Ląstelių ir elgesio rezultatai dėl nugaros striatonigralinio neurono abliacijos: naujos įžvalgos apie striagos funkcijas | neuropsichofarmakologija

Ląstelių ir elgesio rezultatai dėl nugaros striatonigralinio neurono abliacijos: naujos įžvalgos apie striagos funkcijas | neuropsichofarmakologija

Anonim

Dalykai

  • Neuronų fiziologija
  • Psichologija
  • Striatum

Anotacija

Stuburis yra įvestinė bazinių ganglijų tinklo struktūra, kurioje yra nevienalyčių neuronų populiacijos, įskaitant dvi projekcinių neuronų, vadinamų vidutinio stiprumo smailiaisiais neuronais (MSN), ir skirtingų tipų interneuronus. Mes sukūrėme transgeninį pelės modelį, įgalinantį indukuoti striatonigralinių MSN, sudarančių tiesioginį kelią, abliaciją, ekspresuojant žmogaus difterijos toksino (DT) receptorius, kontroliuojamus Slc35d3 geno promotoriaus, geno, praturtinto striatonigraliniais MSN. DT injekcija į striatum suaktyvino daugumos striatonigralinių MSN pašalinimą. DT-tarpininkaujama striatonigralinių MSN abliacija sąlygojo selektyvų cholinerginių interneuronų praradimą nugaros striatumoje, bet ne ventrinėje striatumoje (nucleus carrbens), ir tai rodo regionui būdingą tiesioginio kelio kritinį vaidmenį striatos cholinerginių neuronų homeostazėje. Pelėms, įšvirkštusioms DT į stuburo slankstelį, pakito bazinis ir kokaino sukeltas lokalumas ir dramatiškai sumažėjo L-DOPA sukelta diskinezija parkinsoninės ligos atvejais. Be to, šioms pelėms buvo sumažintas nerimas, atskleidžiant stuburo slankstelio vaidmenį modifikuojant elgesį, apimantį emocinį komponentą, elgesį, paprastai susijusį su limbinėmis struktūromis. Iš viso šie rezultatai pabrėžia tiesioginį striatonigralinį kelią į heterogeninių funkcijų reguliavimą nuo ląstelių išgyvenimo iki motorinės ir emocijų susijusios elgsenos reguliavimo.

ĮVADAS

Baziniai ganglijai (BG) yra pagrindiniai nerviniai substratai, valdantys motorinę ir su atlygiu susijusią elgseną. Jų disfunkcija yra susijusi su keliais sutrikimais, įskaitant Parkinsono ligą (PD), šizofreniją ir priklausomybę nuo narkotikų (Cenci, 2007; Graybiel, 2000; Lobo ir Nestler, 2011). Manoma, kad striatum, kaip pagrindinis BG įvedimas, yra svarbi tarpininkavimo daugeliui netinkamų procesų, atsakingų už šiuos niokojančius neurologinius sutrikimus, vieta.

Stuburis yra klasifikuojamas į nugaros (nugaros striatumo) ir vidurinės (branduolio akumuliatorius) teritorijas, atitinkamai atliekant pažintines / motorines ir emocines / motyvacines funkcijas. Tačiau jungtys ir kitos pertvaros, ypač susijusios su dopamino sistemomis, suteikia daugiafunkcinio sąsajos anatominį pagrindą (Haber ir kt., 2000). Dorsalinis striatas įneša didelę dopaminerginę medžiagą iš pagrindinės nigra pars compacta (SNc), o dopamino signalizacijos disfunkcija susijusi su beveik visais su BG susijusiais sutrikimais. Pagrindiniai dopamino afferento striatos taikiniai yra GABAerginiai vidutinio stiprumo nerviniai neuronai (MSN), kurie sudaro 95% striatos populiacijos. Likusius neuronus, apimančius maždaug 5% viso striatininių neuronų skaičiaus, sudaro skirtingi GABAerginių interneuronų ir cholinerginiai interneuronų potipiai. Nepaisant mažo skaičiaus, cholinerginiai internetiniai neuronai yra labai svarbūs nustatant striatos išėjimą dėl jų tankių galinių laukų, pirmiausia nukreiptų į dvi MSN populiacijas, kurios sutampa su dopaminerginiais neuronais (Bolam ir kt., 1984). Dvi MSN rūšys išskiriamos priklausomai nuo jų projekcijų ir atskiro baltymų rinkinio ekspresijos. MSN, kurie pirmiausia išsikiša į pagrįstą nigra pars reticulata (SNr), vadinamųjų tiesioginio kelio arba striatonigralių, MSN, išreiškia dopamino D 1 receptorius, medžiagą P (SP) ir dinorfiną, tuo tarpu MSN, kurie išsikiša į globus pallidus (GP)., vadinamieji netiesioginiai arba striatopaldaliniai MSN, išreiškia dopamino D2 receptorius ir enkefaliną (Enk) (Gerfen ir kt., 1990; Smith ir kt., 1998). Manoma, kad dėl diferencijuotos dopamino receptorių ekspresijos striatonigraliniai ir striatopaldaliniai MSN vaidina priešingą, bet balansuojantį vaidmenį BG išvestyje ir elgesyje (Albin ir kt., 1989; DeLong, 1990).

Naujausi pokyčiai, susiję su ląstelių tipui pritaikytomis technologijomis, pateikė daugybę duomenų, leidžiančių išsamiau suprasti MSN vaidmenį narkomanijoje (Durieux et al, 2009; Durieux et al, 2012; Ferguson et al, 2011; Lobo et al, 2010). ), kognityvinės funkcijos (Hikida ir kt., 2010; Hikida ir kt., 2013; Nishizawa ir kt., 2012; Tai ir kt., 2012; Yawata ir kt., 2012) ir parkinsonizmo fiziopatologija (Kravitz et al, 2010). Čia mes sukūrėme naują indukuojamą difterijos toksino (DT) receptorių tarpininkavimo abliacijos modelį, kad toliau galėtume ištirti nugaros striatumo striatonigralinių MSN reikšmes. Norėdami apibūdinti elgesį, pirmiausia susitelkėme į motorinę funkciją, susijusią su sutrikusiu strijato dopamino tonu, kokaino sukeltu lokomotyvu ir L-DOPA sukelta diskinezija (LID), kurie yra siejami su selektyviais ir stipriais molekuliniais striatonigralinių MSN pokyčiais, įskaitant ERK signalizaciją ( Bertran-Gonzalez ir kt., 2008; Santini ir kt., 2009). Ūmus atsakas į psichostimuliatorius buvo tiriamas naudojant amfetaminą, naudojant striatonigralinio MSN abliacijos modelį, apsiribojantį pakaušio dalies nugaros striatumu (Durieux ir kt., 2012), ir tiesiogiai parodant nugaros striatonigralinių MSN įsitraukimą į LID, pagrindinę įprastos farmakoterapijos komplikaciją. PD, vis dar trūksta. Vėliau perėjome prie nemotorinės funkcijos, nes sukaupti įrodymai rodo, kad ne tik jutiklinis informacijos apdorojimas, bet ir stuburo slankstelis gali tarpininkauti ir emocinėms / motyvacinėms funkcijoms, klasikiškai priskiriamoms viduriniam striatumui (Balleine ir kt., 2007). Mes sutelkėme dėmesį į nerimo elgesį, visų pirma todėl, kad SP ir dinorfinas, dvi molekulės, kurias išskiria striatonigraliniai MSN, buvo įtraukti į nerimo reguliavimą (Ebner ir Singewald, 2006; Van't Veer ir Carlezon, 2013).

Rezultatai rodo, kad striatonigralinių MSN abliacija daro įtaką nevienalytėms funkcijoms, pradedant motoriniu ir emociniu elgesiu ir baigiant regionui būdingu cholinerginės homeostazės reguliavimu.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Transgeninių pelių generavimas

Žmogaus difterijos toksino receptoriaus žalias fluorescencinis baltymas (DTR-GFP) cDNR buvo įterptas prieš endogeninį ATG į Slc35d3 geno 1 egzoną 196 kilobazės pelės bakterinės dirbtinės chromosomos (BAC) (RP23-344M6) homologinėje rekombinacijoje. naudojant rekombinacinę plazmidę pL451. DNR iš modifikuoto BAC buvo išgryninta ir įšvirkšta į apvaisintų pelių kiaušinių (B65JL / F1) branduolius, kad būtų galima sukurti transgeninius pradmenis (Pelių genetikos inžinerijos centras, Institut Pasteur). Iš viso buvo gauti penki transgenegeniškai teigiami pradininkai ir buvo veisiami su C57Bl / 6 pelėmis. Palikuonį sudarė lygus skaičius DTR ekspresuojančių pelių (DTR + ) ir DTR neišraiškingų pelių (DTR - ).

Stereotaksinės injekcijos

Visos eksperimentinės su gyvūnais procedūros buvo vykdomos griežtai laikantis vietinių taisyklių, susijusių su laboratorinių gyvūnų naudojimu (leidimo Nr. B 13-464) ir EEB (2010/63 / UE) rekomendacijomis dėl laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo. atitiko Prancūzijos žemės ūkio ir miškų ministerijos (Gyvūnų sveikatos ir apsaugos veterinarijos tarnybos) etines gaires.

Chirurgija atlikta 8–12 savaičių pelėms, vartojant ksilazino / ketamino anesteziją (injekcijos į pilvaplėvės ertmę, atitinkamai 10 ir 100 mg / kg). Visos stereotaksinės koordinatės yra išvardytos papildomoje S1 lentelėje. DT (Calbiochem, Darmštatas, Vokietija) buvo praskiestas iki 0, 5 ng / μl koncentracijos, ir 1 μl buvo įšvirkštas dviejose vietose arba į nugarinę striatą, arba į branduolio akumuliatorius. Norint atsekti retrogradą, į SNr buvo įšvirkšta 1 μl fluorescencinių mikrobandelių (Life Technologies, Saint-Aubin, Prancūzija). Dėl dopaminerginio pažeidimo pelėms buvo sušvirkšta vienašališkai (1, 5 μl) 6-hidroksidopamino hidrochlorido (6-OHDA; 2, 7 μg / μl), praskiesto 0, 9% steriliu NaCl, turinčiu 0, 1% askorbo rūgšties; Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, Prancūzija ) į SNc.

Kiekybinė hibridizacija in situ ir dopamino transporterio autoradiografija

Radioaktyvaus in situ hibridizacijos histochemija buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau (Salin ir kt., 2002). Zondai buvo 44–56 merų sintetiniai oligonukleotidai, parinkti pagal Tac1 (kuris koduoja SP; toliau vadinamas SP ), Penk (kuris koduoja Enk; toliau vadinamas Enk ), GAD 67 ir tirozino hidroksilazės ( TH ) seką ir buvo 3 ′ -En-pažymėtas galutinio dezoksinukleotido transferaze su 35S-dATP. 3H-mazindolis buvo naudojamas kaip ligandas dopamino pernešimo vietoms žymėti. Trumpai, po tinkamo plovimo, sekcijos buvo inkubuotos su 15 nM [3H] -mazindoliu („DuPont NEN Research Products“, Bostonas, MA; specifinis aktyvumas, 17 Ci / mmol) „Tris“ buferiniame tirpale, kuriame yra 0, 3 mM desipramino, kad užblokuotų noradrenalino įsisavinimo vietas. .

Kiekybinis RT-PGR

Nešvirkštas ir įšvirkštas trijų DTR + pelių, įšvirkštų DT į stuburo slankstelį, stuburo striatumas buvo perforuojamas atskirai. Specifiniai pradmenys skirtingiems dominantiems genams buvo suprojektuoti naudojant „Universal ProbeLibrary“ („ProbeFinder“ versija 2.5 pelėms, „Roche Diagnostics“) ir, kai įmanoma, parinkti intarpai (papildoma S2 lentelė). Bendra RNR (170 ng) buvo atvirkščiai transkribuota 5 minutes 25 ° C temperatūroje, 30 minučių 42 ° C ir 5 minutes 85 ° C temperatūroje, naudojant iScript atvirkštinės transkripcijos supermix RT-qPCR (BIO-RAD). Buvo naudojamas „Bio-Rad CFX96“ dviratininkas, turintis šiuos ciklo parametrus: 1 ciklas 95 ° C temperatūroje 8 minutes, 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 s, po to 60 ° C 1 minutė. Mėginiai buvo paimti po tris kiekvieno geno pakartojimus. Santykinė tikslinio geno koncentracija buvo apskaičiuota naudojant 2- ΔΔCt metodą (Livak ir Schmittgen, 2001), kuris naudoja normalizavimą β- aktino endogeniniam pamatiniam genui (kaip aprašyta Lobo ir kt., 2006) ir normalizavimą kalibravimo mėginiui (čia neįšvirkščiamas dorsalis). striatum pusė).

Dviguba fluorescencija situacijos hibridizacijoje

Dviejų spalvų fluorescencinė in situ hibridizacija buvo atlikta naudojant fluoresceinu pažymėtą antisense riboprobe, skirtą ChAT arba SP, ir digoksigeninu pažymėtą ribotuvą, skirtą DTR. Po tinkamo išankstinio apdorojimo sekcijos buvo inkubuojamos 65 ° C temperatūroje per naktį hibridizacijos mišinyje, kuriame buvo 400 ng / ml abiejų zondo. Po plovimo po hibridizacijos sekcijos buvo inkubuojamos 5 valandas su anti-fluoresceino-POD (HRP) (1/300) (Roche-Applied Science), o fluoresceino zondas buvo parodytas žaliai su fluoresceino-tiramido reagentu (TSA Plus PerkinElmer Life Sciences). ). Po inaktyvavimo anti-fluoresceino-POD antikūno (3% H 2 O 2 ) HRP konjugato, digoksigeno zondas buvo vizualiai parodytas raudonai su anti-digoksigenino-POD antikūnu (1/300), paskui cianino-3-tiramido reagentu. .

Imunohistochemija

Pelės buvo perfuzijuotos transkardialiai su šaltu 4% paraformaldehidu 0, 1 M fosfatu buferiniame druskos tirpale (PBS, pH 7, 4). Po naktinio pritvirtinimo smegenys buvo apsaugotos PBS tirpale, kuriame yra 30% sacharozės, ir užšaldomos. Kriostato sekcijos (40 μm) buvo inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje su pirminiais antikūnais, tada inkubuojamos su atitinkamais antriniais antikūnais (papildoma S3 lentelė).

Duomenų analizė

Remiantis pelių stereotaksinio Paxinos ir Franklino smegenų atlasu, DT-tarpininkaujamo striatumoje atlikta 4–6 vainikinių pjūvių, tenkančių vienam gyvūnui, apimtis nuo AP = + 1, 54 iki 0, 14, palyginti su bregma (antrasis leidimas, 2001).

Vienos ląstelės RT-PGR

Iš DTR + pelių gautos koronarinės striatos pjūviai (250 μm) buvo paruošti ir užregistruoti, kaip aprašyta anksčiau (Beurrier et al, 2009). Atlikus įrašus prie ląstelių ir visą ląstelę, ląstelių kiekis buvo išsiurbtas, išmestas į mėgintuvėlį, kuriame RT reakcija buvo vykdoma per naktį 40 ° C temperatūroje. Čia naudojamas vienos ląstelės RT-PCR protokolas buvo pritaikytas iš Lena ir kt. (1999), kad tuo pačiu metu būtų galima aptikti DTR-GFP ir ChAT mRNR raišką . Genomo DNR amplifikacija buvo sistemiškai įvertinta naudojant NMDA receptoriaus geno introną (NR1 subvienetas, GRIN1 ) kaip genomo kontrolę (papildoma S4 lentelė). Pirmiausia cDNR buvo amplifikuota 20 PGR ciklų (94 ° C, 1 min .; 60 ° C, 1 min .; 72 ° C, 1 min.), Naudojant 5 U Taq polimerazės (Qiagen, Hilden, Vokietija) ir 10 pmol skirtingų. buvo pridedami pradmenų rinkiniai (papildoma S3 lentelė) (galutinis tūris, 100 μl). Tada buvo atlikti antrieji PGR raundai (40 ciklų, kaip aprašyta aukščiau), naudojant šabloną 6 μl pirmojo PGR produkto (galutinis tūris 50 μl). Kiekviena cDNR buvo amplifikuota atskirai, naudojant jos specifinį pradmenį, sukuriantį 406, 323 ir 162 bp dydžio PGR fragmentus atitinkamai DTR-GFP , ChAT ir GRIN1 intronams .

Elgesio testai

Pelės buvo laikomos grupėje (2–5 pelės / narvas) ir buvo palaikomos 12: 12 valandų šviesos – tamsos cikle (0700 val. Užsidega), turint ad libitum maisto ir vandens.

Lokomotorinė veikla

Lokomotorinis aktyvumas buvo stebimas atskirose veiklos kamerose (11, 2 cm × 20, 7 cm), esančiose garsą slopinančioje kabinoje ir esant homogeniškam apšvietimui („Imetronic“, „Pessac“, Prancūzija). Kiekvienoje kameroje buvo sumontuotos keturios infraraudonųjų spindulių pluoštai, esantys 1, 5 cm virš grindų lygio, du gale ir du kameros priekyje. Pelėms per pirmąsias 3 bandymo dienas buvo injekuotos fiziologinio tirpalo (0, 9% NaCl) injekcijos, kad jos būtų pritaikytos injekcijų, tvarkymo ir aktyvumo kameroms. Ketvirtą dieną kiekvieno genotipo pelės buvo suskirstytos į dvi grupes, kurioms buvo injekcijos į veną fiziologinio tirpalo (0, 9% NaCl) arba kokaino hidrochlorido (5 arba 15 mg / kg; Sigma-Aldrich). Lokomotorinis aktyvumas buvo stebimas iškart po to 60 min. Sijos pertraukų skaičius buvo užfiksuotas 5 minučių dėžėse.

L-DOPA sukelta diskinezija

Pelėms buvo įvesta vienašališka DT injekcija į nugaros striatą, esančią ipsilaterališkai į 6-OHDA suleistą pusę. Po penkiolikos dienų 21 dieną jiems buvo sušvirkščiama viena L-DOPA (20 mg / kg) ir benserazido hidrochlorido (10 mg / kg) dozė. Nenormalūs nevalingi judesiai (AIM) buvo įvertinti dviejų tyrėjų, kurie buvo akli nuo subjekto genotipo 1 min. Kas 20 min., Nuo 20 iki 120 min. Po paskutinės injekcijos 21 dieną. Ašiniai, galūnių ir kalbiniai AIM buvo vertinami pagal anksčiau nustatytą skalę nuo 0–4 kiekvienam AIM potipiui (Lundblad et al, 2004) ir kiekvienam gyvūnui buvo nustatyta trijų balų, apibrėžtų diskinezijos balais, suma (maksimalus balas, 12). Lokomotyvo AIM buvo išreikštas kiekvieno gyvūno priešingų apsisukimų per minutę skaičiumi.

Atviras laukas

Atviro lauko kamera (50 × 50 cm 2 su 30 cm aukščio balto plastiko siena) buvo praktiškai padalinta į centrinį lauką (centrą, 25 × 25 cm 2 ) ir išorinį lauką (periferija). Atviro lauko testą sudarė 5 minučių sesija ir jis buvo atliekamas silpno apšvietimo sąlygomis (12 liuksų). Individualios pelės buvo dedamos į lauko centrą, o gyvūnų keliai buvo fiksuojami vaizdo kamera. Nuvažiuotas atstumas skirtingose ​​zonose buvo analizuojamas vaizdo stebėjimo programine įranga („Viewpoint Life Sciences“, Lionas, Prancūzija).

Padidėjęs pliusas labirintas

Aparatas yra pakeltas 50 cm virš grindų ir jį sudarė keturios rankos (6 cm – 37 cm), dvi užrištos 18 cm aukščio balto plastiko sienomis ir dvi atidarytos. Šviesos intensyvumas buvo 12 liuksų atvirose rankose ir 4 liuksai uždarose rankose. Kiekvienas tyrimas prasidėjo nuo pelės įdėjimo į labirinto centrą, nukreiptą prieš atvirą ranką. Gyvūnų keliai 5 minutes buvo fiksuojami vaizdo kamera. Nuvažiuotas atstumas ir įrašų skaičius atviroje ir uždarytoje rankose buvo įvertinti vaizdo stebėjimo programine įranga („Viewpoint Life Sciences“). Pelės buvo tiriamos pakeltais ir labirintais praėjus 1 dienai po atviro lauko bandymo.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Statistinė analizė (SigmaStat, v3.1) buvo atlikta naudojant nesuporuotą Studento t- testą. Nepavyko atlikti neparametrinio bandymo (Manno ir Vitnio testas), jei normalumo ar lygaus dispersijos testas nepavyko. Analizuojant AIM balų laiko profilius buvo naudojamas dvipusis pakartotinai išmatuotas ANOVA, po kurio sekė Holmo – Sidako postiniai testai. Norint paneigti niekinę hipotezę, reikėjo p <0, 05 reikšmės.

REZULTATAI

Slc35d3 DTR-GFP transgeninių pelių generavimas

Norėdami pašalinti striatonigralinius MSN, mes panaudojome žmogaus DTR, kurio aktyvacija DT sukelia ląstelių apoptozę. Pirmiausia mes patikrinome sulietos DTR-GFP konstrukto gebėjimą sukelti ląstelių žūtį in vitro . Laukinio tipo kultūriniuose hipokampo neuronuose, išreiškiančiuose DTR-GFP suliejimą, DT paskyrimas sukėlė GFP teigiamų ląstelių apoptozę (papildomas paveikslas S1A). Norėdami konkrečiai panaikinti striatonigralinius MSN, pasirinkome DTR-GFP konstrukto ekspresiją kontroliuodami labai praturtintą striatonigralinį MSNs geną Slc35d3 ( Heiman ir kt., 2008; Lobo ir kt., 2006), naudodami BAC pagrįstą strategiją. (Papildomas S1B paveikslas). Transgeninės pelės buvo generuojamos įšvirkščiant rekombinuotą BAC į hibridinių C57Bl / 6 × CB1 F1 apvaisintų kiaušialąsčių branduolius, kurie vėliau buvo implantuojami į pseudopregnentines pateles. Gauti penki Slc35d3 DTR-GFP transgeniniai įkūrėjai (toliau vadinami DTR pelėmis) buvo apaugę C57Bl / 6 pelėmis. Vienas įkūrėjas netinkamai veisėsi ir buvo pašalintas iš tyrimo. Likusiose keturiose eilutėse DTR + pelių striatumoje buvo aptiktos GFP teigiamos ląstelės (papildomas paveikslas S1C) su beveik nesiskiriančiu raiškos modeliu. Intrastrijauminiai DTR-GFP baltymų lygiai, įvertinti Western blot būdu, taip pat buvo panašūs visose keturiose eilutėse (duomenys nepateikti). Tada mes nustatėme, kuriame ląstelių tipe DTR-GFP buvo išreikštas. Į SNr (1a pav.), Pagrindinį striatonigralinių MSN taikinį, buvo įšvirkščiamos retrogradinės fluorescencinės mikrograudelės. GFP teigiamos soma striatinėje su mikrobandelėmis kolokalizavimas patvirtino DTR-GFP raišką striatonigraliniais MSN (1a pav.). Drastiškas GFP fluorescencijos sumažėjimas po DT injekcijos į DTR + pelių stuburo striatumą rodė efektyvią DTR-GFP teigiamų ląstelių abliaciją in vivo (1b pav.). GFP fluorescencijos sumažėjimas pastebėtas nugarinės striatos rozkaudaliniu mastu, kol buvo išsaugota vidurinė dalis (nucleus carrbens) (papildomas paveikslas S2A). Laiko eigos analizė parodė, kad GFP fluorescencijos sumažėjimas buvo progresuojantis nuo 1 dienos iki 7 dienos; per 7 dieną abliacija buvo maksimali ir daugiau nebe evoliucionavo (papildomas S2B paveikslas). Visi šie eksperimentai buvo atlikti praėjus maždaug 15 dienų po DT injekcijos po abliacijos stabilizavimo.

Image

DTR-GFP selektyvi raiška striatonigraliniuose neuronuose ir DT injekcijos poveikis. a) Kairė: fluorescencinių mikrobandelių injekcijos vieta, nurodyta SNr rodykle. Mastelio juosta, 200 μm. SNr: bizonyija nigra pars reticulata. Dešinė: kombinuotas GFP ekspresuojančių striatos neuronų imunofluorescencinis aptikimas ir striatonigralinių MSN retrogradinis žymėjimas praėjus 7 dienoms po fluorescencinių mikrotrandelių injekcijos į DTR + pelių SNr. Mikrokardeliai colocalized su GFP. Svarstyklės, 10 μm. (b) Striatalio GFP imunodetekcija DTR + vainikinės smegenų skiltyje praėjus 7 dienoms po vienašališkos DT injekcijos į striatumą, parodant GFP ekspresijos praradimą įšvirkštoje pusėje (kairėje), palyginti su neinjekuota puse (dešinėje). Svarstyklės, viršuje: 500 μm, o apačia - 20 μm. Cx: žievė, St: striatum, V: skilvelis. (c, d) Radioaktyviosios in situ hibridizacijos ir strijaus SP (c) ir Enk (d) mRNR lygių kiekybinis įvertinimas 15 dienų po vienašalių DT injekcijų į DTR - ( n = 6) ir DTR + ( n = 10) pelių striatumą . Rodyklės rodo įšvirkštą pusę. Svarstyklės, 1 mm. Duomenys pateikiami kaip optinio tankio vertės ir išreiškiami procentais ± SEM. Studentų t- testas: *** p <0, 001 vs neinjektuota pusė. e) Kiekybinis RT-qPCR genais, specifiškai išreikštais striatonigraliais ( SP , Drd1a ) arba striatopalidaliais MSN ( Enk , Drd2 , Adora2a ). Trys DTR + pelės vienašališkai buvo įšvirkštos DT į nugaros striatą, o visi RNR mėginiai iš šios srities buvo surinkti įšvirkščiamoje ir neinjekuotoje pusėse. Kiekvieno mėginio rezultatai buvo apskaičiuoti atsižvelgiant į endogeninio pamatinio geno, β- aktino, raišką, ir raukšlės pokytis buvo nustatytas naudojant 2 ΔΔCt metodą. Studento t- testas: ** p <0, 01, *** p <0, 001 vs neinjektuota pusė. f) Fotomikrogramos, paimtos tamsaus lauko epi apšvietimu, parodančios intraneuroninius GAD 67 mRNR lygius DTR + pelių SNr ir GPe, praėjus 15 dienų po DT injekcijų. Svarstyklės, 100 μm. Kiekybinė SNr (kairėje) ( n = 5 DTR - ir 5 DTR + ) ir GPe (dešinėje) ( n = 5 DTR - ir 6 DTR + ) neuronų neuronų skaičiaus kiekybinė analizė. Duomenys išreiškiami procentais ± SEM. Studento t- testas: * p <0, 05 vs neinjektuota pusė.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Striatonigralinių MSN abliacija DT injekcijos būdu

Norėdami ištirti striatonigralinio MSN abliacijos specifiškumą, mes ištyrėme skirtingų striatos populiacijų žymenis, naudodami hibridizaciją in situ , RT-qPCR arba imunohistochemiją 15 dienų po vienašališkos intrastriatalinės DT injekcijos į nugaros striatumą. Nei vienas iš tirtų žymeklių nepakito DT švirkščiamoje pusėje, o DTR - nešvirkštoje pusėje. DTR + pelėms nustatyta smarkiai sumažinta SP mRNR, specifinė striatonigralinių MSN žymenų reikšmė, tuo tarpu Enk mRNR, specifinis striatopallidalinių MSN žymeklis, nepakito (1c ir d paveikslai). Tarp keturių eilučių 4 linija buvo pasirinkta vėlesniems eksperimentams, nes ji parodė didžiausią SP mRNR sumažėjimą (−66, 3%, palyginti su neinjekuota puse, p <0, 001). RT-qPCR analizė patvirtino reikšmingą SP sumažėjimą (−0, 59 karto palyginti su neinjekuota puse, p <0, 01) ir taip pat parodė ryškų dopamino D 1 receptorių ekspresijos sumažėjimą ( Drd1a : −0, 76 karto, palyginti su neinjekuota puse, p < 0, 001), kitas genas, specifiškai išreikštas striatonigraliniais MSN. Trims genams, praturtintiems striatopaldaliniais MSN (Dopamino D2 receptoriai Drd2 , Enk ir Adenozino A2 A receptoriai Adora2a ), DT injekcija nepadarė įtakos, patvirtindama abliacijos specifiškumą (1e pav.). CAMP reguliuojamo fosfoproteino-32 (DARPP-32), baltymo, išreikšto abiejose MSN populiacijose, lygis taip pat reikšmingai sumažėjo - 39, 2% (duomenys nepateikti).

Žinodami, kad MSNs eina į SNc (Gerfen, 1984), mes ištyrėme TH mRNR lygius DT injekuotų DTR + pelių SNc ir nustatėme, kad jos nepakeitė striatonigralinė MSNs abliacija (duomenys nepateikti). Tada mes siekėme nustatyti intrastriatalinio DT poveikį dviem pagrindiniams striatonigralinio ir striatopaldalinio MSN taikiniams - atitinkamai SNr ir GP GABAerginiams neuronams. Mes ištyrėme GABA sintezės fermento GAD67 intraneuroninius mRNR lygius kaip netiesioginį GABA neuronų aktyvumo indeksą. DAD + pelių SNr padidėjo GAD67 mRNR raiška (+ 18, 2%, palyginti su neinjekuota puse, p <0, 05), atsižvelgiant į šios struktūros padidėjusį aktyvumą dėl striatonigralinių MSN slopinančios slopinamosios kontrolės pašalinimo (1f pav.). Priešingai, GAD67 mRNR išraiška GP nekinta . Visi šie duomenys rodo, kad DTR + transgeninės pelės yra patikimas ir efektyvus modelis, skirtas specifiškai pašalinti striatonigralinius ir striatopalilinius MSN ir kad ši abliacija turi funkcinį poveikį BG išsiskyrimui.

Striatumoje yra trys kategorijos GABAerginių interneuronų su specifiniais citocheminiais žymenimis - parvalbuminu, kalretininu arba neuropeptido Y / NADPH-diafraze ir viena cholinerginių internetinių neuronų, ekspresuojančių cholino acetiltransferazę (ChAT), populiacija (Kawaguchi, 1993). Parvalbumino, kalretinino ar NADPH-diafrazės dažytų neuronų tankis DT injekcijos įtakos neturėjo, tuo tarpu ChAT ekspresuojančių neuronų tankis sumažėjo 42, 7% ( p <0, 01; 2 pav.). Norėdami atmesti žemą ChAT ekspresijos reguliavimą, ištyrėme DT poveikį kitam baltymui, kurį taip pat ekspresuoja striatos cholinerginiai interneuronai, A tipo tirozinkinazės receptoriai (TrkA) (Holtzman ir kt., 1992). TrkA teigiamų ląstelių tankis DT įšvirkštų DTR + pelių pusėje buvo sumažintas iki panašaus lygio kaip ChAT teigiamų ląstelių (–41, 2%, palyginti su neinjekuotomis pusėmis, p <0, 01; 2 paveikslas). DTR pelėms DT injekcija nepadarė įtakos ChAT teigiamų ląstelių tankiui (neįšvirkšta pusė: 44, 20 ± 4, 11, įšvirkšta pusė: 43, 01 ± 3, 25, n = 4 DTR -, p = 0, 83), išskyrus šios populiacijos savitą jautrumą DT lyginant su kitomis strijato populiacijomis.

Image

Striatonigralinio neurono abliacijos pasekmės striagos interneuronams. a) DTR + pelių, švirkščiamų vienašališkai su DT, vainikiniai pjūviai buvo nudažyti praėjus 15 dienų po injekcijų, skirtų konkretiems GABAergic interneuron subpopuliacijų žymekliams (parvalbuminas, PV; NADPH diafrazė NPY interneuronams identifikuoti, kalretininas, CR) ir dviem cholinerginių interneuronų žymekliams ( cholino acetiltransferazė, ChAT; A tipo tirozino kinazės receptoriai, TrKA). Svarstyklės, 50 μm. b) Kiekybinė analizė parodo teigiamų ląstelių tankį injekcijose ir nešvirkštose pusėse ( n = 4 DTR + ). Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Studento t- testas: ** p <0, 01 vs neinjektuota pusė.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Kaip galima paaiškinti cholinerginių interneuronų praradimą? Dvi galimybės: (1) DT injekcija tarpininkauja tiesioginėje ChAT teigiamų neuronų abliacijoje; ir (2) striatonigralinių MSN praradimas nugaros striatumoje netiesiogiai trukdo cholinerginiams interneuronams išgyventi. Norėdami atskirti šias dvi galimybes, atlikome kontrolinių eksperimentų seriją. Naudodami dvigubo dažymo eksperimentus, mes atlikome išsamų DTR ekspresijos tyrimą cholinerginiuose interneuronuose. DTR + pelių striatumoje nerasta kolokalizacijos tarp GFP ir ChAT baltymų (3a pav.). Naudodami dvigubą in situ hibridizaciją, neradome jokio ekspresijos sutapimo tarp ChAT ir DTR , tuo tarpu visos SP ekspresuojančios ląstelės buvo DTR teigiamos (3b pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti DTR ekspresijos nebuvimą cholinerginiuose interneuronuose, mes panaudojome vienos ląstelės RT-PGR. MSNs ir cholinerginiai interneuronai buvo identifikuoti pagal jų skiriamuosius morfologinius požymius ir šaudymo įpročius, užfiksuotus ląstelėse pritvirtintame režime: MSNs turi mažą somatą ir neveikia veiksmų potencialo, tuo tarpu cholinerginiai interneuronai turi didelę somatą ir yra vieninteliai striatos ląstelės skiltelėse, kurios išsiskiria savaime. ChAT mRNR niekada nebuvo nustatyta neuronuose, ekspresuojančiuose DTR ( n = 9), ir DTR mRNR niekada nebuvo aptikta neuronuose, ekspresuojančiuose ChAT ( n = 8) (3c paveikslas). Visi šie rezultatai rodo, kad cholinerginiai interneuronai netenka tiesioginio toksino poveikio, o yra netiesioginė striatonigralinio MSN abliacijos pasekmė. Šią hipotezę dar labiau patvirtina ląstelių nykimo laiko analizė, kurią atlikome nuo 1 iki 22 dienų po DT injekcijos. Mes nustatėme, kad ChAT teigiamų ląstelių praradimas buvo teigiamai susijęs su GFP fluorescencijos praradimu (atspindinčiu MSNs abliaciją) ir kad norint paveikti cholinerginių interneuronų gyvybingumą reikalingas kritinis striatonigralinių MSN abliacijos slenkstis (> 40%) (3d paveikslas). . Galiausiai, kadangi branduolio akumuliatoriai ląstelių sudėties požiūriu yra labai panašūs į nugaros striatumą, mes ištyrėme visiško striatonigralinių MSN abliacijos poveikį, švirkšdami DT į abu tos pačios pelės regionus. Cholinerginiai interneuronai stuburo striatumoje reikšmingai sumažėjo ( p <0, 001), tuo tarpu tie, esantys branduolio branduolyje, nebuvo paveikti ( p = 0, 12), parodant, kad cholinerginiai internetiniai neuronai priklauso nuo striatonigralinių MSN, tai būdinga teritorijai (3e pav.).

Image

DTR ekspresijos nebuvimas cholinerginiuose interneuronuose ir cholinerginio interneurono praradimo ypatybės. a) Dvigubas imunofluorescencinis žymėjimas parodė, kad DTR, pasireiškiantis GFP ekspresija (žalia), nėra kolokalizuojamas su cholino acetiltransferaze (ChAT), žyminančia cholinerginius interneuronus (raudona). Mastelio juosta, 50 μm. b) Dviguba in situ hibridizacija, parodanti, kad DTR (raudona) nėra ekspresuojama ChAT + ląstelėse (žalia, viršuje, rodyklėmis), bet kolokalizuota SP (žalia, apačia). Masto juostos, 25 μm (viršuje) ir 10 μm (apačioje). c) Vieno ląstelių RT-PGR produktų, pagamintų iš dviejų atskirų neuronų, agarozės geliai, kurių elektrinis aktyvumas, užfiksuotas prijungus prie ląstelių, yra pavaizduotas dešinėje. DTR-GFP mRNR (406 bp) aptinkama tylioje ląstelėje, identifikuotoje kaip MSN (viršuje), bet ne spontaniškai šaudančioje ląstelėje, identifikuotoje kaip cholinerginis interneuronas (apačia), kuri iš tikrųjų išreiškia ChAT mRNR (323 bp). Ląstelės yra neigiamos NR1 geno intronui, nenustatydamos, kad citoplazma būtų užteršta genomine DNR. d) Cholinerginių interneuronų (parodytų dažant ChAT) ir striatonigralinių MSN (parodytų dažant GFP) procentas, išreikštas skirtingu laiko momentu po vienašališkos DT injekcijos, yra labai koreliuojamas. e) GFP (kairėje) ir ChAT (dešinėje) imunodetekcija DTR + vainikinių smegenų skyriuje po 15 dienų po vienašališkos DT injekcijos į nugaros striatumą ir branduolio akumuliatorius. Masto juostos, kairės: 500 μm; dešinėje: 50 μm. Kiekybinės analizės iliustruoja ChAT teigiamų ląstelių tankį nugaros striatumoje ir branduolio akumuliatoriuose ( n = 6 DTR + ). Cx: žievė, St: striatum, NAc: nucleus carrbens. Duomenys išreiškiami procentais ± SEM. Studentų t- testas: *** p <0, 001 vs neinjektuota pusė.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Elgesio apibūdinimas

Elgesio eksperimentai buvo atlikti su G3 pelėmis praėjus 15 ± 3 dienoms po intrastriatalinės DT injekcijos į stuburo slankstelį. Injekcijos buvo atliekamos abipusiai, išskyrus LID (vienašališkai injekcija į pažeistą dopamino pusę). Gyvūnai, įtraukti į elgesio analizę, buvo atrinkti a posteriori, remiantis reikšmingu SP mRNR sumažėjimu, nustatytu atliekant in situ hibridizaciją nugaros striatumoje (−63, 27 ± 2, 78%, n = 27 DTR + pelės, p <0, 001). Be to, mes taip pat kiekybiškai įvertinome SP mRNR lygį gyvūnų branduolio branduoliuose, naudojamuose atvirame lauke ir padidintuose plius labirintuose, ir reikšmingų pokyčių neradome (−11, 10 ± 4, 91%, n = 10 DTR + pelės, p = 0, 07). . DTR + pelių produktyvumas buvo lyginamas su jų kontroliuojamais DTR - vadų draugais.

DTR + pelių DT sušvirkštų bazinių ir kokaino sukeltų lokalizacijos pokyčių nėra

Dorsalinis striatumas dalyvauja reguliuojant motorinį aktyvumą ir motorinę reakciją į psichostimuliatorius. Todėl mes ištyrėme bazinį lokomotorinį aktyvumą ir narkotikų sukeltą lokomotyvą po kokaino injekcijos - piktnaudžiavimo vaistu, kuris padidina lokomotyvą sustiprindamas dopamino signalizaciją. DTR + pelėms, palyginti su DTR pelėmis (60 p. ), Buvo žymiai sumažėjęs bazinis judėjimas ( p <0, 05) (4a paveikslas). Kai ūmiai buvo sušvirkšta 15 mg / kg kokaino, tiek DTR, tiek DTR + pelėms buvo padidėjęs aktyvumas, palyginti su jų atitinkama fiziologinio tirpalo injekcijų grupe (DTR - kokainas: + 134, 90%, palyginti su DTR - fiziologiniu tirpalu, p <0, 001; DTR + kokainas). + 302, 24%, palyginti su DTR + fiziologiniu tirpalu, p <0, 001) (4a paveikslas). Kad DTR + pelių hipokomocija nebūtų objektyvi, kokaino sukeltas lokomotorinis aktyvumas buvo normalizuotas kiekvienam genotipui pagal atitinkamą bazinį aktyvumą, užfiksuotą fiziologinio tirpalo injekcijomis pelėms. Lokomotorinis atsakas į kokainą, stebėtas DTR + pelėse, žymiai viršijo DTR pelių (+ 71, 83%, palyginti su DTR - pelėmis, p <0, 01). Norėdami dar labiau patvirtinti padidėjusį DTR + pelių jautrumą kokainui, mes išbandėme mažesnės kokaino dozės poveikį kitoms dviem pelių grupėms. Panašus lokomotorinio atsako į kokainą 5 mg / kg padidėjimas nustatytas DTR + pelėms (+ 72, 90% prieš DTR - pelėms, p <0, 05; 4b paveikslas).

Image

DT injekcija keičia bazinį ir kokaino sukeltą judėjimą. a) Linijinės schemos parodo spinduliuotės pertraukų skaičių per 5 minučių dėžes per 60 minučių po fiziologinio tirpalo ar kokaino (15 mg / kg) injekcijų DTR - ( n = 14 fiziologinio tirpalo ir 10 kokaino) ir DTR + ( n) = 9 druskos tirpalo ir 6 kokaino) pelės. Įžanga parodo bendrosios spinduliuotės pertraukų grupės vidurkį ± SEM per 60 minučių bandymo laikotarpį. Studentų t- testas: *** p <0, 001 vs DTR - sal arba DTR + sal, # p <0, 05 vs DTR - sal. b) Stulpelio diagrama, kurioje lyginamas lokomotorinis atsakas į dvi skirtingas kokaino dozes (5 ir 15 mg / kg). Duomenys yra vidutinis spinduliuotės pertraukų skaičius, išmatuotas per 60 min., Ir išreiškiamas kiekvieno genotipo procentais ± SEM procentais atitinkamu druskos tirpalu apdorotoms pelėms (5 mg / kg grupė: DTR - pelėms, n = 12 fiziologinio tirpalo ir 12 kokaino bei DTR +). pelės, n = 5 druskos tirpalo ir 5 kokaino; 15 mg / kg grupė: DTR - pelės, n = 14 fiziologinio tirpalo ir 10 kokaino bei DTR + pelių, n = 9 fiziologinio tirpalo ir 6 kokaino). Studentų t- testas: * p <0, 05, ** p <0, 01 vs DTR - coc.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

DT-injekuotų DTR + pelių L-DOPA sukelta diskinezija yra stipriai sumažinta

Diskinezija yra dažna PD L-DOPA farmakoterapijos komplikacija, paveikianti didelę daugumą pacientų per kelerius metus nuo gydymo pradžios. LID yra susijęs su biocheminiais striatonigralinio kelio pokyčiais. Todėl mes ištyrėme, ar LID raiška buvo paveikta DT suleistame DTR +, palyginti su DTR - pelėmis, kurios buvo hemoparkinsoninės, vienašališkai intranigraliai įdedant 6-OHDA (5a pav.). Stipri ir lygiavertė dopaminerginė striatum ipsilateralinė denervacija į pažeistą pusę buvo matuojama tiek DTR - (−95, 5%, palyginti su neinjekuota puse, p <0, 001), tiek DTR + (−94, 9%, palyginti su neinjektuota puse, p <0, 001) pelėms (5b paveikslas). ). Po lėtinio 21 dienos gydymo L-DOPA, DTR - pelėms buvo nustatyti tvirti AIM, kurių DTR + pelėse buvo stipriai sumažėję tiek dėl diskinezijos (−67, 1%, p <0, 001), tiek dėl priešingų pusių rotacijos (−78, 4%, p <0, 001). ) (5c pav.). AIM sumažėjimas buvo stebimas kiekvienu laiko momentu per 120 minučių taškų skaičiavimo laikotarpį po paskutinės L-DOPA injekcijos (pakartotinai išmatuoti ANOVA: genotipo efektas, F (1, 26) = 22, 32, p <0, 001; laiko efektas, F) (5, 130) = 50, 21, p <0, 001; genotipo ir laiko sąveika, F (5, 130) = 18, 51, p <0, 001; 5d paveikslas). Šie rezultatai pateikia tiesioginį įrodymą, kad striatonigralinė MSN abliacija gali slopinti LID raišką.

Image

L-DOPA sukelta diskinezija dramatiškai sumažėja po striatonigralinių neuronų abliacijos. a) L-DOPA sukeltos diskinezijos laikas. (b) Autoradiografinis vaizdas ir 3H-mazindolio surišimo kiekybinė analizė, rodanti didelį dopamino galūnių praradimą striatumos ipsilatinėje pusėje su 6-OHDA injekcijos puse (*) ( n = 16 DTR - ir 12 DTR + ). Duomenys išreiškiami procentais ± SEM. Studentų t- testas, *** p <0, 001 vs prieštaringa pusė. Svarstyklės, 1 mm. c) Diskinezijos rezultatas (kairėje; ašinių, kalbinių ir priekinių ir priekinių AIM vidutinių balų suma per 120 min .; ne daugiau kaip 12) ir lokomotyvo AIM (dešinėje; vidutinis priešingų pusių apsisukimų skaičius per 120 min.) po L-DOPA injekcijos. lėtinio gydymo 21 dieną ( n = 16 DTR ir 12 DTR + ). Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Studentų t- testas, *** p <0, 001 vs DTR - pelės. (d) Ašinės, galūnių ir tariamosios diskinezijos laiko profilis, vertinamas kas 20 min. per 120 minučių po L-DOPA injekcijos 21 dieną DTR - ( n = 16) ir DTR + ( n = 12) pelėms. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Abipusė RM ANOVA: Genotipas: F (1, 26) = 22, 32, p <0, 001; laikas: F (5130) = 50, 21, p <0, 001; genotipas × laikas:, F (5, 130) = 18, 51, p <0, 001, Holmo – Sidako posttestas: *** p <0, 001.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

DT injekuotos DTR + pelės rodo anksiolitinį elgesį

Dėl limbinių stuburo slankstelių jungčių padidėja jo įsitraukimo į emocinį apdorojimą galimybė. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes įvertinome savo transgenines peles elgesio paradigmose, susijusiose su nerimo komponentu: atvirame lauke ir padidintame labirinte. Pelės demonstruoja su nerimu susijusį elgesį atvirose vietose; todėl padidėjęs laikas, praleistas centrinėje atvirojo lauko zonoje arba padidėjusio pliuso labirintuose atvirose rankose, aiškinamas kaip sumažėjęs nerimas. DT injekuotos DTR + pelės pastebimai padidino laiką, praleistą centrinėje atviro lauko zonoje ( p <0, 05), taip pat praleistą laiką ( p <0, 001) ir įrašų skaičių ( p <0, 01) padidėjusioje plius labirintas (6 paveikslas). Šie pokyčiai atspindi sumažėjusį nerimą, o ne variklio sutrikimą, nes bendras nuvažiuotas atstumas per 5 minučių bandymo laiką buvo panašus DTR - ir DTR + pelėms lauke (DTR - : 2958, 04 ± 202, 53 mm, n = 17; DTR) + : 2487, 03 ± 264, 37 mm, n = 10; NS) ir EPM (DTR - : 2094, 1 ± 96, 7 mm, n = 17; DTR + : 2014, 8 ± 116, 3 mm, n = 10; NS).

Image

Nerimas sumažėja po striatonigralinės MSN abliacijos. Reprezentatyvūs keliai (a, c) ir kiekybinis įvertinimas, rodantis laiką, praleistą centrinėje atvirojo lauko zonoje (b), taip pat laiką ir įrašų skaičių atvirose rankose padidėjusiame plius labirinte (d) DTR - ( n = 17) ir DTR + ( n = 10) pelių. Duomenys išreiškiami viso laiko procentine išraiška ± SEM. Mokinio t- testas: * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001 vs DTR - pelės.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

DISKUSIJA

Šiame tyrime mes pasiekėme indukuojamą striatonigralinę MSN abliaciją, naudodami specifinę ląstelių tipo DTR išraišką, ir atskleidėme tris originalius rezultatus: (i) regionui būdingą cholinerginių interneuronų homeostazės reguliavimą striatonigraliniais MSN, ii) priežastinį poveikį striatonigraliniai MSN L-DOPA sukeltoje diskinezijoje ir (iii) nugaros striatumo įsitraukimas į nerimo elgesio reguliavimą.

Remdamiesi dviem tyrimais, kuriuose panaudotas FACS (fluorescenciniu būdu aktyvuotas ląstelių rūšiavimas) ir TRAP (transliacinis ribosomų afiniteto gryninimas), kurie nustatė Slc35d3 kaip labiausiai striatonigralų praturtintą geną, kurio išraiška buvo ribojama, pasireiškė DTR ekspresija kontroliuojant Slc35d3 geno promotorių. striatum (Heiman ir kt., 2008; Lobo ir kt., 2006). Atliekant intrastriatalinę DT injekciją į nugaros striatą, buvo pašalinta ne tik dauguma striatonigralinių MSN, bet ir dalis cholinerginių interneuronų. Atlikome daugybę eksperimentų, kurie rodo, kad cholinerginiai nuostoliai, kurie įvyko konkrečiai nugaros dalyje, bet ne vidurinėje striatumoje, yra striatonigralinės MSN abliacijos pasekmė. Kitame tyrime, kuriame striatonigralinių MSN pašalinimas taip pat gaunamas suaktyvinus DTR, pranešta, kad po DT injekcijos nepakinta striatininių cholinerginių interneuronų skaičius (Durieux ir kt., 2012). Šiame tyrime DTR ekspresija striatonigraliniuose MSN pasiekiama sukryžminus iDTR peles (kai DTR ekspresiją kontroliuoja visur esantis Rosa26 promotorius, tačiau ją užkerta „LoxP“ briaunota STOP kasetė) su D1 -Cre pelėmis. Žinant, kad transgeno ekspresijos lygis labai priklauso nuo promotoriaus, naudojamo jo ekspresijai, galime manyti, kad DTR lygis abiejuose modeliuose yra gana skirtingas. Tai taip pat gali paaiškinti veiksmingos DT dozės skirtumą tarp dviejų tyrimų (0, 5 ng / μl vs 0, 1 ng / μl, Durieux ir kt., 2012); iš tikrųjų 0, 1 ng / μl mūsų modelyje reikšmingos abliacijos nesukėlė (neparodyta). DTR ekspresijos lygis gali paveikti degeneracinį procesą, pavyzdžiui, kaip striatonigralinių MSN žūties kinetika ir glijos reaktyvumas, ir skirtingai paveikti cholinerginius interneuronus. Neseniai suaugusiųjų smegenyse buvo įrodytas striatos cholinerginio išgyvenimo priklausomumas nuo ląstelių autonominių procesų, apimančių, pavyzdžiui, garsinio ežio signalą iš dopaminerginių projekcijų, (Gonzalez-Reyes ir kt., 2012). Mūsų atveju striatonigralinių MSN išleistas SP gali būti tinkamas kandidatas palaikyti tokią išgyvenamumo funkciją kaip: (i) daugybė SP teigiamų aksonų galų, užmezgančių sinapsinį kontaktą su cholinerginių neuronų dendritais, rodo intymų ryšį tarp šių dviejų populiacijų. (Bolam ir kt., 1986), (ii) SP biologinėms funkcijoms tarpininkauja NK1 receptoriai, kuriuos beveik išimtinai išreiškia cholinerginiai interneuronai striatumoje (Elde ir kt., 1990; Gerfen, 1991), ir (iii) NK1 receptoriai. aktyvacija skatina išgyvenimo kelius, kurie yra būtini palaikant kai kurias neuronų populiacijas (Chu ir kt., 2011). Skirtingas DT poveikis striatumoje ir branduolio akumuliatoriuose kelia įdomių klausimų ir leidžia manyti, kad cholinerginiai interneuronai turi skirtingas savybes kiekvienoje teritorijoje. Norint ištirti šią regionui būdingą sąveiką tarp striatonigalinių MSNs ir cholinerginių interneuronų, reikės papildomų eksperimentų, kurie nepatenka į šio tyrimo taikymo sritį.

Mūsų elgesio duomenys, rodantys, kad DT-injekuotų DTR + pelių judėjimas yra mažesnis, patvirtina tiesioginio judėjimą skatinančio kelio BG modelį ir yra suderinti su naujausiais tyrimais, teigiančiais, kad opiagenetinė aktyvacija arba specifinė striatonigralinių MSN abliacija atitinkamai padidina ir sumažina judėjimą (Durieux et al. 2012; Kravitz ir kt., 2010). GAD 67 mRNR lygio padidėjimas DT injekuotų pelių SNr dar labiau patvirtina požiūrį, kad hipokomocija atsiranda dėl hiperaktyvaus BG nutekėjimo pašalinus slopinamąjį poveikį, kurį daro striatonigraliniai MSN. Priešingai nei bazinis judėjimas, mūsų transgeninėms pelėms netikėtai padidėjo kokaino sukeltas aktyvumas. Iš tikrųjų ankstesniuose tyrimuose buvo pastebėtas sumažėjęs lokomotorinis atsakas į ūmią psichostimuliatorių injekciją po to, kai buvo specialiai slopinamas sinapsinis perdavimas striatonigraliniuose MSN (Hikida ir kt., 2010) arba panaikinti šie neuronai striatumoje (Durieux ir kt., 2012). Panašu, kad skirtumai tarp naudojamo psichostimuliatoriaus ar striatomos srities nėra tokie, nes tai rodo, kad mūsų fenotipas negali būti tiesioginė striatonigralinės žalos pasekmė. Įdomu tai, kad padidėjus jautrumui ūminiam kokainui, buvo pašalinta pašalinus cholinergines ląsteles stuburo slankstelyje ar branduolio juostoje (Hikida ir kt., 2001; Sano ir kt., 2003), rodantis, kad strialinių cholinerginių interneuronų praradimas, o ne abliacija. striatonigraliniai MSN gali būti atsakingi už kokaino sukeltos lokomotorinės reakcijos stiprinimą.

LID, pagrindinis šalutinis lėtinio L-DOPA gydymo poveikis sergant PD, yra susijęs su molekuliniais pokyčiais, vykstančiais būtent striatonigraliniuose MSN (Santini ir kt., 2009). Mūsų duomenys, rodantys, kad striatonigralinis MSN abliacija neleidžia vystytis LID, pateikia tiesioginius įrodymus apie šių neuronų priežastinį vaidmenį LID. Šis antiskinetinis poveikis atitinka tą, kuris gaunamas po genetinio DARPP-32 inaktyvavimo striatonigraliniuose MSN (Bateup ir kt., 2010). ERK aktyvacijos pokyčiai iš MSN į cholinerginius interneuronus, aprašyti po ilgalaikio L-DOPA poveikio (7 savaitės), rodo, kad cholinerginiai interneuronai taip pat gali būti įtraukti į LID raišką (Ding ir kt., 2011). Čia teigiamas striatonigralinės MSN abliacijos poveikis LID buvo pastebėtas jau praėjus 7 dienoms po gydymo L-DOPA (neparodyta), tuo metu, kai cholinerginiuose interneuronuose ERK aktyvacija dar neįjungta (Ding ir kt., 2011). Taigi mūsų rezultatai patvirtina, kad striatonigraliniai MSN vaidina svarbų vaidmenį diskinezijos vystymesi, taip pat rodo, kad terapinės strategijos, pagrįstos manipuliacijomis nuo dopamino priklausomu signalo perdavimu striatumoje, turėtų būti nukreiptos į striatonigralinius MSN, kad būtų galima veiksmingai kliniškai užkirsti kelią LID.

Kaupiami įrodymai rodo, kad nugaros smegenys taip pat gali būti įtrauktos į emocinį ir motyvacinį procesą (Balleine ir kt., 2007). Čia mes nustatėme, kad DT injekuotos DTR + pelės sumažino nerimą lauke ir padidino labirinto testus. Atsižvelgiant į tai, kad SP yra svarbus reguliuojant emocines būsenas, įskaitant su nerimu susijusį elgesį (Ebner ir Singewald, 2006), ir kad striatonigraliniai MSN yra pagrindinis SP šaltinis striatumoje, mūsų rezultatas rodo strijato SP vaidmenį nerimo reguliavimas. Atsižvelgiant į anksiolitinį striatonigralinių MSN abliacijos poveikį, farmakologinė blokada ar genetinis NK1 receptorių ištrynimas sukėlė anksiolitinį panašų poveikį (File, 1997; Santarelli et al, 2001). Kadangi NK1 receptoriai, kuriuos ekspresuoja cholinerginiai interneuronai, yra svarbūs SP veikimo tarpininkai striatumoje, šios striatos populiacijos praradimas mūsų modelyje greičiausiai paryškins anksiolitinį poveikį. SP yra plačiai paplitęs smegenyse, o SP jautrios sritys, paprastai susijusios su nerimo būsenų valdymu, yra limbinės sistemos dalis (Davis ir kt., 2010). Nors nugaros striatum yra limbinės jungtys per dopamino sistemą (Haber ir kt., 2000), jos įsitraukimas į nerimo elgesį yra gana naujas ir pabrėžia daugybę neuronų substratų, kuriais grindžiamas toks elgesys. Įdomu tai, kad dinorfinas, kitas peptidas, specifiškai išreikštas striatonigralinių MSN, buvo įtrauktas į nerimą ir galėjo dalyvauti sumažėjusiame nerime, kurį sukelia DT švirkščiamos transgeninės pelės (Schwarzer, 2009; Van't Veer ir Carlezon, 2013).

Iš viso mūsų duomenys atskleidžia intymų ryšį tarp striatonigralinių MSN ir cholinerginių interneuronų, esančių nugaros striatumoje, ir pateikia eksperimentinius įrodymus apie šių populiacijų įtaką ne tik nuo dopamino priklausomam motoriniam elgesiui, bet ir kontroliuojant nerimą, pabrėžiant funkcinį dubliavimąsi tarp nugaros striatum ir branduolio akumuliatoriai.

FINANSAVIMAS IR ATSKLEIDIMAS

Autoriai teigia, kad interesų konflikto nėra.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos medžiagos ir metodai

PDF failai

  1. 1.

    Papildomos lentelės

    Neuropsichofarmakologijos tinklalapyje (//www.nature.com/npp) pridedama papildoma informacija