Ctrtr slopina naviko progresavimą per mir-193b nukreipdamas urokinazės plazminogeno aktyvatorių (upa) sergant prostatos vėžiu | onkogenas

Ctrtr slopina naviko progresavimą per mir-193b nukreipdamas urokinazės plazminogeno aktyvatorių (upa) sergant prostatos vėžiu | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • Prostatos vėžys

Anotacija

Cistinė fibrozė (CF), transmembraninis laidumo reguliatorius (CFTR), yra ekspresuojama daugelio organų / audinių, iš kurių gaunama dauguma vėžio, epitelio ląstelėse. Nors kaupiamos ataskaitos parodė, kad vėžys yra susijęs su genetiniais CFTR geno variacijomis, tikslus CFTR vaidmuo vėžio vystymuisi ir galimas pagrindas yra neišaiškintas. Čia mes pranešame, kad CFTR raiška žymiai sumažėja tiek prostatos vėžio ląstelių linijose, tiek žmogaus prostatos vėžio audinių mėginiuose. Per didelis CFTR ekspresija prostatos vėžio ląstelių linijose slopina naviko progresavimą (ląstelių augimą, adheziją ir migraciją), o CFTR numušimas sukelia padidėjusį piktybinį naviką tiek in vitro, tiek in vivo . Be to, mes parodome, kad dėl CFTR numušimo padidėjęs ląstelių proliferacija, ląstelių invazija ir migracija yra žymiai pakeistos antikūnų prieš urokinazės plazminogeno aktyvatorių (uPA) arba uPA receptorius (uPAR), kurie, kaip žinoma, yra susiję su įvairiais piktybiniais vėžio požymiais. . Įdomiau, kad per didelis CFTR ekspresija slopina uPA, padidindamas neseniai aprašytą naviko slopintuvą mikroRNR-193b (miR-193b), o per-miR-193b per didelis ekspresija reikšmingai panaikina piktybinį fenotipą CFTR numušimo metu ir panaikina padidėjusį uPA aktyvumą prostatos vėžio ląstelių linijoje. . Galiausiai parodome, kad CFTR geno perdavimas lemia reikšmingą naviko slopinimą prostatos vėžio ksenografuose in vivo . Apibendrinant, šis tyrimas parodė anksčiau neapibrėžtą naviką slopinantį CFTR vaidmenį ir jo dalyvavimą reguliuojant miR-193b vykstant prostatos vėžiui.

Įvadas

Cistinės fibrozės (CF) transmembraninio laidumo reguliatorius (CFTR) yra Cl - ir HCO 3 - laidus anijonų kanalas, ekspresuojamas daugybės audinių epitelio ląstelėse, kurių mutacijos sukelia CF, bendrą gyvybei pavojingą autosominę recesyvinę ligą tarp baltaodžių. . 1, 2 Nors progresuojanti plaučių liga, kuriai būdingas lėtinis uždegimas ir bakterinė infekcija, yra pagrindinė CF sergamumo priežastis, klinikinės CFTR jonų kanalo funkcijos nebuvimo ar susilpnėjimo pasekmės lemia sudėtines, daugelio organų CF fenotipo, esančio vietoje, požymius. -specifinis, bet labai skiriasi sunkumu ir pradžios amžiumi. 3 Per pastaruosius tris dešimtmečius įspūdingiausias CF sergančių pacientų priežiūros pažangos rezultatas buvo dramatiškas išgyvenamumo pagerėjimas. Pavyzdžiui, nors vidutinis CF pacientų išgyvenimas 1970 m. Buvo tik 16 metų, 2005 m. Jis padidėjo iki daugiau nei 32 metų. 4 Todėl natūrali ligos istorija keičiasi ir atsiranda naujų klinikinių komplikacijų. .

Buvo surinkta įrodymų, rodančių, kad vėžys yra susijęs su genetiniais CFTR geno variantais. Atlikus didelius kohortos tyrimus su Šiaurės Amerikos ir Europos pacientais, sergančiais KF, nustatyta, kad pastebimai padidėjo piktybinių navikų, pažeidžiančių virškinimo traktą, kasą ir kepenų bei tulžies sistemą, rizika. 5, 6, 7. Tačiau pranešta, kad CF geno mutacijos taip pat yra susijusios su mažesne kelių vėžio formų rizika, pavyzdžiui, melanoma, 8 krūties vėžiu, 9 storosios žarnos vėžiu, 10 prostatos vėžiu 11 ir plaučių vėžiu. 12 Prieštaringos išvados gali kilti dėl skirtingo mėginio dydžio, tyrimo struktūros ir įvairių CFTR mutacijų, įtrauktų į atskirus tyrimus. Kita vertus, buvo pranešta, kad CFTR genas dažnai būna hipermetilinis tiek vėžio ląstelių linijose, tiek pirminiuose naviko mėginiuose. 13, 14, 15, 16 Šie rezultatai rodo, kad CFTR nutildymas dėl metilinimo, kurį sukelia metilinimas, gali skatinti kancerogenezę. Nepaisant visų šių indikacijų, tikslus CFTR vaidmuo vėžio vystymuisi ir galimi pagrindiniai mechanizmai nebuvo išaiškinti.

Mes ėmėmės šio tyrimo siekdami ištirti CFTR vaidmenį ir pagrindinius mechanizmus, kaip tariamą naviko slopiklį, atliekant genų manipuliacijas prostatos vėžio ląstelių linijomis ir naviko ksenografinėmis pelėmis. Mūsų duomenys rodo, kad CFTR slopina prostatos vėžio progresavimą tiek in vitro, tiek in vivo . Be to, atskleidžiame, kad naviką slopinantis CFTR poveikis bent iš dalies susijęs su jo gebėjimu pakeisti neseniai aprašytą naviko slopintuvą mikroRNR-193b (miR-193b), nukreiptą į urokinazės tipo plazminogeno aktyvatorių (uPA), kuris yra žinoma, kad dalyvauja įvairiuose piktybiniuose vėžio vystymosi bruožuose.

Rezultatai

Prostatos vėžio mėginiuose ir ląstelių linijose CFTR ekspresija yra sumažinta

Neseniai pastebėjome, kad CFTR ekspresija pastebimai sumažėja senėjusios žiurkės prostatoje (papildomas 1 paveikslas). Be to, specifinio CFTR inhibitoriaus CFTR-inh172 (inh172) slopinant CFTR funkciją padidėja ląstelių proliferacija, kaip nustatyta dažant PCNA (2 papildomas paveikslas). Šie stebėjimai paskatino mus spėlioti, kad CFTR funkcijos slopinimas gali sukelti didelę prostatos vėžio išsivystymo riziką. Todėl mes nusprendėme ištirti CFTR raišką vėžio audinių mikrotraumuose, išanalizavę 62 žmogaus prostatos vėžio pavyzdžius ir 10 atvejų - normalų audinį. Imunohistocheminis CFTR dažymas buvo įvertintas pusiau kiekybiškai, ištyrus citoplazmos ir membranos dažymo intensyvumą. Mūsų rezultatai parodė, kad normaliame audinyje 8/10 (80%) mėginių CFTR teigiamas imunohistocheminis dažymas buvo ++ (2) arba +++ (3). Tačiau prostatos vėžio mėginiuose dauguma atvejų (51/62, 82, 2%) turi silpną + arba neigiamą ± CFTR išraišką (1a ir b paveikslai, 1 papildoma lentelė). Toliau mes ištyrėme CFTR raišką trijose prostatos vėžio ląstelių linijose (PC-3, DU-145, LNcap) ir vienoje įamžintoje prostatos epitelio ląstelių linijoje (PNT1A) RT – PCR metodu. Kaip parodyta 1c paveiksle, CFTR mRNR lygis vėžio ląstelių linijose buvo žymiai mažesnis, palyginti su normaliomis prostatos epitelio ląstelėmis. Šie duomenys patvirtina ankstesnę ataskaitą, rodančią, kad CFTR prostatos vėžio ląstelių linijose yra hipermetilintas jo promotoriaus regione. 15 Visi šie rezultatai rodo, kad CFTR ekspresija yra sumažinta tiek prostatos vėžio audiniuose, tiek ląstelių linijose.

Image

Per didelis CFTR ekspresija slopina augliogeninį fenotipą prostatos vėžio ląstelių linijose. a ) Imunohistocheminis ląstelių branduolių (mėlynas) ir CFTR baltymo (rudos spalvos) dažymas reprezentatyviuose prostatos audinių mikrotraumos vaizduose. Galima pastebėti, kad prostatos vėžio mėginyje CFTR raiška sumažėja, palyginti su normaliu audiniu. b ) CFTR imunoreaktyvumo balų pasiskirstymas normaliuose ir navikuose iš audinių mikrotraumos. * P <0, 05 ( χ 2 -testas). Dažymo intensyvumas +++, ++, + ∼ ± buvo įvertintas atitinkamai 3, 2, 1. c ) prostatos vėžio ląstelių linijose CFTR ekspresija yra sumažinta, palyginti su normalia prostatos epitelio ląstelių linija, kaip nustatyta RT – PGR. ( d ) CFTR Western blot analizė kontroliniame vektoriuje (eGFP-C3) arba CFTR transfekuotose LNcap ir PC-3 ląstelėse. Paveikslėlis yra trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. ( e, f ) LNcap ir PC-3 ląstelių, transfekuotų CFTR arba peGFP-C3, ląstelių augimo analizė, nustatyta MTS tyrimu. Ląstelių augimas pateikiamas procentais padidėjus: Sugertis dn –absorbcija d0 / absorbcija d0 ir duomenys gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų, ** P <0, 01; * P <0, 05. ( g, k ) „AnnexinV / PI“ teigiamų ląstelių srauto citometrinė analizė peGFP-C3 arba CFTR transfekuotose LNcap ( g ) ir PC-3 ( k ) ląstelėse. Kontrolinės arba CFTR per daug ekspresuojančios ląstelės serume badavo 24 valandas, o apoptozinės ląstelės buvo nustatomos dažant „AnnexinV / PI“. Duomenys yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± pusė, *** P <0, 001. ( h, l ) PC-3 ir LNcap ląstelių, transfekuotų peGFP-C3 arba CFTR, adhezijos tyrimas. Parodytas vidutinis bendras PC-3 arba LNcap ląstelių skaičius su kontroliniu arba per daug išreikštu CFTR lygiu, prilipusiu prie matrigeliu padengtų plokštelių. Duomenys gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų, ** P <0, 01. ( i, m ) PC-3 ir LNcap ląstelių, transfekuotų peGFP-C3 arba CFTR, invazijos tyrimas. Parodytas vidutinis ląstelių, turinčių kontrolinį arba per daug išreikštą CFTR lygį, skaičius, įsiveržęs po 24 valandų, skaičius. Duomenys gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų, ** P <0, 01. ( j, n ) PC-3 ir LNcap ląstelių, transfekuotų peGFP-C3 arba CFTR, judrumas. Parodytas vidutinis bendras PC-3 ir LNcap ląstelių, turinčių kontrolinį arba per daug ekspresuotą CFTR lygį, migracija iš citodekso-2 granulių ir prilipusių prie šulinio pagrindo per naktį. Duomenys gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų, ** P <0, 01.

Visas dydis

CFTR yra neigiamai susijęs su tumorigenine veikla vėžio ląstelių linijose

Norėdami ištirti CFTR vaidmenį vėžio vystymesi, vėliau įvertinome pakitusios CFTR ekspresijos įtaką tumorigeniniam aktyvumui prostatos vėžio ląstelių linijose (PC-3, DU-145 ir LNcap). Pirmiausia, norėdami išsiaiškinti, ar CFTR per se turi vėžį slopinantį poveikį vėžinių ląstelių linijoms, apibūdinome prostatos vėžio ląstelių linijas (LNcap, PC-3), kurios buvo transfekuotos ekspresijos vektoriu, turinčiu viso ilgio CFTR cDNR, arba tuščią vektorių ir stebėtos. žymus CFTR baltymo ekspresijos padidėjimas (1d pav.). Taigi transfekcija CFTR žymiai sumažino abiejų ląstelių linijų augimo greitį, palyginti su kontroliniais transfektantais (1e ir f pav.). Be to, dėl negimdinio CFTR ekspresijos abiejose ląstelėse ląstelės tapo jautresnės serumo sukeltam apoptozės poveikiui serume (1g ir k pav.), Tuo tarpu slopinamas ląstelių adhezija, invazija ir judrumas (1h – j ir l – n paveikslai).

Norėdami sustabdyti CFTR ekspresiją vėžio ląstelių linijose, mes transfekavome ląsteles pEF6 / VS-His vektoriu, turinčiu CFTR specifinį plaktuko ribozimą 2, kad susidarytume stabiliai transfekuotas ląsteles (šiame tyrime minimas CFTRrib2) ir pastebėjome reikšmingą CFTR baltymo lygio sumažėjimą. PC-3 ir DU-145 ląstelėse (2a pav.). Mūsų rezultatai parodė, kad CFTR numušimas paskatino ląstelių augimą PC-3 ir DU-145 ląstelėse (2b ir c pav.). Be to, CFTR slopinimas žymiai padidino ląstelių adheziją ir judrumą tiek PC-3, tiek DU-145 ląstelėse (2d – g paveikslai). Apskritai, CFTR slopina daugybines vėžinių ląstelių tumorigenines savybes in vitro .

Image

CFTR numušimas skatina navikų augimą prostatos vėžio ląstelių linijose. a ) CFTR Western blot analizė kontroliniame vektoriuje (pEF-His) ir CFTRrib2 transfekuotose PC-3 ir DU-145 ląstelėse. Paveikslėlis yra trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. ( b, c ) PCTS-3 ir DU-145 ląstelių augimo, transfekuotų pEF-His ar CFTRrib2, ląstelių augimo analizė, nustatyta MTS tyrimu, ląstelių augimas pateikiamas procentiniu padidėjimu: Absorbcija dn –absorbcija d0 / absorbcija d0 ir duomenys gauti iš trys nepriklausomi eksperimentai, ** P <0, 01. ( d, f ) PC-3 ir DU-145 ląstelių, transfekuotų pEF-His arba CFTRrib2, adhezijos tyrimas. Vidutinis bendras PC-3 ir DU-145 ląstelių skaičius su kontroline arba sumažinta CFTR koncentracija, priklijuotos prie matrigel padengtų plokštelių. Duomenys yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sem, ** P <0, 01; *** P <0, 001. ( e, g ) PC-3 ir DU-145 ląstelių, transfekuotų pEF-His arba CFTRrib2, judrumas. Vidutinis bendras PC-3 ir DU-145 ląstelių, turinčių kontrolinį ar sumažintą CFTR lygį, skaičius migravo iš citodekso-2 granulių ir prilipo prie šulinėlio pagrindo. Duomenys yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sem, * P <0, 05, ** P <0, 01.

Visas dydis

CFTR slopina naviko vystymąsi in vivo

Norint įvertinti naviką slopinantį CFTR vaidmenį in vivo , PC-3 ląstelės su manipuliuota CFTR ekspresija buvo auginamos kaip poodiniai navikai plikoms pelėms. Pelių, implantuotų su PC-3 ląstelėmis, stabiliai viršijančių CFTR ( n = 7), auglys, eksperimento pabaigoje (4 savaitės), pastebimai sumažėjo naviko svoris, palyginti su pelių pelėmis, implantuotomis su PC-3 ląstelėmis, perkeltomis kontroliniu vektoriu ( n = 6). (3a pav.). Atvirkščiai, pelėms, augintoms ląstelėse, turinčiose plazmos galvos rubezimą, nukreiptą į CFTR ( n = 4), augliai parodė žymiai padidėjusį naviko krūvį, palyginti su navikais pelėms ( n = 4), implantuotoms su kontrolinėmis ląstelėmis, kurios buvo transfekuotos kontroliuojant vektorių (3c pav. ). Pažymėtina, kad pastebėję, kad manipuliavimas CFTR šiomis vėžio ląstelių linijomis reikšmingai paveikė naviko dydį, nepakeisdamas naviko susidarymo dažnio, tai rodo, kad CFTR slopina naviko progresavimą, o ne auglio inicijavimą in vivo . Kad suprastų CFTR poveikį naviko augimui, kontrolinio vektoriaus arba CFTR transfekuotų PC-3 ląstelių poodiniai naviko skyriai buvo dažomi, kad būtų ekspresuojama PCNA, kuri yra branduolinis baltymas, susijęs su proliferacija, ir Bcl-2, kuris yra antiapoptotinis genas eksperimento baigtyje. Kaip parodyta 3b paveiksle, imunohistocheminė ksenografinių navikų analizė atskleidė, kad CFTR per daug ekspresuojantys navikai rodo žemą mitozinių figūrų dažnį ir antiapoptozės gebėjimą. Taigi, remiantis in vitro stebėjimais, in vivo rezultatai patvirtina nuostatą, kad CFTR slopina vėžio vystymąsi.

Image

CFTR ekspresijos lygiai daro įtaką tumorigeniniam poveikiui in vivo . a ) In vivo ksenografų tyrimas PC-3 ląstelėms, perkeltoms tuščiu vektoriu arba CFTR. Naviko dydis buvo matuojamas praėjus 4 savaitėms po 2 × 106 tumorigeninių PC-3 ląstelių, transfekuotų peGFP-C3 arba CFTR vektoriais matrigeliu (1: 1), injekcijos. Pateikti duomenys yra šešių pelių, gautų kontroliniame vektorių grupėje, ir septynių pelių, esančių CFTR pernelyg ekspresuojančioje grupėje, vidurkis, P = 0, 027. ( b ) Imunohistocheminis ksenografinių navikų CFTR, PCNA, Bcl-2, uPA ir uPAR dažymas iš kontrolinio vektoriaus arba per CFTR transfekuotų PC-3 ląstelių. Svarstyklės, 100 μm. c ) PC-3 ląstelių, transfekuotų tuščiu vektoriu arba CFTRrib2, ksenografo in vivo tyrimas. Naviko dydis buvo matuojamas praėjus 4 savaitėms po 2 × 106 tumorigeninių PC-3 ląstelių, perkeltų pEF-His ar CFTRrib2 vektoriais su matrigeliu (1: 1), injekcijos. pEF / His ( n = 4) prieš CFTR rib2 ( n = 4); P = 0, 049.

Visas dydis

UPA dalyvavimas tarpininkaujant naviką slopinančiam CFTR poveikiui

Koks gali būti mechanizmas (-ai), skatinantis navikų slopinantį CFTR poveikį? Neįtikėtini įrodymai parodė, kad su ląstelių paviršiumi susijęs UPA tarpininkavimas signalizuodamas sukelia daugelio rūšių vėžio, įskaitant prostatos vėžį, progresą ir metastazes, atliekant įvairialypes funkcijas, tiesiogiai arba netiesiogiai sąveikaudamas su integrinais, endocitozės receptoriais ir augimo faktoriais. . 17, 18 Taigi, mes iškėlėme hipotezę, kad daugialypį auglį slopinantį CFTR poveikį gali lemti uPA. Iš tiesų, mes pastebėjome, kad CFTR numušimas žymiai padidino uPA baltymų ekspresiją ir uPA sekreciją PC-3 ląstelėse (4a ir b pav.), Parodydamas, kad uPA aktyvumas šiose vėžio ląstelėse priklauso nuo CFTR. Jei naviką slopinantis CFTR poveikis daugiausia susijęs su uPA ekspresijos / aktyvumo pokyčiais, CFTR numušimo metu pastebėtas poveikis turėtų būti panaikintas keičiant uPA aktyvumą. Norėdami tai išbandyti, mes apdorojome ir kontrolines, ir CFTR numalšintas prostatos vėžio ląsteles (PC-3 ir DU-145) uPA arba uPA receptorių (uPAR) neutralizuojančiais antikūnais ir įvertinome jų pokyčius tumorigeniniuose fenotipuose. Mūsų rezultatai parodė, kad neutralizavimas arba su uPA, arba uPAR antikūnais CFTR numušimo PC-3 (4c – e pav.) Arba DU-145 (papildomi 3a – c paveikslai) metu dramatiškai panaikino CFTR numušimo padidintą ląstelių proliferaciją, migraciją ir invaziją šiose ląstelėse., nurodantį, kad uPA ekspresijos / aktyvumo reguliavimas yra pagrindinis mechanizmas, lemiantis padidėjusį piktybinį naviką, sukeltą šių vėžinių ląstelių CFTR numušimo. Dar svarbiau, kad CFTR reguliuojamasis vaidmuo uPA ekspresijai buvo patvirtintas ksenografinių navikų atvejais. Imunohistocheminis dažymas iš CFTR ekspresuojančių ksenografinių navikų parodė, kad pastebimai sumažėjo uPA ir uPAR ekspresija, palyginti su navikais iš kontrolinių vektorių ląstelių (3b pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad CFTR slopina vėžio vystymąsi sumažindamas uPA aktyvumą.

Image

UPA įtraukimas į naviką slopinantį CFTR poveikį. a ) baltymo uPA ekspresija yra padidinta CFTR numušimo PC-3 ląstelėse, palyginti su vektorių kontrolės ląstelėmis. Paveikslėlis yra trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. ( b ) UPA aktyvumas CFTR numetimo PC-3 ląstelėse, palyginti su vektorių kontrolės ląstelėmis. Eksperimentas buvo atliktas tris nepriklausomus kartus po tris egzempliorius, *** P <0, 001. ( c - e ) PC-3 pEF-His arba CFTRrib2 transfekuotos ląstelės buvo inkubuotos su 10 μg / ml uPA (Santa Cruz, SC-6830) arba uPAR (Santa Cruz, SC-10815) neutralizuojančiu antikūnu, 10 μg / ml. IgG buvo naudojamas kaip antikūnų kontrolė. ( C ) MTS tyrimas rodo, kad padidėjęs PC-3 CFTRrib2 ląstelių augimas yra žymiai atstatomas arba uPA, arba uPAR antikūnų. CFTR šonkaulis, palyginti su pEF-His, * P <0, 05; CFTR rib2, apdoroti uPA arba uPAR antikūnais, palyginti su pEF-His + IgG, # P > 0, 05. ( d ) Modifikuotas Boydeno kameros ląstelių migracijos tyrimas rodo, kad CFTR numušimas žymiai skatina ląstelių migraciją per 72 valandas. Tačiau gydymas uPA arba uPAR antikūnais beveik panaikina padidėjusią migraciją PC-3 CFTRrib2 ląstelėse, CFTR rib2, apdorotose uPA, arba uPAR antikūnus, palyginti su CFTRrib2, gydytais IgG, * P <0, 05. CFTR rib2, apdoroti uPA arba uPAR antikūnais, palyginti su pEF-His + IgG, # P > 0, 05. ( e ) Invazijos tyrimas rodo, kad gydymas arba uPA, arba uPAR antikūnais žymiai panaikina padidėjusią invaziją PC-3 CFTRrib2 ląstelėse, CFTR rib2, apdorotose uPA, arba uPAR antikūnus, palyginti su CFTRrib2, gydytais IgG, * P <0, 05. CFTR rib2, apdoroti uPA arba uPAR antikūnais, palyginti su pEF-His + IgG, # P > 0, 05.

Visas dydis

Auglį slopinantis CFTR poveikis apima miR-193b taikymą į uPA

Įrodyta, kad mikroRNR (miRNR) po transkripcijos reguliuoja daugybę skirtingų genų, reaguodamos į ląstelių mikroaplinkos pokyčius, tokius kaip jonų srautai, kuriuos perduoda jonų kanalai, tokie kaip CFTR, ir yra žinoma, kad jie gali vystytis vėžiui. 19, 20 Tiksliau, miR-193b neseniai buvo identifikuotas kaip epigenetiškai reguliuojamas galimas naviko slopiklis įvairių tipų vėžiui 21, 22, 23 ir įrodytas, kad jis skirtas uPA. Taigi, mes hipoteze, kad uPA per miR-193b gali sukelti daugialypį auglių slopinantį CFTR poveikį. Iš tiesų, mes stebėjome tiesioginį CFTR ryšį su miR-193b ekspresija prostatos vėžio ląstelių linijose. Kaip parodyta, CFTR numušimas paskatino miR-193b ekspresijos slopinimą, tuo tarpu išorinė CFTR ekspresija sukėlė priešingą efektą tiek PC-3, tiek LNcap ląstelių linijose (5a ir b paveikslai, 4 papildomas paveikslas). Įdomiau, kad kai neektopiškai transfektavome pre-miR-193b PC-3 CFTRrib2 ląstelėse, mes pastebėjome reikšmingą ar visišką CFTR numušimo padidintą proliferaciją, migraciją ar invaziją (5c – e pav.), Atitinkamai, PC-3 ląstelėse. . Svarbu tai, kad priverstinis miR-193b ekspresas taip pat visiškai panaikino CFTR numušimo padidintą uPA aktyvumą PC-3 ląstelėse (5f pav.), Kaip buvo galima tikėtis, kad uPA bus miR-193b taikinys.

Image

MiR-193b tarpininkauja CFTR poveikiui uPA. ( a ) miR-193b raiška yra ženkliai slopinama CFTR knockdown PC-3 ląstelėse, palyginti su vektorių kontrolės ląstelėmis, atliekant Q-PCR analizę, *** P <0, 001. ( b ) miR-193b ekspresija žymiai padidėja CFTR per daug ekspresuojančiose PC-3 ląstelėse, palyginti su vektorių kontrolinėmis ląstelėmis, atliekant Q-PCR analizę, *** P <0, 001. ( c - f ) PC-3 CFTRrib2 ląstelės buvo transfekuotos kontroline Pre-miRNR arba Pre-miR-193b ir palygintos su PC-3 pEF-His ląstelėmis, perkeltomis kontrolinėmis Pre-miRNR. ( c ) MTS tyrimas rodo, kad padidėjęs PC-3 CFTRrib2 ląstelių augimas yra ženkliai atstatomas per daug ekspresorizuojant pre-miR-193b, ** P <0, 01; * P <0, 05. ( d ) Cytodex-2 granulių judrumo tyrimas rodo, kad pernelyg didelis pre-miR-193b ekspresas beveik panaikina padidėjusią migraciją PC-3 CFTRrib2 ląstelėse, ** P <0, 01. ( e ) Invazijos testas rodo, kad pernelyg didelis pre-miR-193b ekspresas visiškai panaikina sustiprintą invaziją PC-3 CFTRrib2 ląstelėse per 24 valandas, ** P <0, 01. ( f ) uPA aktyvumo tyrimas rodo, kad per-pre-miR-193b ekspresija visiškai panaikina padidėjusį uPA aktyvumą PC-3 CFTRrib2 ląstelėse, *** P <0, 001; ** P <0, 01. ( g ) „MiR-193b“ ekspresija keturiuose kontroliniuose ir keturiuose CFTR numesto PC-3 ksenografuose, matuojant Q-PGR. ( h ) MiR-193b ekspresija keturiuose kontroliniuose ir keturiuose CFTR padidėjusio ekspresijos PC-3 ksenografuose, išmatuota Q-PCR. ( i ) Kiekybiniai ( g ) ir ( h ) punktų duomenys, rodantys miR-193b, yra padidėję ksenografuose, kuriuose yra CFTR ir kurie ekspresuoja, tuo tarpu sumažėjo ksenografuose, kuriuose yra CFTR, * P <0, 05.

Visas dydis

Remiantis in vitro duomenimis, CFTR reikšmė miR-193b buvo patvirtinta ksenografinių navikų srityje. Rezultatai parodė, kad ksenografiniai navikai iš CFTR numuštų PC-3 ląstelių išreiškė sumažėjusį miR-193b lygį, tuo tarpu CFTR per daug ekspresuojantys navikai pasižymėjo padidėjusia miR-193b ekspresija (5g – i pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad CFTR slopina vėžio vystymąsi pirmiausia per epigenetinį mechanizmą, susijusį su miR-193b, nukreiptu į uPA.

Terapinis CFTR potencialas sergant vėžiu

Tada, norėdami įvertinti terapinį CFTR geno atkūrimo potencialą in vivo , mes panaudojome CFTR DNR tiesiai į atletiškų nuogų pelių ksenografinius navikus, naudodami ultragarso-mikroturbtelio metodą. Kaip parodyta 6a ir b paveiksluose, gydytų navikų tūris labai sumažėjo, palyginti su kontrole, įpurškta tuščiu vektoriu. Gydymas CFTR genų priešvėžiniu poveikiu buvo ypač stiprus, nes atliekant liekanų masių histologinę analizę paaiškėjo, kad difuzinės nekrozės zonose beveik nėra išlikusių ląstelių (6c paveikslas, H&E). Be to, PCNA ir Bcl-2 ekspresija gydomuose ksenografiniuose navikuose buvo dramatiškai sumažinta, palyginti su tais, kuriems buvo injekuoti kontroliniai vektoriai (6c pav.). Be to, remiantis ankstesniais duomenimis, mūsų Western blot analizė parodė, kad tiek uPA, tiek uPAR ekspresija CFTR gydomiems gyvūnams buvo žymiai sumažinta, palyginti su kontrolinių pelių ekspresija (6d pav.). Taigi atrodo, kad CFTR geno pristatymas ir atkūrimas auglyje in vivo turi terapinį potencialą.

Image

Terapinis CFTR potencialas sergant vėžiu. ( a, b ) Poveikis naviko augimui, naudojant CFTR. ( a ) Navikai, susidarę praėjus 2 savaitėms po 2 × 106 PC-3 ląstelių injekcijos, buvo gydomi burbule konjuguota DNR, turinčia peGFP-C3 (viršutinė eilutė įdėtoje nuotraukoje) arba CFTR vektoriais (apatinė eilutė). ( b ) Duomenys yra gauti iš 13 pelių kontrolinių vektorių grupėje ir 12 pelių CFTR atstatymo grupėje, *** P = 0, 0004. c ) HNV ir imunohistocheminis PCNA, Bcl-2 ir CFTR dažymas nuo kontrolinių ar CFTR apdorotų PC-3 ksenografinių navikų. Retos gyvos naviko ląstelių salos nekroziniame navike, gydomos CFTR vektoriu, nurodytos brūkšniuota linija, skalės juosta, 100 μm. ( d ) UPA ir uPAR ekspresija dviejuose kontroliniuose ir dviejuose CFTR apdorotuose PC-3 ksenografuose, matuojant Western blot.

Visas dydis

Diskusija

Nors pastaruoju metu domimasi įvairių vėžio rizika sergantiems CF pacientais ir CFTR mutacijų nešiotojais, CFTR vaidmens vėžio patogenezėje tyrimai yra labai riboti. Buvo pranešta, kad CFTR slopina MUC4 ekspresiją, o tai slopina kasos naviko ląstelių augimą ir metastazes. 26, 27 Kitas tyrimas pasiūlė, kad ΔF508 CFTR mutacija gali apsaugoti nuo krūties vėžio, remiantis įrodymais, kad padidėjęs tarpląstelinis ATP (adenozino trifosfatas) slopina krūties vėžio ląstelių linijos augimą ir kad CFTR pumpuoja ATP iš epitelio ląstelių. 9 Tačiau šio tyrimo išvados nepatvirtino vėlesnė klinikinė ataskaita, rodanti, kad CF sergantiems pacientams krūties piktybinio naviko rizika nėra mažesnė. 28 Prieštaringą išvadą galima paaiškinti galimybe, kad ΔF508 baltymo iškraipanti funkcija tam tikru nežinomu būdu galėjo paveikti tumorigeninį elgesį. Šiame tyrime mes parodėme anksčiau neapibrėžtą naviką slopinantį CFTR vaidmenį prostatos vėžyje. Mūsų atliktas funkcinių tyrimų praradimas ir praradimas aiškiai rodo, kad normali CFTR funkcija slopina vėžio progresavimą, tuo tarpu CFTR ekspresijos slopinimas skatina vėžio vystymąsi tiek in vitro, tiek in vivo. Ypatingai įdomu, be nustatyto poveikio ląstelių dauginimuisi ir apoptozei, mes pastebėjome, kad CFTR yra labai svarbus ląstelių adhezijos, invazijos ir migracijos vėžiui reguliuoti. Taigi CFTR funkcijos praradimas neišvengiamai lemia pagreitintą naviko progresavimą.

Gerai nustatyta, kad uPA / uPAR ašis vaidina pagrindinį vaidmenį ląstelių proliferacijoje, angiogenezėje, tarpląstelinės matricos degradacijoje, invazijoje ir metastazėse vėžio vystymosi metu. 29 Be to, įrodyta, kad per didelis uPA ir uPAR poveikis yra susijęs su neigiama įvairių piktybinių navikų prognozėmis. Sergant prostatos vėžiu, pakitusi uPA ir PAI-1 raiška yra susijusi su nepageidaujamais patologiniais požymiais, tokiais kaip didesnė Gleason suma ir limfmazgių bei skeleto metastazės. 30, 31 Savo tyrime mes parodėme, kad uPA ekspresija ir aktyvumas yra atvirkščiai susiję su CFTR ekspresija prostatos vėžio ląstelių linijose (4a ir b paveikslai). Be to, CFTR per didelis ekspresas dramatiškai slopino uPA / uPAR ekspresiją naviko ksenografuose (3b ir 6d paveikslai). Be to, mes parodėme, kad pagal CFTR numušimą padidėjęs ląstelių proliferacija, ląstelių invazija ir migracija yra praktiškai atvirkštinės arba uPA, arba uPAR antikūnų (4c – e paveikslai ir 3 papildomas paveikslas), rodančių, kad naviką slopinantis CFTR vaidmuo priskiriamas uPA sukelto daugelio piktybinių požymių slopinimas vėžio ląstelėse. Įdomu tai, kad vis daugiau baltymų buvo tiesiogiai ar netiesiogiai sąveikaujantys su CFTR, sudarydami makromolekulinius kompleksus, tai rodo, kad CFTR vaidmuo gali būti sudėtingesnis ir platesnis, nei manėme. 12 Iš tikrųjų, be uPA, mes nustatėme, kad per didelis CFTR ekspresija PC-3 ląstelių linijoje sumažina daugybę genų, dalyvaujančių navikų invazijoje ir migracijoje, tokių kaip TWIST1 , FGFR2 , ITGA1 , THBS1 (duomenys nepateikti). Tačiau norint nustatyti mechanizmą, kuriuo grindžiamas CFTR ir šių genų ryšys, reikia atlikti daugiau tyrimų.

Įdomus šio tyrimo rezultatas yra tas, kad uPA reguliavimas CFTR apima epigenetinį mechanizmą, būtent miR-193b, kuris anksčiau buvo įrodytas, kad nukreiptas į uPA. Nors CFTR pervertinimas ar numušimas sąlygojo atitinkamai miR-193b padidėjimą ir sumažėjusį reguliavimą tiek vėžio ląstelių linijose, tiek naviko ksenografuose (5a paveikslai ir papildomas 4 paveikslas), priverstinis miR-193b ekspresija reikšmingai pakeitė CFTR numušimo padidintą proliferaciją, migraciją. arba invazija (5c – e paveikslai) ir panaikino CFTR numušimo padidintą uPA aktyvumą PC-3 ląstelėse (5f pav.). Įdomiau, kad bandydami įvertinti CFTR ir miR-193b koreliaciją, nustatėme ir CFTR, ir miR-193b raišką šešiais prostatos vėžio mėginių atvejais, kai buvo užtikrinta 80% vėžio ląstelių. Kaip parodyta 6 papildomame paveiksle, mūsų kiekybiniai PGR rezultatai atskleidė reikšmingą CFTR koreliaciją su miR-193b. Visi šie duomenys rodo, kad CFTR slopina naviko progresavimą per miR-193b, nukreiptą į uPA. Pažymėtina, kad uPA taip pat suaktyvina NFkB, gerai žinomas transkripcijos faktorius, susijęs su 32, 33 uždegimais ir vėžiu. 34 Įdomiau, kad įrodyta, kad sugedęs CFTR sukelia endogeninį NF-κB, 35, 36, 37 aktyvavimą, todėl įmanoma, kad be miR-193b, CFTR gali reguliuoti uPA per NFκB. Iš tikrųjų šiame tyrime mes nustatėme, kad CFTR numušimas paskatino aktyvesnį NFkB aktyvavimą prostatos vėžio ląstelių linijose (papildomas 5a paveikslas). Be to, mes parodėme, kad NFkB inhibitorius panaikina uPA reguliavimą CFTR numušimo PC-3 ląstelėse (papildomas 5b paveikslas). Apibendrinant atrodo, kad CFTR gali slopinti uPA sukelto naviko veiklą per genetinius ir epigenetinius mechanizmus.

Kitas įdomus šio tyrimo pastebėjimas yra nuo amžiaus priklausomas CFTR reguliavimas žiurkės prostatoje (1 papildomas paveikslas), kuris atitinka prostatos hiperplazijos ir vėžio paplitimą nuo amžiaus. 38, 39 Kadangi kastracija sukelia slopintą CFTR raišką, o gydymas testosteronu padidina CFTR raišką tiek po kastracijos žiurkės prostatos audiniuose, tiek kultivuojamuose pirminiuose prostatos epitelio ląstelėse (papildomi 7b ir c pav.), Tikėtina, kad senstant prostatai sumažėja Testosteronas gali būti atsakingas už CFTR praradimą tiesiogiai slopinant CFTR promotorių arba indukuojant CFTR geno metilinimą, o tai suteikia ląstelių jautrumą piktybinei transformacijai. Testosterono CFTR ekspresijos reguliavimas turi didelę klinikinę reikšmę. Kliniškai dauguma pacientų, gydomų androgenų deprivacijos terapija, linkę į vėlyvesnį vėžio tipą, o tai paaiškinama nevienalyčiu reagavimu į androgeną skirtingose ​​vėžio ląstelių pogrupiuose. 40 Mūsų išvados, kad androgenai padidina CFTR, o represuota CFTR raiška skatina vėžio vystymąsi, yra alternatyvus mechanizmas, kuriuo grindžiama pastebėta prostatos vėžio gydymo dilema, o tai gali iš esmės pakeisti klinikinę praktiką, susijusią su prostatos vėžio gydymo strategija. Ypač pažymėtina, kad mūsų eksperimentiniuose modeliuose per didelis CFTR ekspresija slopino vėžio vystymąsi tiek nuo androgenų (LNcap), tiek nuo androgenų nepriklausomų (PC-3) vėžio ląstelių linijose ir CFTR pristatymas į prostatos vėžio ksenografus galėjo sukelti pastebimą naviką. regresija. Taigi CFTR gali turėti nemažą terapinį potencialą, nepriklausomai nuo androgenų priklausomybės.

Nors CFTR raišką reguliuojantys mechanizmai yra mažai suprantami, pranešama, kad CFTR genas dažnai būna hipermetilinuotas įvairiuose pirminiuose vėžio mėginiuose ir ląstelių linijose. Įdomu tai, kad neseniai atliktas tyrimas, tiriantis 139 pirminio nesmulkialąstelinio plaučių vėžio atvejus, aiškiai parodė, kad vėžiu sergantiems pacientams CFTR geno metilinimas buvo reikšmingas ir susijęs su prastesniu jaunų pacientų išgyvenimu. 16 Nors šiuo metu nėra pranešimo apie CFTR metilinimo būklę prostatos vėžiu sergantiems pacientams, pranešta, kad prostatos vėžio ląstelių linijose PC-3, DU-145 ir LNcap 15 CFTR promotorius hipermetilinamas, o tai siejama su jo žemu ekspresijos lygiu. šiose ląstelių linijose. Išvados, kad CFTR yra nepakankamai reguliuojamas prostatos vėžio ląstelių linijoje, o pacientų mėginiai kartu su per dideliu CFTR ekspresija slopina prostatos vėžio progresavimą, pateisina būsimus prostatos vėžiu sergančių pacientų CFTR metilinimo ar mutacijos tyrimus, kurie gali būti patrauklūs ir nauji prognozės ir terapinė prostatos vėžio intervencija.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi 1-7 paveikslai

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

  2. 2.

    Papildomos legendos

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)