Chlorokinas slopina žmogaus cd4 + t-ląstelių aktyvaciją ap-1 signalo moduliacija | mokslinės ataskaitos

Chlorokinas slopina žmogaus cd4 + t-ląstelių aktyvaciją ap-1 signalo moduliacija | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Imuninės sistemos slopinimas
  • Limfocitų aktyvacija
  • Signalo perdavimas

Anotacija

Chloroquinas (CQ) yra plačiai naudojamas kaip priešuždegiminis reumatinių ligų gydymas. Nors jo veikimo būdai įgimtai imuninei sistemai yra gerai aprašyti, vis dar nėra pakankamai žinių apie tiesioginį jo poveikį įgimtajai imuninei sistemai. Taigi, mes įvertinome CQ įtaką žmogaus CD4 + T ląstelių aktyvacijos parametrams. CQ tiesiogiai slopino T ląstelių proliferaciją, metabolinį aktyvumą ir citokinų sekreciją po anti-CD3 / anti-CD28 aktyvacijos. Priešingai, CQ neturėjo jokio poveikio T-ląstelių aktyvacijos žymenų padidintam reguliavimui. CQ slopino visų T pagalbinių ląstelių pogrupių aktyvaciją, nors Th2 ląstelių IL-4 ir IL-13 sekrecija buvo mažiau paveikta, palyginti su kitais Th specifiniams citokinais. Iki 10 μM CQ nesumažino ląstelių gyvybingumo, ir tai rodo specifinį slopinamąjį poveikį T ląstelėms. Šios AK savybės buvo visiškai atkuriamos pakartotinės stimuliacijos eksperimentuose. Intraląstelinio signalo analizė parodė, kad CQ specifiškai slopina autofaginį srautą ir papildomai aktyvina AP-1, mažindamas c-JUN fosforilinimą. Šis poveikis buvo susijęs su JNK katalizinio aktyvumo slopinimu. Apibendrinant, mes apibūdinome selektyvų ir grįžtamą CQ imunomoduliacinį poveikį žmogaus CD4 + T ląstelėms. Šie atradimai suteikia naujų įžvalgų apie JNK / AP-1 signalizacijos biologinius veiksmus T ląstelėse ir gali padėti išplėsti terapinį AK spektrą.

Įvadas

Priešmaliariniai vaistai chloroquine (CQ) ir hydroxy-chloroquine (HCQ) yra ligą modifikuojantys vaistai nuo reumatų (DMARD) 1, 2, kurie yra naudojami reumatinių ir jungiamojo audinio ligų, įskaitant sisteminę raudonąją vilkligę ir reumatoidinį artritą, gydyti. 3, 4, 5 . Ypač pacientams, sergantiems metotreksato (MTX) nepakankamumu, CQ arba HCQ derinio su MTX veiksmingumas yra panašus kaip ir MTX derinio su biologiniais vaistais 6, 7 . Be to, šie 4-aminochinolino dariniai turi gerą vaistų saugumo profilį, o pagrindinis nepageidaujamas reiškinys yra tinklainės toksiškumas.

Imunosupresinis CQ stiprumas daugiausia priskiriamas jo kaip silpnos lipofilinės bazės savybėms, kurios labai praturtina rūgštines tarpląstelines pūsleles, tokias kaip lizosomos. Ši lizosomotropinė kinetika lemia daugybės procesų, turinčių įtakos imuninių ląstelių funkcijoms, moduliavimą. Pirmiausia, endolizosomų rūgštingumas labai sumažina monocitų ir dendritinių ląstelių antigeno perdirbimo pajėgumus ir taip slopina antigeno pateikimą į CD4 + T-ląsteles 8, 9, 10 . Taikant panašius mechanizmus, CQ taip pat sumažina tarpląstelinių į ląstelę panašių receptorių signalizaciją 11, 12 . Be to, lizosominis CQ kaupimas slopina autofagijos procesus, o tai taip pat gali prisidėti prie imunomoduliacinių CQ 13, 14 savybių. Adaptyvioji imuninė sistema ir ypač T ląstelės yra kritiškai svarbios reumatinių ir jungiamojo audinio ligų patogenezėje 15 . Taigi teigiamą CQ poveikį taip pat galima priskirti tiesioginiam T ląstelių moduliavimui. Pažymėtina, kad mažai įrodymų apie tiesioginį AK poveikį T-ląstelių funkcijai 16 . Sumažėjęs limfocitų proliferacija ir IL-2 mRNR gamyba CQ paveiktose T ląstelėse pirmą kartą buvo aprašyti sėkliniais tyrimais 17, 18 . Molekuliniu lygmeniu buvo pranešta, kad pelių timocitai ir žmogaus Jurkat T ląstelių linija slopina kalcio signalus chlorokvinu 19, 20 . Tačiau metodologiniai skirtumai, įskaitant įvertintus ląstelių tipus, išmatuotus parametrus ir ypač naudojamas CQ koncentracijas, neleidžia daryti aiškios išvados, o vis dar trūksta išsamios tiesioginio AK poveikio CD4 + T ląstelėms apžvalgos.

Taigi mes įvertinome CQ poveikį T-ląstelių funkcijos parametrams, įskaitant proliferaciją, citokinų sekreciją, autofagiją ir gyvybingumą. Be to, pagrindiniai T-ląstelių aktyvacijos keliai buvo tiriami naudojant Jurkat reporterio ląstelių linijas, tarpląstelinio srauto citometriją, imunoblotus ir specifinius fosfo-baltymams ELISA bei in vitro kinazės tyrimus.

Rezultatai

CQ poveikis CD4 + T-ląstelių aktyvacijai

Tiriant timidino įsiskverbimą, CQ slopino T-ląstelių proliferaciją priklausomai nuo dozės. Reikšmingas proliferacijos sumažėjimas jau buvo nustatytas esant 0, 6 μM CQ (0, 52 ± 0, 17 normalizuotas CQ proliferacijos greitis, p <0, 001; 1A pav.) Ir pasiekė 0, 15 ± 0, 09 esant 10 μM CQ. Ši išvada buvo patvirtinta antruoju proliferacijos tyrimu, naudojant praskiestą fluorescencinių ląstelių proliferacijos trackerį (1 pav. B). IL-2 sekrecija, atspindinti ankstyvą aktyvacijos rodmenį, taip pat buvo sumažinta pradedant nuo 2, 5 μM CQ (p = 0, 041, 1 pav. C). Priešingai nei aprašyti aukščiau, TQ ląstelių aktyvavimo žymenų CD25, CD69 ir CD71 padidėjimas nebuvo slopinamas CQ (1D – F pav. Ir papildomas I paveikslas). CD71 atveju galima pastebėti nedidelio padidėjusio reguliavimo tendenciją, kuri buvo ryškesnė esant didelėms koncentracijoms, tačiau statistinio reikšmingumo nepasiekė (10 μM CQ: 1, 48 ± 0, 2; p = 0, 173).

Image

Žmogaus CD4 + T ląstelės buvo iš anksto inkubuotos su nurodytomis CQ koncentracijomis ir suaktyvintos anti-CD3 / anti-CD28 antikūnais. ( A ) timidino inkorporacijos tyrimų rezultatai; duomenys parodo vidutinį ± SD iš vieno reprezentatyvaus donoro trijų egzempliorių kultūrų (n = 6) ( B ) Normalizuoti dalijimosi rodikliai praėjus 96 valandoms po aktyvavimo iš CPD skiedimo eksperimentų (n = 6) ( C ) Normalizuotos IL-2 sekrecijos vertės iš supernatantų 24 val. po aktyvacijos (n = 6) ( D - F ) Normalizuota CD25 ( D ), CD69 ( E ) ir CD71 ( F ) raiška praėjus 24 valandoms po aktyvavimo (n = 4). ( B - F ) Duomenys rodo vidutinį ± SD, normalizuotą pagal atitinkamo donoro terpę be vaistų (0 μM). * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001.

Visas dydis

CQ poveikis aktyvuotų CD4 + T-ląstelių gyvybingumui ir pakartotiniam stimuliavimui

Iki 10 μM koncentracijos CQ nepaveikė aktyvuotų T ląstelių gyvybingumo (p = 0, 127). Pradėjus nuo 20 μM CQ, pastebėtas reikšmingas T-ląstelių gyvybingumo sumažėjimas (normalizuotas vidurkis: 0, 88; p = 0, 003), kuris dar sumažėjo iki 0, 29 ± 0, 10 esant 100 μM CQ (p <0, 001; 2A pav., B). Ilgalaikė CQ įtaka T-ląstelių funkcijai buvo modeliuojama pakartotiniais stimuliavimo eksperimentais su T ląstelėmis, iš anksto išaugintomis CQ septynias dienas. Kaip aprašyta aukščiau (1A pav., B), pirminės stimuliacijos metu rastas nuo dozės priklausomas nuo TQ ląstelių proliferacijos slopinimas. Priešingai, T ląstelės visiškai reagavo po antrinės stimuliacijos, nepriklausomai nuo pirmojo stimuliavimo metu panaudotos CQ koncentracijos (2 pav. C).

Image

CD4 + T ląstelės buvo suaktyvinamos, esant arba nenurodžius (terpės) nurodytų CQ koncentracijų, ir suaktyvintos anti-CD3 / anti-CD28 antikūnais. Po 72 valandų ląstelių gyvybingumas buvo išmatuotas aneksinu V (x ašis) ir propidium jodidu (y ašis) dažant. ( A ) Vieno donoro reprezentaciniai taškai. Skaičiai nurodyti gyvybingų (aneksinas V - / PI - ) ląstelių procentas. B ) Sukaupti aštuonių sveikų donorų duomenys. ( C ) CD4 + T-ląstelės buvo suaktyvinamos, esant arba nebuvo (0 μM) nurodytų CQ koncentracijų, ir timidino įsiskverbimas buvo išmatuotas po 96 valandų (juodos juostos). Po septynių dienų CQ buvo pašalintas, o ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos dar 96 valandoms terpėje, kurioje nėra CQ (baltos juostos). Duomenys parodo vidutinį + SD iš trijų reprezentatyvaus donoro kultūrų pasikartojimų (n = 5). *** p <0, 001.

Visas dydis

CQ poveikis metaboliniam aktyvumui

T-ląstelių aktyvaciją lydi dideli metabolizmo pokyčiai, įskaitant padidėjusį mitochondrijų kvėpavimą ir anaerobinę glikolizę, kurią galima išmatuoti atitinkamai naudojant deguonies sunaudojimo greitį (OCR) ir tarpląstelinio rūgštėjimo laipsnį (ECAR) 21 . Remiantis aukščiau aprašytais aktyvavimo parametrais, 5 μM arba 10 μM CQ poveikis taip pat reikšmingai slopino bazinio OCR padidėjimą (atitinkamai p = 0, 034 ir p = 0, 002) ir ECAR (p = 0, 025, p = 0, 011, pav.). 3A) po suaktyvinimo. Buvo rastas tiesinis OCR / ECAR santykio sumažėjimas, rodantis, kad CQ panašiu mastu paveikė mitochondrijų kvėpavimą ir anaerobinę glikolizę. Norėdami tiksliau apibrėžti CQ įtaką mitochondrijų kvėpavimui, atlikome testavimo nepalankiausiomis sąlygomis analizę, kurioje nuoseklus ATP jungiamojo reagento oligomicino, elektronų perdavimo grandinės atjungimo reagento FCCP ir mitochondrijų inhibitorių rotenono / antimicino A pridėjimas leidžia išpjaustyti mitochondrijų kvėpavimo parametrus. kaip ATP apykaitos greitį, atsarginį ir maksimalų kvėpavimo dažnį bei ne mitochondrinį kvėpavimą. Šie eksperimentai atskleidė, kad CQ paveiktose T ląstelėse sumažėjo ATP apykaitos greitis ir maksimalus kvėpavimo pajėgumas (p <0, 05 kiekvienoje; 3B pav.).

Image

CD4 + T ląstelės buvo suaktyvinamos esant arba nenurodžius (terpės) nurodytų CQ koncentracijų, ir buvo aktyvuotos anti-CD3 / anti-CD28 antikūnais arba paliktos be stimuliavimo. Po 48 valandų buvo išmatuotas tarpląstelinio rūgštėjimo greitis (ECAR; atspindi anaerobinę glikolizę) ir deguonies sunaudojimo greitis (OCR; atspindi mitochondrijų kvėpavimą). ( A ) vieno reprezentatyvaus donoro vidurkis ± SD (n = 5); ( B ) mitochondrijų streso testas; Nurodytais laiko momentais (rodyklėmis) buvo pridėta ATP jungiamojo reagento oligomicino, elektronų perdavimo grandinės atjungimo reagento FCCP ir mitochondrijų inhibitorių rotenono / antimicino A. Duomenys parodo vidutinį ± SD iš vieno reprezentatyvaus donoro keturženklių kultūrų (n = 5).

Visas dydis

CQ citokinų sekrecijai bendras T ląstelių ir Th pogrupių poveikis

Galimas Th specifinis AK poveikis buvo įvertintas analizuojant citokinų sekrecijos profilį. Efektoriaus citokinų lygiai be pogrupio specifiškumo (TNF-α: 0, 62 ± 0, 18, IL-10: 0, 30 ± 0, 15, normalizuotas vidurkis ± SD), taip pat iš Th1 gauti (IFN-γ: 0, 38 ± 0, 15, normalizuotas vidurkis) ir Th17- Gauti (IL-17: 0, 32 ± 0, 06) citokinai buvo stipriai sumažėję 10 μM CQ. Priešingai, Th2 citokinų slopinimas nebuvo toks ryškus (IL-4: 0, 59 ± 0, 20, IL-13: 0, 63 ± 0, 13, 4A pav.). Atitinkamai, esant 5 μM CQ, IL-4 ir IL-13 sekrecijos slopinimo nerasta, tuo tarpu visi kiti išmatuoti efektoriniai citokinai buvo reikšmingai slopinti (4A pav. Ir 1 lentelė).

Image

Bendros CD4 + T ląstelės arba FACS rūšiuotos T pagalbinės ląstelės buvo veikiamos nurodytomis CQ arba CQ neturinčios terpės koncentracijomis ir aktyvuotos anti-CD3 / anti-CD28 antikūnais. Po 72 valandų buvo išmatuotas nurodytų citokinų supernatanto lygis. ( A ) Supernatanto koncentracijos iš visų CD4 + T ląstelių. Duomenys rodo vieno reprezentatyvaus donoro pakartotinių matavimų vidutines vertes (n = 8). ( B ) Normalizuota FACS išrūšiuotų Th1 (CD4 + CD45RO + CXCR3 + ), Th2 (CD4 + CD45RO + CCR6 - CCR4 + ) ir Th17 (CD4 + CD45RO + CCR6 + CCR4 + ) ląstelių sekrecija. Duomenys rodo vidutinį + SD iš keturių sveikų donorų. ( C ) normalizuotas FACS rūšiuotų Th1, Th2 ir Th17 ląstelių proliferacija, matuojant [3H] -timidino inkorporavimu. Duomenys rodo keturių sveikų donorų vidurkį ± SD. ns nereikšmingas; ** p <0, 05; ** p <0, 01.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Norėdami išsamiau apibrėžti šį poveikį, mes FACS rūšiavome Th1, Th2 ir Th17 ląsteles (grynumas:> 95%) pagal jų labai specifinius chemokino receptorių ekspresijos profilius (papildomas II paveikslas). Kaip aukščiau, CQ stipriai sumažino IF1-γ sekreciją Th1 ląstelėse ir IL-17 sekreciją Th17 ląstelėse (4B pav.). IL-4 ir IL-13 sekrecija Th2 ląstelėmis pastebimai sumažėjo esant 10 μM CQ, tuo tarpu 5 μM CQ poveikis šiems citokinams paveikė mažesnį laipsnį. Priešingai, IL-5 lygis iš Th2 ląstelių jau buvo reikšmingai sumažėjęs esant 5 μM CQ (0, 51 ± 0, 14; p = 0, 041), o poveikis dar ryškesnis esant 10 μM CQ (0, 20 ± 0, 05; p = 0, 002, pav.). 4B). Tačiau visų Th pogrupių dauginimąsi vienodai slopino CQ (4 pav. C).

AK poveikis autofagijai

Nustatę, kad CQ tiesiogiai slopina T-ląstelių aktyvacijos parametrus, mes siekėme nustatyti pagrindinius molekulinius veikimo būdus. Kaupiami įrodymai rodo, kad autofagijos procesai vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant T-ląstelių aktyvaciją 13, 14 . Atsižvelgdami į gerai aprašytą autofaginio srauto slopinimą CQ, mes įvertinome CQ įtaką T-ląstelių autofagijai 13 . Tuo tikslu CD4 + T-ląstelės buvo nudažytos fluorescenciniu žymikliu, kuris selektyviai praturtina autofagines pūsleles ir taip leidžia jas jautriai ir selektyviai aptikti 22 . Pažymėtina, kad po anti-CD3 / anti-CD28 aktyvavimo buvo pastebėtas nedidelis signalo silpnėjimas, kuris gali rodyti padidėjusį autofaginį srautą. Per pirmąsias keturias valandas po T-ląstelių aktyvavimo nebuvo pastebimas reikšmingas CQ poveikis šiam procesui (5A pav., B). Praėjus šešioms valandoms po aktyvavimo, pastebėtas padidėjęs fluorescencinio žymiklio kaupimasis CQ paveiktose T ląstelėse, palyginti su T ląstelėmis, aktyvuotomis paprastoje terpėje (vidurkis 137 ± 11 vs 80 ± 9; p = 0, 027), rodantis, kad padidėjo autofaginės pūslelės dėl autofagosomų apykaitos slopinimo. Šis poveikis išryškėjo vėlesniais laiko momentais po T-ląstelių aktyvacijos (5 pav. B). Kartu atlikta IL-2 mRNR lygio analizė, rodanti ankstyvą T ląstelių aktyvaciją, parodė, kad CQ slopinamasis poveikis buvo didesnis už jo įtaką autofagijai. Žymus IL-2 gamybos slopinimas CQ buvo nustatytas jau po keturių valandų po T-ląstelių aktyvacijos (p = 0, 026, 5 pav. C). Taigi, mes hipoteze, kad, be savo autofagiją slopinančių savybių, CQ gali tiesiogiai slopinti tarpląstelinius signalizacijos kelius, kurie aktyvina IL-2 promotorių.

Image

( A ) CD4 + T-ląstelės buvo suaktyvinamos, esant 10 μM CQ arba neturint (terpės). Nurodytais laiko momentais FACS išmatuotas katijoninių amfifilinių atsekamųjų dažų (Cyto-ID dažų) įsiskverbimas. Juodoji linija: stimuliuotos ląstelės, pilkos spalvos užpildytos histogramos: nestimuliuotos ląstelės. Skaičiai diagramoje rodo vidutinį fluorescencijos intensyvumą. Parodytas vienas reprezentacinis eksperimentas. ( B ) Kaupiami duomenys (vidurkis ± SD) iš „Cyto-ID FACS“ analizės iš trijų nepriklausomų eksperimentų su ląstelėmis, suaktyvintomis, kai nėra (kvadratų) ar nėra (apskritimų) 10 μM CQ. ( C ) IL-2 mRNR lygis iš CD4 + T-ląstelių, suaktyvinamas, kai nėra (kvadratų) arba nėra (apskritimų) 10 μM CQ. Duomenys rodo vidutinį ± SD (n = 3), palyginti su raukšlių lygiais, palyginti su nestimuliuotomis ląstelėmis (porinis mėginys t-testas). ns nereikšmingas, * p <0, 05; ** p <0, 01.

Visas dydis

CQ poveikis tarpląsteliniam signalizavimui

Pirmame etape mes įvertinome pagrindinius tarpląstelinius signalinius mazgus, kurie suveikia po T-ląstelių aktyvacijos. CQ nepakeitė MAP-kinazių ERK ir p38, taip pat mTOR paskesnio taikinio S6RP fosforilinimo (p-reikšmių diapazonas: 0, 344 -> 0, 999, 6A pav.), Tai rodo, kad TCR proksimaliniai signalizacijos įvykiai ir mTOR signalizacija neturi įtakos . Todėl mes analizavome trijų kardinalių transkripcijos faktorių NFAT, NF-κB ir AP-1 būseną, naudodami Jurkat reporterio ląsteles, ekspresuojančias bet kurį GFP reporterio konstrukciją, kontroliuodami atitinkamus promotoriaus elementus 23 . Kai koncentracija labai slopina pirminių T ląstelių aktyvaciją (5 μM ir 10 μM), CQ nepakeitė NFAT ir NF-κB signalizacijos šiose Jurkat reporterio ląstelėse (6 pav. B). Atvirkščiai, AP-1 reporterio veiklos reguliavimas buvo nuosekliai nustatomas po CQ poveikio. Esant 10 μM CQ, šis slopinimas sudarė 32, 7%, palyginti su ląstelėmis, aktyvuotomis be CQ terpėje (p <0, 001). Panašus poveikis buvo pastebėtas ir naudojant neseniai aprašytą trigubą parametrą Jurkat reporterio 24 ląstelių linija (duomenys nepateikti).

Image

( A ) CD4 + T-ląstelės buvo suaktyvinamos, esant arba neturint (terpės) nurodytų CQ koncentracijų. Po 24 valandų S6RP fosforilinimas, P38 ir ERK buvo išmatuotas FACS. Juodoji linija: nestimuliuotos ląstelės, pilkos histogramos: stimuliuotos ląstelės. Skaičiai rodo teigiamų ląstelių procentą (S6RP) arba vidutinį fluorescencijos intensyvumą (p38 ir ERK). Parodytas vienas tipinis eksperimentas (n = 6). ( B ) Jurkat T ląstelės, ekspresuojančios arba NFAT :: GFP (kairysis stulpelis), NF-κB :: GFP (vidurinė skiltis) arba AP-1 :: GFP (dešinė skiltis) reporterio konstruktas, buvo aktyvuotos anti-CD3 / CD80 ekspresuojančios T-ląstelių stimuliatorius, esant arba neturint (terpės) CQ. Po 24 valandų FACS išmatuota GFP ekspresija kaip promotoriaus aktyvumo rodmuo. Juodoji linija: nestimuliuotos ląstelės, pilkos histogramos: stimuliuotos ląstelės. Skaičiai rodo teigiamų ląstelių procentą. Parodytas vienas tipinis eksperimentas (n = 6).

Visas dydis

CQ poveikis AP-1 aktyvacijai pirminėse CD4 + T ląstelėse

Atsižvelgiant į selektyvų CQ slopinamą AP-1 signalizavimą Jurkat T ląstelėse, mes papildomai įvertinome šį poveikį pirminėse CD4 + T ląstelėse. Pagrindiniai AP-1 aktyvavimo T-ląstelėse mechanizmai yra c-JUN fosforilinimas JNK 25, taip pat c-FOS indukcija per ERK-ELK-1 kelią 26, 27 . Taigi buvo įvertinti bendrieji c-JUN ir c-FOS lygiai bei c-JUN fosforilinimas. Tvirtas c-JUN fosforilinimas Ser73 buvo pastebėtas praėjus 2 valandoms po T-ląstelių aktyvacijos terpėje, kurioje nėra QQ, ir pasiekė piką po 4–6 valandų. Priešingai, per 2 valandas po aktyvavimo C-JUN ląstelėse nebuvo galima aptikti c-JUN fosforilinimo, o vėlesniais laikais buvo galima aptikti tik nedidelį signalą. Priešingai nei fosfo-baltymų lygiai, CQ poveikio bendram baltymų c-JUN ir c-FOS lygiui nepastebėta (7A pav. Ir I papildomoji lentelė). Norėdami patvirtinti šiuos pastebėjimus, toliau atlikome specifinį fosfo-JUN ELISA. C-JUN fosforilinimas žymiai sumažėjo CQ paveiktų T-ląstelių lizatuose, palyginti su T-ląstelių lizatais, aktyvuotais be CQ terpėje (normalizuotas vidurkis 0, 59 ± 0, 19, p = 0, 009) (7B pav.). Kadangi c-JUN fosforilinimas daugiausia susijęs su JNK kinazės aktyvumu, mes taip pat išmatuojome JNK fosforilinimo būklę imunoblotu. Tačiau JNK fosforilinimas neturėjo įtakos CQ (7 pav. C). Atitinkamai padarėme išvadą, kad CQ gali slopinti JNK katalizinę funkciją signalo perdavime po aktyvavimo. Norėdami patvirtinti šią hipotezę, mes atlikome kinazės testą in vitro, išmatuodami c-JUN fosforilinimą rekombinantiniu aktyviu JNK1. CQ pridėjimas stipriai sumažino JNK1 katalizinį aktyvumą koncentracijos intervale, kuris randamas pacientų, kuriems taikoma standartinė terapija, limfocituose 28 . JNK aktyvumas buvo visiškai panaikintas esant 1 mM CQ (aktyvumas <1%; p <0, 001; 7D pav. Ir papildomas III paveikslas) ir net esant 1 μM CQ, 87, 1% sumažėjo c-Jun fosforilinimas, tai rodo, kad CQ veikia kaip labai stiprus JNK1 katalizinio aktyvumo inhibitorius.

Image

( A ) CD4 + T-ląstelės buvo aktyvuotos, esant nurodytam laikui, kai nebuvo arba nebuvo (terpės; M) 10 μM CQ. C-JUN (Ser73) fosforilinimas, taip pat visi c-JUN ir c-FOS lygiai buvo analizuojami imunobotologiniu būdu. Aktino ekspresija buvo krovimo kontrolė. Pavaizduotas vienas tipinis eksperimentas (n = 3). Pristatymui buvo apkarpytos skirtingos to paties gelio ekspozicijos. ( B ) c-JUN (Ser73) fosforilinimo analizė ELISA metodu. T-ląstelės buvo suaktyvinamos, esant 4 μm 10 μM CQ arba neturint (terpės). Kiekvienai būklei buvo apskaičiuotas santykis tarp bendro baltymo signalo ir fosfo-baltymo signalo (kairiajame skydelyje). Duomenys rodo vidutinį + SD, gautą iš vieno reprezentatyvaus donoro, atlikto keturių procentų matavimų. Dešinysis skydelis, normalizuotas c-JUN fosforilinimo indukcija atėmus nestimuluotų ląstelių reikšmes. Sukaupti keturių donorų duomenys. ( C ) CD4 + T-ląstelės buvo suaktyvinamos, esant nurodytiems laiko momentams, kai nebuvo arba nebuvo (terpės; M) 10 μM CQ. JNK fosforilinimas (Thr183 / Tyr185), taip pat bendras JNK kiekis buvo išanalizuotas imunobotologiniu tyrimu, pavaizduoti sklypai buvo iškirpti iš to paties gelio. Pavaizduotas vienas tipinis eksperimentas (n = 3). ( D ) Rekombinantinio c-JUN fosforilinimas in vitro rekombinantiniu JNK1, esant arba neturint CQ (1–1000 μM). Fosforilintas c-JUN (Ser73) ir bendras c-JUN buvo aptiktas imunoblotu; pavaizduoti blotai buvo iškirpti iš to paties gelio. Parodytas vienas tipinis eksperimentas (n = 3). * p <0, 05.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes nustatėme naujas imunomoduliacines CQ, labai efektyvaus DMARD, plačiai naudojamo SLE, RA ir kitų jungiamojo audinio ligų gydymui, savybes 3, 4, 5, 6, 7 . Naudojant koncentracijas, imituojančias pacientų, gavusių CQ standartinę terapiją, ląstelių viduje, lygį 28, 29, CQ poveikis slopino įvairius T-ląstelių aktyvacijos parametrus, išskyrus paviršinių molekulių CD25, CD69 ir CD71 ekspresiją. Atsižvelgiant į patofiziologinį Th pogrupių vaidmenį sergant įvairiomis ligomis 30, žinios apie Th pogrupių jautrumą imuninę sistemą slopinančioms medžiagoms gali būti svarbios terapijos tikslais. Šiuo atžvilgiu Th2 citokinų sekrecija buvo mažiau jautri slopinančiam CQ poveikiui, palyginti su Th1 ir Th17 ląstelių citokinų sekrecija. Lygiagrečiomis dozėmis HCQ turėjo panašų poveikį T-ląstelių aktyvacijai (duomenys nepateikti).

Immunomoduliacinis poveikis aktyvacijos sukeltoms T-ląstelių funkcijoms, įskaitant ląstelių proliferaciją, citokinų sekreciją, taip pat ląstelių metabolizmo parametrų padidėjimą, buvo nustatytas esant 0, 6–10 μM CQ, tuo tarpu sumažėjęs ląstelių gyvybingumas buvo pastebėtas veikiant didesnes koncentracijas. Taigi slopinamasis poveikis buvo stebimas esant mažesnei koncentracijai nei ankstesniuose T-ląstelių ir T-ląstelių linijų mechanistiniuose tyrimuose, naudojant 100 μM – 10 mM CQ 19, 20, 31 . Tačiau mūsų naudojamos koncentracijos puikiai imituoja koncentracijas ląstelėse, pasiektas antireumatinės terapijos metu 28, 29 . Taigi, mūsų duomenys turėtų tinkamai apibūdinti moduliacinį pacientų AK sugebėjimą.

Tyrimai, rodantys, kad aktyvuotos T ląstelės kaupia autofagines pūsleles ir autofagijos genų išstūmimas pablogina T ląstelių efektorių funkcijas, parodė galimą ryšį tarp autofagijos ir T ląstelių funkcijų 13, 14 . Kadangi CQ veikia kaip autofaginio srauto inhibitorius, tikėtina, kad šios savybės prisideda prie imunosupresinio poveikio. Iš tiesų, mes nustatėme, kad CQ poveikis padidino autofaginių pūslelių sankaupas T ląstelėse. Pažymėtina, kad lygiagrečios autofagijos ir IL-2 mRNR raiškos analizės, kaip ankstyvosios aktyvacijos rodmenys, parodė, kad slopinantis AK poveikis IL-2 gamybai buvo didesnis nei jo poveikis autofagijai. Todėl mes iškėlėme hipotezę, kad imuninę sistemą slopinanti AK funkcija gali būti ne tik autofaginio srauto slopinimas ir kad AK papildomai veikia signalizacijos kelius, kurie aktyvina IL-2 promotorių.

Šiuo atžvilgiu geriausiai apibrėžti transkripcijos veiksniai yra NFAT, NF-κB ir AP-1, kurie taip pat reguliuoja kitas aktyvuotų T ląstelių efektorines funkcijas 32 . Neseniai išsivysčiusios specifinės Jurkat reporterio ląstelių linijos leidžia nustatyti manipuliacijų įtaką kiekvienam iš aukščiau paminėtų veiksnių 23, 24 . Naudojant šias priemones, buvo stebimas selektyvus AP-1 signalizacijos slopinimas, o NFAT ir NF-κB signalizacijos nebuvo veikiamos. T-ląstelėse AP-1 aktyvumą daugiausia reguliuoja c-FOS transkripcija ir c-JUN 25, 26, 27 fosforilinimo būsena, kurią pirmiausia fosforilina JNK. Periferinio kraujo T-ląstelių veikimas CQ paliko visiškai nepažeistą c-FOS baltymo indukciją ir JNK fosforilinimą, o c-JUN fosforilinimas žymiai sumažėjo. Remiantis šiais rezultatais, in vitro analizė parodė, kad CQ tiesiogiai slopina rekombinantinio JNK1 fermentinį aktyvumą. Šis poveikis pasireiškė net esant koncentracijai, kuri yra mažesnė už tarpląstelinį lygį, pasiekiant įprastą gydymą. Atsižvelgiant į cheminę 4-amino-chinolino CQ struktūrą, mūsų pastebėjimai atitinka JNK inhibitorių, turinčių pakeistą chinolino struktūrą 33, aprašymą. Signalizacijos keliuose slopinanti CQ funkcija atrodo tik AP-1, nes kiti svarbūs signalizacijos mazgai, tokie kaip MAP kinazės ERK ir p38, taip pat mTOR kelias, nebuvo pakeisti.

Mūsų tyrimo rezultatai suteikia naujų įžvalgų apie pagrindinį JNK / AP-1 signalizacijos biologinį poveikį T-ląstelių funkcionalumui. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita apie pirmines žmogaus T-ląsteles, nurodančias, kad ląstelių paviršiaus aktyvacijos žymenų padidėjęs reguliavimas gali būti skirtingai reguliuojamas nuo kitų T-ląstelių aktyvacijos parametrų, įskaitant proliferaciją, citokinų sekreciją ir ląstelių metabolizmo padidėjusį reguliavimą. Ypač pastarojo reguliavimas CD4 + T-ląstelėse iki šiol nėra visiškai suprantamas ir šiuose procesuose numatomi keli signalizacijos keliai, įskaitant mTOR ir c-Myc. Mūsų duomenys tvirtai rodo, kad JNK / AP-1 signalizacija yra papildomas modulis ląstelių metabolizmo perprogramavimui aktyvuotose T ląstelėse. Be to, šie stebėjimai taip pat sutampa su pastebėjimais, įrodančiais, kad T-ląstelių efektoriaus funkcijas reguliuoja atskiri signalizacijos moduliai CD4 + T-ląstelėse 21, 36 .

Skirtingi Th pogrupiai gali skirtingai panaudoti JNK / AP-1 signalizaciją, kad gautų specifinius efektorinius citokinus. Ypač IL-4 ir IL-13 sekrecija Th2 ląstelėse parodė mažesnį jautrumą CQ slopinimui, o tai rodo mažesnį AP-1 aktyvumo slenkstį šiems procesams. Visų pirma, IL-5 gamyba turėjo didžiausią jautrumą CQ poveikiui, tai rodo, kad IL-5 gamyba Th2 ląstelėse yra skirtingai reguliuojama, palyginti su kitais Th2 citokinais. Šią hipotezę patvirtina tyrimai su pelių Th2 ląstelėmis, kurie rodo, kad AP-1 yra labai svarbus reguliuojant IL-5 gamybą37 . Galiausiai anerginėms T ląstelėms trūksta AP-1 signalinio aktyvumo 38 . Kadangi CQ poveikis buvo grįžtamasis atliekant pakartotinius stimuliavimo eksperimentus, JNK / AP-1 signalizacijos trūkumas T ląstelėse gali būti palaikomas palaikant, bet ne sukeliant anergiją. Taigi, CQ veikia skirtingai nei kitos egzogeninės 39, 40 ir endogeninės 21 imuninę sistemą slopinančios medžiagos, kurios suaktyvindamos sukelia hiporeakcijos ar anergijos būsenas.

Mūsų išvados taip pat gali būti svarbios naujoviškoms klinikinėms reikmėms sergant T ląstelių sukeliamomis ligomis. CQ netoksiškai ir grįžtamai slopina T-ląstelių funkcijas ir stipriai veikia Th1 ir Th17 ląstelių citokinų sekreciją. Atitinkamai, klinikinėmis sąlygomis, kurias sukelia Th1 arba Th17 ląstelės, tokiomis kaip išsėtinė sklerozė ar uždegiminės žarnyno ligos, AK gali turėti potencialą kaip ligą modifikuojantis vaistas 41, 42 . Be to, AK taip pat gali būti taikoma gydant piktybines ligas, kurių AP-1 veikimo būdas yra nereguliuojamas, kaip nustatyta nesmulkialąsteliniame plaučių vėžyje, gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžyje arba 43, 44, 45, 46, 47 . Todėl belieka ištirti, ar AP-1 slopinanti AK potencija prisideda prie veikimo vėžio ląstelėse.

Šiuo atžvilgiu taip pat reikia nustatyti, ar galimas tiesioginis AK poveikis navikinėms ląstelėms yra neutralizuotas tuo pat metu slopinant priešnavikinį imunitetą. Kita vertus, AK gali būti naudingi navikiniai procesai, kuriuos sukelia lėtinis uždegimas. Daugybė klinikinių tyrimų, kuriuose šiuo metu vertinamas AK terapinis poveikis pacientams, sergantiems ateroskleroze, autoimuniniu hepatitu, osteoartritu, taip pat gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu, latakų vėžiu, plaučių vėžiu, glioblastoma ir daugybine mieloma, galėtų padėti išsiaiškinti minėtus klausimus.

Apibendrinant, mes pateikiame išsamią tiesioginio CQ poveikio T-ląstelių aktyvacijai apžvalgą. CQ grįžtamai slopina aktyvacijos sukeltą proliferaciją, metabolinį aktyvumą ir citokinų sekreciją, tuo tarpu aktyvacijos žymenų išraiška neturi įtakos. Molekuliniame lygmenyje JNK / AP-1 signalizacijos slopinimą apibrėžėme kaip naują veikimo būdą, prisidedantį prie imunosupresinių CQ savybių.

Medžiagos ir metodai

Etiniai aspektai, ląstelių izoliacija ir kultūra

Tyrimą patvirtino Vienos medicinos universiteto etikos komitetas (EB Nr. 1381/2014) ir jis buvo atliktas pagal Pasaulio medicinos asociacijos Helsinkio deklaraciją (1964 m., Įskaitant dabartinius pakeitimus). Iš visų tiriamųjų buvo gautas informuotas sutikimas. Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PBMC) buvo išskirtos iš sveikų savanorių, centrifuguojant Ficoll (700 x g, 25 min., RT), ir CD4 + T ląstelės (grynumas> 95%) buvo išskirtos naudojant Magnisort CD4 žmogaus T ląstelių praturtinimo rinkinį ( eBioscience, San Diegas, Kalifornija). Visi funkciniai tyrimai buvo atlikti naudojant IMDM + GlutaMax (GE Healthcare, Piscataway, NJ), papildytą 10% veršienos vaisiaus serumu (GE Healthcare), 15 μg / ml gentamicino ir 1 μg / ml amfotericino B (abu - Sigma Aldrich, Sent Luisas, MO).

Visų tyrimų metu ląstelės buvo inkubuotos su CQ (Sigma Aldrich) 60 minučių ir rezultatai buvo palyginti su ląstelėmis, kurios nebuvo veikiamos CQ. In vitro lygiai buvo pasirinkti mėgdžiojant vaistų ląstelėse koncentracijas, nustatytas pacientams, kuriems buvo taikoma standartinė terapija su 400 mg CQ per parą. 28, 29 . Atliekant visus tyrimus, ląstelės buvo suaktyvinamos anti-CD3 / anti-CD28 dengtomis mikrobriaunutėmis (Invitrogen, Carlsbad, CA), esant ląstelių ir granulių santykiui 2: 1.

Platinimo tyrimai

1 × 105 CD4 + T-ląstelės buvo pasėtos trimis egzemplioriais 96 šulinėlių plokščio dugno plokštelėse ir aktyvuotos veikiant CQ. Po 72 valandų kultūros buvo impulsuojamos [metil-3H] timidinu (1 μCi duobutėje, Perkin Elmer, Bostonas, MA) dar 18 valandų, prieš tai jas apdorojant Packard scintiliacijos skaitikliu (Packard, Meriden, CT) 21, 23 Kai kuriuose eksperimentuose Th1 ląstelės (CD4 + CD45RO + CXCR3 + ), Th2 ląstelės (CD4 + CD45RO + CXCR3 - CCR6 - CCR4 + ) ir Th17 ląstelės (CD4 + CD45RO + CXCR3 - CCR6 + CCR4 + ) 48 buvo išskirtos srauto citometrija ir apdorojami kaip aprašyta aukščiau. Šiems pogrupiams identifikuoti buvo naudojami šie antikūnai: anti-žmogaus CD4 FITC (klonas SK3), CD45RO eFluor450 (klonas UCHL1), CXCR3 PE (klonas CEW33D), CCR6 PerCP-Cy5.5 (klonas R6H1) ir CCR4 APC (klonas). D8SEE; visa eBioscience). Pakartotinės stimuliacijos eksperimentams buvo aktyvuota 1 × 106 CD4 + T ląstelių, esant arba neturint CQ. Po septynių dienų ląstelės buvo surinktos ir gausiai išplautos IMDM be CQ, o 1 x 105 gyvybingos ląstelės buvo pakartotinai pasėtos trimis egzemplioriais. Tada ląstelės buvo aktyvuojamos dar 72 valandas ir buvo matuojamas proliferacija, kaip aprašyta aukščiau.

Kaip antrasis proliferacijos rodmuo, prieš pradedant CQ, CD4 + T ląstelės buvo paženklintos 1, 5 μM eFluor670 ląstelių proliferacijos dažais (eBioscience). Šių tyrimų metu proliferacija buvo matuojama nustatant CPD skiedimą FACS Canto II srauto citometru (BD, Franklin Lakes, NJ). Palyginimui, padalijimo indeksas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę 49 :

Image

Bioenergetiniai tyrimai

OCR (deguonies sunaudojimo laipsnio) ir ECAR (tarpląstelinio rūgštėjimo laipsnio) analizė buvo atlikta naudojant XF24 tarpląstelinio srauto analizatorių (Seahorse Bioscience, Šiaurės Billerica, MA, JAV) 21 . Trumpai tariant, T ląstelės (4 × 106) buvo suaktyvinamos, esant arba neturint (terpės) CQ. Po 48 valandų ląstelės buvo surinktos, vieną kartą perplautos PBS ir pasėtos XF 24 duobučių ląstelių kultūros mikrotinklais (1x106 / duobutėje), iš anksto padengtas Cell-Tak (Seahorse Bioscience) 2 valandas. Ląstelės prieš tyrimą buvo laikomos inkubatoriuje, kuriame nėra CO 2, 37 ° C temperatūroje vieną valandą prieš tyrimą. Nurodytu laiku OCR / ECAR lygis buvo matuojamas tris minutes. Mitochondrijų streso testui buvo pridėtas ATP sintazės inhibitorius Oligomicinas (1 μM), po to 3 μM FCCP, kad būtų suaktyvintas mitochondrijų atjungimas. Ne mitochondrinis kvėpavimas buvo išmatuotas sušvirkštus Rotenone / antimicino A (po 1 μM).

Citokinų sekrecijos tyrimai

Po 24 valandų (IL-2) ir 72 valandų (IL-4, IL-13, IL-17, IFN-γ) suaktyvinimo T-ląstelių, supernatantai buvo surinkti ir citokinų lygis buvo nustatytas Luminex multiplekso analize (Luminex Corporation, Ostinas, Teksasas). Norint nustatyti efektinius citokinų sekreciją Th p pogrupiuose, FACS surūšiuotų Th p pogrupių supernatantai (žr. Aukščiau) buvo surinkti praėjus 72 valandoms po aktyvacijos. IL-4, IL-5, IL-13, IL-17 ir IFN-γ sekrecijos lygis buvo matuojamas naudojant Luminex multiplekso analizę.

Ląstelių gyvybingumo tyrimai

Esant nurodytoms CQ koncentracijoms, buvo suaktyvintos 1 × 106 CD4 + T ląstelės. Po 72 valandų ląstelės buvo surinktos ir vieną kartą plaunamos aneksino dažymo buferiu (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2, 5 mM CaCl2, pH 7, 4, visi Sigma Aldrich). Mėginiai buvo inkubuojami su 5 μl Annexin V-APC (eBioscience) 10 minučių kambario temperatūroje, po to plaunami aneksino dažymo buferiu ir pridedama propidium jodido (PI, Sigma Aldrich; galutinė koncentracija 100 ng / ml). Anneksino V - / PI ląstelės kultūrose buvo identifikuotos kaip gyvybingos ląstelės, naudojant srauto citometriją.

Srauto citometrija

5x105 CD4 + T-ląstelės buvo aktyvuotos, esant arba neturint CQ. Stimuliuojamos ląstelės ir ląstelės, aktyvuotos be vaistų (teigiama kontrolė), buvo įtrauktos kaip kontrolinės ląstelės. Po 24 valandų ląstelės buvo surinktos, išplautos PBS + 0, 5% BSA + 0, 05% NaN3 (visos Sigma Aldrich) ir inkubuotos su anti-žmogaus CD25-PE-Cy7 (klonas: BC96), CD69-APC (klonas: FN50). ir CD71-PE (klonas: OKT9, „eBioscience“).

Su autofagija susijusių tarpląstelinių vakuolių matavimui mes panaudojome „Cyto-ID Autofhagy Detection Kit“ (Enzo Life Science, Loerrach, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. 5x105 CD4 + T-ląstelės buvo aktyvuotos, esant arba neturint CQ. Stimuliuojamos ląstelės ir ląstelės, aktyvuotos be vaistų (teigiama kontrolė), buvo įtrauktos kaip kontrolinės ląstelės. Nurodytais laiko momentais ląstelės buvo surinktos, vieną kartą perplautos dažymo buferiu ir 20 minučių inkubuotos katijoniniais amfifiliniais atsekamosiomis medžiagomis kambario temperatūroje. Po plovimo dažų įterpimas į autofagines vakuumas buvo išmatuotas srauto citometrijos metodu.

Norint nustatyti ląstelėje signalizuojančių baltymų fosforilinimą, ląstelės buvo suaktyvintos kaip aprašyta aukščiau (10 μM CQ) ir apdorotos taip, kaip aprašyta anksčiau. 21, 23 . Ląstelės buvo surinktos ir fiksuotos I fiksavimo buferiu I (BD Phosflow, BD Biosciences) 10 minučių 37 ° C temperatūroje. Po plovimo PBS + 0, 5% BSA + 0, 05% NaN3, ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos iš anksto atšaldytame (–20 ° C) Permeabilization Buffer III (BD Phosflow) ir inkubuojamos ant ledo 30 minučių. Po to ląstelės du kartus plaunamos PBS + 0, 5% BSA + 0, 05% NaN 3 ir 20 μL anti-fosf-S6RP (S240; Alexa Fluor 647 konjuguotas; klonas N4-41), anti-fosfo-ERK (T202 / Y204; Ramusis vandenynas). Mėlynai konjuguoti; 20 A klonas) ir anti-fosfo-p38 (T180 / Y182; konjuguoti PE; 36 / p38 klonas; BD Phosflow) arba izotipu suderinti kontroliniai antikūnai buvo dedami 60 minučių. Vėliau ląstelės buvo plaunamos ir analizuojamos FACS Canto II srauto citometru.

Kiekybinis PGR

Santykiniam RNR produkcijos kiekybiniam įvertinimui T ląstelės buvo aktyvuotos, esant 10 μM CQ arba neturint. Nurodytais laiko momentais RNR buvo išskirta naudojant „QIAcube“ RNR išskyrimo stotį (Qiagenas, Hildenas, Vokietija), o cDNR buvo sukurta atsitiktinės heksamerais gruntuotos atvirkštinės transkripcijos būdu. Santykinis IL-2 transkripcijos lygis buvo kiekybiškai įvertintas naudojant iTaq SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV) 7900HT greito realaus laiko PGR sistemoje (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Kaip atskaitos taškas buvo naudojami transkripciniai beta-2-mikroglobulino lygiai. Buvo naudojami šie pradmenys: IL-2: 5′-ATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTT-3 ′, IL-2 apsisukimas: 5′-CACTTAATTATCAAGTCAGTGTTGAGATGA-3 ′, b2m, skirtas: 5′-GGAATTGATTTGGGAGAGCCATT-3: ′, ′ ′, ′ ′, ′ ′, ′: ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ′, ' -3 ′. Kiekybiniam įvertinimui iš atitinkamų mėginių ΔCT vertės buvo apskaičiuotos (ΔCT = CT IL-2 - CT b2m ), o IL-2 raiška buvo apskaičiuota pagal formulę:

Image

NFAT, NF-κB ir AP-1 reporterių testai

1 × 10 6 Jurkat T ląstelės, ekspresuojančios NFAT :: GFP, NF-κB :: GFP arba AP-1 :: GFP promotoriaus elementą, buvo stimuliuojamos 2 × 10 5 BW 5147 T-ląstelių stimuliatoriaus ląstelėmis, perkeltomis membranoje surištais. OKT3 single-chain fragment variable and human CD80 (TCS CD80) 50 in the presence or absence of 5 μM or 10 μM. Unstimulated reporter cells served as a reference. After 24 hours, cells were harvested and the percentage of GFP-positive cells was established by flow cytometry. Promoter activity was calculated relative to the percentage of positive cells from samples activated in substance-free medium 21 .

Imunoblotai

4 × 10 6 CD4 + T-cells were activated in the presence or absence of 10 μM CQ for the indicated times. Cells were lysed in RIPA buffer with protease and phosphatase inhibitors (Sigma Aldrich). Cellular debris was removed (25, 000 × g, 4 °C, 15 minutes). Samples were resolved by SDS-PAGE on 4–12% gradient gels under reducing conditions (Life Technologies, Paisley, UK), followed by transfer onto PVDF membranes (GE Healthcare). For immunoblotting the following antibodies were used: rabbit anti-pc-JUN (Ser73; clone D47G9), mouse anti-c-JUN (clone L70B11), rabbit anti-c-FOS (clone 9F6), rabbit anti-Actin (clone D18C11), rabbit anti-phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185; clone 81E11), rabbit anti-SAPK/JNK (clone 56G8; all New England Biolabs, Ipswich, MA). After incubation with secondary horseradish peroxidase-conjugated antibodies, binding was visualized using the SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL). To allow statistic evaluation of the immunoblots, band intensity was quantified using the ImageJ software (National Institute of Health, Bethesda, MD; Version 1.50e).

Phospho-c-JUN ELISA

The (total/phospho) InstantOne ELISA (eBioscience) was used according to the manufacturer's instructions. In brief, 4 × 10 6 CD4 + T-cells were activated in the presence or absence of 10 μM CQ. After 4 hours, cells were harvested, lysed and protein concentrations in the lysates were adjusted to 0.5 μg/μL. Lysates were incubated for one hour with either a total c-JUN capture/detection antibody mix or a phospho c-JUN capture/detection antibody mix in quadruplets. Afterwards samples were washed and incubated in substrate solution and absorbance was measured at 450 nm. A phospho : total absorbance ratio was calculated from each sample.

In vitro JNK activity assay

The SAPK/JNK activity assay kit (New England Biolabs) was used according to the manufacturers' instructions. Recombinant human JNK1 (5 ng) was incubated with CQ (1 μM-1 mM) or plain reaction buffer at room temperature for 15 min. The kinase reaction was initiated by the addition of recombinant human c-JUN (1 μg) and ATP (200 μM). Phosphorylation of the c-JUN target peptide was conducted by incubation of the reaction mix at 30 °C for 30 min. The negative control reaction was performed in the absence of ATP. The reaction was stopped by addition of SDS sample buffer and incubation at 98 °C for 15 minutes. Afterwards, samples were resolved on by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane and detection of phosphorylated and total c-JUN was performed as described above.

Statistinė analizė

Statistical analyses were performed using GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Version 6.07). Proliferation rates, cell viability and cytokine levels were normalized to corresponding controls using fixed point normalization as evaluated by Degasperi et al . 51 and are given in mean percentages ± standard deviation.

For group comparison, an analysis of variance (ANOVA) with repeated measures was performed. For post-hoc testing, Dunett's test (comparison to medium) or the Holm-Šídák test (multiple comparisons between subgroups) was performed using adjusted p-values. Statistical significance was defined as a p-value < 0.05 (two-sided). In figures, statistically significant values are depicted as follows: *p < 0.05; ** p <0, 01; *** p <0, 001.

Papildoma informacija

How to cite this article : Schmidt, RLJ et al . Chloroquine inhibits human CD4 + T-cell activation by AP-1 signaling modulation. Mokslas. Rep. 7, 42191; doi: 10.1038/srep42191 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.