Kaspazės-4 aktyvacija, vykstant bakteriniam paviršiaus baltymui, yra tarpininkaujama katepsinu g žmogaus dantenų fibroblastuose | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Kaspazės-4 aktyvacija, vykstant bakteriniam paviršiaus baltymui, yra tarpininkaujama katepsinu g žmogaus dantenų fibroblastuose | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių mirtis ir imuninis atsakas
  • Lėtinis uždegimas

Anotacija

Kaspazė-4 yra uždegiminė kaspazė; tačiau jos aktyvavimo mechanizmas yra mažai suprantamas. Šiame tyrime mes parodėme, kad Td92, periodonto patogeno Treponema denticola paviršiaus baltymas ir Treponema pallidum paviršiaus baltymo Tp92 homologas, aktyvina kaspazę-4 ir indukuoja piroptozę pirminiuose kultūriniuose žmogaus dantenų fibroblastuose (HGF) per katepsino G aktyvaciją. Katepsino G slopinimas arba katepsiino G numalšinimas siRNR slopino Td92 sukeltą kaspazės-4 aktyvaciją ir ląstelių žūtį. Td92 sukeltą ląstelių žūtį smarkiai slopino siRNR sunaikinimas dėl gasdermino D. Td92 gydymas katepsiinu G prisijungė prie kaspazės-4 ir šių dviejų molekulių koagregaciją. Be to, Td92 sukėlė IL-1 α ekspresiją ir sekreciją, ir tai slopino kaspazės-4 numušimas. Citochalazinas D neužblokavo Td92 sukeltos kaspazės-4 aktyvacijos, todėl galima daryti išvadą, kad Td92 internalizuoti nereikia kaspazės-4 aktyvacijai. Mūsų rezultatai rodo, kad katepsinas G yra tiesiogiai susijęs su kaspazės-4 aktyvacija bakteriniu ligandu, kuris yra atsakingas už ląstelių žūtį ir IL-1 α sekreciją HGF.

Pagrindinis

Kaspazės yra aspartatui būdingos cisteino proteazės, susijusios su užprogramuota ląstelių mirtimi ir uždegimu. Iš uždegiminių kaspazių (kaspazės-1, -4, -5 ir -12 žmonėms) geriausiai apibūdinama kaspazė-1. 1 Kanoninė uždegiminė jėga suaktyvina kaspazę-1, kuri pro-IL-1 β ir pro-IL-18 gali perdirbti į jų aktyvias ir sekretuojamas formas. 2 Įrodyta, kad kaspazė-1 ir kaspazė-11 skaido gasderminą D, sukurdami N-galo skilimo produktą, kuris oligomerizacijos būdu sudaro poras ląstelės membranoje, ir dėl to ląstelė žūva. 3, 4, 5, 6

Žmogaus kaspazės-4, funkcinio pelių kaspazės-11 ortologo, vaidmens tyrimai buvo nukreipti į endoplazminio retikulumo (ER) streso sukeltą apoptozę. 7, 8, 9 Tačiau naujausi tyrimai taip pat parodė savo vaidmenį kanoniniame ir nekanoniniame uždegiminių procesų aktyvavime ir uždegiminių ląstelių žūtyje. 10, 11, 12, 13 Kaspazė-4, esanti toje pačioje vietoje kaip ir kaspazės-1, -5 ir -12 genai, dalyvauja NLRP3 uždegimo sukelto kaspazės-1 suaktyvinime odos keratinocituose, stimuliuojamais UVB, todėl aktyvinant pro-IL-1 β . Kaspazė-4 vaidina svarbų vaidmenį užkertant kelią uždegimui keratinocituose per TLR3 15 ligandą ir epitelio ląstelėse, užkrėstose Shigella . Kaspazės-4 aktyvinimas Legionella pneumophila yra nepriklausomas nuo kaspazės-1 ir IL-1 β brendimo, tačiau sukelia ląstelių žūtį ir IL-1 α sekreciją žmogaus makrofaguose. 10 Kaspazė-4, suaktyvinta ląstelių LPS, kontroliuoja IL-1 α ir IL-1 β sekreciją, taip pat ląstelių žūtį. Intraceliulinė LPS tiesiogiai sąveikauja su kaspaze-4 arba jos pelių ortologine kaspaze-11, po to suaktyvinamos šios kaspazės, o tai lemia nuo kaspazės-1 nepriklausomą piropatozę. 13

Katepsinas G yra serino proteazė, priklausanti chimotripsino super šeimai. Žmogaus katepsinas G yra sintetinamas kaip 255 aa prepropeptidas. 18-aa signalo peptidas ir sekantis dipeptidas (Gly19 ir Glu20) pašalinami aktyvinimui. Katepsiinas G turi antimikrobinį poveikį ir dalyvauja chemotaksyje, apoptozėje, imuniniame atsake ir uždegime, tarpląstelinių matricos baltymų hidrolizėje ir trombocitų aktyvavime. 18, 19, 20

Periodontitas yra lėtinio uždegimo rūšis, kurią sukelia daugybė patogeninių rūšių, esančių poodinėse kišenėse, dėl kurių dantys netenkama. Periodonto patogenai liečiasi su suliariniu epiteliu, o keli patogenai prasiskverbia giliai į dantenų jungiamąjį audinį. Žmogaus dantenų fibroblastai (HGF) yra gausiausios dantenų jungiamojo audinio ląstelės ir jie aktyviai dalyvauja uždegiminiame atsake į bakterinę infekciją. Priešuždegiminė ląstelių mirtis, kurią sukelia kaspazė-1 ir kaspazė-4, veikia kaip gynybos nuo šeimininko mechanizmas, pašalindama invazinius patogenus ir aktyvuodama įgimtą imuninę sistemą ankstyvoje infekcijos fazėje. Tačiau ląstelių žūtis gali palengvinti patogenų pasklidimą giliuose vietose, kad būtų skatinama infekcija. Neseniai pranešėme, kad Td92, pagrindinio periodontopatogeno T. denticola paviršiaus baltymas, sąveikauja su α 5 β 1 integrinu, aktyvuoja kaspazę-1 per NLRP3 uždegiminę medžiagą ir makrofaguose sukelia piroptozę. 22 Td92-homologiniai baltymai yra kelių rūšių burnos Treponemos ir T. pallidum , sifilio sukėlėjo, paviršiuje. 23, 24

Šiame tyrime parodyta, kad Td92 aktyvina kaspazę-4 nepriklausomai nuo kaspazės-1 pirminiuose kultivuotuose HGF per katepsiino G aktyvaciją. Td92 suaktyvinta kaspazė-4 sukelia piroptozinių ląstelių žūtį ir IL-1 α sekreciją. Td92 sąveika su α 5 β 1 integrinu, neįtraukiant į ląsteles, sukelia kaspazės-4 aktyvaciją. Išsiaiškinęs katepsino G vaidmenį kaspazę-4 suaktyvinant bakteriniam paviršiniam baltymui Td92, padeda geriau suprasti kaspazės-4 vaidmenį įgimtam imuniniam atsakui ir ląstelių mirčiai.

Rezultatai

Td92 aktyvina kaspazę-4

Ankstesniame tyrime mes parodėme, kad T. denticola paviršiaus baltymas Td92 suaktyvina kaspazę-1 ir piroptozę makrofaguose per NLRP3 uždegiminį aktyvavimą sąveikaudamas su α 5 β 1. 22 paskatino mus išanalizuoti Td92 vaidmenį kaspazės-4 aktyvavime skirtinguose ląstelių tipuose. Kaspazė-4 yra ekspresuojama įvairiuose audiniuose ir susideda iš prodomeno (p22) ir dviejų mažų domenų (p20 ir p10), kurie suskaidomi aktyvavimo metu, panašiai kaip kaspazės-1. Kaspazės-4 aktyvinimas buvo aptiktas suskaidžius kaspazės-4 produktus (20 kDa fragmentus). Kai THP-1 makrofagai buvo apdoroti Td92, aktyvuota kaspazės-4 forma buvo nustatyta kultūros supernatantuose (1a pav.). Kaspazės-4 aktyvacija taip pat buvo nustatyta ląstelėse, apdorotose Pam3CSK4 - NLRP7 uždegimo ligandu. 25 Td-B (Td92 C-galinė pusė (Jun ir kt., 22 )) kaspazės-4 nesuaktyvino. Td-G (Td92 N-galinė pusė), kuris galėtų suaktyvinti kaspazę-1 THP-1 ląstelėse, 22 taip pat suaktyvino kaspazę-4 (1a pav.). Nuo dozės priklausomas aktyvaus kaspazės-4 išsiskyrimas Td92 buvo pastebėtas iš PBMC gaunamų makrofagų, taip pat THP-1 ląstelių (1b paveikslas).

Image

Td92 skatina kaspazės-4 aktyvaciją. THP-1 ląstelės ( a ir b ), iš PBMC gauti makrofagai ( b ) ir HGF ( c ) 6 valandas buvo apdorojamos Td92, Td-G, Td-B arba Pam3CSK4 (Pam3). Kaspase-1, kaspazė-4 ir IL-1 β kultūros supernatantuose ir pro-kaspazė-1, pro-kaspazė-4, pro-IL-1 β ir aktinas ląstelių lizatuose buvo aptikti atliekant Western blot analizę.

Visas dydis

Tada mes išbandėme Td92 gebėjimą sukelti kaspazės aktyvaciją pirminiuose kultūriniuose HGF. Td92 sukėlė kaspazės-4 aktyvaciją HGF (1c pav.). Priešingai nei kaspazės-1 aktyvacija THP-1 ląstelėse ir iš PBMC gaunamuose makrofaguose, 22 Td92 nesukėlė kaspazės-1 aktyvacijos ar IL-1 β sekrecijos HGF. Įdomu tai, kad sintetinis peptidas Pam3CSK4, kuris taip pat sukėlė kaspazės-4 aktyvaciją THP-1 ląstelėse, nesukėlė kaspazės-4 aktyvacijos HGF. Šie rezultatai rodo, kad kaspazė-1 ir kaspazė-4 yra reguliuojami skirtingai, priklausomai nuo ląstelių tipo ir ligando. Td92 suaktyvinta kaspazė-4 buvo slopinama neutralizuojančio antikūno prieš α 5 β 1 integriną, bet ne citochalazino D (1 papildomas paveikslas), kaip anksčiau parodyta Td92 sukeltai kaspazės-1 aktyvacijai makrofaguose. 22 Norėdami išaiškinti pagrindinius kaspazės-4 aktyvacijos mechanizmus, tolimesniems eksperimentams panaudojome HGF. Panašiai kaip kaspazė-1, aktyvioji kaspazė-4 buvo retai aptinkama ląstelių lizatuose, nes jos sekrecija įvyko greitai, o tai gali sumažinti tarpląstelinio proteolitinio aktyvumo sumažėjimą. 2

I tipo interferono (IFN) signalizacija sukelia pelių kaspazės-11, žmogaus kaspazės-4 funkcinio ortologo, ekspresiją ir aktyvaciją. 26 Norėdami patikrinti, ar IFN signalizavimas susijęs su Td92 sukeltos kaspazės-4 ekspresija ir aktyvacija, HGF buvo apdoroti Td92 ir išanalizuota IFN- β mRNR raiška. Kaip parodyta papildomame 2a paveiksle, Td92 reikšmingai sukėlė IFN- β mRNR ekspresiją jau praėjus 3 valandoms po gydymo. Tačiau neutralizavęs IFN- β antikūnas neslopino Td92 sukeltos kaspazės-4 mRNR ekspresijos ir aktyvacijos iki 16 val. Vėliau (papildomi 2b ir c paveikslai). Šie rezultatai rodo, kad I tipo IFN signalizacija nedalyvauja Td92 sukeltoje kaspazės-4 aktyvacijoje.

Td92 aktyvuota kaspazė-4 sukelia ląstelių žūtį

Mes ištyrėme, ar Td92 aktyvuota kaspazė-4 sukelia HGF ląstelių žūtį, matuojant LDH išsiskyrimą. Td92 sukėlė nuo dozės ir laiko priklausomą LDH išsiskyrimą (2a pav.), O siRNR sukeltas kaspazės-4 numušimas žymiai sumažino Td92 sukeltą LDH išsiskyrimą (2b paveikslas). Priešingai, kaspazės-1 numušimas neturėjo įtakos Td92 sukeltam LDH išsiskyrimui HGF (2c paveikslas). Kaspazės-4 ir kaspazės-1 RNR interferencija buvo patvirtinta realaus laiko qPCR (duomenys nepateikti) ir Western blotting (2b ir c paveikslai). Mes taip pat panaudojome kaspazės inhibitorius, kad patvirtintume kaspazės-4 vaidmenį Td92 sukeltų ląstelių žūtyje. Kaspazės inhibitoriai Ac-YVAD-CHO (kaspazės-1/4 inhibitorius) ir Ac-LEVD-CHO (kaspazės-4/5 inhibitoriai) reikšmingai slopino LDH išsiskyrimą (2d paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad kaspazė-4 yra atsakinga už HGF, gydomo Td92, ląstelių mirtį.

Image

Kaspazė-4 yra atsakinga už HGF ląstelių žūtį. ( a ) HGF buvo stimuliuojami įvairiomis Td92 dozėmis 6 valandas arba 10 μg / ml Td92 skirtingais inkubacijos laikais. Buvo įvertintas ląstelių kultūros supernatantų išsiskyrimas iš citoplazmos fermento LDH. # P <0, 01, palyginti su neapdorota kontrole. HGF buvo transfekuoti kontrolinėmis siRNR arba siRNR, specifiškomis kaspazės-4 ( b ) arba kaspazės-1 ( c ) -oms, 24 valandas. Transfekcijos efektyvumą patvirtino Western blot. siRNR transfekuotos ląstelės buvo apdorotos Td92 6 valandas, o ląstelių kultūros supernatantai buvo įvertinti dėl LDH lygio. * P <0, 01, palyginti su kontrolinėmis siRNR transfekuotomis ląstelėmis. Parodyta kaspazės-4 ( b ) ir kaspazės-1 ( c ) ekspresijos densitometrinė analizė, palyginti su aktinu. ( d ) HGF prieš apdorojimą Td92 (10 μg / ml) 6 valandas buvo iš anksto apdoroti Ac-YVAD-CHO arba Ac-LEVD-CHO. Ląstelių kultūros supernatantai buvo įvertinti dėl LDH lygio. # P <0, 01, palyginti su neapdorota kontroline, ir * P <0, 05, palyginti su Td92 stimuliuotomis ląstelėmis. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD

Visas dydis

ER stresas susijęs su kaspazės-4 aktyvacija ir apoptozė. 27 Norint išsiaiškinti ER streso įtaką Td92 sukeltai kaspazės-4 aktyvacijai, buvo įvertinta ER streso žymenų išraiška, įskaitant gliukozės reguliuojamą baltymą 78 kDa (GRP78) ir CCAAT / stipriklius rišančio baltymo homologinį baltymą (CHOP). Td92 nesukėlė GRP78 ar CHOP mRNR ekspresijos iki 12 h, tuo tarpu ER streso induktorius thapsigarginas žymiai padidino GRP78 ir CHOP mRNR ekspresiją (3 papildomas paveikslas).

Norėdami dar labiau patvirtinti, kad Td92 sukėlė pyroptosis, bet ne apoptozę, HGF buvo gydomi Td92 ir dažomi propidium jodidu (PI) bei aneksinu V. Mes įvertinome PI + / aneksino V - ląstelių, teigiamas piroptozės, ir PI - / aneksino V +, teigiamas. dėl apoptozės. Srauto citometrinė analizė parodė, kad Td92 žymiai padidino PI + / aneksino V - ląstelių, bet ne PI - / aneksino V + ląstelių dalį HGF po 16 val. (3a paveikslas), tuo tarpu nei PI + / aneksinas V -, nei PI - / Anneksino V + ląstelės buvo stebimos po 4 ir 8 valandų gydymo (papildomas 4 paveikslas). Staurosporinas, apoptozės induktorius, žymiai padidino PI - / aneksino V + ląstelių dalį per 4 ir 8 inkubacijos valandas. Be to, prieš pradedant gydymą Ac-YVAD-CHO arba Ac-LEVD-CHO, Td92 sukeltų PI + / aneksino V - HGF dalis smarkiai sumažėjo, tuo tarpu staurosporino sukeltų PI - / aneksino V + ląstelių šie pokyčiai nepadarė. inhibitoriai. Be to, TdT tarpininkaujantis dUTP slaptojo galo žymėjimo (TUNEL) tyrimas parodė, kad gydymas Td92 sukelia branduolio suskaidymą (3b pav.), Kurį slopina gydymas Ac-YVAD-CHO arba Ac-LEVD-CHO. Gydymas Td92 nesukėlė kaspazės-3, vienos iš pagrindinių apoptozės vykdytojų, aktyvacijos (3c paveikslas). Neseniai buvo pranešta, kad uždegiminės kaspazės suskaido gasderminą D į 30 kDa N-galą ir 22 kDa C-galinį fragmentą, tokiu būdu gasdermino N domenai sukelia piroptozę, sudarydami oligomerines poras ląstelės membranoje. 4, 5, 6, 28 Norėdami nustatyti, ar Td92 sukelta ląstelių žūtis priklauso nuo gasdermino D, mes atlikome genetinį gasdermino D numušimą, naudodami siRNR technologiją. siRNR sunaikinimas gasderminas D reikšmingai slopino ląstelių mirtį, kurią HGF sukelia Td92 (5 papildomas paveikslas). Šie rezultatai patvirtina, kad Td92 sukelta kaspazės-4 aktyvacija sukelia pyroptosis, o ne ER streso sukeltą apoptozę.

Image

Td92 skatina PI įsisavinimą ir DNR suskaidymą. a ) HGF nurodytą laiką buvo gydomi Td92 (10 μg / ml) arba staurosporinu (1 μg / ml), esant arba neturint Ac-YVAD-CHO (YVAD, 50 μM ) arba Ac-LEVD -CHO (LEVD, 50 μM ) ir nudažytas PI ir aneksinu V, po to atlikta srauto citometrinė analizė. ( b ) HGF buvo prieš tai apdoroti Ac-YVAD-CHO (YVAD, 50 μM ) arba Ac-LEVD-CHO (LEVD, 50 μM ) 30 minučių prieš apdorojimą Td92 (10 μg / ml) 16 valandų. Ląstelėms buvo atliktas TUNEL tyrimas ir stebimos konfokalinio lazerinio skenavimo mikroskopu. 10 mikroskopinių laukų vaizdai kiekvienoje duobutėje buvo imami padidinant × 200 ir TUNEL teigiamų ląstelių procentas buvo apskaičiuotas naudojant NIH ImageJ programinę įrangą. Buvo suskaičiuota mažiausiai 500 ląstelių kiekvienai eksperimentinei būklei. Mastelio juostos yra 50 μm . Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD. # P <0, 01, palyginti su negydytais kontroliniais, ir * P <0, 05, palyginti su Td92 stimuliuotomis ląstelėmis. c ) HGF buvo gydomi Td92 (10 μg / ml) arba staurosporinu nurodytoje dozėje 6 valandas. Kaspanas-4 kultūros supernatantuose ir kaspazė-3, pro-kaspazė-3, pro-kaspazė-4 ir aktinas ląstelių lizatuose buvo aptikti atliekant Western blot analizę.

Visas dydis

Serino proteazės inhibitoriai slopina Td92 sukeltą kaspazės-4 aktyvaciją

Bromoenolio laktonas (BEL) yra serino proteazės inhibitorius. Jis slopina kaspazės-1 aktyvacijos ir IL-1 β sekrecijos indukciją ATP būdu LPS pirminiuose makrofaguose, kurie aktyvina NLRP3 uždegimą, ir Salmonella infekciją, kuri aktyvina NLRC4 uždegimą. 29 Ankstesniame pranešime „Bay 11-7082“, NF-κB inhibitorius, slopinantis I κB fosforilinimą, slopino Td92 sukeltą kaspazės-1 aktyvaciją ir IL-1 β sekreciją, taip pat pro-IL-1 β ekspresiją., THP-1 ląstelėse. 22 Taigi, mes išbandėme serino proteazės inhibitorių (BEL ir tosilfenilalanilo chlormetilketono (TPCK)) ir Bay 11-7082 įtakų poveikį Td92 sukeltai kaspazės-4 aktyvacijai HGF. Išankstinis gydymas serino proteazės inhibitoriais sumažino kaspazės-4 aktyvaciją, tuo tarpu įlanka 11-7082 neslopino kaspazės-4 aktyvacijos HGF (4a pav.). Įlanka 11-7082 ir serino proteazės inhibitoriai paveikė ląstelių mirtį pagal jų kaspazės-4 aktyvacijos slopinimo būdus (4b paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad serino proteazės vaidina svarbų vaidmenį kaspazės-4 aktyvacijoje ir ląstelių žūtyje HGF. Mes taip pat ištyrėme, ar „Bay 11-7082“ ir serino proteazės inhibitoriai turi įtakos kaspazės-4 mRNR raiškai. Td92 reikšmingai sukėlė kaspazės-4 mRNR raišką HGF dar 3 valandą po stimuliacijos, tačiau inhibitoriai nepadarė įtakos Td92 sukeltai kaspazės-4 mRNR raiškai (papildomas 6 paveikslas), parodydami, kad serino proteazės inhibitoriai nukreipia kaspazės-4 aktyvaciją, bet ne kaspazės-4 išraiška.

Image

Serino proteazės inhibitoriai slopina Td92 sukeltą kaspazės-4 aktyvaciją ir ląstelių žūtį. ( a ir b ) HGF buvo iš anksto apdoroti įlanka 11-7082, TPCK arba BEL nurodytomis koncentracijomis 30 min., prieš tai 6 valandas apdorojant Td92 (10 μg / ml). Kaspanas-4 kultūros supernatantuose ir pro-kaspazė-4 bei aktinas ląstelių lizatuose buvo aptikti atliekant Western blot ( a ). Išmatuotas LDH išsiskyrimas kultūros supernatantuose ( b ). Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD. # P <0, 01, palyginti su negydytais kontroliniais, ir * P <0, 05, palyginti su Td92 stimuliuotomis ląstelėmis

Visas dydis

Td92 suaktyvina katepsiną G, kuris savo ruožtu suaktyvina kaspazę-4

Buvo pranešta, kad katepino G, serino proteazė, suskaido rekombinantinę pro-kaspazę-7 į maksimaliai aktyvuotą 30 formą ir skatina kaspazės-3 aktyvaciją kultivuojamuose žiurkių kardiomiocituose. Kadangi Td92 sukeltą kaspazės-4 aktyvaciją slopino serino proteazės inhibitoriai, mes ištyrėme, ar katepsinas G dalyvavo Td92 sukeltoje kaspazės-4 aktyvacijoje. Žmogaus katepsinas G sintetinamas kaip prepropeptidas, kuris suskaidomas, kad būtų gauta aktyvioji forma (28 kDa). Td92 HGF indukuoja fermentinį katepsino G aktyvumą priklausomai nuo laiko ir dozės (5a pav.). Neapdorotose ląstelėse pro kateepino G raiška buvo nustatyta ribinė ląstelių lizatuose. Propuksinės ir aktyviosios katepsino G formos buvo žymiai sustiprintos apdorojant Td92, o aktyvioji forma buvo vyraujanti forma tiek ląstelių lizatuose, tiek kultūros supernatantuose. Aktyvus katepsino G išsiskyrimas į kultūros supernatantus buvo nustatytas jau po 30 minučių po Td92 stimuliacijos. Ląstelių gydymas katepsino G inhibitoriumi (5b paveikslas, kairysis skydelis) ir katepsino G numušimas (5b paveikslas, dešinė panelė) sumažino Td92 sukeltą kaspazės-4 aktyvaciją, o kaspazės-4 numušimas neturėjo įtakos katepsino G aktyvumui (papildomas 7 paveikslas). ), leidžia daryti prielaidą, kad katepsino G aktyvacija vyksta prieš kaspazės-4 aktyvaciją. Kadangi Td92 sąveikauja su α 5 β 1 integrinu, norėdamas sukelti kaspazės 1 aktyvaciją makrofaguose, 22 mes išanalizavome, ar α 5 β 1 integrino sunaikinimas paveikė Td92 sukeltą katepsino G aktyvumą. Kategizino G aktyvumas buvo smarkiai slopinamas HGF, transfekuotose siRNR, būdingiems α 5 β 1 integrinui (5c paveikslas). Td92 taip pat sukėlė katepsino G mRNR raišką (5d pav.). Dvigubi imunofluorescencijos testai parodė, kad gydymas Td92 vos 30 min. Sukėlė katepsino G ir kaspazės-4 koagregaciją (6a pav.), Kurią slopino gydymas katepsino G inhibitoriumi (6b paveikslas, kairysis skydelis) arba katepsino G numušimas. geno ekspresija naudojant siRNR (6b paveikslas, dešinė panelė). Td-G, Td92 N-galinė pusė, sukėlusi kaspazės-1 aktyvaciją makrofaguose, 22 taip pat sukėlė katepsino G ir kaspazės-4 koagregaciją (6a pav.). Td-B, Td92 C-galinė pusė, nesukėlė koagregacijos (papildomas 8 paveikslas). Mes taip pat patvirtinome katepsino G ir Td92 gydytų ląstelių lizatų kaspazės-4 sąveiką imunoprecipitacijos tyrimu (papildomas 9 paveikslas). Neapdorotose arba Td-B apdorotose ląstelėse katepsinas G sąveikavo su kaspaze-4 baziniame lygmenyje. Td92 ar negydytose ląstelėse nenustatyta sąveikos tarp katepsino G ir kaspazės-1. Pastebėtina, kad aktyvus katepsinas G jungiasi tik prie prokaspazės-4 (50 kDa) ląstelių lizatuose. Šis rezultatas atitinka pastebėjimą, kad kaspazė-4 išsiskiria tiesiogiai suaktyvinus, tai paaiškina, kodėl aktyvioji kaspazė-4 retai buvo aptinkama ląstelių lizatuose. Norėdami nustatyti, ar katepsino G ir kaspazės-4 sąveika buvo specifinė Td92, mes išbandėme atsaką į LPS. Shi ir kt. 13 pranešė, kad tarpląstelinė LPS tiesiogiai prisijungia prie kaspazės-4, dėl to kaspazė-4 oligomerizuojasi ir aktyvuojasi. Mūsų eksperimentuose Escherichia coli LPS buvo įvesta į HGF naudojant transfekcijos reagentą, o kaspazės-4 aktyvacija buvo įvertinta esant rekombinantiniam CD14 ir LBP, kurie yra reikalingi LPS signalizavimui. Mes ištyrėme dviejų tipų LPS iš skirtingų padermių: LPS B4 iš E. coli O111: B4 ir LPS B5 iš E. coli 055: B5. LPS B4 yra TLR4 agonistas, tuo tarpu LPS B5 yra TLR2 ir TLR4 agonistas. Nepriklausomai nuo naudojamo transfekcijos reagento, abi LPS formos paskatino kaspazės-4 aktyvaciją. Tačiau LPS neaktyvavo katepsino G, ir tai rodo kaspazės-4 aktyvavimo mechanizmo skirtumus tarp Td92 ir LPS (papildomas 10 paveikslas). Kaspazės-4 aktyvacija taip pat buvo patikrinta pridedant aktyvaus rekombinantinio katepsino G prie neapdorotų HGF lizatų (6c paveikslas). Kaspazės-4 aktyvacija katepsinu G buvo tvirta rūgštinėmis (pH 5) ir neutraliomis pH (pH 7, 2) sąlygomis. Mes taip pat išbandėme, ar Td92 suaktyvino katepsiną G HOK-16B ląstelėse, žmogaus dantenų epitelio ląstelių linijoje. Kaip ir HGF, Td92 sukėlė katepsino G aktyvaciją (papildomas 11a paveikslas) ir katepsino G bei kaspazės-4 koagregaciją HOK-16B ląstelėse (papildomas 11b paveikslas). Apibendrinant, Td92 sąveika su α 5 β 1 integrinu sukelia katepsino G aktyvaciją, o tai savo ruožtu sukelia kaspazės-4 aktyvaciją tiesioginės sąveikos dėka.

Image

Td92 sukelta kaspazės-4 aktyvacija yra susijusi su katepsino G aktyvumu. a ) HGF buvo apdorojami Td92 (1–10 μg / ml) 0, 5–6 valandas. HGF katepsino G aktyvumas buvo vertinamas naudojant katepsino G aktyvumo tyrimo rinkinį, o supernatantų ir ląstelių lizatų aktyviosios katepsino G ir pro katepinsino G dalys buvo aptiktos atliekant Western blot analizę. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD. # P <0, 01, palyginti su neapdorota kontrole. ( b ) HGF buvo iš anksto apdoroti katepsino G inhibitoriumi I nurodytomis koncentracijomis 30 minučių arba pernešti kontroline siRNR arba siRNR, specifiškais katepsiinui G (cathG) 24 valandas, prieš stimuliavimą Td92 (10 μg / ml) 6 valandas. Kaspase-4 kultūros supernatantuose ir pro-kaspazė-4, pro-katepsinas G ir aktinas ląstelių lizatuose buvo aptikti atliekant Western blot analizę. ( c ) HGF buvo transfekuoti kontroline siRNR arba siRNR, specifiškais α 5 ir β 1 integrinams 24 valandas. siRNR transfekuotos ląstelės 6 valandas buvo gydomos Td92 ir įvertintos katepsino G aktyvumu. Transfekcijos efektyvumą patvirtino Western blot. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontrolinėmis siRNR transfekuotomis ląstelėmis. Parodyta katepsino G ( b ) ir α 5 / β 1 ( c ) integrino ekspresijos densitometrinė analizė aktino atžvilgiu. ( d ) HGF buvo apdorojami Td92 5 min., 30 min., 3 ir 6 h. Katepsiino G mRNR raiška buvo analizuojama realaus laiko RT-PGR. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. # P <0, 01, palyginti su neapdorota kontrole

Visas dydis

Image

Kaspazės-4 sąveikauja katepsinas G, veikiant Td92. a ) HGF 1 valandą buvo gydomi Td92 (10 μg / ml) arba Td-G (5 μg / ml). Stimuliuotos ląstelės buvo inkubuotos su anti-katepsino G ir anti-kaspazės-4 antikūnais, po to inkubuojamos atitinkamai su Cy3 ir FITC konjuguotais antriniais antikūnais. Ląstelės buvo vaizduojamos konfokaline lazerine skenavimo mikroskopija. Mastelio juostos yra 50 μm . ( b ) HGF buvo iš anksto apdoroti katepsino G inhibitoriumi I (CatG I) 30 minučių arba pernešti kontroline siRNR arba siRNR, specifiškais katepsiinui G, 24 valandas prieš stimuliavimą Td92 1 valandą. 10 mikroskopinių laukų vaizdai kiekvienoje duobutėje buvo imami padidinant × 200, o koagregatų procentinė dalis apskaičiuota, palyginti su visomis ląstelėmis, naudojant NIH ImageJ programinę įrangą. Buvo suskaičiuota mažiausiai 500 ląstelių kiekvienai eksperimentinei būklei. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. * P <0, 01, palyginti su Td92 stimuliuotomis ląstelėmis. ** P <0, 01, palyginti su kontrolinėmis siRNR transfekuotomis ląstelėmis. Mastelio juostos yra 50 μm . ( c ) HGF lizatai (100 μg baltymų) buvo inkubuojami su aktyviu rekombinantiniu katepsinu G nurodytomis koncentracijomis, esant pH 7, 2 arba pH 5, 0, Tris-HCl buferiui, esant 37 ° C, 1 val. Gauti lizatai buvo atlikti Western blot, kad būtų galima aptikti kaspazę-4

Visas dydis

Po tarpląstelinio frakcionavimo paaiškėjo, kad prokatepinas G buvo aptiktas daugiausia neapdorotų HGF citozolinėje frakcijoje (papildomas 12a paveikslas). Neapdorotuose HGF aktyvios katepsino G buvo aptiktos tiek citozolinėje, tiek membraninėje frakcijose, nors citozolinėje frakcijoje buvo aptikta daugiau aktyvaus fermento nei membranos frakcijoje. Po HGF apdorojimo Td92, citozolyje, membranos frakcijoje ir kultūros supernatantuose buvo aptiktas aktyvus katepsinas G. Šie rezultatai leidžia manyti, kad citozolyje esantis katepsinas G gali sąveikauti su kaspaze-4. Nors citozolio frakcijoje aktyvioji katepsino G forma buvo nustatyta tokiu pat lygiu neapdorotose ir Td92 apdorotose ląstelėse, katepsiino G aktyvumas buvo žymiai didesnis Td92 apdorotose ląstelėse (5a paveikslas). Imuninis HGF padengimas anti-katepsino G Ab ir anti-LAMP-1 Ab neparodė katepsino G lokalizacijos lizosomose, tuo tarpu katepsinas G buvo pastebėtas neutrofilų lizosomose (papildomas 12b paveikslas). Kadangi Td92 sukėlė katepsino G mRNR ekspresiją (5d pav.), Mūsų duomenys rodo, kad Td92 yra transkripcinis aktyvavimas ir katepsino G sintezė de novo , palaikydami galimą katepsino G sąveiką su kaspaze-4, kurią taip pat sukėlė Td92.

Td92 aktyvuota kaspazė-4 yra susijusi su IL-1 α sekrecija

Kadangi Td92 gydytuose HGF nebuvo stebėta kaspazės-1 aktyvacija ir IL-1 β sekrecija, mes išanalizavome IL-1 α raišką ir sekreciją. Realaus laiko RT-PGR atskleidė, kad Td92 sukėlė IL-1 α mRNR raišką (7a pav.). Td92 sukelta IL-1 α ekspresija taip pat buvo patvirtinta baltymų lygiu ELISA ir Western blot tyrimais (7b paveikslas). Įdomu tai, kad Td92 aktyvuota kaspazė-4 ir IL-1 α buvo aptikti kultūros supernatantuose jau praėjus 30 minučių po stimuliacijos (papildomas 13a paveikslas). Td92 suaktyvino MAPK, bet ne NF-κB kelią HGF (papildomas 13b paveikslas). MAPK inhibitoriai reikšmingai slopino Td92 sukeltą IL-1 α mRNR raišką (papildomas 13c paveikslas), bet ne IL-1 α sekreciją ar kaspazės-4 aktyvaciją (papildomas 13d paveikslas). Kaspazės-4 geno numušimas žymiai sumažino išskiriamo IL-1 α lygį, nustatytą atliekant vakarinį blotinimą (7c paveikslas, kairysis skydelis), tuo tarpu kaspazės-1 genėjimas neturėjo įtakos IL-1 α sekrecijai (7c paveikslas, dešinė plokštė). Be to, kaspazės-4 inhibitoriai sumažino IL-1 α sekreciją Td92 gydytuose HGF (papildomas 13e paveikslas), bet ne Td92 sukeltą IL-8 sekreciją (papildomas 13f paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad kaspazės-4 aktyvacija yra konkrečiai susijusi su IL-1 α sekrecija. Gydymas katepsino G inhibitoriumi (7d paveikslas) ir katepsino G geno sunaikinimas (7e paveikslas) sumažino Td92 sukeltą IL-1 α sekreciją, patvirtindami mūsų hipotezę, kad katepso G priklausomas kaspazės-4 aktyvavimas yra būtina sąlyga IL-1 α sekrecijai. . Tačiau gasRmin D sunaikinimas siRNR nepaveikė IL-1 α sekrecijos (duomenys nepateikti).

Image

Td92 indukuoja IL-1 α raišką ir sekreciją. ( a ir b ) HGF buvo apdoroti Td92 (10 μg / ml), Pam3CSK4 (Pam3, 0, 5 μg / ml), PP4 (10 μg / ml), Td-G (5 μg / ml) arba Td. -B (5 μg / ml) 3–6 valandas. IL-1 α mRNR ekspresija buvo analizuojama realaus laiko RT-PGR ( a ), o išsiskyrusi IL-1 α buvo analizuota ELISA ( b, kairėje pusėje) ir Western blot ( b, dešinėje skiltyje). Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD. # P <0, 01, palyginti su negydytais kontroliniais preparatais. ( c ) HGF buvo transfekuoti kontroline siRNR, kaspase-4 (Casp-4) arba kaspazės-1 (Casp-1) siRNR 24 valandas. siRNR transfekuotos ląstelės buvo apdorotos Td92 6 val. IL-1 α kultūros supernatantuose ir pro-IL-1 α , pro-kaspazė-4, pro-kaspazė-1 ir aktinas ląstelių lizatuose buvo aptikti atliekant Western blot analizę. ( d ) HGF buvo iš anksto apdoroti katepsino G inhibitoriumi I nurodytomis koncentracijomis 30 min., po to stimuliacija Td92 (10 μg / ml) 6 valandas. IL-1 α lygis kultūros supernatantuose buvo analizuotas ELISA metodu ir Western blot metodu. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkis ± SD. # P <0, 01, palyginti su negydytais kontroliniais, ir * P <0, 01, palyginti su Td92 stimuliuotomis ląstelėmis. ( e ) HGF 24 valandas buvo transfekuoti kontroline siRNR arba siRNR, specifiškais katepsiinui G (cathG), prieš stimuliavimą Td92 (10 μg / ml) 6 valandas. IL-1 α kultūros supernatantuose ir pro-IL-1 α , pro-katepino G ir aktinas ląstelių lizatuose buvo aptikti atliekant Western blot analizę. Parodyta kaspazės-4 ( c, kairiajame skydelyje), kaspazės-1 ( c, dešinėje skydelyje) ir katepsiino G ( e ) ekspresijos densitometrinė analizė, palyginti su aktinu.

Visas dydis

Ankstesniame tyrime mes parodėme, kad Td92 aktyvuoja kaspazę-1 per NLRP3 uždegimą. Tačiau NLRP3 numušimas neturėjo įtakos katepsino G aktyvacijai, kaspazės-4 aktyvacijai ar IL-1 α sekrecijai HGF (papildomas paveikslas S14).

Diskusija

Šiame tyrime mes įrodėme, kad Td92, pagrindinio periodonto patogeno T. denticola paviršiaus baltymas, sukelia katepzino G suaktyvinimą kaspazės-4 aktyvacijai ir piroptozei HGF. Nors Td92 makrofaguose sukėlė ir kaspazę-1, ir kaspazę-4, Td92 HGF aktyvino tik kaspazę-4. Todėl Td92 ir HGF yra tinkamas bakterinis ligandas ir ląstelių tipas, atitinkamai, norint ištirti kaspazės-4 aktyvaciją nepriklausomai nuo kaspazės-1 aktyvacijos. Kadangi Td92 homologai randami skirtingose ​​burnos treponemų rūšyse ir T. pallidum , 23, 24, o Treponema rūšių išorinės membranos yra trapios, 32 išorinės membranos baltymai išleidžiami į aplinką išorinių membraninių pūslelių pavidalu. Taigi, vietinės paviršiaus baltymų, įskaitant Td92, koncentracijos gali būti padidintos, o Td92 ir jo homologai gali pasiekti tokias koncentracijas, kad sukeltų katepsino G aktyvaciją.

Nors mes parodėme, kad kaspazės-4 aktyvacija nepriklausė nuo kaspazės-1 aktyvacijos, kiti tyrimai pranešė, kad kaspazė-4 vaidina aktyvavimą kaspazėje-1. Įrodyta, kad kaspazės-4 reikia norint suaktyvinti kaspazę-1 per NLRP3, sukeliančią keratinocitų uždegimą, reaguojant į UVB švitinimą. 14 Kaspazė-4 taip pat reikalinga kaspazės-1 aktyvavimui kaspazės-4 transgeninių pelių kaulų čiulpų makrofaguose, stimuliuojamose LPS arba Pam3CSK4, nesant ATP. Tai yra signalas, reikalingas uždegiminiam surinkimui, ir sukelia IL-1 β ir IL -18 sekrecija. 33 Nors įvairios bakterijos ir jų molekulės suaktyvina kaspazę-1, 34 ribotas skaičius mikrobų ligandų suaktyvina kaspazę-4. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad tarpląstelinė LPS tiesiogiai sąveikauja su kaspazės aktyvavimo ir įdarbinimo domenais: kaspazė-4 ir kaspazė-11, sukeldama oligomerizaciją ir aktyvavimą šiose kaspazėse, o po to - piroptozę. 13 Mūsų tyrime LPS sukėlė kaspazės-4 aktyvaciją HGF, tačiau ji nesukėlė katepsino G, tai rodo, kad kaspazės-4 aktyvacija Td92 skiriasi nuo LPS.

Katepsinas G randamas neutrofilų azurofilų granulėse ir aktyvacijos metu gali būti išskiriamas arba gali būti sujungtas su membrana. Jis turi ir fiziologinių, ir patologinių funkcijų. Katepsiinas G veikia antimikrobiškai, skaidydamas fagolizosomų patogenus arba užmušdamas tarpląstelines bakterijas per proteolitinį išorinės membranos skaidymą. 19 Jis skaido tarpląstelinius matricos baltymus fibronektiną, kolageną, proteoglikaną ir elastiną ir aktyvina matricos metaloproteinazes, darydamas žalą ląstelėms ir audiniams. 20, 35 Padidinta katepsino G išraiška ir aktyvumas nustatomi periodontitu sergančių pacientų dantenų audiniuose ir kreviskuliariniame skystyje, palyginti su sveikų asmenų. 36 Mycobacterium tuberculosis Rv3364c baltymas, signalo perdavimo perdavimo operono komponentas, slopina katepsino G aktyvumą tiesiogiai veikdamas makrofaguose su plazmos membranomis susietą katepsiną G. Ši sąveika slopina kaspazės-1 aktyvaciją ir ląstelės-šeimininkės mirtį. 37 Tačiau apie kaspazės-4 suaktyvinimą katepsinu G, kurį suaktyvina bakterinis ligadas, nepastebėta.

Td92 suaktyvinta kaspazė-4 dalyvavo IL-1 α perdirbime ir sekrecijoje HGF. Taip pat pastebėta makrofagų, užkrėstų gramneigiamais patogenais, kaspazės-4 sąlygota IL-1 α sekrecija ir ląstelių žūtis. 10 L. pneumophila , Yersinia pseudotuberculosis ir Salmonella typhimurium sukelia kaspazės-4 aktyvaciją, todėl išsiskiria IL-1 α, bet ne IL-1 β . IL-1 α yra susijęs su šeimininko gynyba ir uždegimu, panašiai kaip IL-1 β . 38, 39, 40 Priešingai nei nuo nuo benzdermino D priklausančio IL-1 β sekrecija, apdorojama uždegiminėmis kaspazėmis, 4, 6 IL-1 α sekrecijai Td92 HGF įtakos neturėjo gasdermin D smūgis, nors ją sumažino kaspazė. 4 numušimo ir kaspazės-4 inhibitoriai.

Uždegiminė ląstelių mirtis prisideda prie įgimtos šeimininkų gynybos, pašalindama įsibroviančias bakterijas ankstyvosiose infekcijos stadijose, o uždelstas ląstelių žūtis gali palengvinti bakterijų dauginimąsi ląstelėse. Dėl nuolatinės ląstelių žūties išsiskiria tarpląstelinis turinys, o vėliau - uždegimas. Periodontitu sergančių pacientų dantenų audiniai yra veikiami kelių patogenų rūšių, iš kurių keli įsiveržia į epitelio ląsteles ir jungiamuosius audinius, sudarytus iš fibroblastų, makrofagų ir dendritinių ląstelių. Todėl tam tikros ląstelių mirties rūšys naudingos tam tikroms ląstelėms-šeimininkėms, tuo pačiu kenkdamos kitoms. Dantenų epitelio ląstelių ir fibroblastų ląstelių mirtis dėl lėtinio uždegimo gali palengvinti periodontopatogenų įsiskverbimą giliai į audinius. Naujausi tyrimai parodė, kad periodontopatogenai gali sukelti piropatozę suaktyvindami kaspazę-1. 22, 42, 43 Kadangi apoptozė turi keletą bendrų bruožų, susijusių su piroptozės gydymu, 44 kuris neseniai buvo tiriamas kartu su uždegimais, periodonto audinių ląstelių mirties tipus, kuriuos sukelia periodontopatogenai, periodonto audinių ląstelėse reikia ištirti išsamiau, kad būtų sukurtos prognozinės ir diagnostinės strategijos . Piroptozė, kuriai tarpininkaujant periodontopatogenai suaktyvina kaspazę-4, šiuo metu yra mažai suprantama.

Apibendrinant, mes parodome, kad katepsinas G tiesiogiai dalyvauja kaspazės-4 aktyvavime HGF Td92, periodonto patogeno bakterinio paviršiaus baltymo, nedalyvaujant kaspazės-1 ir NLRP3. Td92 ir α 5 β 1 integrino sąveika sukelia katepsino G aktyvaciją. Td92 aktyvuota kaspazė-4 yra atsakinga už piroptozę ir IL-1 α sekreciją. Mechanizmo, kuriuo Td92 sukelia ląstelių žūtį ir uždegiminį atsaką, paaiškinimas padidina mūsų supratimą apie Treponema infekcijų patogenezę, nes Td92 homologų yra įvairiose burnos Treponema rūšyse, taip pat T. pallidum .

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento ląstelių mirties ir diferenciacijos svetainėje (//www.nature.com/cdd)