Cirkuliuojančios folikulų t pagalbinės ląstelės ir citokinų profilis žmonėms po vakcinacijos rvsv-zebov ebolos vakcina | mokslinės ataskaitos

Cirkuliuojančios folikulų t pagalbinės ląstelės ir citokinų profilis žmonėms po vakcinacijos rvsv-zebov ebolos vakcina | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ligos
  • Užkrečiamos ligos

Anotacija

Naujausias Zairo ebolaviruso (ZEBOV) protrūkis buvo didžiausias ir labiausiai paplitęs per visą užfiksuotą istoriją, pabrėžiant veiksmingos vakcinos poreikį. Čia mes analizavome žmogaus ląstelių imuninį atsaką, sukeltą vienkartinės kandidato į rVSV-ZEBOV vakcinos dozę, kuris parodė reikšmingą apsauginį veiksmingumą endemijos populiacijose Gvinėjoje. Tai yra pirmasis išsamus ZEBOV-GP specifinių cirkuliuojančių folikulų T ląstelių (cTfh) apibūdinimas. Kadangi ikiklinikinių ZEBOV infekcijos modelių antikūnų titrai koreliavo su apsauga, buvo manoma, kad Tfh koreliuoja su apsauga. Iš tikrųjų ZEBOV specifiniai cTfh duomenys koreliavo su antikūnų titrais žmogaus vakcinose ir netikėtai su Tfh17 pogrupiu. Dviejų pažangiausių technologijų derinys leido atlikti imuninių profilių sudarymą retoms ląstelių populiacijoms ir gali padėti išaiškinti įvairių vakcinų apsaugos koreliacijas.

Įvadas

Ebolaviruso gentis priklauso Filoviridae šeimai (filovirusas) ir apima daug labai patogeniškų virusų rūšių, kurie gali būti perduodami žmonėms iš laukinių gyvūnų 1 ir lengvai tarp žmonių 2 . Ebolos viruso liga (EVD) yra sunki žmonių liga, susijusi su mirtingumu, kuris užfiksuotas nuo 25 iki 90 procentų per užregistruotus ligos protrūkius 2, 3 . Pirmą kartą apie EVD buvo pranešta 1976 m., Įvykus dviem vienu metu protrūkiams Sudane ir Kongo Demokratinėje Respublikoje (KDR), kur su skirtingais protrūkiais buvo susijusios dvi skirtingos Ebola viruso rūšys: Zaire Ebolavirus (ZEBOV) ir Sudan Ebolavirus (SEBOV) 4, tačiau, paskutinis protrūkis viršijo visas ankstesnes epidemijas pagal geografinį paplitimą ir atvejų skaičių 3 .

Nors ši liga yra susijusi su dideliu mirštamumo laipsniu, profilaktikos ir gydymo galimybės yra menkos ir klinikinis veiksmingumas nebuvo iki galo įvertintas. Pageidautina ZEBOV vakcinos tikslinio produkto savybės yra didelis veiksmingumas po vienkartinės imunizacijos, greitas apsaugos atsiradimas ir ilgalaikis imunitetas. Tokių savybių vakcina turėtų galimybę greitai sustabdyti ligos plitimą ar net užkirsti kelią reikšmingiems protrūkiams. Įvertintas įvairių vakcinų platformų veiksmingumas ikiklinikiniuose modeliuose, įskaitant nežmoginius primatus. Viena iš švino skiepų platformų yra pagrįsta gyvu, replikacijai tinkamu rekombinantiniu vezikulinio stomatito virusu (rVSV) 5, kuriame VSV gliko baltymo (VSV-GP) genas yra pakeistas ZEBOV glikoproteinu. Ši vakcina sėkmingai apsaugojo nežmoginius primatus (NHP) nuo užsikrėtimo ZEBOV 6, 7 . Be to, ši vakcina pademonstravo apsaugą nuo ekspozicijos (PEP) NHP modelyje, ir tai leido ją tirti kaip priešpriešinę priemonę pagal nepaprastosios padėties protokolus įtariamai Ebolos Zaire ekspozicijai kaip pooperacinę terapiją; Ankstyvieji klinikiniai tyrimai JAV, Europoje ir Afrikoje parodė, kad vienkartinis vakcinuojamos vakcinos užkrėtimas yra imunogeniškas 11, 12, 13 ir toleruojamas daugumai vakcinuotų asmenų, nors buvo pastebėtas reaktogeniškumas 11, 12 . III fazės veiksmingumo tyrimas pagal vakcinavimo žiedinę schemą, kai artimi ZEBOV pacientų kontaktai buvo paskiepyti iškart arba praėjus trims savaitėms po naujai nustatyto atvejo diagnozavimo, parodė, kad šis gyvas, susilpnintas vienos dozės vakcinos kandidatas yra labai efektyvus 14 .

Tačiau iki šiol pranešta, kad EBOV vakcinos sukeltos imuninės apsaugos koreliacijos yra įvairios, o ikiklinikinių modelių duomenys rodo, kad ląstelinis ir humorinis mechanizmai yra susiję 7, 15, 16, 17 . Imuninių mechanizmų, užtikrinančių apsaugą, tipas gali priklausyti nuo vakcinos platformos. Imuniniai mechanizmai, kuriuos sukėlė rVSV-ZEBOV vakcinos, buvo ištirti pelių modeliuose 15 ir NHP 7 . Pastaruoju atveju gyvūnai buvo imunizuoti rVSV-ZEBOV po to, kai imunizacijos metu arba prieš pat užkrėtimą buvo sunaikintos CD4 + arba CD8 + T ląstelės. Nors CD8 + T ląstelių išeikvojimas neturėjo įtakos vakcinos veiksmingumui, CD4 + T ląstelių praradimas vakcinacijos metu turėjo didelę įtaką antikūnų reakcijai (sumažėjusiems titrams) ir su tuo susijusiai apsaugai. CD4 + T ląstelių išeikvojimas užkrėtimo metu neturėjo jokio poveikio, rodantis, kad ši T ląstelių populiacija neturi tiesioginės efektorinės funkcijos.

Šios analizės tikslas buvo apibūdinti cirkuliuojančių folikulų pagalbininkų T ląsteles (cTfh) ir citokinų imuninius profilius, kuriuos sukėlė rVSV-ZEBOV vakcina, nes apie šios vakcinos kandidato sukeltą imuninį profilį yra mažai duomenų apie žmones (ty tik serologija). . Vakciną iš pradžių sukūrė „Public Health Canada“, licenciją turinti „NewLink Genetics Corp.“, kuri inicijavo klinikinius vakcinos (žymimos BPSC1001) tyrimus ir GMP, vėliau sublicencijavo ją išimtinai „Merck & Co“, kuri užsiima vėlyvosios stadijos kūrimu. vakcinos kandidato (V920). Šis tyrimas nustato labai išsamius imunoprofilus V920 vakcinuotų žmonių kohortai (klinikinio tyrimo aprašymą žr. 13 nuorodą) ir priemones bei parametrus, kurie leis palyginti su ZEBOV paveiktų žmonių reakcijomis, taigi, imuninio atsako vertinimus, kurie vėliau gali būti naudojami nustatant imuninės apsaugos koreliacijas.

Rezultatai

ZEBOV-GP citokinų profilis stimuliavo imuninį atsaką PBMC

Norint apibūdinti ZEBOV-GP specifinių periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PBMC) citokinų profilį, kultūros ZBOV-GP peptidais stimuliuotų ląstelių supernatantas buvo analizuotas naudojant Mesoscale citokinų multiplekso tyrimo platformą (1 lentelė). Ištirti citokinai yra skirtingų funkcinių kategorijų atstovai: IL-1β ir IL-8 (priešuždegiminiai), IFN-γ, IL-12, IL-2, TNF-α (Th1), IL-4, IL-6, IL-13 (Th2) ir IL-10 (imunomoduliuojantis). IFN-γ buvo gausiausiai citokinų išskiriamas iš visų trijų vakcinos dozių grupių, reaguojant į ZEBOV-GP peptidus. Tyrime dalyvavę tiriamieji buvo suskirstyti į tris dozių grupes ir atitinkamai buvo paimti 3 x 10 6, 2 x 10 7 arba 1 x 10 8 apnašas formuojančių vienetų (pfu) rVSV-ZEBOV vienkartine intramuskuline inokuliacija.

Pilno dydžio lentelė

Kiekvienos kohortos citokinų parašai buvo nustatyti naudojant koreliacijos matricą (1 pav.), Kurios rezultatas buvo šie pagrindiniai pastebėjimai: (1) 1 kohortoje koreliacijų grupė atsiranda dėl antigeno stimuliacijos, kurią sudaro IL-1β, IL-4, IL-10 ir TNF-α. Taip pat yra tvirtas ryšys tarp IL-12 ir IL-13, tačiau tik su dviem veiksniais to negalima laikyti tikru klasteriu. Nors IFN-γ yra aukštai išreikštas stimuliuotų ląstelių, jis neturi jokių kitų koreliacijų. (2) 2 kohortoje yra dvi citokinų grupės, parodančios koreliacijas: Pirmąjį klasterį sudaro IL-2, IL-6, IL-12 ir IL-13, o antrą klasterį sudaro IL-1β, IL-4, IL -10 ir TNF-α. IFN-γ turi tik neigiamą koreliaciją su IL-8. (3) 2 grupės grupės: Pirmasis klasteris, susidedantis iš IL-2, IL-8, IL-12, IL-13 ir antrojo klasterio su IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10 ir TNF- α. IFN-γ vis dar turi tik neigiamą, nors ir silpną koreliaciją, būtent su IL-8 ir IL-2. Padarome išvadą, kad padidinus vakcinos dozę, pasikeitė stimuliuotų PBMC citokinų signalas. Nors IL1β, IL-4, IL-10 ir TNF-α klasteriai aptinkami visose trijose grupėse, pagrindinis IL-2, IL-12, IL-13 klasteris išryškėja tik 2 kohortoje. Nors IL-6 yra 2 grupės 1 grupės dalis, ji pereina į antrąją grupę 3 grupėje. Tarp IL-6 ir IL-8 yra stipri neigiama koreliacija. Proinflambinis citokinų išsiskyrimo laipsnis padidėjo vartojant vakcinos dozę. Dozių grupės skyrėsi pagal IL-2 atsako dydį (p = 0, 03, ANOVA, IL-6 (p = 0, 016, ANOVA) ir TNF-α (p = 0, 017, ANOVA). Grupės taip pat skyrėsi IL -8 atsakymas, nors ir nežymiai (p = 0, 08, ANOVA).

Image

Korelograma pavaizduoja ryšius tarp citokinų, kuriuos gamina PBMC iš tiriamųjų grupių 1 kohortoje (a grupė), 2 kohortoje (b grupė) ir 3 kohortoje (c grupėje) reaguojant į stimuliaciją ZEBOV-GP-peptidais. Spalvos nurodo koreliacijos lygį (mėlyna - teigiama, raudona - neigiama, balta - nėra koreliacijos). Faktinius citokinų duomenis žr. 1 lentelėje.

Visas dydis

Imunizacija rVSV-ZEBOV-GP sukelia reikšmingą cTFH lygį

Anksčiau buvo aprašytas CD154 kaip aktyvavimo žymeklio ir retų ląstelių aptikimo įrankių naudojimas 18 . Pirminis ZEBOV-GP specifinių CD4 + CXCR5 + T ląstelių įvertinimas, pagrįstas CD154 raiška po stimuliacijos ZEBOV-GP peptidais, parodė, kad cTfh ląstelių dažnis buvo labai mažas (2 pav.) Ir kad nuodugnus norint ištirti šios populiacijos funkcinius pogrupius, reikėjo pakeisti srauto citometrinės analizės logistiką. Placebo kontrolinių asmenų atsakymai neviršijo atsako į vakcinuotų asmenų, išmatuotų per 0 dieną, atsako. Taigi 0, 28 ir 56 dienų PBMC buvo stimuliuojami iš dalies sutampančiais ZEBOV peptidais arba kontroline stimuliacija ir buvo praturtinti remiantis aktyvavimo žymens išraiška. CD154. CXCR5 + CD4 + T ląstelių dažnis praturtintoje populiacijoje padidėjo visose trijose vakcinų grupėse nuo pradinio lygio (0 diena) (3 pav.). CXCR5 + T ląstelių dažnis reikšmingai skyrėsi trijose grupėse 28 dieną (p <0, 001, ANOVA) ir 56 dieną (p = 0, 009, ANOVA). Buvo reikšminga sąveika tarp laiko taško ir grupės (p = 0, 001, dvipusė ANOVA) (papildoma S1 lentelė). Tarp 28 ir 56 dienų reikšmingų dažnio pokyčių nepastebėta. Didelės dozės kohorta (3 kohorta) turėjo didžiausią atsaką, tačiau dar reikia nustatyti, ar didesni atsakai yra susiję su pakitusiomis cTfh ląstelių funkcijomis ar patvarumu.

Image

1, 2 ir 3 grupėms buvo sušvirkšta viena IM atitinkamai 3 × 10 6, 2 × 10 7 arba 1 × 10 8 pfu. 0, 28 ir 56 dienų limfocitai buvo stimuliuoti EBOV peptidais ir dažyti CD3, CD4, CD154, CXCR5 ekspresijai. Dėžutėje pateiktas n = 10 tiriamųjų vienoje vakcinos grupėje ir laiko punkte. Čia nurodyti dažniai yra CD154 + (specifiškai ZEBOV) CD4 + CXCR5 + ląstelių procentas gyvybingose ​​CD3 + PBMC populiacijose. Statistiniai vakcinų grupių skirtumai buvo rasti 28 dieną (p = 0, 004, ANOVA) ir 56 dieną (p = 0, 013, ANOVA).

Visas dydis

Image

1, 2 ir 3 grupėms buvo sušvirkšta viena IM atitinkamai 3 × 10 6, 2 × 10 7 arba 1 × 10 8 pfu. 0, 28 ir 56 dienų limfocitai buvo stimuliuoti ZEBOV-GP-peptidais ir praturtinti remiantis aktyvavimo žymens CD154 ekspresija. Dėžutėje pateiktas n = 10 tiriamųjų vienoje vakcinos grupėje ir laiko punkte. Žr. Papildomą S1 pav. Pateiktas dažnis yra CXCR5 + ląstelių procentas praturtintose CD4 + CD154 + T ląstelėse. Statistiškai skirtumai tarp kohortų 28 dieną (p <0, 001, ANOVA) ir 56 dieną (p = 0, 009), bet nebuvo 0 dieną (p = 0, 78). Skliausteliuose su žvaigždutėmis nurodomi statistiniai laiko taškų skirtumai. Išsamią statistinę analizę žr. Papildomoje S1 lentelėje.

Visas dydis

Vakcinos dozė ir jos poveikis diferencinei cTfh pogrupių indukcijai

Norėdami toliau tirti ZEBOV-GP specifinių CD4 + T ląstelių reakcijų sudėties skirtumus ir galimą ląstelių atsako poliarizaciją, atsižvelgiant į vakcinos dozę, įvertinome chemokinų receptorių (CXCR3 ir CCR6), kurie yra susiję su skirtingais skirtingais, raišką. CXCR5 pogrupiai žmogaus periferiniame kraujyje 19, 20 . Analizė atskleidė ryškų cTfh17 ląstelių vyravimą, po to seka cTfh2 ir cTfh1 ląstelių pogrupis (4 pav.). Imunizacija su rVSV-ZEBOV vakcina žymiai padidino cTfh17 pogrupio dažnį (ypač 3 grupėje), bet ne kituose Tfh pogrupiuose. Išplečiant statistinę analizę, įtraukiant abu veiksnius, laiką po vakcinacijos ir vakcinos grupę, reikšminga šių veiksnių sąveika cTfh17 subpopuliacijai (dvipusis ANOVA, p <0, 001), bet ne cTfh1 ar cTfh2 subpopuliacijoms. (Papildoma S2 lentelė). Pogrupio pokyčių kinetika taip pat rodo, kad yra bent šie Tfh pogrupiai, nes ZEBOV-GP specifinio cTfh dažnis palaikomas 56 dieną.

Image

PBMC, praturtintas remiantis aktyvavimo žymens CD154 ekspresija, vėliau buvo analizuojamas srauto citometrija, kad būtų galima ekspresuoti CD3, CD4, CXCR5 ir pogrupio specifinius žymenis CCR6 ir CXCR3. Atsakymai įvairiose grupėse (1 kohorta (a grupė, b grupė), 2 kohortoje c grupė, d grupė 3 grupėje (e grupė f)) parodyti 28 dienai (a grupė, c, e) ir 56 dienai (a grupė, a, c, e). Skydas b, d, f) dėžutėse. Paryškinta linija šalia kiekvieno laukelio parodo kiekvienos cTfh populiacijos vidutinį dažnį 0 dieną. Duomenys išreikšti absoliučiais CD3 + CD4 + CXCR5 + CCR6 - CXCR3 - (Tfh2), CD3 + CD4 + CXCR5 + CCR6 - CXCR3 + skaičiais. (Tfh1) ir CD3 + CD4 + CXCR5 + CCR6 + CXCR3 - (Tfh17) CD4 + CD154 + T ląstelėse (žiūrėjimo į vartojimą strategiją žr. Papildomame S1 pav.). Išsamią statistinę analizę žr. Papildomoje S2 lentelėje.

Visas dydis

Koreliacija tarp cTfh pogrupių dažnių ir ZEBOV-GP specifinių antikūnų titrų

Palyginus vakcinos sukeltų antikūnų titrus (papildoma S3 lentelė) su cTfh dažniais, nustatyta reikšminga koreliacija tarp ZEBOV specifinių cTfh ląstelių (CD154 + CD4 + CXCR5 + ) 28 dieną (R2 = 0, 372, p = 0, 033) (2 pav. 5, viršutinė eilutė). Koreliacija prarandama 56 dieną, o antikūnų duomenys iš vėlesnių laiko momentų dar nėra. Toliau analizuojant ryšį tarp ZEBOV-GP specifinių cTfh pogrupių ir antikūnų titro, 28 dienai buvo nustatyta netikėta koreliacija tarp Tfh17 lygių ir antikūnų titrų (5 pav., Apatinė eilutė, R2 = 0, 422, p = 0, 014). ) ir 56 dieną (R2 = 0, 37, p = 0, 031), bet Tfh1 ir Tfh2 bei antikūnų titrui reikšmė nėra svarbi (papildomas S2 pav.).

Image

Scatterblotai, lyginantys ELISA titrą (matuojant kaip ELISA vienetus / ml) ir CD154 + CD4 + CXCR5 + (cTfh, viršutinė eilutė) dažnį arba CD154 + CD4 + CXCR5 + CCCR6 + CXCR3 - (cTfh17, apatinė eilutė) dažnį 28 dieną 28 dieną (kairysis stulpelis) ir 56 diena (dešinysis stulpelis). Parodytas Pearsono koreliacijos koeficientas R 2 ir p vertės. Visų kohortų duomenys buvo sujungti, kad būtų gautas didelis imties dydis. Tarp antikūnų titro ir cTfh1 ar cTfh2 koreliacijų nepastebėta (papildomas 2 pav.).

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime naudojamas dviejų išskirtinai jautrių technologijų derinys ir pateikiamas išsamus ir pirmasis ZEBOV-glikoproteinui (GP) būdingų žmogaus imuninių atsakų citokinų profilis. Trims savanorių grupėms buvo sušvirkšta didėjančios rVSV-ZEBOV vakcinos dozė į raumenis. Antrajai grupei skiriama dozė atitinka dozę, kuri buvo naudojama žiediniame tyrime Gvinėjoje. Dėl to 2014 m. Protrūkio metu buvo pasiektas labai aukštas apsauginis veiksmingumas nuo infekcijos. Kai jis stimuliuojamas in vitro peptidų telkiniu, atitinkančiu ZEBOV sekas. -GP, vakcinos dozė koreliavo su platesniu ir sudėtingesniu citokinų modeliu su vis sudėtingesnėmis asociacijomis. Ląstelių, gaunamų iš mažų dozių vakcinų grupės (1 kohorta), reakcija daugiausia dominavo IFN-γ sekrecija. Šis citokinas padidėjo su vakcinos doze, tačiau teigiamai nedarė koreliacijos su jokiu kitu citokinu nė vienoje iš trijų kohortų savanorių (1 lentelė, 1 pav.). Tačiau jis neigiamai koreliavo su 2 kohortos IL-8 ir papildomai su 3 kohortos IL-2. Skiepytų asmenų citokinų parašai 2 ir 3 grupėse atskleidė dvi pagrindines koreliacijų grupes: (1) 1 klasteris su IL -2, IL-12 ir IL-13 - priklausomai nuo vakcinos dozės, IL-6 ir IL-10 (2 kohorta) arba IL-8 (3 kohorta) yra šios grupės dalis. Apskritai, daugelis iš šių veiksnių gali skatinti T ir B ląstelių dauginimąsi, nepriklausomai vienas nuo kito. (2) Antrame klasteryje buvo IL-1-β, IL-4, IL-10 ir TNF-α. Mes hipotezuojame, kad padidinus vakcinos dozę, atsiranda citokinų profilio, kuris skatina humoralinį imuninį atsaką, iškreipimas, kurį patvirtina serologiniai duomenys 13 ir papildoma S3 lentelė. Priežastinį ryšį tarp šių dviejų parametrų reikės nustatyti atliekant būsimus funkcinius tyrimus. Papildomos informacijos galima gauti apibūdinant citokinus gaminančių ląstelių kilmę. Savo tyrime mes panaudojome labai jautrų tūrinio aptikimo metodą, būtent „Mesoscale“ platformą, norėdami analizuoti kultūros supernatantus iš stimuliuotų PBMC. Tokie masinio skaitymo metodai nurodo citokinų profilį ir absoliučius citokinų kiekius populiacijos lygyje, todėl apibūdina bendrą individualaus vakcinos gavėjo citokinų atsaką. Pakartotinių tyrimų taikymas leidžia plačiai apibūdinti imuninį atsaką esant ribotam ląstelių kiekiui, tačiau, skirtingai nei dažant tarpląstelinį citokinų dažymą, negalima daryti išvadų dėl citokinus / chemokinus gaminančių ląstelių dažnio ir tapatumo. Tačiau analizuojant retas ląsteles, tokias kaip antigenui specifinis cTfh ribotame mėginio kiekyje, jų dažnis gali būti mažesnis už srauto citometro aptikimo slenkstį (peržiūrėtas 18 nuorodoje). Taigi tokios analizės paprastai apsiriboja keliais veiksniais ir negali sudaryti plataus citokinų profilio. Šiam tyrimui mes siekėme nustatyti skaitymo protokolą, kurį būtų galima pritaikyti įvairiems vakcinų tyrimams, kuriuose paciento medžiagos kiekis yra ribotas, tačiau ieškant imuninės imuninės koreliacijos apsaugos reikalingi didelio tankio duomenų rinkiniai.

Ankstesni ikiklinikinių modelių tyrimai parodė, kad antikūnai ir CD4 + T ląstelės yra apsaugoti nuo ZEBOV, tarpininkaujant rVSV-ZEBOV 7, 15 vakcinai. Taigi, be citokinų profilio apibūdinimo, mes siekėme įgyti įžvalgos apie funkcinius CD4 + T ląstelių pogrupius, būtent Tfh ląsteles, nes šios ląstelės yra labai svarbios tarpininkaujant nuo T ląstelių priklausomam humoriniam imuniniam atsakui. Šis tyrimas apibūdina funkcinius CD4 + T ląstelių pogrupius, pagrįstus anksčiau nustatytais pogrupių žymekliais 19, 20 . Nors tikslus cTfh ląstelių fenotipas vis dar yra diskusijų objektas, vakcinos sukeltos cTfh profilio apibūdinimui panaudojome nusistovėjusią grupę 19, kuri palengvins šios vakcinos kandidato imunologinį vertinimą. Reikėjo modifikuoti įprastinę srauto citometrinę analizę, nes antigenui specifiškų cTfh ląstelių dažnis buvo mažas (2 pav.), Ko buvo galima tikėtis atsižvelgiant į tiriamųjų imunologinį naivumą į ZEBOV-GP ir imunizaciją vienkartine vakcinos doze. . Norėdami įveikti šį iššūkį, praturtinome antigeno specifines T ląsteles, pagrįstas CD154, ir vėliau atlikome išsamų antigenui specifinių CD4 + CXCR5 + T ląstelių pogrupių apibūdinimą (3 pav.). CD4 + T ląstelių pogrupius suskirstėme pagal CXCR5 (chemokino receptoriaus, kuris leukocitų migraciją nukreipia į limfoidinių audinių B ląstelių skyrius), CXCR3 (išreikšto aktyvuotose T ląstelėse, pageidautina Th1 ląstelėse), ir CCR6 (išreikšto ekspresija). T atminties ląstelėse, pageidautina Th17 ląstelėse) 21 (4 pav.). Pastarųjų ląstelių populiacija vis labiau pripažįstama vaidinanti lemiamą reikšmę imunitetui nuo infekcinių ligų, ir teigiama, kad Th17 ląstelės vaidina vaidmenį vakcinos sukeltoje imuninėje atmintyje. Tikrasis Tfh subpopuliacijų pasiskirstymas tarp audinių ir periferinio kraujo dar nėra išsamiai aprašytas (apžvelgtas 22 nuorodoje). Nors šis apibūdinimas yra moksliškai svarbus, atliekant bet kokią analizę, kuria siekiama apibūdinti imunofrofilą, kuris būtų skirtas vakcinos kūrimui, kontekstas yra mažai reikšmingas, nes periferinis kraujas yra lengviausiai prieinamas imuninių ląstelių šaltinis tokioms pastangoms. Taigi cTfh ląstelių, priešingai nei audiniuose esančių Tfh ląstelių, naudojimas ieškant apsaugos koreliacijų yra labai tinkamas 22 .

Tfh17 ląstelių vaidmuo skiepų sukeltame imunitete yra nauja tyrimų sritis. Iki šiol šios ląstelės daugiausia buvo siejamos su ligos eiga ir patologija, tačiau dabar vis labiau suprantama, kad jos vaidina lemiamą vaidmenį tarpininkaujant apsaugai nuo įvairių patogenų 23, 24, 25 ir kad jas gali suaktyvinti daugiausia gyvos, susilpnintos vakcinos 23, 26 ir gleivinės vakcinos 27 . Įrodyta, kad tiek Tfh2, tiek Tfh17 pogrupiai yra veiksmingi teikiant B ląstelių pagalbą 20 . Galiausiai padidėjo Tfh2 ir Tfh17 ląstelių dažnis asmenims, turintiems plačiai neutralizuojančius antikūnus prieš ŽIV 28, pagrindžiančius dabartinę hipotezę, kad Tfh17, be Tfh2, gali būti svarbūs skatinant humorinį imuninį atsaką. Mūsų duomenys rodo, kad ląstelinis imuninis atsakas efektyviai palaikomas 56 dieną po vienkartinės imunizacijos įvairiomis rVSV-ZEBOV dozėmis (4 pav.). Būsimų tyrimų metu pagrindinis dėmesys turėtų būti skiriamas dabartinės imunologinės analizės ryšiui su imunologiniais parametrais, kuriuos lemia Tfh ir B ląstelių sąveika, apibrėžti antikūnų afinitetą ir Fc funkcionalumą, taip pat atminties išlikimą.

Stebėjimas, kad antikūnų titrai koreliuoja su ZEBOV-GP specifinių cTfh17 ląstelių dažniu (5 pav.), Buvo netikėtas, nes tradiciškai manoma, kad Tfh2 skatina didžiąją dalį humoralinio atsako. Tačiau keletas naujausių tyrimų parodė, kad IL-17 vaidina svarbų vaidmenį sukeliant antikūnų reakcijas, keičiant izotipą ir gemalo centrą. Be to, vis daugėja įrodymų, kad Th17 vaidina lemiamą vaidmenį atšaukiant vakcinų, nukreiptų prieš bakterinius, grybelinius ir virusinius patogenus, sukeltą reakciją (apžvelgta 21 nuorodoje). Dabartinis tyrimas praplečia šias žinias žmogaus imuniniam atsakui į ZEBOV, apie kurį anksčiau nebuvo pranešta. Negalime atmesti galimybės, kad kiti T ląstelių pogrupiai, tokie kaip Tfh2, ypač ląstelės, reziduojančios limfinių audinių gemaliniuose centruose, taip pat prisideda prie antikūnų atsako ir todėl gali veikti sinergiškai su cTfh17. Čia pateikti duomenys apsiriboja reakcijomis, kurias galima išmatuoti periferiniame kraujyje, ir todėl jie parodo tik veiksmingo vakcinos atsako į ZEBOV pakaitinį žymeklį.

Kalbant apie šiame tyrime stebėtą vakcinos dozės reakciją, iš kitų ligos modelių vyrauja pirmenybė, kad imunizuojant didelėmis antigeno dozėmis padažnėja antigeno specifinių ląstelių, tačiau šių ląstelių T ląstelių receptorių (TCR) afinitetas yra didesnis. sumažino 31, 32 . Neseniai atliktas tyrimas rodo, kad antigeno afinitetas daro didelę įtaką T ląstelių reakcijų diferenciacijai 33 . Mes pirmą kartą parodome šį stulbinantį vakcinos dozės poveikį Tfh1 / Tfh2 / Tfh17 santykiui žmogaus ZEBOV vakcinos kontekste. Supratimas apie ryšį tarp antigeno dozės, T ląstelių atsako kokybės ir iš to išliekančių Tfh subpopuliacijų yra nepaprastai svarbus planuojant vakcinų schemas ir gerinant vakcinos efektyvumą, išskyrus vakcinas prieš ZEBOV.

Ateities tyrimais turėtų būti siekiama išplėsti šiame tyrime pateiktą analizę, naudojant lauko tyrimuose paskiepytų asmenų mėginius, taip pat nustatyti citokinų ir cTfh reakcijas išgyvenusiems asmenims. Analizės grupės padidinimas įtraukiant ZEBOV specifinių atminties B ląstelių dažnį, taip pat sustiprinantis antikūnų atsako apibūdinimą atsižvelgiant į afinitetą, izotipo profilį ir net imunoglobulino sunkiosios grandinės glikozilinimo modelius (apžvelgtas 34 skyriuje). ) dar labiau priartins mus prie galutinio apsaugos nuo ZEBOV atitikimo nustatymo, o šis tyrimas yra svarbus pirmas žingsnis link šio tikslo.

Medžiagos ir metodai

Tyrimo planas ir pavyzdžiai

Mėginiai buvo paimti iš tiriamųjų, dalyvaujančių I fazės klinikiniame tyrime (NCT02269423), atlikto klinikinių tyrimų centre WRAIR 13 . Metodai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių. Visus eksperimentinius protokolus patvirtino WRAIR žmogaus subjektų apsaugos skyrius (WRAIR # 2163), o visi tiriamieji davė informuotą sutikimą ateityje naudoti pavyzdžius. Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės (PBMC) buvo surinktos 0 dieną ir įvairiais laiko momentais po vakcinacijos ir konservuotos.

„ZEBOV Kikwit GP Consensus“ peptidų kaupimas

15-merų liofilizuoti peptidai (persidengiantys 11 aminorūgščių) buvo įsigyti iš „Atlantic Peptides“ (Lewisburg, PA) ir ištirpinti DMSO, esant 10 mg / ml koncentracijai. Po to buvo sujungti vienodi peptidų kiekiai ir padalyti į 6 vienodus alikvotus (0, 45 mg kiekvieno peptido); iš baseinų nebuvo praleisti hidrofobiniai peptidai.

Žmogaus 10 plex citokinų prouždegiminė panelė

Kiekvieno tyrimo dalyvio, nuo 0 iki 28 dienos po imunizacijos, kriofiziškai konservuoti PBMC buvo stimuliuojami ZEBOV-GP peptidų telkiniais (15-mer peptidai, persidengiantys 11 AA), esant 0, 5 μg / ml galutinei koncentracijai 48 valandas. „Mesoscale Discovery“ 10-plex žmogaus priešuždegiminio skydelio rinkinys (IL-1β, IL-8, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IFN-γ, TNF- α) buvo naudojamas kultūros supernatantams analizuoti pagal gamintojo protokolą. Plokštelės buvo nuskaitytos naudojant „QuickPlex SQ120“.

Polichrominis srauto citometrinis dažymas

0, 28 ir 56 dienų laikomi šaltai konservuoti PBMC buvo kultivuojami ZEBOV-GP Megapool (viso peptido telkiniu), esant 1, 0 μg / ml, arba vien tik terpę (kontrolinė stimuliacija). Ląstelės buvo kultivuojamos 16 valandų (37 ° C, 5% CO 2 ) visa terpėje (RPMI-1640 (Life Technologies, Waltham, MA)), turinčioje 10% žmogaus serumo (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). koncentracija 5 × 107 ląstelių / ml. Anti-žmogaus CCR6-APC (REA190) ir CD40 (HB14) buvo įpilti į kultūrą atitinkamai 1:10 ir 1: 100 skiedžiant. Po stimuliacijos ląstelės buvo plaunamos ir 15 minučių dažytos antižmogišku CD154-biotinu (5C8) 4 ° C temperatūroje FACS tirpale (0, 5% žmogaus serumo ir 0, 1% natrio azido PBS). Ląstelės buvo 15 minučių inkubuojamos su anti-biotino mikrobandelėmis (ultrapure, Miltenyi Biotec, San Diegas, CA) 4 ° C temperatūroje. Po plovimo iš anksto titruotas ir optimizuotas antikūnų kokteilis su fluoro chromo konjuguotais antikūnais prieš CD3-VioBlue (BW264 / 56), CD4-PerCPVio700 (M-T466), CD185-PEVio770 (REA103), CD183-VioBrightFITC (REA232), RE422. Pridedami -PE (5C8) ir „Zombie Aqua Fixable“ dažai (BioLegend, San Diegas, CA) ir inkubuojami 45 minutes 4 ° C temperatūroje. Visi monokloniniai antikūnai ląstelių kultūrai ir analizei buvo įsigyti iš Miltenyi Biotec (San Diegas, CA). Po plovimo ir pakartotinio sumaišymo PBS, ląstelės buvo praturtintos ir surinktos MACSQuant Analyzer 10.

Pririšimo strategija pavaizduota papildomame 1 pav. Limfocitai pirmiausia buvo išskirstyti pasklidimo būdu, o paskui buvo pagrįsti gyvybingumu ir linijos3 žymeniu CD3. Praturtintos antigenui specifiškos ląstelės buvo surūšiuotos kartu ekspresuojant CD4 ir CD154, po to ekspresuojant CD4 ir CXCR5. CD4 + CXCR5 + ląstelėse pogrupiai, remiantis CCR6 ir CXCR3 ekspresija, buvo toliau identifikuojami kaip Tfh1, Tfh2 ir Tfh17 ląstelės. Kiekybinė analizė buvo atlikta naudojant FlowJo 10 (Treestar, Ashland, OR).

Statistinė analizė

Įvairių grupių ir laiko taškų duomenys buvo patikrinti pagal statistinę reikšmę naudojant ANOVA („Minitab“ programinės įrangos paketas, „Minitab Inc.“, State College, PA). Koreliacijos tarp Tfh dažnio ir antikūnų titrų atitinkamais laiko momentais (0 diena, 28 diena, 56 diena) buvo nustatytos pagal Pearsono koreliaciją (Minitab). Koreliacijos matrica / korelograma buvo apskaičiuota ir nubraižyta naudojant R programinę įrangą (STHDA svetainė).

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį : Farooq, F. ir kt . Žmonėms cirkuliuojančios T folikulo pagalbinės ląstelės ir citokinų profilis po vakcinacijos rVSV-ZEBOV Ebola vakcina. Mokslas. Rep. 6, 27944; „doi“: 10.1038 / srep27944 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.