Naujos ląstelių linijos (csqt-2), pasižyminčios kepenų ląstelių vėžinių navikų trombų, turinčių didelį metastazinį aktyvumą, apibūdinimas | britų žurnalas apie vėžį

Naujos ląstelių linijos (csqt-2), pasižyminčios kepenų ląstelių vėžinių navikų trombų, turinčių didelį metastazinį aktyvumą, apibūdinimas | britų žurnalas apie vėžį

Anonim

Dalykai

  • Vėžio modeliai
  • Kepenų vėžys
  • Metastazės

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Pagrindiniai faktai:

Portalinis venų naviko trombas (PVTT) labai susijęs su kepenų ląstelių karcinomos (HCC) progresavimu ir metastazėmis. Tačiau nėra tinkamų PVTT ląstelių modelių, pagal kuriuos būtų galima ištirti PVTT biologines ir fiziologines savybes.

Metodai:

Pirminė ląstelių kultūra buvo atlikta naudojant paeiliui ksenografinę liniją, vadinamą PVTT-# 1, kuri buvo gauta iš 60 metų vyro, sergančio HCC, kartu su PVTT.

Rezultatai:

Buvo nustatyta iš eilės ląstelių linija, pavadinta CSQT-2. Ląstelių linija parodė agresyvius fenotipus, susijusius su ląstelių augimu, išgyvenimu, migracija, ksenografu ir metastazėmis. Be to, ortotopinis transplantacijos tyrimas parodė, kad nuogas pelėms gali būti generuojamas PVTT, kai kepenyse buvo inokuliuotos CSQT-2 ląstelės, ir kad tai rodo tipišką migracijos polinkį į portalinės venos kraujagyslių šakas. Be to, įsitvirtinusios CSQT-2 ląstelės taip pat parodė skirtingą naviką inicijuojančių ląstelių (TIC) žymenų, tokių kaip CD133, CD90 ir EpCAM, raišką.

Išvada:

CSQT-2 sukūrimas gali būti tinkamas modelis, tiriantis su PVTT susijusio HCC molekulinius mechanizmus.

Pagrindinis

Kepenų ląstelių karcinoma (HCC) yra penktasis labiausiai paplitęs vėžys visame pasaulyje (Parkin, 2006; Portolani ir kt., 2006; Yamane ir Weber, 2009), ir tai yra viena didžiausių sveikatos problemų visame pasaulyje. Šiuo metu labiausiai paplitę geografiniai regionai yra rytinė Azija, taip pat Vidurio ir Vakarų Afrika, tuo tarpu sergamumas didėja Šiaurės ir Pietų Amerikoje (Bosch et al, 2005; Michielsen et al, 2005; Chen et al, 2006). Be to, mirtingumas dėl kepenų vėžio sparčiausiai didėjo JAV, nors bendras mirštamumas nuo vėžio mažėjo (www.seer.cancer.gov). Tiesą sakant, kepenų vėžio metastazės ir pasikartojimas yra labai mirtini (Kornek ir kt., 2008). Deja, prastas supratimas apie HCC metastazių vystymąsi buvo pagrindinė kliūtis tobulinti HCC terapiją (Shuqun et al, 2004; Sun et al, 2007; Amarapurkar et al, 2008; Lim et al, 2008; Ramaiah and Rittling, 2008). Portalinės venos naviko trombas (PVTT), atsirandantis dėl HCC ląstelių invazijos į portalinę veną, yra ypatingas HCC metastazių tipas (Shuqun et al, 2007; Zhou et al, 2008). Chau ir kt. (2003) pranešė, kad mikroskopinių navikų trombų dažnis yra apie 49, 6%. Kaip gerai žinomas blogas prognostinis veiksnys, PVTT pastebimai pablogina kepenų funkciją ir yra susijęs su didesniu pasikartojimu bei intrahepatinėmis metastazėmis (Li ir kt., 2009). Nepaisant to, PVTT etiologija atliekant HCC metastazes yra beveik nežinoma (Shuqun ir kt., 2006; Inoue ir kt., 2009; Inui ir kt., 2009). Dėl netinkamo mechanizmo, per kurį PVTT dalyvauja HCC metastazėse, supratimo gali būti eksperimentinio modelio nebuvimas (Takizawa ir kt., 2007; Liang ir kt., 2008). Tačiau daugeliu atvejų pirminės PVTT ląstelių kultūros nesugeba išgyventi ir ilgą laiką klestėti (Choi ir kt., 2008). Todėl šio tyrimo tikslas buvo nustatyti PVTT kilmės HCC ląstelių liniją, turinčią PVTT savybes. Mes sėkmingai sukūrėme žmogaus PVTT ksenografo modelį nuogoms pelėms, pavadintą PVTT-1 (pateiktas paskelbti), kuris klestėjo ištisoms kartoms. Čia, panaudojus šio modelio ortotropinį naviką, pavyko sukurti naujas PVTT kilmės HCC ląstelių linijas, kurios galėtų prisidėti tiriant PVTT.

medžiagos ir metodai

Eksperimento dizainas

Šį eksperimentinį protokolą patvirtino Rytų hepatobiliarinės ligoninės institucinė apžvalgos taryba. Iš paciento buvo gautas informuotas sutikimas.

Pacientas

Naviko audinys buvo gautas iš 60 metų vyro iš šiaurės vakarų Kinijos, kuriam buvo diagnozuotas HCC kartu su PVTT. Jo onkologinė šeimos istorija nebuvo žinoma. Jis neturėjo operacijų istorijos. Kraujo tyrimai parodė AST lygį 86 U l –1, α -fetoproteino lygį 258 ng ml –1, kanceroembryoninio antigeno lygį 2, 8 ng ml –1 ir teigiamą HBsAg. Prieš operaciją pacientas skundėsi švelniu viršutinės dešinės pilvo dalies skausmu. Kompiuterinė tomografija parodė pažeidimą (10 cm × 11 cm) dešinėje kepenų skilties dalyje ir PVTT invaziją į dešinę portalo venos šaką. Pacientui atlikome dalinę kepenų rezekciją ir trombektomiją. Patologiniai vertinimai patvirtino, kad tiek HCC, tiek PVTT parodė vidutinį skirtumą pagal Edmondsono kriterijus ir kad kepenų cirozė buvo lengva. Pacientas mirė nuo metastazių plaučiuose praėjus 3 mėnesiams po hepatektomijos.

Gyvūnai ir ląstelių linijos

Iš Kinijos mokslo akademijos Mitybos mokslų instituto gavome 6 savaičių BALB / c nuogų pelių patinus, kurios buvo laikomos konkrečioje be patogenų būsenoje. Pelių tyrimo protokolą patvirtino Šanchajaus medicinos eksperimentinės gyvūnų priežiūros komisija. 7702 kepenų vėžio ląstelių linijos buvo įsigytos iš Kinijos mokslų akademijos Šanchajaus ląstelių biologijos instituto ląstelių banko tipo kultūros kolekcijos. Jie buvo kultivuoti RPMI 1640 ir papildyti 10% vaisiaus galvijų serumo, 10 vienetų ml –1 penicilino ir 10 vienetų ml – 1 streptomicino 37 ° C temperatūroje, drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5% CO 2 . MHCC97-H ir MHCC97-L ląstelių linijos buvo įsigytos iš Šanchajaus Fudano universiteto Kepenų vėžio instituto. Jie buvo kultivuoti DMEM ir papildyti 10% vaisiaus galvijų serumo, 10 vienetų ml –1 penicilino ir 10 vienetų ml –1 streptomicino.

Antikūnai ir reagentai

Triušių anti-žmogaus fosfo-Akt ir EGFR antikūnai buvo atsinešti iš ląstelių signalo. Pelės monokloninis anti-žmogaus β- aktino antikūnas buvo nupirktas iš „Santa Cruz Biotechnology“. APC pažymėti anti-CD133 ir FITC pažymėti anti-CD90, EpCAM antikūnai buvo paimti iš MACS.

PVTT ksenografo modelio sukūrimas

PVTT ksenografo modelio sukūrimas buvo atliktas, kaip aprašė Sun ir kt. (1996), su nedidelėmis modifikacijomis. Iš pradžių sukūrėme nuoseklų pelių naviko liniją, naudodami paciento vartų venos naviko trombo pavyzdį. Kai paciento PVTT mėginys buvo paimtas, jis buvo supjaustytas maždaug 2 mm × 2 mm x 2 mm dydžio gabalėliais, implantuojamais į kiekvienos iš šešių nuogų pelių kepenis. Kai ortotopinis navikas sugebėjo išgyventi ir išsivystė į bendrą naviko tūrį, jis buvo pašalintas ir supjaustytas maždaug 2 mm × 2 mm × 2 mm dydžio gabalėliais, kurie buvo implantuojami į kepenis ir po oda (pažastyje ir kirkšnyje). ) kiekvienos nuogos pelės, naudojant anksčiau aprašytą metodą. Pagaliau pavyko sukurti ksenografo modelį pavadinimu PVTT-1.

Pirminių ir vienas po kito einančių ląstelių kultūrų auginimas

Keli bandymai pirminėse kultūrose buvo atlikti naudojant ortotropinį naviką, gautą iš aukščiau aprašyto PVTT-# 1 ksenografo modelio. Šie ksenografai buvo pašalinti ir panaudoti pirminėms kultūroms in vitro skirtingais auginimo būdais, aprašytais Tian ir kt. (1999). Galų gale mes pastebėjome, kad ląstelių kultūrai tinkamiausia aplinka buvo DMEM su 10% galvijo vaisiaus serumu 37 ° C temperatūroje, sudrėkintoje atmosferoje su 5% anglies dioksidu in vitro . Paeiliui einanti HCC ląstelių linija, praėjusi daugiau nei 100 kartų, buvo pavadinta CSQT-2.

RNR ekstrahavimas ir RT PGR tyrimas

Visa RNR buvo išskirta naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen) iš CSQT-2 ląstelių linijų ir iš PVTT pacientų audinių, gavus jų informuotą sutikimą pagal institucinius reguliavimo reikalavimus. RNR mėginiai buvo atskirti 2% agarozės geluose, turinčiuose etidžio bromido, ir tada jų kokybė buvo nustatyta pagal 18 S ir 28 S RNR juostų matomumą UV šviesoje. Iš viso 2 μg aukštos kokybės RNR buvo perdirbta tiesiai į cDNR naudojant atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Promega, Madison, WI, JAV), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. PCR procedūra, naudojama žmogaus cIAP1, EGFR, β- 5 integrino, uPAR, cMet ir β- aktino nustatymui, buvo šiek tiek pakeista, remiantis Tian ir kt. (1999) aprašyta procedūra.

DNR išskyrimas

Išaugintos ląstelės (1x106) buvo kruopščiai homogenizuotos 400 μl DNR denatūravimo tirpale, po to inkubuotos 100 μl 5% SDS (m V – 1 ) buferyje, kuriame yra 20 μl RNAazės ir 20 μl proteinazės K 37 ° C 24 val. DNR buvo ekstrahuota fenolio – chloroformo pavidalu. Ekstrahuota DNR nusodinama etanoliu ir pakartotinai suspenduojama distiliuotame vandenyje.

Citogeninė analizė

Chromosomų paruošimas ir G juostų nustatymas buvo atlikti kaip aprašyta Seabright (1971) su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, kolcemidis buvo pridėtas prie ląstelių kultūrų 60-ą kartą praeinant iki galutinės 0, 25 mg ml –1 koncentracijos 10–15 h. Tada ląstelės buvo tripsinizuotos ir centrifuguotos esant 1200 aps./min. 12 min. Naudota hipotoninė terpė buvo 0, 075 mol kalio chlorido 20 minučių 37 ° C temperatūroje, tada fiksatorius (metanolis / ledinė acto rūgštis, 3: 1) buvo pakeistas tris kartus prieš skaidrių darymą. Kai kurie stikleliai buvo bandomi 60 ° C temperatūroje 8–10 h, kad būtų galima nustatyti G juostą. Senos plokštelės buvo tirpinamos 3, 5 min., Nuplaunamos vandenyje ir nudažytos Giemsa, vėl nuplaunamos, išdžiovinamos oru ir tiriamos mikroskopu. C juostai likusios dalys mirkomos 0, 2 N druskos rūgštyje 1 valandą, po to inkubuojamos 5% Ba (OH) 2 esant 56 ° C 10 minučių ir nuplaunamos vandenyje. Po to stikleliai buvo pakartotinai inkubuojami su 2 x SSC (fiziologiniu tirpalu natrio citrato) 67 ° C temperatūroje 1–1, 5 valandos, vėl nuplaunami ir dažomi „Giemsa“.

Vakarų botas

Pasodintos ląstelės du kartus plaunamos PBS ir 30 minučių lizuojamos RIPA buferiu. Ląstelių lizatai buvo išaiškinti centrifuguojant 10 000 g 15 min., O baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bradfordo reagentą (Sigma). Bendri ląstelių lizatai (40 mg baltymų) buvo atskirti naudojant 10% SDS – PAGE gelius ir elektriniu būdu pernešti ant polivinilideno difluorido membranų (Millipore, Bedford, MA, JAV). Užkimšus 5% pieno, membranos buvo tiriamos pirminiais antikūnais praskiedžiant 1: 1000. Membrana buvo nuplauta ir po to 1 valandą inkubuota su krienų peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais. Imunoreaktyvūs baltymai buvo aptikti sustiprintais chemoliuminescencijos reagentais (Pierce, Rockford, IL, JAV) ir nufotografuoti su Kodak X-Omat mėlyna autoradiografijos plėvele.

Ląstelių paviršiaus žymenų ekspresijos analizė

Ląstelės (106) buvo tirpintos ir suspenduotos 100 μl D-Hanko buferio. Pridėta APC arba FITC pažymėtų ląstelių paviršiaus žymenų, taikomų antikūnų (CD133, CD90 ir EpCAM) (10 μl), ir ląstelės buvo inkubuojamos ant ledo 20 minučių. Tada ląstelės buvo plaunamos D-Hanko buferiu du kartus, pakartotinai suspenduojamos 300 μl D-Hanko buferiu ir siunčiamos FACS analizei.

MTT tyrimas

Ląstelių augimo kreivės tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta Patterson Jr MK (1979), su nedidelėmis modifikacijomis. Ląstelės buvo dedamos į 96 šulinėlių plokšteles su 3000 ląstelių kiekvienoje duobutėje, įvairios trukmės kultivuojamos 10% FBS DMEM ir ląstelių skaičius buvo matuojamas MTT tyrimu pagal MTT gamintojo pateiktą protokolą.

Minkšto agaro tyrimas

Ląstelės buvo dedamos į 24 šulinėlių plokščio dugno plokšteles, naudojant dviejų sluoksnių minkšto agaro sistemą, turinčią 1 × 103 ląstelių kiekvienoje duobutėje, 400 μl tūrio duobutėje, kaip aprašyta anksčiau (Munker ir kt., 1986). Po 14 dienų inkubacijos kolonijos buvo suskaičiuotos ir išmatuotos. Visi eksperimentai buvo pakartoti mažiausiai tris kartus, naudojant tris bandinių plokšteles kiekviename eksperimento taške.

Boydeno kamera

Boydeno kamera (8 μm porų dydžio polikarbonato membrana) buvo gauta iš Neuroprobe Corp, Bethesda, MD, JAV. Ląstelės (2x105) 0, 05 ml terpėje su 1% FBS buvo dedamos į viršutinę kamerą, o apatinė kamera buvo įpilama į 0, 152 ml terpės, turinčios 10% FBS. Ląstelės, kurios migravo į apatinį filtrų paviršių, buvo aptiktos tradiciniu dažymu H&E, ir po penkis kiekvieno šulinio laukus buvo suskaičiuota po 4–24 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 . Buvo tiriami trys šulinėliai kiekvienai būklei ir ląstelių tipui, o eksperimentai buvo pakartoti tris kartus.

Tumorogeniškumo tyrimas

Kultūrinės CSQT-2 ląstelės buvo plaunamos D-Hanko tirpalu, o 100 000, 10 000 arba 1000 ląstelių, suspenduotų 100 ml DMEM ir 100 ml Matrigel, buvo sušvirkštos į 6 savaičių amžiaus nuogų pelių patinų, įsigytų iš Šanchajaus laboratorinių gyvūnų centras, CAS (Šanchajus, Kinija). Jie buvo gydomi vadovaujantis Amerikos laboratorijų akreditavimo asociacijos rekomendacijomis. Grupėse su skirtingais ląstelių skaičiais buvo naudojamos trys pelės. Gauti navikai buvo matuojami kartą per savaitę prieš pelių nužudymą ir naviko tūris (mm 3 ) buvo apskaičiuotas pagal standartinę formulę: ilgis × plotis × aukštis × 0, 5236.

Ortotopinė transplantacija

Ortotopinei transplantacijai gauti pavyzdžiai buvo supjaustyti maždaug 2 mm × 2 mm x 2 mm dydžio gabalėliais, implantuoti į kiekvienos iš šešių nuogų pelių kepenis ir poodį (pažastyje ir kirkšnyje), naudojant aprašytą metodą. iš aukščiau paminėtų Sun et al (1996). Kai poodinis navikas pasiekė 1–1, 5 cm skersmens, jis buvo pašalintas ir supjaustytas maždaug 2 mm × 2 mm × 2 mm dydžio gabalėliais, kurie buvo implantuojami į kepenis ir po oda (pažastyje ir kirkšnyje) kiekviename iš šešių nuogos pelės, naudojant anksčiau aprašytus metodus.

CSQT-2 ląstelių žymėjimas luciferaze

Luc2 luciferazę koduojančios srities seka buvo amplifikuota PGR ir klonuota į FG12 lentivirusinį ekspresijos vektorių. FG12-Luc2 konstruktas buvo perkeltas į pakuotės-293T ląsteles lentivirusinių virusų gamybai. CSQT-2 ląstelės buvo užkrėstos FG12-Luc2 lentivirusu, kad stabiliai ekspresuotų luciferazės geną.

Eksperimentinis metastazių tyrimas

Atlikdami eksperimentinį metastazių tyrimą, mūsų eksperimente buvo naudojami du injekcijos būdai. Intrakardinis ir intraspleeninis keliai. Iš viso kiekvienoje injekcijoje buvo panaudota 500 000 ląstelių. Metastazavęs naviko augimas buvo matuojamas nustatant luciferazės aktyvumą naudojant IVIS. Pelės patinai buvo laikomos standartinėmis sąlygomis. Intrakardinėms injekcijoms subkonfluentinės ląstelės buvo surinktos, nuplautos PBS ir pakartotinai suspenduotos, esant 1 × 107 ląstelių mililitre koncentracijai. BALB / c nuogos pelės buvo anestezuojamos intraperitoniniu būdu sušvirkščiant chloralinį hidratą (30 mg kg – 1 ) ir buvo pastatytos ant gulimos padėties. Apžiūrėjus arterinio kraujo tekėjimą į švirkštą, į kairįjį skilvelį per trečią tarpšonkaulinę erdvę buvo sušvirkščiama 5 × 105 ląstelių. Sėkmingą injekciją patvirtino skubi IVIS. Intrapleninėms injekcijoms pelės, pateptos anestezijomis, buvo dedamos ant gulimos padėties ant nuogų pelių stalų. Nuogos pelės blužnis buvo ištirtas su odos ir pilvaplėvės pjūviais, o 5 x 105 CSQT-2 ląstelės buvo įšvirkštos į nuogų pelių blužnį metastazavimui. Metastazė pasirodė praėjus 4 savaitėms po injekcijos. Sėkmingą injekciją patvirtino skubi IVIS. Visi tyrimai su gyvūnais buvo atlikti pagal SIBS laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą, kurį patvirtino Šanchajaus biologinių mokslų institutų gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Rezultatai

HCC ląstelių linijos sukūrimas

Norėdami nustatyti HCC kultūrą, pirmiausia sukūrėme nuoseklią pelių naviko liniją, naudodami aukščiau paminėtą paciento vartų venos naviko trombo pavyzdį. Tada buvo atlikta pirminė kultūra, naudojant ortotropinį naviką, gautą iš tos naviko linijos. Pagaliau mums pavyko išlaikyti pirmines kultivuojamas ląsteles ir subkutti jas daugiau kaip 100 kartų DMEM su 10% vaisiaus galvijų serumu in vitro . Ši iš eilės einanti HCC ląstelių linija buvo pavadinta CSQT-2.

HCC ląstelių linijos CSQT-2 morfologija

Per keletą pirmųjų ištraukų CSQT-2 ląstelės sudarė nepažeistas kolonijas, turinčias tipiškas epitelio ląstelių formas (1A pav.). CSQT-2 ląstelės, eidamos iš eilės, vis tiek išsaugojo savo epitelio ląstelių formas, tačiau jos atsitraukė viena nuo kitos ir prarado kolonijos tipo formavimąsi, palyginti su pradiniu praėjimu (1A pav.). Itin struktūriškai CSQT-2 ląstelės ant ląstelių paviršių rodė intensyvias mikrovileles, kurios greičiausiai buvo suformuotos sutrikdant aktino ir tubulino turinčio citoskeleto reguliavimą (1B pav.). Ištyrus perdavimo elektroniniu mikroskopu, daugumoje CSQT-2 ląstelių buvo netaisyklingų desmosomų, mitochondrijų, ribosomų ir branduolių (1C paveikslas).

Image

CSQT-2 ląstelių linijos morfologija. ( A ) Kultūrinių ląstelių linijos CSQT-2 mikrofotografija iš skirtingų kultūros ištraukų. a: pirminė ląstelė, b: 3 pasažas, c: 55 taškas. ( B ) CSQT-2 ląstelių skenavimo elektroninė mikroskopija, rodanti mikrovilles ląstelės paviršiuje (sem, × 2000). ( C ) CSQT-2 ląstelių linijos, demonstruojančios netaisyklingas desmosomas, mitochondrijus, ribosomas ir branduolius, perdavimo elektronų mikroskopija. (TEM, × 7 500).

Visas dydis

CSQT-2 ląstelių linijos charakteristika in vitro

Po kelių in vitro kultūros ištraukų atlikome daugybę tyrimų, skirtų apibūdinti CSQT-2 ląsteles in vitro . Ląstelių augimas CSQT-2 ląstelėse buvo tiriamas naudojant MTT tyrimą, naudojant MHCC97-H ląsteles kaip teigiamą kontrolę (2A pav.). Nustatyta, kad CSQT-2 ląstelių dvigubas laikas in vitro buvo trumpesnis , palyginti su MHCC97-H ląstelėmis, kurios buvo žinomos kaip gana agresyvios. Spartus ląstelių augimas CSQT-2 ląstelėse gali būti susijęs su mažesne ląstelių apoptozė ir greitesniais ląstelių ciklais. Kaip parodyta 2B paveiksle, apie 50% ląstelių buvo S-G2-M fazėse (2B paveikslas). Be to, CSQT-2 ląstelės parodė stipresnius augimo sugebėjimus nuo tvirtinimo vietos (2C pav.). Migracijos tyrime buvo parodyta, kad CSQT-2 ląstelių migracijos pajėgumai viršijo MHCC97-H ląstelių (2D paveikslas). Visi šie rezultatai rodo, kad CSQT-2 ląstelės gali būti intensyviau metastazuojamos in vivo .

Image

CSQT-2 ląstelių linijos tyrimas in vitro . ( A ) CSQT-2 ir MHCC97-H ląstelių augimas. Abi ląstelės buvo dedamos į 96 šulinėlių plokštelę, kurioje kiekvienoje duobutėje buvo 3000 ląstelių. MTT tyrimas buvo atliekamas kiekvieną dieną, norint pavaizduoti augimo kreivę. ( B ) CSQT-2 ląstelių ciklo analizė. CSQT-2 ląstelės buvo surinktos FACS analizei po PI dažymo. ( C ) Nuo tvirtinimo vietos nepriklausomas augimas. CSQT-2 ir MHCC97-H ląstelės buvo nusodintos 1, 0% agare su 20% FBS, papildytos 2 savaites, kad būtų patikrintas kolonijų susidarymas. ( D ) CSQT-2 ir MHCC97-H ląstelių migracijos analizė. Abiejoms ląstelėms buvo nustatytas modifikuotas Boydeno kameros tyrimas, siekiant patikrinti migracijos gebėjimą.

Visas dydis

CSQT-2 ląstelių linijos charakteristikos in vivo

Atlikus in vitro tyrimą, buvo tiriamas CSQT-2 ląstelių elgesys in vivo . Nuogoms pelėms CSQT-2 ląstelės parodė stipresnį poodinį tumorogeniškumą (3A pav.). Pažymėdami CSQT-2 ląsteles Luc2 reporterio genu, mes realiu laiku sėkmingai nustatėme ortotropinio naviko susidarymą. Kaip parodyta 3B paveiksle, CSQT-2 ląstelės galėjo generuoti HCC pelėse, kurių imunodeficitas yra silpnas. Tada, norėdami įvertinti metastazavusį CSQT-2 ląstelių potencialą, atlikome intrakardines injekcijas plikoms pelėms ir kaulų bei limfmazgių metastazavusius pažeidimus (3C pav.). Panašiai praėjus 3 savaitėms po CSQT-2 ląstelių injekcijos į blužnį, buvo nustatyta metastazių kepenyse (3D paveikslas). Žinoma, kad PVTT dažnai susijęs su HCC progresavimu. Mūsų tyrimo metu ortotropinis CSQT-2 navikų implantavimas nuogų pelių kepenyse sukūrė PVTT vietas šeimininko portalo venų sistemose (3E pav.). Visa tai, kas pasakyta, parodė, kad CSQT-2 ląstelės pakartoja klinikinius piktybinio HCC požymius.

Image

CSQT-2 ląstelių linijos in vivo tyrimas. ( A ) CSQT-2 naviko augimas po oda. 100 000, 10 000 arba 1000 CSQT-2 ląstelių buvo pasėjamos ant nuogų pelių šonų. Kiekvienoje grupėje buvo naudojamos trys pelės, turinčios skirtingą ląstelių skaičių. ( B ) Ortotropinis CSQT-2 naviko, pažymėto luciferaze, augimas. CSQT-2 ląstelės, pažymėtos luciferaze, pirmiausia buvo įšvirkštos į nuogų pelių šoną. Pasirodžius poodiniam navikui, jis buvo surinktas ir pasėtas šviežių nuogų pelių kepenyse. Ortotropinis naviko augimas buvo matuojamas nustatant luciferazės aktyvumą IVIS sistema. ( C ) Metastazavęs CSQT-2 naviko augimas širdies injekcijomis. 500 000 CSQT-2 ląstelių buvo įšvirkščiamos į kairią pelių poodį, kad būtų galima metastazuoti. Parodyta metastazė praėjus 4 savaitėms po injekcijos. ( D ) Metastazavęs CSQT-2 naviko augimas injekcijomis į blužnį. 500 metrų CSQT-2 ląstelių buvo įšvirkštos į nuogų pelių blužnį metastazavimui. Parodyta metastazė praėjus 4 savaitėms po injekcijos. ( E ) PVTT, suformuotas iš CSQT-2 ortotropinio naviko. Pelės kepenys, esančios ( B ), buvo surinktos fiksacijai ir H&E dažymui, kad būtų galima nustatyti, ar nesiformuoja PVTT. Parodytos trys tipiškos PVTT sekcijos.

Visas dydis

Naviko inicijuojančių ląstelių žymenų raiškos CSQT-2 nustatymas

Buvo pranešta, kad HCC tikriausiai atsirado iš kelių vėžio ląstelių, kurios ekspresuoja tam tikrus naviką inicijuojančius (TIC) žymenis, tokius kaip CD133, CD90 ir EpCAM. Nustatyta, kad ankstyvuosiuose pasažuose nedidelė pirminių CSQT-2 ląstelių dalis ekspresuoja CD133, tuo tarpu CD133 teigiamų ląstelių (4A paveikslas) arba CD90 ląstelių (4B paveikslas) nebuvo galima aptikti po 30 ir daugiau fragmentų. Priešingai nei CD133 ir CD90 ekspresija, EpCAM pozityvumas CSQT-2 ląstelėse dramatiškai padidėjo gavus daugiau praėjimų (4C pav.).

Image

Naviką inicijuojančios ląstelės žymeklio CSQT-2 ekspresija. CD133, CD90 ir EpCAM ekspresija buvo patikrinta per FACS tiek P5, tiek P60 kartos CSQT-2.

Visas dydis

Su metastazėmis susijusių genų identifikavimas CSQT-2

Vėžinės metastazės yra sudėtingas procesas, kurį palengvina nenormalus su metastazėmis susijusių genų, tokių kaip ląstelių dauginimasis, apoptozė ir migracija, raiška. EGFR buvo dramatiškai per daug ekspresuotas CSQT-2 ląstelėse, o tai gali prisidėti prie greito naviko augimo (5A ir C paveikslai). Akt, pagrindinis ląstelių išgyvenimo reguliatorius, taip pat buvo hiperfosforilintas CSQT-2 ląstelėse (5C pav.), Kas greičiausiai paskatino apoptozės slopinimą. Atsižvelgiant į Akt hiperaktyvaciją, cIAP1 ekspresija taip pat buvo sureguliuota CSQT-2 ląstelėse. HGF – cMet kaskados turėjo didelę reikšmę kontroliuojant HCC ląstelių proliferaciją ir metastazes. Mes nustatėme, kad cMet ekspresija buvo tokia pati kaip MHCC97-H ląstelių (5B pav.). Be to, mes išbandėme kitus su metastazėmis susijusius genus, tokius kaip uPAR ir kai kuriuos Integrinus. Iš viso buvo nustatyta, kad daugelis kitų su metastazėmis susijusių genų rodo CSQT-2 ląstelių disreguliaciją (5 pav.).

Image

CSQT-2 ląstelių linijos su metastazėmis susijusi genų ekspresija. ( A ) ir ( B ) tiek MHCC97-H, tiek CSQT-2 ląstelės buvo surinktos RNR gryninti, o po to RT – PGR, nukreiptos į EGFR, cIAP1, Met, uPAR, ITB5 ir β- aktiną. ( C ) Ląstelės buvo surinktos dėl Western blot analizės, norint nustatyti EGFR ir fosforilintą Akt baltymą.

Visas dydis

CSQT-2 ląstelių linijos kariotipas

Naudodamiesi G juostų dažymo technologija, mes išanalizavome CSQT-2 ląstelių linijos kariotipą, norėdami nustatyti anomalijas tiek skaičiumi, tiek struktūra (6 paveikslas). Chromosomų skaičius šioje ląstelių linijoje svyravo nuo 58 iki 73, o mediana buvo 67. Bent trys reikšmingi anomalijos, pridėkite (3) (qter → pter ::?), Der (4) t (qter → zp14 ::? ) ir pridėkite (19) (qter → pter ::?) buvo randami visada visose ląstelėse (30/30). Be to, dar du variantai, pridėkite (15) (? :: pter → q24 ::?) ir pridėkite (18) (pter → qter ::?) Rasta daugumoje ląstelių (29 iš 30). Kai kurie kiti pakeitimai, 1pter → p12 :: 16qter → pter, pridėti (2) (qter → pter ::?) Ir pridėti (7) (? :: pter → qter ::?), Taip pat buvo randami dažnai (1 ir 2 lentelės) ).

Image

CSQT-2 ląstelių linijos kariotipo analizė (60 ištrauka). CSQT-2 ląstelių linijos kariotipas, susijęs su skaičiaus ir struktūros anomalijomis 60 eisenoje.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Metastazių prevencija ir veiksminga kontrolė yra labai svarbios HCC terapijai, todėl būtina tobulinti supratimą apie HCC progresavimo ir metastazių molekulinius mechanizmus (Tang ir kt., 2004; Wang ir kt., 2009). Kadangi PVTT susidarymas yra dažnas HCC metastazių atvejis, pagrįstai ir verta atlikti su PVTT susijusio HCC tyrimus. Pavyzdžiui, nors reikšmingas ryšys tarp PVTT susidarymo ir HCC metastazių yra gerai dokumentuotas daugelyje grupių, ar PVTT susidarymas prisideda prie intrahepatinės, ar tolimos HCC metastazės, vis dar nežinoma (Qiu ir kt., 2008). Taip pat įmanoma, kad PVTT yra tik HCC metastazių pasekmė (Aldrighetti ir kt., 2009; Matsumoto ir kt., 2009). Kitas įdomus klausimas yra tai, kuo PVTT ląstelės skiriasi nuo pirminių protėvių, ar jos skiriasi nei pirminės HCC ląstelės (Chen ir Huang, 2005). Tačiau, jei tinkamo ląstelių modelio nėra, šiuos klausimus ištirti labai sunku.

Mūsų žiniomis, CSQT-2 yra pirmoji HCC vartų venų naviko trombo kilmės ląstelių linija, pasižyminti palyginti dideliu metastazavimo potencialu. Dar svarbiau, kad ši ląstelių linija po ortotropinės inokuliacijos galėjo generuoti PVTT nuogas peles. Tai, kad CSQT-2 sugeba generuoti PVTT, labai palengvina mūsų PVTT progresavimo tyrimus. Dar svarbiau, kad tai leido mums ištirti, ar PVTT susidaro prieš ekstravaskulinę metastazę, o tai galėtų parodyti PVTT reikšmę. Be to, galėtume ištirti, ar užkertant kelią PVTT susidarymui įtaką turi ekstravaskulinės HCC metastazės. Be to, kaip gerai žinoma, vėžio kamieninių ląstelių teorija tvirtina, kad vėžio masę sudaro palyginti maža viso naviko dalis, vadinama vėžio kamieninėmis ląstelėmis arba TIC (Guglielmi ir kt., 1998; Bansal ir Banerjee, 2009). ; Kawasaki ir kt., 2009; Tu ir kt., 2009). Ankstesniuose HCC TIC tyrimuose nustatyta, kad mes galime atskirti arba praturtinti HCC TIC naudodami specifinį dažymą ląstelių paviršiaus žymenims, tokiems kaip CD133, CD90 ir EpCAM (Yang ir kt., 2008a, 2008b; Yamashita ir kt., 2009; Yeh ir kt., 2009). ; Yoshikawa ir kt., 2009; Zhu ir kt., 2009). Įdomu, kad CSQT-2 ląstelių linija neparodė teigiamo CD133 ar CD90, net jei atitinkamose pirminėse ląstelėse buvo akivaizdžių CD133 ir CD90 teigiamų pogrupių, tai leido manyti, kad šie du žymenys mūsų ląstelių linijoje gali būti ne tokie svarbūs. Keista, bet visa CSQT-2 ląstelių populiacija ląstelių linijoje buvo teigiama EpCAM. Tai gali paaiškinti stiprų CSQT-2 ksenografinį sugebėjimą nuogoms pelėms (Yamashita ir kt., 2008). Be to, toks stebėjimas taip pat iškėlė galimybę, kad TIC žymeklio išraiška gali skirtis tarp pirminių ir portalinių venų invazinių HCC ląstelių. Jei tai bus patvirtinta, tai neabejotinai pakeis mūsų vėžio kamieninių ląstelių teorijos aiškinimą ir mes galime nustatyti HCC ląstelių liniją iš pirminės HCC ir suporuotos PVTT ląstelių linijos. Kai mums pasiseks, bus galima palyginti šių dviejų tipų ląstelių linijų skirtumus ir panašumus, tai ne tik praplės mūsų žinias apie HCC ir PVTT progresą, bet ir leis ištirti mechanizmą, per kurį HCC gali progresuoti iki PVTT.

Pokyčių istorija