Ccr6– reguliuojančios t ląstelės neleidžia atkurti žarnos th17 ląstelių išilgai ccr6 – ccl20 ašies gydomiems žmonėms, infekuotiems hiv-1 | gleivinės imunologija

Ccr6– reguliuojančios t ląstelės neleidžia atkurti žarnos th17 ląstelių išilgai ccr6 – ccl20 ašies gydomiems žmonėms, infekuotiems hiv-1 | gleivinės imunologija

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • ŽIV infekcija
  • Reguliacinės T ląstelės
  • T-pagalbininkas 17 ląstelių

Anotacija

Žarnos CD4 + T ląstelės, ypač T tipo pagalbinis 17 tipo (Th17) pogrupis, nėra visiškai atkurtos daugumai ŽIV-1 infekuotų asmenų, nepaisant kombinuoto antiretrovirusinio gydymo, kai jos pradedamos lėtinėje infekcijos stadijoje. Čia parodyta, kad pasikeitė CCR6 – CCL20 chemotaktinė ašis, sumažėjus plonosios žarnos epitelio ląstelių CCL20 gamybai gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. Dėl to sutrinka CCR6 + CD4 + T-ląstelių, ypač Th17 ląstelių, pririšimas prie plonosios žarnos gleivinės. Priešingai, padidėjo FoxP3 + T reguliuojančių (Treg) ląstelių, ypač CCR6 - pogrupyje, žarnyne. Dėl to atsirandantis Th17 / CCR6 - Treg santykio disbalansas ir su tuo susijęs poslinkis iš interleukino (IL) -17 į IL-10 ir transformuojantis augimo faktorius β (TGF-β) užstoja CCL20 gamybą enterocitais, išlaikydamas neigiamą atsiliepimą apie įdarbinimą. gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonojoje žarnoje CCR6 + CD4 + T ląstelių.

ĮVADAS

Žarnyno gleivinė sudaro didžiulį barjerą tarp aplinkos ir šeimininko. Jį sudaro kelios gynybos linijos. Pirmiausia, gleivių gamyba, antimikrobiniai peptidai ir imunoglobulinai A sumažina tiesioginius žarnyno patogenų ir epitelio ląstelių kontaktus. Antra, palaikant sveiką epitelio barjerą, išvengiama patogenų įsiskverbimo. Galiausiai įgimtas ir adaptyvus atsakas gali būti patogenų, kurie prasiskverbė į žarnyno audinį pažeisdami epitelio barjerą, dalis. 1

Limfocitai randami organizuotose imuninės indukcijos vietose (Peyerio pleistrai ir mezenteriniai limfmazgiai) žarnyne ir difuzinėse efektoriaus vietose išilgai žarnyno epitelio ir lamina propria. ŽIV-1 infekcijos metu žarnyno CD4 + T ląstelės yra labai išeikvotos. 2, 3, 4, 5, 6 Ypač didelį susirūpinimą kelia 17-os (Th17) T helperų ląstelės, T-ląstelių pogrupis, turintis didelę reikšmę antibakterinei ir priešgrybelinei gleivinės gynybai. 7, 8 Didelis žarnyno CD4 + T ląstelių jautrumas ŽIV-1 yra dėl aktyvuotos atminties CD4 + T ląstelių būklės žarnyno gleivinėje, ląstelių, išreiškiančių CCR5 pagrindinį receptorių ŽIV-1 patekimui, gausos ir afiniteto. viruso gaubto glikoproteino Gp120 α 4 β 7 - heterodimerinio integrino, ekspresuoto daugumos žarnyno T ląstelių. 9, 10, 11, 12 CD4 + T ląstelių išeikvojimas žarnyne, ypač Th17 ląstelių pogrupyje, yra pagrindinis ŽIV-1 infekcijos patofiziologijos veiksnys, nes yra patogeniško simianinio imunodeficito viruso (SIV) infekcijoje. Azijos makakose. 7, 8, 13

Th17 ląstelių praradimas žarnyno gleivinėje buvo susijęs su mikrobų perkėlimu iš žarnos liumenų į kraują, todėl sisteminis uždegimas ir ligos eiga. 14, 15, 16, 17, atvirkščiai, žarnos Th17 ląstelės selektyviai konservuojamos natūralių šeimininkų, tokių kaip Afrikos žaliosios beždžionės ir suodžių manganai, nepatogeniškoje SIV infekcijoje. 8, 18 Tai galėtų prisidėti prie mikrobų translokacijos ir sisteminio uždegimo nebuvimo šiose rūšyse, pabrėždami ŽIV-1 infekuotų asmenų žarnos Th17 ląstelių išsaugojimo ar atkūrimo svarbą.

Pradėjus kombinuotą antiretrovirusinį gydymą (CART) ankstyvosios ŽIV-1 pirminės infekcijos metu, būtų galima išsaugoti žarnos T ląstelių homeostazę ir epitelio barjero vientisumą. 19, 20 Tačiau CD4 + T ląstelių atstatymas atrodo atidėtas daugumai tiriamųjų, kuriems lėtinė stadija yra pradėta CART, ir žarnyno gleivinės lamina propria yra ne tokia išsami, nei periferiniame kraujyje ir organizuotame limfoide. audinius. 4, 21, nepaisant nuolatinio efektyvaus CART, žarnyno gleivinė ypač ištuštėja Th17 ląstelėse. 8, 16, 20

Anksčiau mes parodėme, kad CD4 + T ląstelių pritraukimas į žarnyną gali būti susijęs su nepilnu CD4 + T ląstelių atstatymu žarnyno gleivinėje. 22 Pagrindinės chemotaktinės ašys, susijusios su T limfocitų prigijimu prie plonosios žarnos, yra α 4 β 7 - gleivinės adresinės ląstelės adhezijos molekulė-1 (MAdCAM-1) ir CCR9 – CCL25 ašys. 23, 24, 25 Limfocitų paruošimas indukcinėse su žarnynu susijusio limfoidinio audinio vietose CD103 + dendritinėmis ląstelėmis, esant retinoinė rūgščiai, vitamino A metabolitui, sukelia aukšto lygio α 4 β 7 ir CCR9 ekspresiją. Tada 26, 27 įspaustos T ląstelės, ekspresuojančios CCR9 ir α 4 β 7, linkusios migruoti iš kraujo į plonosios žarnos gleivinės efektorines vietas. Α 4 β 7 integrinas suriša MAdCAM-1, kuris yra ekspresuojamas Peyerio pleistrų ir mezenterinių limfmazgių endotelio venose ir plonosiose žarnyne bei gaubtinėje žarnoje. 23 Atrodo, kad chemokiną CCL25 konstituciškai gamina plonosios žarnos epitelinės ląstelės. Taigi 24, 25 imuninės ląstelės, ekspresuojančios CCR9 ir α 4 β 7, yra linkusios migruoti būtent į plonąją žarną, kas rodo, kad šis žarnos segmentas turi specifinę imuninę funkciją.

CCR6 – CCL20 ašis taip pat vaidina svarbų vaidmenį nustatant imunines ląsteles žarnyne, ypač dendritinėse ląstelėse prie Peyerio pleistrų, taip pat Th17 ir T reguliavimo (Treg) ląstelėse, prigludusiose prie žarnyno lamina propria. 28, 29, 30, 31, 32, 33 CCL20 gamina tiek plonosios žarnos, tiek storosios žarnos epitelinės ląstelės. Jį taip pat gali sukelti uždegiminiai dirgikliai, ypač citokinai, tokie kaip interleukinas (IL) -1β ir naviko nekrozės faktorius α (TNF-α), ir kai kurie su patogenais susiję molekuliniai modeliai per Toll-like receptor (TLR) signalus. 34, 35 Segmentinės gijinės bakterijos ypač gali paskatinti žarnos enterocitus gaminti CCL20, taigi Th17 ląstelės priglunda prie žarnyno. 36

Taigi atrodo, kad CCR6 – CCL20 ašis vaidina svarbų vaidmenį reguliuodama imuninę žarnos gleivinės homeostazę. ŽIV-1 ar patogeninių SIV infekcijų metu Th17 ląstelės žarnyno gleivinėje yra žymiai ir selektyviai išeikvotos, dėl to atsiranda nesubalansuotas Th17 / Treg ląstelių santykis, koreliuojantis su sisteminiu uždegimu. 18, 20 Th17 / Treg ląstelių santykis žarnos gleivinėje išlieka mažesnis daugumos ŽIV-1 infekuotų asmenų organizme, net neinfekuotiems asmenims, net ir palaikant nuolatinę ŽIV-1 replikacijos kontrolę pagal CART, ir tai koreliuoja su CD4 + T atkūrimu. žarnos gleivinėje esančios ląstelės. 20

Anksčiau aprašėme CCR9 – CCL25 chemotaktinės ašies pokyčius, kurie prisideda prie prasto CD4 + T ląstelių atstatymo plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims, kurie pradėjo CART lėtinėje infekcijos fazėje. Atrodo, kad trūksta CD4 + T ląstelių išilgai CCR9 – CCL25 ašies. Tai yra susijusi su sumažėjusia plonosios žarnos epitelio ląstelių CCL25 gamyba. 22

Dabar mes sutelkėme dėmesį į CCR6 + CD4 + T ląstelių priskyrimą plonosios žarnos gleivinei, ypač Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių pogrupiams. Nuolatiniai mikrobų translokacijos ir uždegiminiai dirgikliai, gydomi ŽIV infekuotų asmenų žarnyno gleivinėje, teoriškai turėtų paskatinti CCL20 gamybą ir CCR6 + T ląstelių, tokių kaip Th17 ląstelių, priskyrimą žarnynui, tačiau ankstesnės ataskaitos parodė, kad Th17 žarnos ląstelės šioje vietoje neatstatomos. nustatymas. 8, 19, 20 Todėl mes ištyrėme CCR6 – CCL20 ašies funkcinę būklę ŽIV-1 infekuotiems asmenims, esant nuolatiniam efektyviam CART, ir kaip ji sąveikauja su α 4 β 7 –MadCAM-1 ir CCR9 – CCL25 ašimis.

REZULTATAI

Sumažėjęs CCL20 išsiskyrimas enterocituose apsunkina CCR6 + CD4 + T ląstelių priskyrimą plonojoje žarnoje gydytiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims.

Anksčiau mes parodėme, kad CD4 + T ląstelės išlieka išeikvotos tiek procentais, tiek absoliučiu skaičiumi, daugumos ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje, nepaisant ilgalaikio efektyvaus CART. 22 Tai prieštarauja tinkamam CD4 + T kiekio kraujyje atstatymui tiems tiriamiesiems (mediana 668 ląstelės viename μl; tarpkvartilinis diapazonas (IQR), 451–849), kurie buvo gydomi vidutiniškai 5 metus (IQR, 4–5, 5). ). Pakeitimai žarnyne esančiose CD4 + T ląstelėse gali prisidėti prie pastebėto sutrikusios gleivinės imuninės sistemos atstatymo. Mes sutelkėme dėmesį į CCR6 – CCL20 chemotaktinę ašį, nes ji reguliuoja Th17 ląstelių buvimą. 30, 31 CCR6 + dažnis CD4 + T ląstelėse gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų periferiniame kraujyje ir neinfekuotose kontrolinėse medžiagose buvo panašus, analizuotas srauto citometrijos metodu (50%, palyginti su 52%, P = 0, 29; 1a pav.) ), tačiau gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje jų dažnis buvo žymiai sumažėjęs (46, 8%, palyginti su 60, 4%, P = 0, 01; 1a pav.). Statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp CD4 + T-ląstelių skaičiaus ir CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnio nebuvo gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims nei kraujyje ( ρ = 0, 31, P = 0, 19), nei žarnos gleivinėje. ( ρ = −0, 41, P = 0, 21; duomenys nepateikti).

Image

Sumažėjęs CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnis ir pakitusi CCL20 raiška plonųjų žarnų gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. a ) CCR6 + ląstelių dažnis CD4 + T ląstelėse gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų (PB, n = 20; žarnos, n = 11) ir neinfekuotų asmenų (PB) periferiniame kraujyje (PB) ir plonosios žarnos gleivinėje., n = 10; žarnos, n = 11). Ląstelių procentai buvo nustatyti srauto citometrijos metodu. ( b ) Gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų ( n = 11) periferinio kraujo ir plonosios žarnos gleivinės CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnio koreliacija. Kiekvienas simbolis žymi vieną asmenį. c ) CCL20 mRNR raiška plonosios žarnos epitelio ląstelėse gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims ( n = 17) ir neinfekuotiems asmenims ( n = 14). CCL20 mRNR buvo kiekybiškai įvertinta realaus laiko atvirkštinės transkriptazės-PGR (RT-PGR) ir normalizuota iki GAPDH . AS, savavališkas vienetas. ( d, e ) CCL20 chemokino gamyba plonosios žarnos gleivinėje. ( d ) Gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų ( n = 9) ir neinfekuotų asmenų ( n = 5) plonosios žarnos gleivinėje CCL20 chemokinas buvo išmatuotas paviršiaus ploto vienetu, naudojant NIS elementą (Nikon). e ) Parodyti reprezentatyviai gydyti ŽIV-1 infekuoti ir neužkrėsti asmenys. CCL20 (rausvai raudona) buvo nudažytas imunohistochemija. Ląstelių branduoliai yra priešakiniai (mėlyni) (LSM 710 Confocal mikroskopas, originalus padidinimas × 200).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

CDR + T ląstelių CCR6 + dažnis periferiniame kraujyje ir plonosios žarnos gleivinėje buvo atvirkščiai koreliuotas gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims ( ρ = −0, 65, P = 0, 03; 1b paveikslas), kas rodo ląstelių judėjimą tarp dviejų skyrių. . Chemokino CCL20, CCR6 ligando, gamybą plonosios žarnos gleivinėje nustatėme išmatuodami CCL20 mRNR enterocituose realiojo laiko atvirkštinės transkriptazės-PGR (RT-PGR) pagalba. Gydyti ŽIV-1 infekuoti asmenys enterocituose turėjo 6 kartus mažiau CCL20 mRNR nei neinfekuoti kontroliniai ( P = 0, 0009; 1c paveikslas). Taip pat įvertinome CCL20 susidarymą duodenojejunaliniame audinyje imunohistochemijos būdu. Gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje žymiai sumažėjo CCL20 dažymas (CCL20 kiekybinis įvertinimas paviršiaus ploto vienete, P = 0, 004; 1d pav.), Sutinkamai su mRNR duomenimis, beveik vien epitelio ląstelių dažymas ( 1e pav.). Šie rezultatai rodo, kad sumažėjusi enterocitų CCL20 gamyba yra susijusi su pakitusiais CCR6 + CD4 + T ląstelių prigijimais prie gydytų plonosios žarnos gleivinės ŽIV-1 infekuotiems asmenims.

Plonosios žarnos gleivinėje CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnis nebuvo koreliuojamas nei su ŽIV-1 DNR ( ρ = 0, 02, P = 0, 96; 2a paveikslas), nei su likusiomis RNR apkrovomis žarnyno audiniuose ( ρ = −0, 26, P = 0, 47). ; 2b pav., Teigdamas, kad pagrindinis ŽIV-1 liekamojo replikacijos vaidmuo sumažėjusiame CCD6 + CD4 + T ląstelių dažnyje yra gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų žarnų gleivinėje.

Image

Trūksta koreliacijos tarp ŽIV-1 DNR ar RNR ir CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnio plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. a ) Koreliacija tarp ŽIV-1 DNR žarnyno CD4 + T ląstelėse (kopijų per 10 6 ląstelių) arba b ) ŽIV-1 RNR žarnos audinyje (kopijos viename audinyje) ir CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnis gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinė ( n = 11 - ŽIV-1 DNR; n = 10 - ŽIV-1 RNR). Kiekvienas simbolis žymi vieną asmenį. ŽIV-1 DNR / RNR buvo kiekybiškai įvertinta realaus laiko PGR / atvirkštinės transkriptazės-PGR (RT-PGR) su pradmenų poromis ir Taqman zondais, specifiškais LTR-rodmeniui, naudojant šviesos ciklą („Roche“). CCR6 + CD4 + T ląstelių procentai buvo nustatyti srauto citometrijos metodu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Th17 ląstelių trūkumas kontrastuoja su padidėjusia CCR6 - Tregs plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims.

Išanalizavę pagrindinius CCR6 + T-ląstelių pogrupius, susijusius su gleivinės imunitetu, išsamiau panagrinėjome CCR6 + CD4 + T ląsteles, gabenančias gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų žarnas. Mes panaudojome srauto citometriją, kad nustatytume Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių dažnį periferiniame kraujyje ir plonosios žarnos gleivinėje, remdamiesi jų CD3 + CD4 + CCR4 + CXCR3 - CCR6 + CD161 +, CD3 + CD4 + CCR4 - CXCR3 + CCR6 + CD161 + ir CD3 + CD4 + CD25 aukšto CD127 mažo FoxP3 + fenotipų (tipiniai eksperimentai parodyti 3a, b paveiksluose, skirtuose limfocitams iš periferinio kraujo, ir papildomame S1a, b paveiksle - limfocitai iš plonosios žarnos gleivinės. ). 30, 31, 37, 38, 39

Image

Sumažėjęs 17 tipo T pagalbininkų (Th17) ir Th1Th17 ląstelių dažnis, tačiau padidėjęs CCR6 - T reguliuojančių (Treg) ląstelių dažnis plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. ( a, b ) srauto citometrijos nustatymo strategija Th17 ląstelėms (CD3 + CD4 + CCR4 + CXCR3 - CCR6 + CD161 + ) ir Th1Th17 ląstelėms (CD3 + CD4 + CCR4 - CXCR3 + CCR6 + CD161 + ) ( a ) ir Treg ląstelės (CD3 + CD4 + CD25 didelis CD127 žemas FoxP3 + ) ( b ). Parodytas tipiškas periferinio kraujo limfocitų eksperimentas. 2c – h pav. Parodytų Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių dažnis buvo apskaičiuotas kaip CCR4 + CXCR3 - CCR6 + CD161 + ląstelių procentas tarp CD3 + CD4 + T ląstelių; CCR4 - CXCR3 + CCR6 + CD161 + ląstelių procentas tarp CD3 + CD4 + T ląstelių ir CCR25 aukšto CD127 mažo FoxP3 + ląstelių procentas tarp CD3 + CD4 + T ląstelių. ( c, d ) Th17 ląstelių ( c ) ir Th1Th17 ląstelių ( d ) dažnis CD4 + T ląstelėse gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų periferiniame kraujyje (PB) ir plonosios žarnos gleivinėje (PB, n = 20; žarnos), n = 11) ir neužkrėstų asmenų (PB, n = 10; žarnos, n = 11). e ) Treg ląstelių dažnis CD4 + T ląstelėse gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų PB ir plonosios žarnos gleivinėje (PB, n = 20; žarnyne, n = 11) ir neinfekuotų asmenų (PB, n = 10; žarnos, n = 11). f ) CCR6 + ląstelių dažnis Treg ląstelėse plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims ( n = 11) ir neinfekuotiems asmenims ( n = 11). g ) CCR6 dažnis - Treg ląstelės CD4 + T ląstelėse plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems ( n = 11) ir neinfekuotiems ( n = 11) asmenims.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Th17, Th1Th17 ir Treg dažnis CD4 + T ląstelėse gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų ir neinfekuotų kontrolinių asmenų periferiniame kraujyje reikšmingai nesiskyrė (1, 2% palyginti su 2% Th17 ląstelėmis, P = 0, 13, 3c pav.) ; 1, 3% palyginti su 2% „Th1Th17“ ląstelėms, P = 0, 35, 3d paveikslas; ir 15, 8%, palyginti su 13, 3%, naudojant „Treg“ ląsteles, P = 0, 17, 3e paveikslas). Tačiau Th17 ląstelės buvo gydomos ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinės CD4 + T ląstelėse žymiai rečiau nei kontrolinėse grupėse (4, 3%, palyginti su 7, 7%, P = 0, 02; 3c pav.) Th1Th17 ląstelėms (4, 2%, palyginti su 6, 8%, P = 0, 01; 3d paveikslas). ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje CD4 + T ląstelėse Trego ląstelės buvo dažnesnės nei neinfekuotose kontrolinėse dalyse (28, 2%, palyginti su 18, 1%, P = 0, 008; 3e pav.).

Tada mes išanalizavome Treg ląstelių pogrupius CCR6 + ir CCR6. Nors gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje padidėjo Treg ląstelių dažnis, Treg ląstelėse buvo mažiau CCR6 + nei neinfekuotose kontrolinėse grupėse (49, 8%, palyginti su 69, 8%, P = 0, 07; 3f pav. Taigi padidėjęs Treg ląstelių skaičius CD4 + T ląstelėse gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje atsirado dėl jų CCR6 - pogrupio (13, 5%, palyginti su 6, 43%, P = 0, 001; 3g paveikslas). pririšimas prie žarnos nepriklauso nuo CCR6 – CCL20 ašies.

Žarnyne Th17 / CCR6 - Treg santykis yra koreliuojamas su CCR6 + CD4 + T ląstelių priskyrimu plonosioms žarnoms gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims.

Treg ląstelių CCR6 + pogrupis migruoti į žarnas priklauso nuo CCR6 – CCL20 ašies, kaip Th17 ląstelių. Treg ląstelių pogrupiai CCR6 + ir CCR6 turėtų būti nagrinėjami atskirai, nes gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje jie keičiasi skirtingai. Todėl tolimesnėse analizėse mes įvertinome tik Th17 / CCR6 - Treg ir Th1Th17 / CCR6 - Treg santykį. Gydytais ŽIV-1 infekuotais asmenimis Th17 / CCR6 - Treg santykis buvo žymiai mažesnis nei neinfekuotose kontrolinėse grupėse (0, 32 vs 1, 45, P = 0, 001; 4a paveikslas), kaip ir Th1Th17 / CCR6 - Treg santykis (0, 33 vs 1, 40)., P = 0, 002; 4b paveikslas).

Image

Koreliacija tarp Th17 / CCR6 - T norminio (Treg) santykio ir CCR6 + CD4 + T ląstelių priskyrimo plonosios žarnos gleivinei. ( a, b ) Th17 / CCR6 - Trego santykis ( a ) ir Th1Th17 / CCR6 - Treg santykis ( b ) plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems ( n = 11) ir neinfekuotiems ( n = 11) asmenims. ( c - e ) Neigiama koreliacija tarp CCR6 - Treg ląstelių ir CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnio ( c ), T helperio 17 tipo (Th17) ląstelių ( d ) ir Th1Th17 ląstelių ( e ) mažose. žarnyno gleivinė (11 gydytų ŽIV-1 infekuotų ir 11 neužkrėstų asmenų). ( f, g ) koreliacija tarp Th17 / CCR6 - Treg santykio ( f ) ir Th1Th17 / CCR6 - Treg santykio ( g ) ir CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnio plonosios žarnos gleivinėje (11 gydytų ŽIV-1 infekuotų). ir 11 neužkrėstų asmenų). ŽIV-1 - baltas simbolis; ŽIV-1 +, pilkas simbolis.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

CCR6 - Treg ląstelių plonosios žarnos gleivinėje dažnis buvo neigiamai koreliuojamas su CCR6 + CD4 + T ląstelių ( ρ = −0, 87, P <0, 0001; 4c paveikslas), Th17 ląstelių ( ρ = −0, 64, P = 0, 001) dažniu. ; 4d pav.) Ir Th1Th17 ląstelės ( ρ = −0, 56, P = 0, 007; 4 e paveikslas). Šie duomenys rodo, kad kuo daugiau CCR6 - Treg ląstelių yra plonosios žarnos lamina propria, tuo mažiau CCR6 + CD4 + T ląstelių, ypač Th17 ir Th1Th17, migruoja į ją.

Tiek Th17 / CCR6 - Treg, tiek Th1Th17 / CCR6 - Treg santykiai ir CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnis plonosios žarnos gleivinėje buvo stipriai koreliuojami ( ρ = 0, 86 Th17 / CCR6 - Treg santykiui, P≤ 0, 0001, pav. 4f; ρ = 0, 92, kai Th1Th17 / CCR6 - Trego santykis, P≤ 0, 0001, 4g paveikslas). ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje esančios Treg ląstelės gali pereiti nuo Th17 prie CCR6 - tai gali būti CCR6 – CCL20 chemotaktinės ašies pakitimo pasekmė, tačiau ji taip pat gali būti priežastis, jei šis pusiausvyros sutrikimas neigiamai paveikia daro įtaką CCL20 gamybai.

Α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis, bet ne CCR9 – CCL25 ašis, iš dalies kompensuoja netinkamą CCR6 + CD4 + T ląstelių priskyrimą išilgai CCR6 – CCL20 ašies gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims.

Tada mes ištyrėme, ar Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelės gali migruoti iš kraujo į plonosios žarnos gleivinę išilgai CCR9 – CCL25 ir α 4 β 7 –MAdCAM-1 chemotaktinių ašių, be CCR6 – CCL20 ašies. Mes ištyrėme CCR9 ir α 4 β 7 raišką Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių pogrupiuose srauto citometrija. Didžioji dalis žarnyno Th1Th17 ląstelių ekspresuoja CCR9, tuo tarpu tik kelios Th17 ląstelės tai padarė (61, 3%, palyginti su 5, 9% gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų; P = 0, 003; 5a pav.). Daugiau žarnyno CCR6 + Treg ląstelių išreiškė CCR9 nei jų CCR6 - kolegos (34, 5%, palyginti su 22, 3% gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų, P = 0, 003; 5a pav.). Β 7 integrinas buvo ekspresuojamas daugumoje Th17 (91, 3%), Th1Th17 (84, 6%) ir Treg ląstelių, tiek CCR6 - (74, 5%), tiek CCR6 + ląstelių (81%), gydant ŽIV-1 infekuotus asmenis. (5b pav.). 5c paveiksle parodyta CCR9 ir β 7 integrino išraiška Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių pogrupiuose periferiniame kraujyje ir plonosios žarnos gleivinėje reprezentatyviai gydytu ŽIV-1 infekuotu asmeniu. Šie rezultatai rodo, kad tropinės žarnos Th17 ląstelės, priklausomai nuo CCR6 – CCL20 ir α 4 β 7 –MAdCAM-1 ašių, migruoja į plonosios žarnos gleivinę, nepriklauso nuo CCR9 – CCL25 ašies, nors ši chemotaktinė ašis galėtų būti svarbi skirtas Th1Th17 ląstelėms.

Image

Sąveika tarp CCR6-CCL20, CCR9-CCL25 ir α 4 β 7 –MadCAM-1 chemotaktinių ašių, skirtų T tipo pagalbininkų 17 tipo (Th17), Th1Th17 ir T reguliuojančių (Treg) ląstelių sujungimui su apdorotų plonosios žarnos gleivine. ŽIV-1 infekuoti asmenys. ( a, b ) CCR9 + ląstelių ( a ) ir β 7 + ląstelių ( b ) dažnis Th17, Th1Th17, CCR6 + ir CCR6 - Treg ląstelių pogrupiuose plonųjų žarnų gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims ( n = 11). Ląstelių procentai buvo nustatyti srauto citometrijos metodu. c ) CCR9 ir β 7 integrino išraiškos ant Th17, Th1Th17, CCR6 + ir CCR6 - Treg ląstelių periferiniame kraujyje (PB) ir plonosios žarnos gleivinėje reprezentatyviai apdoroto ŽIV-1 užkrėsto asmens srauto citometrijos analizė. Žarnyno limfocitams β 7 dažymas buvo padalintas į tris kategorijas (β 7 -, β 7 int ir β 7 didelis ). ( d ) Gleivinių adresacinių ląstelių adhezijos molekulės-1 (MAdCAM-1) kiekių ir CDR + + CCR9 + β 7, esančių CD4 + T ląstelėse, dažnis plonųjų žarnų gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims ( n = 10). Kiekvienas simbolis žymi vieną asmenį. e ) CCR6 + ląstelių dažnis CD8 + T ląstelėse plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims ( n = 11) ir neinfekuotiems asmenims ( n = 11). Ląstelių procentai buvo nustatyti srauto citometrijos metodu. f ) koreliacija tarp MAdCAM-1 kiekių ir didelio CCR6 + β 7 dažnio CD8 + T ląstelėse plonosiose žarnyno gleivinėse gydant ŽIV-1 infekuotus asmenis ( n = 10). Kiekvienas simbolis žymi vieną asmenį. ( g ) CXCR3 + dažnis CCR6 + CD8 + ląstelėse gydomomis ŽIV-1 infekuotomis ( n = 11) ir neinfekuotomis asmenimis ( n = 11). Ląstelių procentai buvo nustatyti srauto citometrijos metodu. AS, savavališkas vienetas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Tada mes ištyrėme šių ašių funkcijas ir kaip jos galėtų kompensuoti viena kitą. Anksčiau mes parodėme, kad CCR9 – CCL25 ašis yra pakitusi gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims, nes sumažėja CCL25 gamyba plonosios žarnos epitelio ląstelėse. Tai koreliuoja su mažiau CCR9 + CD4 + T ląstelių plonosios žarnos gleivinėje, kurią atspindi gausesnės žarnos tropinės CCR9 + CD4 + T ląstelės periferiniame kraujyje. Dabartiniai CCR9 + ląstelių rezultatai Th17 ir Th1Th17 bei Treg ląstelių pogrupiuose buvo panašūs (duomenys nepateikti). Taip pat naudojant imunohistochemiją, mes parodėme, kad MAdCAM-1 kiekis gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų žarnos lamina propria endotelio ląstelėse buvo panašus į neužkrėstų kontrolinių medžiagų. Taigi α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis galėtų funkcionuoti gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. MAdCAM-1 kiekis buvo teigiamai koreliuojamas su CCR6 + CCR9 + β 7 CD4 + T ląstelių dažniu gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų žarnyne ( ρ = 0, 69, P = 0, 03; 5d pav.). MAdCAM-1 kiekis ir CCR6 + CCR9 + β 7 aukštų Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių pogrupių žarnyne dažnis taip pat buvo linkęs koreliuoti ( ρ = 0, 54, P = 0, 09 Th17; ρ = 0, 60, P = 0, 05 - Th1Th17 ir ρ = 0, 53, P = 0, 09 - Trego ląstelėms, duomenys nepateikti). Tai rodo, kad α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis funkcionuoja ir varo kai kurias CCR6 + CCR9 + β 7 + ląsteles į plonosios žarnos gleivinę kaip alternatyvą sugedusioms CCR6 – CCL20 ir CCR9 – CCL25 ašims. Tačiau jis negali visiškai kompensuoti netinkamo CCR6 + CD4 + T ląstelių priskyrimo išilgai CCR6 – CCL20 ašies, nes Th17 ir Th1Th17 ląstelės gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosiose žarnų gleivinėse, nepaisant veiksmingo CART, liko ženkliai išeikvotos.

Priešingai nei pastebėtas CCR6 + CD4 + T ląstelių išeikvojimas žarnyno gleivinėje, CCR6 + CD8 + T ląstelių dažnis ŽIV-1 infekuotiems asmenims ir neinfekuotoms kontrolėms buvo panašus (52, 6%, palyginti su 58, 8%, P = 0, 14). ; 5e pav.). Taigi, atrodo, kad CCR6 – CCL20 ašies defektas skirtingai veikia CD4 + ir CD8 + T ląstelių populiacijas ŽIV-1 infekuotiems asmenims, kaip tai yra CCR9 – CCL25 ašies atveju. 22 Anksčiau mes parodėme, kad žarnyno CD8 + T ląstelės ekspresuoja didesnį β 7 integrino kiekį nei CD4 + T ląstelės. 22 α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis atrodo veikianti, nes mes nustatėme tvirtą teigiamą koreliaciją tarp MAdCAM-1 lygio ir CCR6 + β 7 aukštų CD8 + T ląstelių dažnio apdorotų plonųjų žarnų gleivinėse. ŽIV-1 infekuoti asmenys ( ρ = 0, 80, P = 0, 006; 5f pav.). Be to, CXCR3 + CCR6 + CD8 + T ląstelių dažnis plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims buvo didesnis nei neinfekuotose kontrolinėse grupėse (35, 3%, palyginti su 23, 6%, P = 0, 02; 5g paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad CD8 + T ląstelių gabenimas į žarnas labiau priklauso nuo α 4 β 7 ir (arba) CXCR3 sukeliamos chemotaksės, nei nuo CCR6 ir (arba) CCR9 šioje aplinkoje.

CCR6 ir CCR6 + Treg ląstelės demonstruoja skirtingus chemokino receptorius ir citokinų gamybos profilį

ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje padidėjo CCR6 - Treg ląstelių dažnis, o CCR6 + Treg ir Th17 / Th1Th17 ląstelių - sumažėjo. Taigi mes ištyrėme CCR6 ir CCR6 + Treg ląstelių fenotipą. Be α 4 β 7 integrino ir CCR9 chemokino receptorių, daugiau CCR6 + Treg ląstelių išreiškė CCR4, CCR5 ir CCR10 nei jų CCR6 - kolegos, gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims (50, 8%, palyginti su 28, 8% CCR4, P = 0, 04; 28, 8%, palyginti su 17, 5%, CCR5, P = 0, 08; 14%, palyginti su 4, 9%, CCR10, P = 0, 04; 6a pav.). Ir CCR6 +, ir CCR6 - Treg ląstelių pogrupiai išreiškė CXCR4 panašiu intensyvumu (duomenys nepateikti). Priešingai, daugiau CCR6 - Treg ląstelių išreiškė CXCR3 nei jų CCR6 + kolegos (37, 7% palyginti su 27, 8%, P = 0, 04; 6a pav.), O CXCR3 + CCR6 - Treg ląstelės CD4 + T ląstelėse buvo didesnės. gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims nei neinfekuotiems kontroliniams pacientams (37, 7%, palyginti su 16, 9%, P = 0, 02; 6b pav.). Taigi CXCR3 sukelta chemotaksė gali prisidėti prie CCR6 - Treg ląstelių priskyrimo plonosios žarnos gleivinei.

Image

CCR6 ir CCR6 + T reguliuojančių (Treg) ląstelių chemokino receptoriai ir citokinų gamybos profiliai. ( a ) CCR4 +, CCR5 +, CCR10 + ir CXCR3 + ląstelių dažnis CCR6 - ir CCR6 + Treg ląstelių pogrupiuose periferiniame kraujyje (PB) gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų ( n = 5). Ląstelių procentai buvo nustatyti srauto citometrijos metodu. ( b ) CXCR3 + dažnis CCR6 - Treg ląstelėse gydytais ŽIV-1 infekuotais ( n = 5) ir neinfekuotais asmenimis ( n = 5). c ) Interleukino-10 (IL-10) gamyba ir augimo faktoriaus β1 (TGF-β1) pavertimas CCR6 ir CCR6 + Treg ląstelių pogrupiais. ( d ) IL-17 gamyba iš T helperio 17 tipo (Th17) ląstelių ir CCR6 - ir CCR6 + Treg ląstelių pogrupių. Ląstelės buvo išrūšiuotos iš PB, naudojant srauto citometriją, kultivuojamos ir stimuliuotos ex vivo. Kultūrinėje terpėje išskiriami citokinai buvo kiekybiškai įvertinti fermentais sujungto imunosorbento tyrimu (ELISA). Parodytas vidurkis ir sd ( n = 4 nepriklausomi eksperimentai, atlikti su skirtingais donorais). e ) IL-17 ir IL-10 gaminančių Treg ląstelių fenotipas PB ir žarnos gleivinėje. Parodytas CCR6 + (baltos juostos) ir CCR6 - (juodos juostos) ląstelių dažnis tarp IL-17 ir IL-10 gaminančių Treg ląstelių. Prieš IL-17 ir IL-10 dažymą ir srauto citometrijos analizę ląstelės buvo stimuliuotos forbole 12-miristato 13-acetato (PMA) / jonomicinu. Parodytas vidurkis ( n = 6 asmenys PB analizei ir n = 4 asmenys žarnų gleivinės analizei). * P <0, 05; ** P <0, 01.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

CCR6 ir CCR6 + Treg ląstelės taip pat skyrėsi pagal citokinų gamybos profilį. Iš periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių CCR6 - ir CCR6 + Treg ir Th17 ląstelės buvo surūšiuotos srauto citometrijos būdu. Išrūšiuotos ląstelės buvo auginamos ex vivo ir apibūdintos pagal citokinų gamybos profilį naudojant fermentų susietą imunosorbentų tyrimą. CCR6 - Trego ląstelės gamino daugiau IL-10 nei CCR6 + Treg ląstelės ( P = 0, 02; 6c paveikslas), tuo tarpu abu Treg ląstelių pogrupiai gamino panašų augimo faktoriaus β transformavimo lygį (TGF-β, P = 0, 12; 6c paveikslas). CCR6 + Treg ląstelės daugiausia skiriasi nuo jų CCR6 - analogų IL-17 susidarymo atžvilgiu ( P = 0, 02; 6d paveikslas). Taigi CCR6 + Tregs išskiria reikšmingą kiekį IL-17, nors mažesniu mastu nei Th17 ląstelės (maždaug keturis kartus mažiau, P = 0, 03). Šie duomenys buvo patvirtinti in vivo periferiniame kraujyje ir žarnų gleivinėje srauto citometrijos metodu. Didžioji dauguma IL-17 gaminančių Treg ląstelių buvo TreR ląstelių CCR6 + frakcijoje, tiek periferinio kraujo, tiek žarnyno Treg ląstelėse, kaip analizuota srauto citometrija ( P = 0, 005; 6e paveikslas). Priešingai, dauguma IL-10 gaminančių Treg ląstelių buvo CCR6 - Treg ląstelių frakcijoje ( P = 0, 018; 6e pav.). Taigi IL-17 gaminančios ląstelės, daugiausia Th17 ląstelės, taip pat Treg ląstelių CCR6 + pogrupis, priklausantis nuo CCR6 – CCL20 chemotaktinės ašies, buvo sumažintos gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje, tuo tarpu CCR6 - Padidėjo tregai, turintys skirtingus chemokino receptorius ir citokinų gamybos profilį.

Th17 / CCR6 - Treg santykio disbalansas CCR6 - Treg ląstelių naudai ir su tuo susijęs perėjimas nuo IL-17 iki IL-10 ir TGF-β užstoja CCL20 gamybą enterocitų

Poslinkis nuo Th17 prie CCR6 - Treg ląstelių gali būti ir CCR6 – CCL20 chemotaktinės ašies pasikeitimo pasekmė, ir jos priežastis. Todėl mes ištyrėme citokinų, kuriuos gamina Th17 ir Treg ląstelių pogrupiai, įtaką CCL20 gamybai plonosios žarnos epitelio ląstelėse. Sukūrėme ex vivo žmogaus pirminių plonosios žarnos epitelio ląstelių, išaugintų kaip diferencijuotų enterocitų monosluoksnių ant transverterinių intarpų, modelį (papildomas paveikslas S2), kad toliau galėtume ištirti veiksnius, modulijuojančius CCL20 gamybą enterocituose. Mes išmatuojome CCL20 gamybą realiojo laiko RT-PGR ( CCL20 mRNR) ir fermentais sujungto imunosorbento tyrimu (CCL20 baltymu). CCL20 gamybą gali sukelti keli uždegiminiai dirgikliai. Kaip teigiamą kontrolę naudojome IL-1β ir TNF-α (duomenys nepateikti). Aktyvindami 1–6 TLR, enterocitai sukėlė CCL20 gamybą, taip pat aktyvuodami į NOD2 panašų receptorių, nors atsakas buvo mažesnis (papildomas S3 paveikslas). Taigi mikrobų jutimas paskatino enterocitus gaminti CCL20. Tai prieštarauja sumažėjusiai CCL20 gamybai gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. Tada mes nustatėme, ar citokinai, kuriuos gamina Th17 ir Treg ląstelių pogrupiai žarnos lamina propria, gali modifikuoti enterocitų CCL20 gamybą.

Stimuliacija IL-17A padidino enterocitų CCL20 gamybą mūsų ex vivo modelyje (7a pav.). Taigi IL-17 gaminančios ląstelės, daugiausia Th17 ląstelės, taip pat Treg ląstelių CCR6 + pogrupis, galėtų sukurti teigiamo grįžtamojo ryšio kilpą, išskirdamos IL-17, kuris tada indukuoja CCL20 gamybą, taigi skatintų CCR6 + ląstelių įsitraukimą į mažas žarnyno gleivinė. Enterocitų nepakankamas reagavimas į IL-17 per jo receptorius (IL-17R) gali prisidėti prie sumažėjusio CCL20 susidarymo gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. Iš plonosios žarnos biopsijos atliktame IL-17RA mRNR kiekyje išmatuota realiojo laiko RT-PGR. Gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų vidutinis IL-17RA mRNR kiekis buvo mažesnis nei neinfekuotų kontrolinių grupių ( P = 0, 013, papildomas S4a paveikslas). Mes taip pat įvertinome IL-8 (CXCL8) mRNR, nes šio chemokino gamybą enterocitai taip pat gali sukelti IL-17A per IL-17RA sukeltą NF-κB signalizaciją, kaip tai daroma CCL20 atveju. 34, 40, 41. Mes nustatėme, kad IL-8 mRNR taip pat buvo mažiau gauta gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims nei neinfekuotiems kontroliniams pacientams ( P = 0, 011, papildomas S4b paveikslas) ir kad IL-8 mRNR lygiai buvo stipriai koreliuojami. su IL-17RA mRNR ( ρ = 0, 80, P = 0, 0004, papildomas S4c pav.), rodo ryšį tarp sumažėjusio enterocitų interleukino 17A receptoriaus (IL-17RA) ekspresijos ir mažos IL-8 produkcijos. Tačiau CCL20 mRNR ir IL-17RA mRNR lygiai nebuvo statistiškai reikšmingai koreliuojami ( ρ = 0, 45, P = 0, 10, papildoma S4d pav.), Kas rodo, kad sumažėjęs CCL20 produkcija gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims priklauso ne tik dėl nepakankamo IL-17 mikroaplinkos ir (arba) dėl enterocitų jautrumo per IL-17R nepakankamumo, bet taip pat dėl ​​papildomų susijusių reguliavimo veiksnių.

Image

Poslinkio iš 17 tipo T pagalbininkų (Th17) į CCR6 - T reguliuojančias (Treg) ląsteles įtaka plonosios žarnos epitelio ląstelių, auginamų ex vivo, CCL20 gamybai. a ) CCL20 mRNR ekspresija pirminėse plonosios žarnos epitelio ląstelėse, apdorotose 15 valandų 0, 5, 5 arba 50 ng ml −1 interleukino (IL) -17A, IL-10 arba transformuojančio augimo faktoriaus β1 (TGF-β1). Pirminės plonosios žarnos epitelio ląstelės buvo kultivuojamos kaip diferencijuotų enterocitų monosluoksniai ant transvertinių intarpų. Pateikti duomenys buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų, atliktų su skirtingais donorais. CCL20 mRNR raiška enterocituose buvo įvertinta realiojo laiko atvirkštinės transkriptazės-PGR (RT-PGR) ir normalizuota iki GAPDH . b ) pirminių plonosios žarnos epitelio ląstelių CCL20 ekspresija po jų auginimo kartu su įvairiomis proporcijomis Th17 ir CCR6 - Treg ląstelėmis. Enterocituose esanti CCL20 mRNR buvo kiekybiškai įvertinta realaus laiko RT-PGR ir normalizuota iki GAPDH (juodos juostos); Į auginimo terpę išskiriama CCL20 buvo kiekybiškai įvertinta fermentais sujungtu imunosorbentų tyrimu (ELISA) (baltos juostos). Rezultatai pateikiami kaip CCL20 kartų pokytis, kai neinfekuotų asmenų Th17 / CCR6 - Treg santykis keičiasi nuo savo fiziologinės vertės Th17 ląstelių (kairėje) arba CCR6 - Treg ląstelių (dešinėje) naudai, nes tai yra atvejo ŽIV-1 infekuotiems asmenims. Neužkrėstų (fiziologinis santykis 3/2) ir gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų (patologinis santykis 1/3) plonosios žarnos gleivinėje išmatuoti Th17 / CCR6 - Treg santykiai žymimi atitinkamai atviromis ir užpildytomis rodyklėmis. AS, savavališkas vienetas. c ) teigiama koreliacija tarp IL-17 ir CCL20 baltymų lygio. ( d, e ) Neigiamos koreliacijos tarp IL-10 ( d ) arba TGF-β1 ( e ) ir CCL20 baltymo lygio. Baltymų lygis buvo išmatuotas ELISA metodu atliekant eksperimentus su kultivacija ( n = 8).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Atsižvelgdami į galimą Trego ląstelių pagamintų citokinų įtaką enterocitų CCL20 gamybai, mes nustatėme, kad tiek IL-10, tiek TGF-β1 tai sumažino mūsų ex vivo modelyje (7a pav.). Taigi, CCR6 - Trego ląstelės galėtų neigiamai reguliuoti CCR6 – CCL20 chemotaktinę ašį, išskirdamos IL-10 ir TGF-β1, bet ne IL-17.

Mes auginome ex vivo pirminės plonosios žarnos epitelio ląsteles su įvairiomis proporcijomis Th17 ir CCR6 - Treg ląstelėmis, surūšiuotomis pagal srauto citometriją ir patalpintomis apatiniame transvelių kameroje, kad imituotų lamina propria ir epitelio sąveikas. Tiek CCL20 mRNR, tiek CCL20 baltymo gamyba (7b pav.) Buvo nualinta, kai Th17 / CCR6 - Treg santykis pasislinko CCR6 - Treg ląstelių naudai. CCL20 gamyba sumažėjo keturis kartus (CCL20 baltymas) iki šešis kartus ( CCL20 mRNR), kai Th17 / CCR6 - Treg santykis pakito nuo fiziologinės vertės (1, 6 mūsų neinfekuotose kontrolinėse medžiagose) iki to, kuris buvo pastebėtas gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. (0, 35), suderinus su mūsų duomenimis in vivo . Išskiriamo CCL20 baltymo lygiai buvo teigiamai koreliuojami su IL-17 koncentracija ( ρ = 0, 93, P = 0, 0007; 7c paveikslas), tuo tarpu jie buvo neigiamai koreliuojami su IL-10 ( ρ = –0, 83, P = 0, 01; 7d pav.) Ir TGF-β1 ( ρ = −0, 71, P = 0, 04; 7 e paveikslas). Todėl šie rezultatai rodo, kad mažas Th17 / CCR6 - Treg santykis žarnyne ir su tuo susijęs perėjimas nuo IL-17 iki IL-10 ir TGF-β neleidžia normaliai gaminti CCL20 enterocitų, kurie sulieja CCR6 + nustatymą. CD4 + T ląstelės, ypač Th17 ląstelės, patenka į plonosios žarnos gleivinę išilgai CCR6 – CCL20 ašies, išlaikydamos užburtą ratą gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims, nepaisant veiksmingo CART.

DISKUSIJA

Žmogaus gleivinės lamina propria CD4 + T ląstelės nėra visiškai atkurtos daugumai gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų, kuriems CART prasidėjo lėtinėje stadijoje, priešingai nei periferiniame kraujyje ir organizuotuose limfoidiniuose audiniuose. 4, 21 Šis sutrikęs gleivinės imuninis barjeras yra susijęs su nuolatiniu žemo lygio mikrobų perkėlimu iš žarnos mikrobiotos į kraują, kurstant lėtinį sisteminį uždegimą ŽIV-1 infekuotiems asmenims, nepaisant veiksmingo CART. 14, 15, 16, 17 Anksčiau aprašėme, kaip pakitęs CD4 + T ląstelių pririšimas prie plonosios žarnos gleivinės išilgai CCR9 – CCL25 chemotaktinės ašies galėtų prisidėti prie šio prasto žarnyno imuninio atstatymo. 22 Mes ištyrėme CCR6 – CCL20 ašies veikimą, nes ši chemotaktinė ašis specialiai reguliuoja Th17 ląstelių priskyrimą žarnynui. 30, 31, 33 duomenys. Mūsų išvados rodo, kad gydomiems ŽIV-1 infekuotiems pacientams sutrinka CCR6 + CD4 + T ląstelių plonosios žarnos gleivinė, daugiausia dėl sumažėjusio enterocitų CCL20 gamybos. Šis defektas buvo susijęs su sutrikusia Th17 ir Th1Th17 ląstelių restauracija plonosios žarnos gleivinėje. Trego ląstelės, priešingai, buvo dažnesnės, tačiau tik jų CCR6 - pogrupis. Dėl perėjimo iš IL-17 į IL-10 ir TGF-β1 enterocitai suliečia CCL20 gamybą, sukurdami neigiamą grįžtamąjį ryšį, kad įdarbintumėte CCR6 + CD4 + T ląsteles į plonosios žarnos gleivinę.

Pusiausvyros tarp Th17 ir Treg ląstelių praradimas žarnyno gleivinėje buvo susijęs su ligos progresavimu replikuojamojoje patogeninėje SIV infekcijoje pigmentinėse makakose, tuo tarpu Th17 / Treg santykis išlieka nepakitęs nepatogeniškos SIV infekcijos metu Afrikos žaliose beždžionėse. 8, 18 Poslinkis nuo Th17 į Treg ląsteles taip pat buvo susijęs su nuolatiniu CD4 + T-ląstelių išeikvojimu žarnų gleivinėje, nepaisant ŽIV-1 infekuotų asmenų CART. 20 Pradėjus CART ankstyvosios ŽIV-1 pirminės infekcijos metu, lėtinėje infekcijos fazėje žarnos CD4 + T ląstelės buvo geriau atkuriamos imuniniu būdu, nei tada, kai CART buvo pradėta vėlai. 20 Tačiau Th17 ląstelių populiacija žarnyno gleivinėje nebuvo visiškai atkurta net tiems asmenims, kuriems kartotinis gydymas buvo pradėtas anksti, išskyrus tuos, kurie pradėjo kartoti ŽIV-1 pirminės infekcijos Fiebig I / II stadijose. Tai rodo, kad žarnyno gleivinės homeostazė yra anksti sutrikdyta užsikrėtus ŽIV-1, išlieka, nepaisant veiksmingo CART, ir neleidžia atkurti normalios žarnos Th17 ląstelių populiacijos.

Nustatant replikacines ŽIV / SIV infekcijas, CCL20 galėtų atlikti tam tikrą vaidmenį rekrutuojant CCR6 + ląsteles į uždegiminius audinius. 18, 42, 43, 44 CCR6 + CD4 + T ląstelėms galėtų būti teikiamos pirmenybės SIV / ŽIV, nes jos yra labai atsparios infekcijai. 45, 46, 47 Esant efektyviam CART, likęs ŽIV-1 replikacija žarnyne gali prisidėti prie blogo gleivinės CD4 + T ląstelių, ypač CCR6 + CD4 + T ląstelių, atstatymo. Nepaisant CART, visų tirtų asmenų plonojo žarnyno gleivinėje buvo nustatyta ŽIV-1 RNR, absoliutus ŽIV-1 RNR krūvis plonojo žarnyno audinyje buvo mažas ir mes neradome koreliacijos tarp jos ir nė vieno CCR6 + CD4 išeikvojimo. + T-ląstelių pogrupiai. Taigi, mūsų rezultatai nerodo, kad likęs ŽIV-1 replikacija vaidina tiesioginį vaidmenį prastai atkuriant CCR6 + CD4 + T ląsteles plonosios žarnos gleivinėje šioje populiacijoje gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų, turinčių nuolatinį nenustatomą plazmos viruso kiekį. daugelį metų. Toliau ginčydamiesi dėl tiesioginio ŽIV-1 replikacijos vaidmens, mes nustatėme, kad CCL20 ir CCL25 gamybą padidino ŽIV-1 replikacija plonojo žarnyno histo kultūrų ex vivo modelyje, užkrėstų R5 tropiniu virusu (duomenys nepateikti), priešingai. iki sumažėjusio CCL20 ir CCL25 lygio plonųjų žarnų gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad sumažėjęs CCR6 + CD4 + T ląstelių dažnis žarnyne geriausiai gali būti paaiškinamas ne naujų darbuotojų pritraukimu, o nuolatiniu ŽIV-1 replikacija.

Dauguma tyrimų su ŽIV-1 infekuotais asmenimis buvo atlikti atliekant biopsijas iš tiesiosios žarnos arba distalinės gaubtinės žarnos. CD4 + T limfocitų populiacijos plonojoje žarnoje ir storosios žarnos / tiesiojoje žarnoje gali skirtis; pavyzdžiui, atrodo, kad dauguma Th17 ląstelių yra plonosios žarnos gleivinėje. 33, 48 Taip pat skiriasi chemotaktinės ašys, dalyvaujančios T ląstelių priartėjime prie plonosios žarnos ir storosios žarnos; CCR9 – CCL25 ašis dalyvauja tik nustatant plonosios žarnos gleivinę. 24, 25 Taigi išvados, padarytos atlikus plonojo žarnyno ir storosios žarnos imuninės sistemos atsigavimą, gali labai skirtis.

Skirtumų taip pat gali atsirasti dėl Th17 ir Th1Th17 ląstelių apibrėžimo. Mes juos apibrėžėme pagal jų paviršiaus fenotipus, o ne pagal IL-17 ir interferono-γ (IFN-γ) gamybą. Forbolio 12-miristato 13-acetato / jonomicino stimuliacija, reikalinga tarpląsteliniam citokinų dažymui, smarkiai sumažina kai kurių chemokinų receptorių, ypač CCR9, reguliavimą, užkertant kelią teisingam stimuliuotų T limfocitų fenotipų nustatymui pagal jų citokinų gamybos profilį. Todėl mes apibrėžėme Th17 ląsteles kaip CD3 + CD4 + CCR4 + CXCR3 - CCR6 + CD161 + ląsteles, o Th1Th17 ląsteles kaip CD3 + CD4 + CCR4 - CXCR3 + CCR6 + CD161 + ląsteles, kurios buvo aiškiai susijusios su IL-17 + IFN- Periferinio kraujo limfocitų γ - ir IL-17 + IFN- + + fenotipai. 30, 31, 37, 38 Kalbant apie Treg ląsteles, anksčiau buvo aprašyti keli FoxP3 + Treg ląstelių pogrupiai su skirtingais citokinų gamybos profiliais. 49, 50, 51, 52, 53 CCR6 + Treg ląstelės gali gaminti IL-17 išlaikydamos FoxP3 raišką. Tiek CCR6 +, tiek CCR6 - „ Treg“ pogrupiai išlaiko slopinančią funkciją. 49, 50, 51, 52, 53. Mes nustatėme, kad IL-17 gaminančios ląstelės, ty Th17, Th1Th17 ir CCR6 + Treg ląstelės, buvo gydomos ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje. padidėjęs CCR6 - Treg ląstelių dažnis, sukeliantis nesubalansuotą Th17 / CCR6 - Treg ląstelių santykį.

Ištyrę alternatyvias chemotaktines ašis, kuriomis galėtų naudotis CCR6 - Treg ląstelės, kad pasiektų plonosios žarnos gleivinę, mes nustatėme, kad dauguma žarnų tropinių Trego ląstelių, tiek CCR6 +, tiek CCR6 - pogrupiuose, ekspresuoja α 4 β 7 integriną, tuo tarpu ant CCR6 + Treg ląstelių buvo žymiai daugiau CCR9 nei ant jų CCR6. Taigi, sugedusios CCR6 – CCL20 ir CCR9 – CCL25 ašys galėtų prisidėti prie to, kad CCR6 + Treg ląstelės nesusirenka į plonosios žarnos gleivinę. Priešingai, α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis atrodo veikianti, nes mes nustatėme panašų kiekį MAdCAM-1 ant gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų endotelio ląstelių ir neužkrėstų kontrolinių grupių. Taip pat mes nustatėme teigiamą koreliaciją tarp MAdCAM-1 kiekio ir CCR6 + CCR9 + β 7 aukštų pogrupių Th17, Th1Th17 ir Treg ląstelių dažnio, taip pat su CCR6 + β 7 aukštų CD8 + T ląstelių dažniu plonosios žarnos gleivinė, tai rodo, kad α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis iš dalies kompensuoja pažeistas ašis CCR6 – CCL20 ir CCR9 – CCL25. Daugiau CCR6 + Treg ląstelių išreiškė CCR4, CCR5 ir CCR10 nei jų CCR6 - kolegos - tai leidžia manyti, kad šios chemotaktinės ašys neveda į preferencinį CCR6 - Treg ląstelių įdarbinimą plonosios žarnos gleivinėje gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims. Tačiau daugiau CCR6 - Treg ląstelių išreiškė CXCR3 nei jų CCR6 +, ir CXCR3 + CCR6 - Treg ląstelių CD4 + T ląstelėse dažnis buvo didesnis gydomų ŽIV-1 infekuotų asmenų organizme nei neinfekuotų kontrolinių grupių. Taigi ši chemotaktinė ašis galėtų prisidėti prie CCR6 - Treg ląstelių sulyginimo su plonosios žarnos gleivine, kaip tai gali būti nutiesta CD8 + T ląstelių atveju. Mes turime preliminarius rezultatus, rodančius, kad CXCR3 + Th1 limfocitai yra dažnesni gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje nei neinfekuotose kontrolinėse dalyse, taip pat rodo, kad CXCR3 sukelta chemotaksis veikia kai kuriuos ląstelių pogrupius (duomenys nepateikti). Tai pateisina tolesnius tyrimus, siekiant ištirti CXCL9, CXCL10 ir CXCL11, CXCR3 ligandų, vaidmenį šioje aplinkoje. Priešingai, Th1Th17, kuris yra CXCR3 +, liko be išeikvojimo gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje. Mes nustatėme, kad dauguma Th1Th17 ląstelių ekspresuoja CCR9, tuo tarpu tik kelios Th17 ląstelės tai padarė, tai rodo, kad CCR9 – CCL25 chemotaktinė ašis yra būtina Th1Th17 ląstelių prigijimui žarnyne. CXCR3 ir α 4 β 7 sukelto chemotaksio gali nepakakti, kad kompensuotų trūkumų turinčias CCR9 – CCL25 ir CCR6 – CCL20 ašis Th1Th17 ląstelių pritraukimui į plonosios žarnos gleivinę.

Mes įvertinome IL-17, IL-10 ir TGF-β citokinų įtaką CCL20 gamybai, naudodami plonosios žarnos epitelio ląsteles, išaugintas ex vivo kaip monoliarinius poliarizuotų enterocitų sluoksnius. Enterocitų diferenciacija buvo tikrinama pagal jų citokeratino (CK) -18 ir CK-20 išraišką, organizuojant sandarias jungtis, kurias atskleidė nenutrūkstamas ZO-1 dažymas, o epitelio vientisumas buvo tikrinamas matuojant transepitelio elektrinę varžą. Mūsų rezultatų tinkamumą patvirtina žmogaus plonosios žarnos pirminių epitelio ląstelių, o ne storosios žarnos ląstelių linijų panaudojimas, ir pirminių enterocitų, esančių intarpuose, ir Th17 ir Treg ląstelių, esančių apatiniame transvelių kameroje, mėginių imitavimas, pateikimas įdėkluose. propria ir epitelio sąveikos. Mes nustatėme, kad CCL20, kurį gamina enterocitai, skatina IL-17 gaminančios ląstelės, sukurdamos teigiamą grįžtamąjį ryšį, kuris verčia tolimesnį CCR6 + T ląstelių įdarbinimą žarnyno gleivinėje. Priešingai, CCR6 - Trego ląstelės užtemdė CCL20 gamybą enterocitais, sutrikdydamos CCR6 – CCL20 chemotaktinę ašį. Gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims poslinkis nuo CCR6 + IL-17 gaminančių ląstelių prie CCR6 - ląstelių plonosios žarnos gleivinėje atrodo tiek dėl CCR6 – CCL20 chemotaktinės ašies pakitimo, tiek ir yra jos priežastis. dėl kontrastingų IL-17 ir IL-10 / TGF-β1 vaidmens enterocitų CCL20 gamyboje. Taip pat gali būti susijęs su enterocitų nejautrumu IL-17A, nes mes nustatėme, kad gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims IL-17RA ekspresija sumažėjo. Pats IL-17A, tačiau ryškiausiai sinergijoje su uždegimą sukeliančiais citokinais, tokiais kaip TNF-α, sukelia kelių uždegimo mediatorių gamybą per IL-17RA signalizaciją. 34, 40, 41 IL-21 skatina Th17 ląstelių diferenciaciją ir skatina IL-17RA ekspresiją, 54 ir įrodyta, kad gydymas IL-21 pagerina Th17 žarnyno atstatymą gydomose SIV infekuotose makakose. 55, 56 Priešingai, Th1 citokinai, ypač IFN-γ ir IL-2, neigiamai reguliuoja Th17 diferenciaciją ir IL-17RA raišką. 54, 57, 58. Mūsų preliminarūs rezultatai atskleidė padidėjusį Th1 ląstelių dažnį gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje, o tai gali padėti sumažinti IL-17RA raišką. Turi būti atlikti tolesni tyrimai dėl sumažėjusio enterocitų IL-17RA ekspresijos mechanizmų ir pasekmių.

Apibendrinant, mes aprašėme mechanizmą, kuris gali paaiškinti, kodėl Th17 ląstelės efektyviai neatsinaujina gydytų ŽIV-1 infekuotų asmenų plonosios žarnos gleivinėje, nepaisant nuolatinio efektyvaus CART. Tokiu atveju sutrinka CCR6 – CCL20 žarnų chemotaktinė ašis, dėl kurios sutrinka Th17, Th1Th17 ir CCR6 + Treg ląstelių priskyrimas plonosios žarnos gleivinei, kurią tik iš dalies kompensuoja α 4 β 7 –MadCAM-1 ašis. Priešingai, CCR6 - Treg ląstelės gali veiksmingai migruoti į plonosios žarnos gleivinę, galbūt per CXCR3 sąlygotą chemotaksį, ir tai lemia pakitusį Th17 / CCR6 - Treg santykį, kuris užstoja CCL20 gamybą enterocituose, išlaikydamas neigiamą grįžtamojo ryšio ciklą. CCR6 + CD4 + T ląstelių pritraukimas į plonosios žarnos gleivinę gydomiems ŽIV-1 infekuotiems asmenims.

METODAI

Tiriamieji ir pavyzdžiai

ANRS EP44 tyrimo grupė buvo aprašyta anksčiau. 22 Trumpai tariant, Tulūzos universiteto ligoninėje (Tulūza, Prancūzija) buvo įdarbinta 20 ŽIV-1 infekuotų asmenų. Jiems buvo suteiktas ilgalaikis efektyvus 5 metų mediana (IQR, 4–5, 5), pradėtas lėtinėje infekcijos stadijoje (vidutinis žemiausias CD4 + T ląstelių skaičius - 185 ląstelės viename μl, IQR 123–221 ląstelės viename μl). ). Visi turėjo nuolatinę ŽIV-1 RNR plazmoje <20 kopijų viename mililitre. Jų vidutinis CD4 + T ląstelių skaičius buvo 668 ląstelės viename μl (IQR 451–849 ląstelės viename μl), CART, kraujo ir žarnyno mėginių paėmimo metu (klinikinė informacija pateikta papildomoje S1 lentelėje). Kontrolėmis buvo panaudota keturiolika neužkrėstų asmenų. Abi grupės buvo panašios savo amžiaus (51 ir 53 metai, P = 0, 44) ir lyties (vyrų 86 proc., Palyginti su 67 proc., P = 0, 32). The frequency of CD4 + T cells remained lower in the peripheral blood of treated HIV-1-infected individuals than in uninfected controls (40.7% vs. 64.8%, P <0.0001) despite their being on sustained suppressive cART. Biopsies of duodenojejunal mucosa were taken from each patient during an upper endoscopy, and peripheral blood samples were taken at the same time. Certain analyses could not be performed on the entire study population because samples were unavailable for some subjects. All individuals were free of inflammatory or lymphoproliferative bowel disease on histopathologic examination.

Etikos pareiškimas

The study was approved by the Institutional Review Board CPP Sud-Ouest et Outre-Mer II. All participants provided informed consent (trial registration number NCT01038401).

Isolation of small intestine mucosal lymphocytes

Duodenojejunal biopsies ( n =5) were digested with 0.5 mg ml −1 collagenase type II-S (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). T lymphocytes were isolated by positive selection (EasySep Human CD3 Positive Selection Kit, Stemcell, Grenoble, France) and processed immediately.

Immunophenotyping of peripheral blood and mucosal lymphocytes

Flow cytometry analyses were performed on a BD LSRFortessa driven by the FACSDiva software (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Th17 (CD3 + CD4 + CXCR3 CCR4 + CCR6 + CD161 + ) and Th1Th17 (CD3 + CD4 + CXCR3 + CCR4 CCR6 + CD161 + ) cells were stained with anti-human CD3-BV655 (OKT3, Biolegend), CD4-PE-Cy7 (SK3), CXCR3-PerCP-Cy5.5 (1C6), CCR4-PE (1G1), CCR6-BV786 (11A9) (all from BD Biosciences, San Diego, CA), and CD161-eFluor450 (HP-3G10, eBiosciences, San Diego, CA) monoclonal antibodies (mAbs).

Treg cells were stained with anti-human CD3-PerCP-Cy5.5 (UCHT1, Ozyme, St Quentin Yvelines, France) or CD3-BV655 (OKT3, Biolegend), CD4-PacificBlue (RPA-T4, BD Biosciences), CD127-PE or FITC (R34.34, Beckman Coulter, Brea, CA), CD25-PE-Cy7 (M-A25), CD45RA-APC-Cy7 (HI 100), HLA-DR-PE-Cy5 (L243), CCR6-BV768 (11A9) (all from BD Biosciences), and FoxP3-AlexaFluor700 (PCH101, eBiosciences) mAbs using Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). CCR6 expression on IL-17- and IL-10-producing memory Treg cells was assessed by flow cytometry. Cells were activated with phorbol 12-myristate 13-acetate (20 ng ml −1 ) and ionomycin (1, 000 ng ml −1 ) for 6 h and monensin was added after 1 h, before staining with anti IL-17-PE (eBio64DEC17, eBiosciences) and anti-IL-10-PerCP-Cy5.5 (JES3-0D7, Biolegend) mAbs using Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences).

The cell subsets were also analyzed for the expression of the gut-homing receptors with anti-human CCR4-PE (1G1), CCR5-PerCP-Cy5.5 (2D7), CCR6-BV786 (11A9), CCR9-FITC (112509), CCR10-APC (314305), CXCR3-PerCP-Cy5.5 (1C6), CXCR4-PE-Cy5 (12G5), and β 7 -APC (FIB504) mAbs (all from BD Biosciences, except CCR9 and CCR10 mAbs from R&D Systems, Minneapolis, MN). We previously showed that β 7 + CD4 + T cells coexpress the α 4 integrin chain, with Förster resonance energy transfer demonstration of the association between the α 4 and β 7 chains. β 7 + CD4 + T cells were also labeled with the α 4 β 7 Act-1 mAb. 22

Quantification of HIV-1 in the small intestine mucosa

HIV-1 DNA/RNA was quantified by real-time PCR/RT-PCR with primer pairs and Taqman probes specific for LTR/ gag on a Light-Cycler (Roche Diagnostics, Meylan, France), as previously described. 59, 60 HIV-1 DNA is expressed as copies per 10 6 gut CD4 + T cells. HIV-1 RNA is expressed as copies per mg of gut tissue.

Quantification of CCL20 , IL-8 , and IL-17RA mRNA in small intestine epithelial cells

RNA was extracted from small intestine epithelial cells using the RNeasy minikit (Qiagen, Hilden, Germany). The primers were designed to amplify a fragment encompassing a spliced region of CCL20 , IL-8 , and IL-17RA mRNA. RT-PCR was performed on a LightCycler 480 (Roche). Data are given as relative quantities of CCL20 , IL-8 , and IL-17RA mRNA normalized to GAPDH mRNA (ΔΔCt method). The primer and probe sequences used were: GAPDH sense, 5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′, antisense, 5′- GACTGTGGTCATGAGTCCT-3′, and probe, 5′-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAA-3′; CCL20 sense, 5′-CTTTGATGTCAGTGCTGCTACT-3′, antisense, 5′-GATTTGCGCACACAGACAACT-3′, and probe, 5′-CACACGGCAGCTGGCCAATGAAGG-3′; IL-8 sense, 5′-CTTCCTGATTTCTGCAGCTC-3′, antisense, 5′-GGTGGAAAGGTTTGGAGTATG-3′, and probe, 5′-CACTCCTTGGCAAAACTGCACCTTC-3′; IL-17RA sense, 5′-GTGGCTCACATCGAATGGAC-3′, antisense, 5′-GCACAAACGTTCATTGGTGTTC-3′, and probe, 5′-TCGAGGTACAGGATGCTGGCGTCTGTC-3′.

Imunohistochemija

Fresh tissues were fixed in 4% neutral buffered formalin and embedded in paraffin. Immunohistochemistry was performed on 3 μm sections using anti-CCL20 (MAB360, R&D Systems) and MAdCAM-1 (MCA2321T, Serotec, Kidlington, Oxfordshire, UK) mAbs and the appropriate secondary antibodies. MAdCAM-1 expression was quantified on endothelial cells semiquantitatively. Quantification was performed using LAS v3.7 (Leica microsystems, Wetzlar, Germany) and NIS-element (Nikon, Tokyo, Japan) in a blinded manner regarding HIV-1 infection status.

Isolation and culture of primary small intestine epithelial cells

Human intestinal tissue was obtained from small bowel surgical resections of HIV-negative individuals at the department of general and digestive surgery of Toulouse University Hospital, France. All individuals were free of inflammatory bowel disease. Informed consent was obtained from each donor as approved by the local ethics committee. Intestinal tissue was digested using collagenase, dispase, and DNAse. The digests were subjected to Percoll density gradient and epithelial cells were isolated by magnetic positive selection (human epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)-positive selection kit, Stemcell). Cell purity was >95% by flow cytometry (anti-EpCAM mAb, Stemcell). Cells were placed in gelatin-coated wells (Corning BioCoat, New York, NY) and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (1:1), 5% fetal bovine serum, and 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B supplemented with hepatocyte culture medium (HCM) Single Quote kit (Lonza, Basel, Switzerland).

Polarized enterocyte cultures

Primary small intestine epithelial cells were cultured on transwell inserts (0.4 μm pore polycarbonate membranes coated with Corning Matrigel) at 4.10 5 cells per insert. They were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (1:1), 5% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B with ITS (Sigma-Aldrich) and 5 ng ml −1 epidermal growth factor for 2 days. Fetal bovine serum was then removed from the medium, while hydrocortisone and 3, 3′, 5-triiodo- L -thyronine (Sigma-Aldrich) were added. This resulted in monolayers of polarized epithelial cells. The differentiation of the enterocytes was checked by their expression of CK-20 (mAb from Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) and by the organization of tight junctions revealed by continuous ZO-1 staining (mAb from Invitrogen, Carlsbad, CA) on an inverted confocal laser scanning microscope (LSM 710, Zeiss, Oberkochen, Germany) (Supplementary Figure S2). The enterocytes also expressed CK-18 and EpCAM (data not shown). The integrity of the epithelium was checked by measuring the transepithelial electrical resistance between the apical and basolateral sides of the monolayer (mean: 450 ohms cm −2, as assessed using Millicell ERS-2, Millipore, Darmstadt, Germany).

Stimulation of primary enterocytes ex vivo

TLR ligands Pam3CSK4 (TLR1/2 agonist), heat-killed Listeria monocytogenes (HKLM; TLR2 agonist), lipopolysaccharide (LPS; TLR4 agonist), Salmonella typhimurium flagellin (ST-FLA; TLR5 agonist), FSL-1 (TLR6/2 agonist), and NLR ligand muramyl dipeptide (MDP; NOD2 agonist) were all purchased from InvivoGen (Toulouse, France). Pam3CSK4, LPS, ST-FLA, and FSL-1 were used at 0.1 or 1 μg ml −1 ; HKLM was used at 10 8 cells per ml; MDP was used at 1 or 10 μg ml −1 . Human cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-17A, IL-10, and TGF-β1 from eBiosciences) were used at 0.5, 5, or 50 ng ml −1 . All stimulations were performed during 15 h on the differentiated enterocytes cultured on transwell inserts, without epidermal growth factor, hydrocortisone, or 3, 3′, 5-triiodo- L -thyronine in the medium. TNF-α and IL-1β were positive controls for CCL20 induction (data not shown).

Flow cytometry sorting and ex vivo culture of Treg and Th17 cells

CCR6 + and CCR6 Treg and Th17 cells were sorted from memory CD4 + T cells by flow cytometry on a FACSARIA II (BD Biosciences). Purities of sorted cells were >99% for all subsets. Sorted cells were stimulated by CD3/CD28 Dynabeads and cultured in OpTmizer medium (Life Technology, Carlsbad, CA) with IL-2 for 1–2 weeks.

Ex vivo functional profiles of Treg and Th17 cells

Flow cytometry-sorted Treg and Th17 cells were cultured ex vivo and activated with phorbol 12-myristate 13-acetate/ionomycin for 6 h. For coculture experiments, various proportions of Treg and Th17 cells were placed in the bottom chamber of the transwells for coculture with primary small intestine epithelial cells during 15 h. We assessed CCL20 production by quantifying CCL20 mRNA in the enterocytes by RT-PCR, and CCL20, IL-17, IL-10, and TGF-β1 secreted proteins by enzyme-linked immunosorbent assay (R&D Systems).

Statistinė analizė

Quantitative variables are described by their medians and interquartile ranges, shown as box plots, and compared using the Wilcoxon rank-sum test. The Wilcoxon signed-rank test was used for matched pairs. Correlations were estimated by calculating Spearman's rank correlation coefficients. All tests were two sided, and P values of ≤0.05 were considered statistically significant. Statistical analyses were performed with Stata 10.0 (College Station, TX).

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

  4. 4.

    Papildomas 4 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

  2. 2.

    Papildoma informacija

    PAPILDOMA MEDŽIAGA susieta su internetine šio leidinio versija adresu //www.nature.com/mi