidas C20-Jp-Hp sumažina gripo viruso HA baltymo replikaciją

Pradiniai rezultatai paskatino mus toliau vertinti slopinamąjį šių peptidų poveikį gripo viruso replikacijai. Gripo HA baltymas yra susijęs su viruso replikacija, taigi HA baltymo mRNR lygis po gydymo peptidais tiesiogiai atspindi slopinamąjį 14 peptidų poveikį. Kaip aprašyta 2A pav., Atlikus tą pačią procedūrą, kaip ir CPE tyrime, visa RNR buvo ekstrahuota ir atvirkščiai perrašyta į cDNR. Tada realiojo laiko PGR buvo atlikta su SYBR Premix Ex Taq pagal gamintojo nurodymus. Gripo A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) HA baltymo geno raiška buvo normalizuota iki ląstelinio GAPDH geno. Kaip rezultatas, po gydymo išbandytu peptidu, buvo pastebėtas smarkiai sumažėjęs mRNR ekspresijos lygis (2A pav.), Atitinkantis CPE tyrimo rezultatus.

Image

( A) Antivirusinis pasirinktų peptidų aktyvumas prieš gripą A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) naudojant qRT-PGR. Peptidai buvo iš anksto apdoroti A / Puerto Rico / 8/34 virusu 100 TCID50 30 minučių, tada viruso ir peptidų mišinys buvo perkeltas į ląsteles dar 1 valandą. Praėjus 24 val. Po užkrėtimo, matricos genas buvo aptiktas atliekant kiekybinį realaus laiko PGR. Statistinis duomenų, susijusių su virusų grupe, reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip p <0, 05 (* p <0, 01, ** p <0, 001). ( B ) C20-Jp-Hp apnašų mažinimo testas nuo gripo A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1). Ląstelės buvo suskirstytos į keturias grupes. 1 grupė (ląstelių paruošimas): peptidai buvo dedami į vienkartinius ląstelių sluoksnius 30 minučių prieš gripo viruso adsorbciją 37 ° C temperatūroje esant 5% CO 2 . 2 grupė (viruso paruošimas): peptidai buvo inkubuojami su gripo virusu 30 minučių 37 ° C temperatūroje, prieš pridedant į ląsteles. 3 grupė (infekcijos metu): Į ląsteles tuo pačiu metu buvo pridėtas virusas A / PR / 8/34 (100 TCID50) su peptidu (10 μM). 4 grupė (po infekcijos): peptidai buvo dedami į vienkartinius ląstelių sluoksnius po gripo viruso adsorbcijos 37 ° C temperatūroje, esant 5% CO 2, 30 min. Po 48 valandų inkubavimo 37 ° C temperatūroje 5% CO2, kiekvienos grupės plokštelės buvo suskaičiuotos. Arbidolis (5 μM) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. ( C ) C20-Jp-Hp ir C20-Hp-Jp anti-gripo virusinio aktyvumo papildymo laiko tarpsniais tyrimai MDCK ląstelėse atliekant CPE redukcijos testą. Arbidolis buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Visi duomenys buvo atlikti trimis egzemplioriais ir atlikti trys nepriklausomi nustatymai.

Visas dydis

Hibridizuoti peptidai rodo mažesnį toksiškumą ląstelėse ir aukštesnį terapinį indeksą nei jų prototipai

Siekiant įvertinti šių peptidų toksiškumą ląstelėse, MTT tyrimas buvo naudojamas kiekybiškai įvertinti MDCK ląstelių gyvybingumą. Kaip parodyta 1 lentelėje, C20-Hp-Jp ir C20-Jp-Hp CC 50 vertės buvo atitinkamai 129, 19 ± 3, 85 ir 135, 54 ± 0, 58 μM, kurios buvo daug didesnės nei C18-Jp ir C20-Hp prototipai, parodantys žadantis šių peptidų potencialas kuriant anti-IAV agentus. Dar svarbiau, kad mažesnis hibridizuotų peptidų toksiškumas žinduolių ląstelėms rodo naują švino peptidų modifikavimo strategiją.

Šie duomenys paskatino mus toliau įvertinti toksiškumą naudojant kitas žinduolių ląsteles. Kaip nurodyta 2 lentelėje, taikant tą pačią MTT tyrimo procedūrą, hibridizuotų peptidų mažesnis nei jų prototipų toksiškumas buvo patvirtintas dar kartą atliekant bandymus su HaCaT ląstelėmis, kai C20-Jp-Hp toksiškumas buvo stebimas maždaug dviem kartus, palyginti su C20. -Hp pati (2 lentelė).

C20-Jp-Hp rodo slopinamąjį poveikį ankstyvoje infekcijos stadijoje

Norint nustatyti išsamų peptido slopinamąjį gripo gyvenimo ciklo žingsnį, C20-Jp-Hp antivirusinis poveikis A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) viruso štamui buvo tiriamas naudojant plokštelių mažinimo testą, naudojant keturis skirtingus laiko taškus. skiriant vaistą: užkrėtimo metu, prieš viruso apdorojimą, ląstelių paruošimą ir po infekcijos 15 . Taigi, kaip parodyta 2B pav., Išankstinis viruso gydymas buvo laikomas veiksmingiausiu vaisto skyrimu.

Ankstyvosios stadijos slopinantis C20-Jp-Hp ir C20-Hp-Jp poveikis buvo patvirtintas CPE tyrimu. Viruso slopinimas, palyginti su įvairiomis C20-Jp-Hp, C20-Hp-Jp ir C18-Jp peptidų koncentracijomis link A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) viruso padermės, buvo atliekamas dviem vaistais (per infekciją ir prieš pradedant gydymą). viruso). Dėl to visi peptidai, gavę apnašų mažinimo analizės rezultatus, turėjo didesnį slopinamąjį poveikį nei apdorojant virusą (2 pav. C). Tai rodo, kad šie peptidai ankstyvoje stadijoje slopina viruso infekciją, veikdami kaip „ įėjimo inhibitoriai “, panašius į jų C18-Jp ir C20-Hp 8, 9 prototipus.

C20-Jp-Hp slopina H5N1 gripo A pseudo viruso patekimą

Dėl stipraus anti-IAV aktyvumo ir gero selektyvumo indekso, mes panaudojome H5N1 pseudo virusą kaip modelį, norėdami ištirti galimą šio peptido veikimo mechanizmą. Kaip pranešta anksčiau 16, pseudo tipo virusas buvo sukonstruotas naudojant A / Thailand / Kan353 / 2004 HA ir NA koduojančias plazmides su ŽIV stuburu, kuriomis vėliau buvo patikrintas antivirusinis poveikis, išmatuojant slopinamąjį poveikį H5N1 infekcijai. pseudo virusas MDCK ląstelėse.

Kaip parodyta 3A pav., Visi Cn-Jp-Hp (n = 12, 14, 16, 18, 20) peptidai, turintys įvairaus ilgio lipidų grandines, turėjo skirtingą slopinamąjį poveikį, iš kurio C18-Jp-Hp ir C20-Jp-Hp buvo aktyviausi peptidai prieš patikrintą viruso štamą. Aišku, rezultatai rodo, kad šie hibridizuoti peptidai gali sąveikauti su HA, NA ar ŽIV stuburo glikoproteinais, taip slopindami virusų užkrečiamumą 17 .

Image

( A ) Cn-Jp-Hp (n = 12, 14, 16, 18, 20) peptidų H5N1 pesudoviruso užkrečiamumo slopinimas. Įvairių koncentracijų peptidai buvo inkubuojami su pseudo-tipo dalelėmis 30 minučių 37 ° C temperatūroje, prieš tai perkeliant į MDCK ląsteles. Viruso, peptido ir MDCK ląstelių mišinys buvo inkubuotas dar 48 valandas, o tada luciferozės aktyvumas, atitinkantis virusų išgyvenamumą, buvo išmatuotas mikrotekine luminometru. ( B ) VSV-G pseudo virusas buvo sukonstruotas panaudojant VSV glikoproteinu koduotą plazmidę, panašią į H5N1 pseudo virusą. C20-Jp-Hp buvo serijiniu būdu du kartus praskiedžiamas nuo 50 iki 0, 78 μg / ml auginimo terpėje ir po to inkubuojamas su VSVG pseudovirusu 37 ° C temperatūroje 30 minučių prieš perpilant į MDCK ląsteles. Taikant tą pačią procedūrą, kaip ir H5N1 pseudo virusui, buvo nustatytas slopinamasis poveikis VSVG pseudo virusui. Palyginimui, tame pačiame eksperimente buvo naudojamos įvairios koncentracijos C20-Jp-Hp, slopinančios H5N1 pseudo viruso užkrečiamumą. Visi duomenys buvo išreikšti trijų nepriklausomų pakartojimų vidurkiu. ( C ) Neuraminidazės (NA) slopinimo tyrimas. Šiame eksperimente buvo naudojama A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) viruso neuraminidazė. Reakcijos mišinys, susidedantis iš ištirtų peptidų ir viruso MES buferyje, buvo inkubuojamas 45 min., Po to į kiekvieną reakcijos šulinėlį buvo įpilama 4-MU-NANA. Skilimo reakcija buvo vykdoma dar 1 valandą, po to nutraukta 100 μL 34 mM NaOH (83% etanolio). Gauta mišinio fluorescencija buvo užregistruota esant sužadinimo bangos ilgiui 340 nm ir emisijos bangos ilgiui 440 nm. Oseltamiviro fosfatas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė.

Visas dydis

C20-Jp-Hp negali slopinti vezikulinio stomatito (VSV) pseudo viruso patekimo

Atsižvelgiant į tai, kad tiek gripo A virusas, tiek vezikulinio stomatito virusas (VSV) yra tas pats endocitozės maršrutas infekcijos procese, tada mes panaudojome VSV kaip neigiamą kontrolę, norėdami ištirti galimą šių peptidų taikinį. Vezikulinio stomatito pseudovirusas buvo sukonstruotas koduojant VSV-glikoproteino plazmidę į ŽIV stuburą, panašų į IAV pseudoviruso, ir po to pritaikytas pasirinktų peptidų 18 atrankai.

Dėl to C20-Jp-Hp neparodė galimybės žymiai sumažinti VSV pseudo viruso užkrečiamumą MDCK ląstelėse, tai rodo, kad C20-Jp-Hp taikinys neturėtų būti ŽIV stuburas (3 pav. B). Taigi, šių peptidų anti-IAV gali selektyviai sąveikauti su HA, NA ar abiem, kad slopintų IAV infekcinį pobūdį.

C20-Jp-Hp negali slopinti neuraminidazės aktyvumo (NA)

Tada mes išbandėme, ar C20-Jp-Hp sąveikauja su neuraminidaze (NA). Taigi NA inhibicijos tyrimas buvo naudojamas įvertinti fermentinį NA aktyvumą ir taip nustatyti galimą šio peptido taikinį 19 . Matuojant fluorescencijos intensyvumą, kurį NA sukėlė nuo A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) viruso suskaidyto 4-MU-NANA substrato, 3C pav. Pateikti duomenys parodė, kad slopinantis poveikis iš viso buvo stebimas 0, 39–50 μg / ml diapazonas, tai rodo, kad C20-Jp-Hp negalėjo slopinti NA aktyvumo. Todėl labiausiai įmanomas C20-Jp-Hp taikinys buvo HA, kuris užkirto kelią viruso patekimui į šeimininko ląsteles.

C20-Jp-Hp anti-IAV aktyvumas susijęs su sąveika su HA2 subvienetu

Kaip minėta aukščiau, HA glikoproteiną sudaro du subvienetai - HA1 ir HA2. Norėdami apibūdinti galimą C20-Jp-Hp ir HA sąveiką, tada atlikome HA slopinimo (HI) tyrimą, kad nustatytume, ar sialio rūgšties surišimo vieta HA1 subvienete gali būti C20-Jp-Hp 20 taikinys. Dėl to nepastebėtas vištų eritrocitų agliutinacijos slopinimas, rodantis, kad sialio rūgšties surišimo vieta HA1 subvienete nebuvo C20-Jp-Hp surišimo vieta (4A pav.).

Image

( A ) slopinamasis peptidų poveikis viruso adsorbcijai tikslinėse ląstelėse. Hemagliutinacijos slopinimo (HI) tyrimas buvo atliktas naudojant 4 kartus didesnius viruso HA vienetus (4HAU) kiekvienoje duobutėje. Į 25 μL virusą (4HAU) įpilant 25 μl peptidų iš dvigubo nuoseklaus fiziologinio tirpalo tirpalo, į kiekvieną šulinėlį buvo įpilta 50 μL eritrocitų (0, 5% tūrio / druskos tirpale). Hemagliutinacijos reakcijos rezultatai buvo nuskaityti po 1 valandos inkubacijos. PBS be viruso buvo naudojama kaip teigiama kontrolė, o virusas - tik kaip neigiama kontrolė. ( B ) Hemolizės slopinimo tyrimas. Peptidas (10 μM) PBS buvo sumaišytas su gripo viruso A / PR / 8/34 (H1N1) paderme. Tada buvo pridėta 200 μL 2% vištienos eritrocitų, pašildytų 37 ° C temperatūroje. Inkubuojant dar 30 min. 37 ° C temperatūroje, pridedama 100 µL natrio acetato (0, 5 M; pH 4, 6–6, 0) ir sumaišoma su eritrocitų suspensija, kad būtų pradėta hemolizė. Po 30 minučių inkubavimo mišinys buvo centrifuguojamas, o supernatantai, turintys išsiskyrusį hemoglobiną, buvo matuojami OD 535 . ( C ) C20-Jp-Hp ir HA-FP-O sąveika analizuota žiedinio dichroizmo (CD) spektru. (i) C20-Jp-Hp sąveikauja su HA-FP-O PBS (pH 7, 4) ir (ii) rūgštinės būklės (pH 5, 0); (iii) HA-FP-O sumaišytas su HA-FP-1 PBS (pH 7, 4) ir (iv) rūgščioje būsenoje (pH 5, 0). Atskirų arba mišrių peptidų, turinčių lygiaverčių koncentracijų, CD kreivės buvo nuskaitytos nuo 195 iki 260 nm, vidutiniškai atliekant keturis nuskaitymus.

Visas dydis

Tada mes išbandėme, ar HA2 subvienetas buvo galimas C20-Jp-Hp taikinys. Viruso-šeimininko ląstelių membranos susiliejimo atveju, HA2 vyksta konformacijos pokyčiai, kuriuos sukelia žemos pH 21 endosoma. Taigi, mes panaudojome hemolizės slopinimo testą, norėdami įvertinti slopinamąjį C20-Jp-Hp poveikį A / PR / 8/34 (H1N1) gripo viruso sukelto eritrocitų lizei esant žemam pH. Kaip parodyta 4B pav., Kai 2% vištienos eritrocitai buvo sumaišyti su vienoda tūrio dalimi peptido (20 μM) ir gripo viruso A / PR / 8/34 (H1N1) 96 gilumoje plokštelėje, eritrocitų lizė rūgščioje būsenoje sumažėjo, palyginti su tik viruso hemoliziniu poveikiu. Taigi, antivirusinis C20-Jp-Hp aktyvumas gali atsirasti dėl HA2 subvieneto konformacinių pertvarkymų slopinimo ir taip nutraukti viruso-šeimininko ląstelių membranų suliejimą.

Norėdami patvirtinti šį išskaičiavimą, tada panaudojome HA-FP-O peptidą, gautą iš HA2 N-galo srities, norėdami ištirti HA-FP-O ir C20-Jp-Hp 22 sąveiką. Eksperimentas buvo atliktas išmatuojant HA-FP-O žiedinio dichroizmo (CD) spektrus, esant arba esant C20-Jp-Hp, neutraliomis ir rūgščiomis sąlygomis. Peptidas HA-FP-O yra H1 potipio HA2 segmentas, kurio seka yra GLFGAIAGFI E NGW E GMI D G. Tai yra vadinamasis sulietas peptidas, atsakingas už membranos destabilizaciją ir suliejimą rūgščioje aplinkoje, todėl vaidina svarbų vaidmenį viruso patekimas į šeimininko ląsteles 4 . Be to, mes panaudojome teigiamai įkrautą HA-FP-O darinį, pavadintą HA-FP-1 su GLFGAIAGFI K NGW K GMI K G seka, norėdami ištirti, ar šis peptidas turi panašų poveikį 23 .

CD spektroskopija parodė, kad reikšmingi pokyčiai buvo pastebėti pridedant C20-Jp-Hp į HA-FP-O, ypač esant pH 5 (4 pav. C), kur šių dviejų peptidų mišinys buvo gerai suformuotas II tipo α- spiralinė struktūra, kai bangos ilgis ne mažesnis kaip 203 nm, panaši į poli (Pro) II 24 CD kreives, dažniausiai pastebimas rutuliniuose baltymuose 25 . Priešingai, šio reiškinio nebuvo pastebėta tarp HA-FP-O ir jo teigiamai įkrauto darinio HA-FP-1 sąveikos. Todėl dramatiškas CD spektro skirtumas tarp atskirų ir sumaišytų peptidų patvirtino, kad C20-Jp-Hp gali sąveikauti su HA2, galbūt fusogenine sritimi, ir tai patvirtina teiginį, kad viruso glikoproteino HA2 subvienetas yra specifinis C20-Jp taikinys. -Hp.

Galima C20-Jp-Hp jungimosi vieta gali būti fusogeninė HA2 sritis

CD spektroskopijos ir hemolizės slopinimo tyrimas leido manyti, kad C20-Jp-Hp gali sąveikauti su fusogeniniu HA2 regionu, blokuodamas HA2 konformacinius pokyčius ir vėliau slopindamas viruso patekimą. Norėdami parodyti šį procesą ir nustatyti galimą C20-Jp-Hp surišimo vietą, tada atlikome kompiuterinį modeliavimą.

Dokavimo modeliavimas buvo atliktas naudojant 4EDB ​​(H1) ir 4UO0 (H3) HA baltymus, paimtus iš Baltymų duomenų banko (PDB) su „Sybyl 2.0“ programine įranga. Atsižvelgdami į labai konservuotas A gripo virusų sintezuotų peptidų struktūras (3 lentelė) 26, mes atlikome modelį HA fuzogeniniam regionui, kišenei, apimančiai HA1 N- ir C-galinius segmentus, ir sintetiniam peptidui. HA2 27, 28. Palyginimui, abu peptidai Jp-Hp ir Jp-GGG-Hp buvo naudojami doko modeliavimui, kad būtų galima palyginti jų jungimosi afiniteto skirtumus. Dėl to 4EDB ​​baltyme bendras Jp-Hp ir fusogeninio HA2 regiono sąveikos balas buvo 5, 9550, o Jp-GGG-Hp - tik –0, 3385. Tokia pati išvada padaryta ir 4UO0 baltyme, kur balai buvo atitinkamai 5, 5110 (Jp-Hp) ir 0, 8572 (Jp-GGG-Hp). Tolesnės analizės parodė, kad galimo sąveikos komplekse, kurį sudaro HA fusogeninis regionas su Jp-Hp peptidu (5 pav.), Glu21 ​​(1), Thr18 (1), Gly316 (1), Leu317 (1) liekanos ) ir Arg318 (1) sudaro stiprų intramolekulinį vandenilio ryšį su liekanomis iš Jp-Hp (5 pav. A). Be to, vandenilio ryšys tarp azoto atomo ant Jp-Hp triptofano liekanos indolo žiedo su Leu2 NH grupe (2) ir aromatinė π-π komplektavimo sąveika tarp Jp-Hp ir Phe3 indolo žiedo (2). ), taip pat buvo pastebėtas HA2 sulietojo peptido fenilo alanino likutis (5B pav.).

Pilno dydžio lentelė

Image

( A ) Jp-Hp ir fusogeninio HA2 regiono sąveika. ( B ) dalinė ( A ) struktūra, kurioje buvo nurodyta Jp-Hp sąveika su HA2 sulydytu peptidu. Dokavimo modeliavimas buvo atliktas naudojant „Sybyl 2.0“ programinę įrangą, o naudojama HA struktūra buvo 4EDB ​​(H1), paimta iš Baltymų duomenų banko (PDB).

Visas dydis

Diskusija

Dėl pastaruoju metu atsiradusio kiaulių ir paukščių gripo, taip pat dėl ​​vaistams atsparių virusinių štamų, skubiai reikia naujų ir veiksmingų vaistų nuo gripo. Šiame darbe hibridizavus du trumpus peptidus, mes nustatėme naują galingų anti-IAV lipopeptidų grupę, kurių IC50 vertės yra nuo 0, 5 iki 10, 0 μM, iš kurių C20-Jp-Hp buvo nurodytas kaip pats stipriausias. kai tiriama su įvairiausiais gripo virusais, palyginti su kitais analogais. Taigi šiam mechanizmo tyrimui C20-Jp-Hp buvo pasirinktas kaip pagrindinis junginys.

Remiantis pseudo tipo viruso patekimo modeliais, taip pat HA slopinimo (HI) ir hemolizės slopinimo tyrimais, mechanizmo tyrimas parodė, kad C20-Jp-Hp gali slopinti virusinę infekciją ankstyvoje stadijoje, sąveikaudamas su fusogeniniu HA2 subvienetas. Šis procesas apima HA2 konformacinių pertvarkymų blokavimą, tokiu būdu trukdant viruso membranai susilieti su tikslinėmis ląstelėmis šeimininkais. Šis išskaičiavimas buvo toliau vertinamas naudojant CD spektroskopinę technologiją, kur buvo pastebėta reikšminga C20-Jp-Hp sąveika su HA-FP-O fusogeniniu peptidu, gautu iš HA2. Šis reiškinys buvo panašus į rezultatus, kuriuos pranešė Li ir kt ., Ištyrę cholesterolio pažymėto peptido sąveiką su Niukaslio ligos viruso (NDV) sulydytu glikoproteinu, pagal kurį taip pat pastebėtas panašus CD spektro konformacinis pokytis 29., paremdama šiame tyrime pasiūlytą išvadą.

Be to, struktūriniu požiūriu C20-Jp-Hp peptidas yra teigiamai įkrautas peptidas, turintis pagrindinę savybę, kuris gali suteikti papildomą apsauginį efektą, padidindamas intraendosominį pH ir taip užkirsti kelią konformaciniams HA2 pokyčiams, panašiems kaip ir iš CL 61917 ir CL 385319 30 .

Iki šiol buvo pranešta apie kelis A gripo viruso patekimo inhibitorius. Šiame tyrime pateikiame dar vieną C20-ARLPRKKWK struktūrą. Šis junginys yra lipopeptidas, veikiantis trikdydamas fusogeninę funkciją, galbūt sąveikaudamas su fuzogenine HA2 sritimi. Susilieję gripo A virusų peptidai yra žinomi dėl savo konservatyvios sekos (3 lentelė) ir lemiamą vaidmenį fusogeniniame procese 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, todėl yra potencialus taikinys antivirusiniai vaistai įsikišti. Dėl to C20-Jp-Hp turi platų ir stiprų anti-IAV aktyvumą. Palyginus su C18-Jp ir C20-Hp prototipais, šie hibridizuoti peptidai, įskaitant C20-Jp-Hp, pasižymi daug mažesniu toksiškumu ląstelėse ir didesniu selektyvumo rodikliu, taigi rodo perspektyvų naujų anti-IAV vaistų, kurie paskatins mus ateityje atlikti intensyvesnius ir išsamesnius tyrimus in vitro ir in vivo .

Metodai

Medžiaga ir chemikalai

9-fluorenilmetoksikarbonilo (Fmoc) apsaugotos L-amino rūgštys, 2- (H-benzo-triazol-1-il) -1, 1, 3, 3-tetrametil-uronio heksafluorofosfatas (HBTU), hidroksibenzotriazolas (HOBt) ir derva. rinkinio amido 4- (2 ′, 4′-dimetoksifenil-Fmoc-aminometil) -fenoksi-acetamido-MHBA (MBHA) dervos buvo nupirktos iš „GL Biochem Ltd.“ (Šanchajus, Kinija), o kitos, įskaitant riebalų rūgštis, N, N- Diizopropiletilaminas (DIEA) ir organiniai tirpikliai buvo įsigyti iš Aladdin Co. (Kinija), turintys peptidų sintezės laipsnį.

Ląstelės ir virusinės padermės

Madin Darby šunų inksto (MDCK), HaCaT ir 293T ląstelės, gautos iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (ATCC), buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje „Eagle“ terpėje (DMEM), turinčioje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS). Gripo A / Aichi / 2/68 (H3N2), A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1), A / FM / 1/47 (H1N1) pelėms pritaikytas štamas, A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) su NA-H274Y mutacijos virusu, 6 dienų (H3 potipis), 699 (H3 potipis) ir gripo B viruso klinikiniai izoliatai buvo dauginami 9 dienų amžiaus embrionuotų vištų kiaušinių alantoininėse ertmėse 37 ° C temperatūroje. Allanto skystis buvo nuimtas, nuskaidrinamas centrifuguojant mažu greičiu ir laikomas –80 ° C. Viruso titras buvo nustatytas analizuojant 50% audinių kultūros užkrečiamąją dozę (TCID50) MDCK ląstelėse ir įvertintas naudojant Reed ir Muench metodą 34, 35 . A gripo virusai 690 (H3), 699 (H3) ir B gripo virusai buvo gauti iš Guangdongo provincijos ligų kontrolės ir prevencijos centro, kurie yra kliniškai svarbūs virusai.

Peptidų sintezė

Šiame tyrime buvo aprašyti peptidų sintezės metodai 36 . Trumpai tariant, visi peptidai buvo susintetinti naudojant standartinį 9-fluorenilmetoksikarbonilo (Fmoc) kietosios fazės protokolą ant Rink Amide MHBA dervos. Linijinės peptido sekos buvo surinktos ant ABI 433A peptidų sintezatoriaus su 0, 1 mmol skalėje. Sintezė buvo atlikta su aštuonis kartus viršijančiu Fmoc apsaugotos aminorūgšties kiekiu ir katalizuota su aštuonis kartus viršijančiu HBTU / HOBt ir šešiolika kartų diizopropil etilamino (DIEA) pertekliumi dimetilformamide (DMF). Surinkus peptidus, į dervą buvo įpilama dešimt kartų riebalų rūgšties perteklius ir vėliau jis buvo sujungtas su standartinėmis aminorūgščių sujungimo sąlygomis. Tada lipopeptidai buvo suskaidomi iš dervos, naudojant reagentą M, kuriame yra 87, 5% trifluoracto rūgšties, 2, 5% etandititolio, 5% tioanizolio ir 5% dejonizuoto vandens. Skilimo reakcija buvo vykdoma kambario temperatūroje 3 valandas, atlikus standartinį apdorojimą (neapdorotas produktas nusodinamas t-butilmetilo eteryje ir du kartus plaunamas tuo pačiu tirpikliu). Peptidų grynumas buvo analizuojamas RP-HPLC, naudojant Waters HPLC su C18, 250 × 4, 6 mm kolonoje (Sepax Technologies, JAV) ir, jei reikia, išgrynintas. HPLC analizės sąlygos buvo tokios: tėkmės greitis, 1 ml / min; judančioji fazė, A tirpiklis: vanduo (0, 075% trifluoracto rūgšties), B: acetonitrilas: metanolis (v: v = 1: 1, papildomai su 0, 075% trifluoracto rūgšties); gradientas: nuo 15% iki 20% B (2 min.), nuo 20% iki 60% B (10 min.), nuo 60% iki 80% B (6 min.), nuo 80% iki 90% B (6 min.). Visų lipopeptidų grynumas buvo didesnis nei 95%.

Kiekvieno peptido molekulinė masė buvo patvirtinta naudojant purškimo jonizacijos masės spektrometriją (ESI-MS, Waters), kaip buvo pranešta anksčiau 33 . Masė buvo atlikta naudojant „Waters 3100“ vieno kvadrupolio masės spektrometrą teigiamame režime, ypač esant kapiliarinei įtampai –3 kV ir kūgio įtampai –30 V. Azoto buvo naudojamas tiek kūgio dujoms (50 lh −1 ), tiek šalinimui. dujos (650 lh −1 ), kai šaltinio ir išsausėjimo temperatūra laikomos atitinkamai 350 ° C.

Citopatinio poveikio (CPE) slopinimo tyrimas

Peptidų antivirusinis aktyvumas prieš gripo virusus buvo patikrintas CPE tyrimu. MDCK ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles po 2 x 104 ląstelių kiekvienoje duobutėje ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje drėkintoje 5% CO2 atmosferoje 24 valandas prieš užkrėtimą. Dvigubai praskiestų peptidų koncentracijų serija buvo iš anksto inkubuota su A gripo virusu (100 TCID50) 30 minučių 37 ° C temperatūroje, o viruso ir peptido mišiniai vėliau buvo dedami į ląsteles ir inkubuojami dar 30 min. Tada ląstelės du kartus plaunamos PBS, kad būtų pašalintas neabsorbuotas virusas, po to pridėta DMEM, papildyta 1 μg / ml TPCK-tripsino ir 0, 2% BSA. Praėjus 48 valandoms po užsikrėtimo, buvo atlikta mikroskopija, siekiant nustatyti antivirusinį poveikį, kuris buvo išreikštas kaip koncentracija, kuri sumažino viruso sukeltą CPE 50%. Duomenys buvo papildomai patvirtinti naudojant MTT analizę, o gauti spektrofotometriniai duomenys buvo naudojami IC50 apskaičiuoti. Eksperimentas buvo pakartotas mažiausiai tris kartus, o antivirusinis vaistas ribavirinas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė.

Kiekybinis realaus laiko PGR tyrimas

Kiekybinis realaus laiko PGR buvo naudojamas įvertinti viruso HA geno replikacijos slopinimą 9 peptidais. Trumpai tariant, MDCK ląstelės buvo auginamos su 2x105 ląstelių kiekvienoje duobutėje 37 ° C temperatūroje 5% CO 2, 24 valandas, kol susiformavo. Tada gripo A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virusas 100 TCID50 buvo iš anksto apdorotas peptidais, esant atitinkamai 5 μM ir 10 μM koncentracijai, esant 37 ° C 30 minučių. Vėliau, ta pačia procedūra kaip ir CPE tyrimas, visa RNR buvo ekstrahuota TRIzol reagentu (Invitrogen) praėjus 24 valandoms po užkrėtimo, RNR kokybė ir kiekis buvo nustatyti UV spektrofotometru (Merinton SMA1000, JAV). Visa RNR buvo atvirkščiai perrašyta į cDNR naudojant „PrimeScript RT“ reagento rinkinį. Tada realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant ABI7500 PGR instrumentą (Applied Biosystems, JAV) su SYBR Premix Ex Taq pagal gamintojo instrukcijas. Gripo HA baltymo geno raiška buvo normalizuota iki GAPDH geno, kuris stabiliai ekspresuojamas MDCK ląstelėse. Kartotiniai genų ekspresijos pokyčiai buvo apskaičiuoti klasikiniu 2- ΔΔCT metodu.

Realaus laiko PGR tyrimas buvo atliktas kartu su ląstelėmis, apdorotomis peptidais, kaip aprašyta aukščiau. Visi mėginiai buvo paimti trimis egzemplioriais. qPCR sąlygos: 95 ° C 30 s, po to 40 ciklų 95 ° C 5 s, 60 ° C 34 s. Gripo viruso HA geno pradinės sekos buvo 5′-TTCCCAAGATCCATCCGGCAA-3 ′ (pirmyn) ir 5′-CCTGCTCGAAGA CAGCCACAACG-3 ′ (atvirkštinė), kaip vidinė kontrolė buvo naudojami GAPDH pradmenys: 5′-AGGGCAATGCCAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC ir 5′-AGGCG TCGGAGGGCC CCCTC-3 ′ (atvirkščiai). Statistinis duomenų reikšmingumas buvo nustatytas naudojant vienpusį ANOVA metodą, naudojant SPSS 20.0 programinę įrangą. Statistinis duomenų, susijusių su virusų grupe, reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip p <0, 05 (* p <0, 01, ** p <0, 001).

Apnašų mažinimo tyrimas

2x105 MDCK ląstelės kiekvienoje duobutėje buvo sėjamos į 6 šulinėlių plokšteles ir auginamos per naktį, kol sutekės, tada kultūrinė terpė buvo pašalinta 37 . Prieš eksperimentą buvo paruoštas 100 TCID50 A / PR / 8/34 (H1N1) viruso, taip pat peptidas, esant 10 μM koncentracijai auginimo terpėje. Šiame eksperimente buvo naudojami keturi vaistų skyrimo tipai: 1 grupė (ląstelių paruošimas): peptidas buvo dedamas į vienkartinius ląstelių sluoksnius 30 minučių prieš gripo viruso adsorbciją 37 ° C temperatūroje esant 5% CO 2 ; 2 grupė (viruso paruošimas): 10 μM peptidas buvo inkubuotas su gripo virusu A / PR / 8/34 (H1N1) 30 minučių 37 ° C temperatūroje, prieš pridedant į ląsteles; 3 grupė (infekcijos metu): virusas A / PR / 8/34 (H1N1) kartu su peptidu (10 μM) tuo pačiu metu buvo pridėtas prie ląstelių monosluoksnių; 4 grupė (po užkrėtimo): peptidas buvo pridėtas prie vienkartinių ląstelių sluoksnių po gripo viruso adsorbcijos 37 ° C temperatūroje, esant 5% CO 2, 30 min. Plokštelės buvo inkubuojamos CO 2 inkubatoriuje 1 valandą su keliais pertraukiamais akmenimis. Po viruso įsisavinimo pasėliai buvo pašalinti ir į šulinius įpilta 3 ml 0, 5% agarozės užpilto, paruošto auginimo terpėje, turinčioje 1 μg / ml tripsino ir peptido. Po inkubacijos 48 valandas, ląstelių monosluoksnis buvo fiksuotas 4% paraformaldehidu 1 valandą. Tada agarozės perdanga buvo pašalinta, o vienkartinis ląstelių sluoksnis nudažytas 0, 5% (m / t) kristalų violetiniu tirpalu, paruoštu 5% etanolyje. Plokštės buvo suskaičiuotos apžiūrint 37 .

Citotoksiškumo tyrimas

MTT tyrimas buvo naudojamas siekiant įvertinti peptidų citotoksiškumą MDCK ir HaCaT ląstelėse. Žinduolių ląstelės (1x104 / duobučio), užaugintos 96 šulinėlių plokštelėje 24 valandas, 48 ​​valandas buvo apdorojamos peptidais koncentracijomis arba tuščiais kontroliniais tirpalais (3% metanolio) 37 ° C ir 5% CO 2 . Ląstelių gyvybingumas buvo išmatuotas MTT tyrimu. MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazo liumbromidas), 0, 5 mg / ml, DMEM, buvo įpilta į kiekvieną šulinį ir inkubuota 37 ° C temperatūroje dar 4 valandas. Sumažintas MTT (formazanas) buvo ekstrahuotas DMSO. Absorbcija esant 570 nm bangos ilgiui buvo nustatyta mikrotitrinių plokštelių skaitytuve („Genios Pro Tecan“, Šveicarija). Peptidų citotoksiškumas buvo įvertintas palyginus peptidais apdorotų ląstelių išgyvenamumą su tirpikliais apdorotų ląstelių išgyvenamumu. Tirpikliais apdorotos kontrolės išgyvenamumas buvo 100%.

H5N1 pseudo viruso patekimą slopinančio aktyvumo matavimas

H5N1 pseudo virusas buvo paruoštas naudojant A / Thailand / Kan353 / 2004 HA ir NA koduojančias plazmides, kaip aprašyta anksčiau 9 . Trumpai tariant, 1 μg HA plazmidė, 1 μg NA plazmidė ir 3 μg ŽIV stuburo plazmidė (pNL4-3.luc.R - E - ), kurioje yra Env ir Vpr trūkumų turinčio, luciferazę ekspresuojančio ŽIV-1 genomo kiekvienoje duobutėje, buvo bendrai transfekuotos į 293T ląsteles 6 šulinėlių plokštelėje (60–70% susikaupusios), naudojant transfekcijos reagentą PEI (polietileniminą). Po 48 valandų inkubacijos kultūros supernatantai buvo surinkti ir laikomi –80 ° C temperatūroje. Pseudotipų dalelių kiekis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant luciferazės testą.

Matuojant peptidų slopinamąjį aktyvumą, MDCK ląstelės, auginančios 1x104 / duobutėje, buvo auginamos 24 valandas, kol susikaupė. Nurodytos koncentracijos peptidai buvo inkubuojami su tokiu pat tūriu pseudo tipo viruso dalelių 37 ° C temperatūroje 30 min., Po to perkeliami į ląsteles, o po to inkubuojami dar 48 h. Antivirusiniam poveikiui įvertinti užkrėstos MDCK ląstelės vėliau buvo lizuojamos lizuojančiu reagentu, gautu iš luciferazės rinkinio gamybos, po to pridedant luciferazės substratą. Luciferazės aktyvumas buvo matuojamas mikrotinkliniu luminometru („Genios Pro Tecan“, Šveicarija).

Slopinamojo aktyvumo matavimas patekus į VSVG pseudo virusą

Taikant panašią procedūrą kaip H5N1 pseudo virusas, VSV pseudo virusas buvo sukonstruotas naudojant VSV glikoproteinu koduotą plazmidę ir ŽIV stuburo plazmidę (pNL4-3.luc.R - E - ). Tada šių peptidų slopinamasis poveikis VSVG pseudovirusui buvo patikrintas taip: MDCK ląstelės (1x104 / duobutėje) buvo pasėtos 96 šulinėlių plokštelėse ir auginamos per naktį. Peptidai serijiniu būdu buvo du kartus praskiedžiami nuo 50 iki 0, 78 μg / ml kultūrinėje terpėje ir po to inkubuojami su vienodo tūrio pseudo-tipo dalelėmis 37 ° C temperatūroje 30 minučių. Vėliau viruso ir peptidų mišinys buvo perkeltas į MDCK ląsteles ir inkubuotas 48 valandas 37 ° C temperatūroje prieš atliekant luciferazės tyrimą, kaip aprašyta aukščiau.

Neuraminidazės (NA) slopinimo tyrimas

Norint ištirti peptidų veikimo mechanizmą, gripo viruso NA aktyvumas buvo nustatytas išmatuojant fluorescencijos intensyvumą, atsirandantį suskaidžius 4-MU-NANA [2- (4-metilumbelliferyl) -α-DN-acetilneuramininės rūgšties natrio] substratą. viruso NA. Šiame eksperimente buvo naudojama A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) viruso neuraminidazė. Trumpai tariant, reakcijos mišinys, sudarytas iš tirtų peptidų, viruso 33 mM MES buferyje (kuriame yra 4 mM CaCl2, pH 6, 5), buvo inkubuojamas 45 minutes kambario temperatūroje, o po to 50 μL 4-MU-NANA substrato ištirpinta Į kiekvieną reakcijos šulinėlį buvo įpilta 33 mM MES buferio. Mišinys inkubuotas dar 1 valandą 37 ° C temperatūroje, uždengtas aliuminio plėvele, o po to nutrauktas 100 μL 34 mM NaOH (83% etanolio). Neuraminidazės (NA) inhibitorius Osltamiviro fosfatas 33 mM MES buferyje buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Gauta mišinio fluorescencija buvo užregistruota esant sužadinimo bangos ilgiui 340 nm ir emisijos bangos ilgiui 440 nm 9 .

Image

kur F virusas yra gripo viruso kontrolės fluorescencija (virusas, buferis ir substratas), F substratas yra substrato kontrolės (buferio ir substrato) fluorescencija, o F mėginys yra tirtų mėginių (viruso, mėginio tirpalo ir substratas). Eksperimentas buvo pakartotas mažiausiai du kartus, kiekvieną kartą pateikiant panašius duomenis.

Hemagliutinacijos slopinimo (HI) tyrimas

HI tyrimas buvo atliktas siekiant įvertinti slopinamąjį peptido poveikį viruso adsorbcijai tikslinėse ląstelėse. HI tyrimams buvo paruošti keturis kartus A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) viruso HA vienetų (HAU) vienoje duobutėje (25 μL) V formos dugne esančiose 96 šulinėlių mikro plokštelėse, tada lygus tūris ( Į plokštelę buvo įpilta 25 μL) peptidų, pradedant nuo 50 μg / ml dvigubo serijinio praskiedimo PBS. Vėliau, norint pradėti eksperimentą, į kiekvieną šulinėlį buvo įpilama 50 μL vištienos eritrocitų (0, 5% v / v PBS). Po 1 valandos inkubacijos 37 ° C temperatūroje hemagliutinacijos reakcijos rezultatai buvo nuskaityti, kaip parodyta 4B pav. PBS be viruso buvo naudojama kaip teigiama kontrolė, o virusas - tik kaip neigiama kontrolė.

Hemolizės slopinimo tyrimas

Peptido slopinamasis poveikis HA2 subvieneto konformaciniams pokyčiams buvo įvertintas hemolizės slopinimo tyrimu. Protokolas buvo priimtas iš anksčiau pateiktos literatūros, nedaug pataisant 22 . Briefly, 100 μL of peptide diluted in PBS was mixed with an equal volume of the influenza virus A/PR/8/34 (H1N1) strain (10 7 TCID 50 /mL) in a 96-deepwell plate. After incubating the virus-peptide mixture at room temperature for 30 min, 200 μL of 2% chicken erythrocytes pre-warmed at 37 °C was added. The mixture was then incubated at 37 °C for another 30 min before inducing hemolysis.

To initiate the hemolysis, 100 μL of sodium acetate (0.5 M, pH 4.6 to 6.0) was added into the mixture to adjust the pH. After incubation for 30 min, cell debris and un-lysed cells were removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 min and the absorbance of the released hemoglobin in the supernatant was read at 535 nm. The experiment was repeated at least twice with each data in triplicate each time.

Circular dichroism (CD) spectra analyses

Peptides were dissolved in PBS (pH 7.4) and sodium acetate buffer (12.5 mM, pH 5.0) respectively. The scanning wavelength was used from 195 to 260 nm with an average of four scans in a spectropolarimeter of JASCO (J-810) by using cuvettes with 0.2 cm path length. On average, three independent scans were taken at a scanning rate of 100 nm/min. The CD data analyses were performed with the spectrum manager software provided by the equipment manufacturer.

To compare the changes in the secondary structure, the CD curves of each single peptide and the combination of two peptides (peptide mixtures) at an equimolar concentration in PBS (pH 7.4) or sodium acetate buffer (pH 5.0) were measured, respectively. In these studies, single peptides were prepared at a concentration of 0.2 mM, and peptide mixtures were prepared at equimolar concentrations (with respect to each peptide in mixture, the final concentration was 0.1 mM).

Statistinė analizė

The half cytotoxic concentration (CC 50 ) and half inhibitory concentration (IC 50 ) values of peptides were determined with Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA), and the data were expressed as means ± standard deviation (SD) from triplicate assay with at least three independent experiments. Statistical significance of the data was determined by one-way ANOVA method using SPSS 20.0 software.

Papildoma informacija

How to cite this article : Lin, D. et al . A ''building block'' approach to the new influenza A virus entry inhibitors with reduced cellular toxicities. Mokslas. Rep. 6, 22790; doi: 10.1038/srep22790 (2016).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.