H5n6, h3n2, h3n8 bendra cirkuliacija ir naujo h3n6 remitorto atsiradimas vietinėje bendruomenėje Kinijos Hunano provincijoje | mokslinės ataskaitos

H5n6, h3n2, h3n8 bendra cirkuliacija ir naujo h3n6 remitorto atsiradimas vietinėje bendruomenėje Kinijos Hunano provincijoje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Gripo virusas

Anotacija

Paukščių ar laukinių paukščių daugybinės paukščių gripo virusų (AIV) infekcijos prisideda prie H5 potipio virusų nuolatinės evoliucijos gamtoje ir suteikia galimybę skirtingos kilmės AIV rekombinuoti. Šiame tyrime 2014–2015 m. Atlikome Kinijos Hunano provincijos ančių, žąsų ir bendruomenės aplinkos AIV stebėjimą. Mes išskyrėme kelis kartu cirkuliuojančius AIV, įskaitant H3N2, H3N8 ir H5N6, ir, svarbiausia, naują remitortą: H3N6. Filogenetiniai tyrimai rodo, kad labai tikėtina, kad H3N6 yra kilęs iš H5N6, kuris neseniai įrodytas, kad turi zoonozinį potencialą ir žmonių infekcijas. Tyrimai su žinduolių ląstelių linijomis ir pelių modeliu rodo, kad keturi atrinkti ančių ar žąsų AIV gali užkrėsti MDCK ir A549 ląsteles, tačiau jų pelių patogeniškumas yra mažas. Mes siūlome, kad dėl galimo kelių potipių, įskaitant H5N6, cirkuliacijos vietinėje vietoje gali atsirasti naujų potipių, tokių kaip H3N6, genų perskirstymo būdu.

Įvadas

Vandens paukščiai, tokie kaip laukiniai paukščiai, antys ir žąsys, yra natūralūs paukščių gripo virusų (AIV) rezervuarai visame pasaulyje, o labiausiai patogeniški žmonių gripo virusai yra kilę iš vandens paukščių 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Šiuo metu iš vandens paukščių buvo išskirti 16 AIV hammagglutininų (HA) ir 9 neuraminidazių (NA), o tarp AIV, galinčių užkrėsti žmones, H5 ir H7 (N9) yra dažniausiai 7, 8, 9, 10, 11 . Svarbu tai, kad besimptomė vandens paukščių infekcija, turinti daugumą AIV, gali skatinti gripo virusų išsivystymą 12 . Naminių ančių ir žąsų padėtis yra tarp laukinių vandens paukščių ir sausumos naminių paukščių. Šiuose ūkiuose nenaudojamos jokios biologinio saugumo priemonės ir atviras šėrimas, trūksta dezinfekavimo, taip pat glaudus kontaktas su gyvūnais tarp migruojančių paukščių ir naminių ančių bei žąsų, turinčių vandens, maisto ir būstą, sukelia problemų. Taigi, įvairių šaltinių AIV egzistuoja toje pačioje ekosistemoje, palengvindamos rūšių perdavimą ir virusų genų perrinkimą. Bendra infekcija su skirtingais vandens paukščių AIV paprastai laikoma reikšmingu mechanizmu, skatinančiu virusų įvairovę, sukuriant naujus remisortus 1, 4, 13 .

Pirmą kartą labai patogeniškas H5N1 virusas buvo nustatytas sergančioms žąsims Guangdongo provincijoje 1996 m. 14 . 1997 m. H5N1 reamortantai, kurių HA genas buvo iš A / žąsų / Guangdongo / 1/96 tipo virusų, sukėlė mirtiną protrūkį naminiams paukščiams ir žmonėms Honkonge15. Nuo 2004 m. Pradžios dideli H5N1 virusinės infekcijos protrūkiai paukštininkystės ūkiuose sukėlė milijonus naminių paukščių mirčių - 3, 6, 16 . 2005 m. Dėl H5N1 virusinės infekcijos Qinghai ežero rajone mirė tūkstančiai migruojančių vandens paukščių 3, 6 . Tada Qinghai ežero H5N1 virusas išplito Europoje ir Afrikoje ir padidino pasaulinį viruso paplitimą. Neseniai Azijoje buvo išskirtas naujas H5N6 virusas, kuris H5N1 ir H6N6 virusus sukėlė 17, 18, 19 . Toks naujas virusas buvo patogeniškas vištoms ir nuo 2014 m. Kinijoje sukėlė keletą žmonių infekcijų 20, 21 . Be to, H5N6 virusas taip pat buvo išskirtas iš naminių kačių ir laukinių paukščių Kinijoje 22, o tai rodo, kad žinduoliai ir laukiniai paukščiai gali prisidėti prie viruso cirkuliacijos.

H3 gripo virusas yra plačiai paplitęs įvairiose rūšyse ir dažnai buvo išskirtas iš žmonių, kiaulių, paukščių ar laukinių gyvūnų. H3 potipiai nustatė naminių paukščių kilmės linijas ir sukėlė lengvas ar sunkias ligas, o iš naminių naminių paukščių visame pasaulyje buvo išskirti daugybiniai potipiai, tokie kaip H3N2, H3N6 ir H3N8. 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 . Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad paukščių kilmės H3 gripo virusai gali daugintis pelių kvėpavimo takuose, tai reiškia, kad paukščių H3 izoliatai gali kelti pavojų visuomenės sveikatai 30, 31 .

Bendras AIV, apimančių H3 ir H5 potipius, cirkuliacija išlieka blogai suprantama. 2014 m. Žiemą mes nukreipėme į ūkius Wugango mieste, Hunano provincijoje, Kinijoje, ir surinkome pavyzdžių iš naminių ančių ir žąsų bei iš ančių fermų vandens. Šiame tyrime mes pranešame apie naujus H3 ir H5 gripo virusų, kilusių iš bendro protėvio naminėse ančiose, pasikartojimus ir pabrėžiame poreikį kontroliuoti H5N6 virusinę infekciją paukščių fermų vandens paukščiuose.

Rezultatai

Mėginių paėmimas ir virusų išskyrimas

Mūsų ilgalaikės priežiūros projekto metu nuo 2014 m. Lapkričio mėn. Iki 2015 m. Balandžio mėn. Buvo paimti du mėginiai. Mėginių paėmimo vietos buvo palei upę Wugang mieste, Hunano provincijoje, Kinijoje. Naminių ančių ir žąsų auginimas šiame regione pastaraisiais metais labai išaugo. Dauguma ūkių buvo pastatyti didelio tankio teritorijose, kuriose nebuvo biologinio saugumo priemonių. Kai kuriuose ūkiuose sveikos ir sergančios antys ar žąsys buvo laikomos kartu. Iš viso sėkmingai tirti 86 gripo kamienai iš 160 sergančių paukščių mėginių (teigiamas procentas - 53, 8%) (neskelbti duomenys). Iš išmatų mėginių virusas nebuvo išskirtas, o filogenetinei analizei ir biologiniams eksperimentams buvo atrinkta 10 padermių (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Filogenija ir naujojo pasirinkimo aptikimas

Norėdami ištirti genetinį ryšį tarp šių bendrai cirkuliuojančių AIV, pirmiausia palyginome abiejų pagrindinių viruso genų sekas. Keturių H3N2, trijų H3N6 ir vieno H3N8 virusų HA genai turėjo 87, 8–100% nukleotidų tapatumą. DK / HuN / 146/2014 (H3N6) HA genas nukleotidų lygyje turėjo 87, 8–91, 2% tapatumą su keturiais H3N2 virusais. DK / HuN / 199/2014 (H3N8) ir keturių H3N2 virusų HA geno nukleotidų tapatumas buvo tik 88, 1–92, 3% ir buvo pats panašiausias į A / vandens paukštį / Korea / CN-1/2004 (H3N6). ) (94 proc.). Keturių H3N2 virusų HA nukleotidų tapatumas buvo 88, 2–100%. Filogenetinė H3 duomenų rinkinių analizė parodė, kad N2, N6 ir N8 dažniausiai buvo renkami lokaliai (pav. S1). Keturių H3N2 virusų NA genai turėjo 93–99, 1% nukleotidų tapatumo ir susibūrė į Eurazijos paukščių tipo H3N2 virusus. NA genas A / antis / Hunan / 199/2014 (H3N8) turėjo didžiausią panašumą su A / vištiena / Vietnam / G14 / 2008 (H3N8) (97%). Mūsų tyrime išskirti N2 virusai buvo suskirstyti į dvi genetiškai skirtingas grupes, kurios rodo daugybinį įvedimą ir koinfekciją vietinėse vietose. Trys N6 izoliatai, vienas H3 ir du H5, buvo sugrupuoti pagal palaikomas aukštas įkrovos vertes (1 pav .; S1A pav.), Nurodant galimą naujojo H3N6 viruso, turinčio rezortantą H5N6, H5N6 kilmę (2 pav.). Rengiant rankraštį, pranešta, kad 2014 m. H3N6 virusas - A / antis / Guangxi / 175D12 / 2014 - buvo išskirtas iš vietinės anties Guangxi provincijoje 32 . Ši seka buvo įtraukta į mūsų analizę ir filogenetiškai buvo artima H5N6 (1 pav.), Tačiau tiesioginio ryšio nebuvo (ty palaikoma aukšta įkrovos lazdelė). Dėl skirtingos tokio H3N6 viruso ir daugiau izoliatų geografinės padėties (2014 m. Ir 2015 m. Išskirtos trys padermės), H3N6 viruso plitimas pietų Kinijos ančiose buvo nepakankamai įvertintas.

Image

N6 filogeninis NA genų medis yra viduryje tik dėl aiškumo. Neįrodomos įkrovos vertės, mažesnės nei 70%, o dviejų žvaigždučių (**) reikšmė yra aukšta (> 90%), o vienos žvaigždės (*) reikšmė yra vidutinė (> 70% <90%). Juosta žymi nukleotidų pakeitimus vienoje vietoje (poroje / vietoje). Į šį tyrimą įtraukti virusai yra pilki. Santrumpos yra šios: BG, pupelių žąsis; CK, vištiena; DK, antis; Env, aplinka; Gs, žąsis; Md, Meladas; MD, muskuso antis; PG, balandis; QA, putpelė; SW, kiaulė; WD, laukinė antis; AH, Anhui; FJ, Fujianas; GD, Guangdong; GY, Guijangas; GX, Guangxi; GZ, Guidžou; HuB, Hubei; HK, Honkongas; HuN, Hunanas; JS, Jiangsu; JX, Jiangxi; SC, Sičuanas; SD, Shandong; SX, Šansi; ST, Šantou; SZ, Šenzenas; XJ, Sindziangas; YN, Yunnan; ZJ, Džedziangas.

Visas dydis

Image

Originalių H5N1 ir H6N6 virusų, sukėlusių naująjį H5N6, perpardavimo iliustracija; ir vėlesnis H5N6 ir H3N2 arba H3N8 virusų asortimentas, kuris paskatino naujojo H3N6 generavimą.

Visas dydis

Gs / HuN / 118/2014 (H5N6) ir DK / HuN / 144/2014 (H5N6) virusų HA nukleotidų lygis buvo panašus į 99, 3% ir tapatumas su žmogaus virusu A / Guangzhou / 39715/2014 (H5N6) - 97, 9%. ). Filogenetinė analizė parodė, kad du H5N6 virusai buvo suskirstyti į 2.3.4.4 klade su kitais naujais Azijos pavieniais paukščių ir žmonių H5N6 virusais (duomenys nepateikti). Du H5N6 virusai buvo sugrupuoti į 2.3.4.4 klade su dar vienais naujais paukščių ir žmonių H5N6 virusais, išskirtais Laose ir Kinijos pietuose po 2013 m. 33, 34, patvirtinant jų naujausią kilmę.

Molekulinės savybės

Molekulinė analizė atskleidė, kad naujai išskirtų H3N6 ir H3N2 bei H3N8 HA baltymo skilimo vietoje yra vienos bazinės aminorūgšties (aa) (arginino) liekanų PEKQTR / GLF motyvas, būdingas mažai patogeniškiems AIV ( LPAIV). Toks motyvas skyrėsi nuo dviejų H5N6 virusų HA RERRRKR / GLF, atspindinčių didelį viščiukų patogeniškumą (2 lentelė). Buvo pranešta, kad keli amino rūgščių pokyčiai HA, įskaitant T160A, Q226L ir G228S, skatina AIV afinitetą žmogaus tipo receptoriams 35, 36 . Analizuojant receptorių surišimo vietą, paaiškėjo, kad į paukščius panašus receptorių surišimo motyvas yra 226 ir 228 padėtyje HA. Tačiau dviejose H3N2 padermėse buvo nustatyta 160A mutacija. NA delecija (59–69 aminorūgščių padėtis) buvo H3N6 ir H5N6 virusuose, bet ne H3N2 ir H3N8 virusuose. Amino rūgštis, esanti 592, 627 ir 701 padėtyse PB2, leido manyti, kad šie virusai yra mažai patogeniški pelėms 37, 38, 39, tačiau M1 ir NS1 aminorūgščių mutacijos parodė, kad šie virusai gali įgyti replikacijos galimybę žinduoliams 40, 41 . Taigi ančių išskirtas H3N6 virusas turėjo unikalią savybę, palyginti su H3N2 ir H3N8 virusais, ir turėjo tam tikras molekulines savybes su H5N6 virusu.

Pilno dydžio lentelė

H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusų replikacija žinduolių ląstelėse

H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 izoliatas buvo pasirinktas žinduolių ląstelių replikacijai įvertinti. MDCK ląstelėse trijų H3 gripo virusų replikacija buvo žymiai didesnė nei H5N6. tačiau 72 valandas po užsikrėtimo viruso titrai buvo mažesni nei DK / HuN / 144/2014 (H5N6) (3A pav.). Trys H3 gripo virusai (DK / HuN / 121/2014, DK / HuN / 146/2014 ir DK / HuN / 199/2014) efektyviai replikavosi žmogaus A549 ląstelėse. DK / HuN / 144/2014 (H5N6) gerai replikavosi žmogaus A549 ląstelėje praėjus 24 valandoms po užkrėtimo. Šie rezultatai parodė, kad atrinktos H3 padermės ir H5N6 virusas iš ančių galėjo efektyviai daugintis žinduolių ląstelėse.

Image

MDCK ir A549 ląstelės buvo pasėjamos virusu (10 4 EID50), ir supernatantai buvo surinkti titravimui. ( A ) Virusų augimo kreivės MDCK ląstelėse. ( B ) A549 ląstelių virusų augimo kreivės. Pateikti duomenys yra viruso titrai (log 10 EID 50 / ml), o punktyrinės linijos rodo apatines aptikimo ribas.

Visas dydis

Pelių H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusų Virulencija

Buvo įvertintas keturių gripo virusų, ištirtų žinduolių ląstelėse, patogeniškumas pelėms. Po šešių savaičių BALB / c pelių užkrėtimo kiekvieno viruso 10 6 EID50, per dviejų savaičių stebėjimo laikotarpį liga ar mirtis neįvyko (4A pav.). DK / HuN / 121/2014 (H3N2) ir DK / HuN / 199/2014 (H3N8) replikavosi aukštais titrais ne tik plaučiuose, bet ir nosies turbinatuose (4B pav., D). Nors DK / HuN / 146/2014 (H3N6) ir DK / HuN / 144/2014 (H5N6) efektyviai replikavosi plaučiuose, jie vos ne replikavosi nosies turbinatuose (4C pav., E), ir tai rodo, kad šių dviejų padermių genų rekombinacija gali būti netinkamas veiksmingam replikavimui žinduoliuose prieš formuojant stabilią liniją. Nebuvo rasta jokių virusų smegenyse, blužnyje ar inkstuose. Taigi AIV, kilę iš ančių ar žąsų, pelėse sukėlė infekciją, bet neturėjo jokios akivaizdžios ligos ar mirtingumo.

Image

( A ) H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusų Virulencija pelėms. Pelės buvo užkrėstos H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusais (106 EID50) po 50 μl. Pelės svoris buvo stebimas kiekvieną dieną dvi savaites. ( B – E ) H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusų dauginimasis pelėse. 3 dienos po inokuliacijos trys pelės buvo sužalotos, o nosies turbinatai, plaučiai, inkstai, blužniai ir smegenys buvo surinkti viruso titravimui vištų kiaušiniuose. Pateikti duomenys yra trijų pelių viruso titrai (log 10 EID 50 / ml); klaidų juostos nurodo standartinius nuokrypius.

Visas dydis

Diskusija

Hunano provincija Kinijoje yra migruojančių paukščių Rytų Azijos ir Australijos skrajute. Šiame regione auginamų ančių ir žąsų ūkiai yra blogai užauginti, o naminių ančių ir žąsų auginimas vyksta tankiai ir laisvai laikomose vietose, netaikant biologinio saugumo priemonių, todėl šis regionas tampa puikia AIV ekosistema tarp naminių ar migruojančių paukščių. Be to, antys ar žąsys iš kai kurių paukštininkystės ūkių buvo importuotos ir vėliau parduotos gyvų naminių paukščių rinkose, kurios suteikia papildomų galimybių virusams persirinkti ir išsivystyti užsienyje esančioms AIV, esančioms už Hunano provincijos ribų. Todėl šis veisimo, ūkininkavimo ir rinkodaros modelis paskatino skirtingų šaltinių gripo virusus ūkiuose sugyventi kartu ir palengvinti rūšių persikėlimą tarp virusų bei virusų genų perskirstymą. Siekiant užkirsti kelią virusų plitimui ir kontroliuoti jį, būtina griežtai įgyvendinti priemones, įskaitant uždarą šėrimą, draudimą nemokamai gabenti ir aktyvią priežiūrą.

Mūsų filogenetinės analizės parodė, kad vietiniuose ančių ir žąsų ūkiuose H3 ir N6 potipių tipai dažnai persiskirstė. Ankstesnis darbas parodė, kad H5N6 virusai buvo nauji rezorbatoriai, kurie atsirado Pietryčių Azijoje, o N6 buvo gauti iš H6N6 18, 20, 22, 42 . Filogenetinės analizės parodė, kad visi naujojo H3N6 rezorbatoriaus NA, PB2, PB1, PA, NP, M ir NS buvo gauti iš neseniai atsiradusio H5N6 (1 pav. Ir S1 pav.), O jo HA genas buvo iš H3N2 arba H3N8. izoliuota nuo pietų Kinijos. Tuo tarpu H3N2, H3N8 ir H5N6 virusus sėkmingai išskyrėme iš ančių ir žąsų toje pačioje vietoje, tai reiškia, kad kelių potipių cirkuliacija palengvina gripo viruso vystymąsi ir perskirstymą vandens paukščiams.

Vandens paukščiai yra pagrindiniai natūralūs H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusų šeimininkai. Literatūroje mes patvirtinome, kad dauguma H3N2, H3N8 ir H5N6 virusų, apie kuriuos pranešta 2012–2014 m., Buvo išskirti iš vandens paukščių, ypač medetkų ir muskusinių ančių, ir tik nedaugelis buvo išskirti iš viščiukų. Šie rezultatai rodo, kad vandens paukščiai, bet ne naminiai vištos, prisidėjo prie H3N2, H3N8 ir H5N6 virusų evoliucijos. Žmonių užsikrėtimas H5N6 virusu Kinijoje pabrėžia galimą viruso pavojų visuomenės sveikatai. Mūsų tyrime, nepaisant efektyvaus žinduolių ląstelių dauginimosi, du H5N6 izoliatai buvo mažai patogeniški žinduoliams. Panašiai naujojo H3N6 rinkinys taip pat turėjo mažą pelių virulentiškumą. Taigi H3N6 ir H5N6 AIV dar nėra visiškai pritaikyti ir gali sukelti sunkias žinduolių ligas, jei jiems bus leista vystytis toliau.

Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad naminiai ančių ir žąsų ūkiai pietų Kinijoje sukuria kelių AIV apyvartos ekosistemą ir palengvina naujų reimortantų, tokių kaip H3N6, kurie galėtų užkrėsti žinduolius, generavimą. Taigi pietų Kinijoje skubiai reikia plataus masto susijusių AIV stebėsenos vandens paukščiuose ūkiuose ir žinduolių aplinkinėse teritorijose.

Metodai

Priemonės ir etikos pareiškimas

Visi eksperimentai su gyvais H5N6 virusais buvo atlikti sustiprinto gyvūnų biologinio saugumo lygio 3+ (ABSL3 +) patalpose Lanžou veterinarijos tyrimų institute (LVRI) ir Kinijos žemės ūkio mokslų akademijos (CAAS) Harbino veterinarijos tyrimų institute (HVRI). Šis tyrimas buvo atliktas griežtai laikantis Kinijos Liaudies Respublikos mokslo ir technologijos ministerijos laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadove pateiktų rekomendacijų. Tyrimų su gyvūnais protokolus patvirtino ir LVRI, ir HVRI eksperimentų su gyvūnais etikos komitetas.

Viruso išskyrimas

Iš aštuonių naminių paukščių fermų prie upės iš ančių ir žąsų buvo paimta 160 mėginių. Be to, buvo paimta 10 išmatų ir 10 vandens mėginių. Kiekvienas audinio, tampono, išmatų ar vandens mėginys buvo dedamas į 2 ml būtiniausios terpės, papildytos penicilinu (2000 V / ml) ir streptomicinu (2000 V / ml). Mėginiai buvo nedelsiant užšaldyti sausu ledu ir pernešti į laboratoriją laikomi ant sauso ledo. Visi atskiri mėginiai buvo pasėti į 10 dienų embrionuotų vištų kiaušinių 48 valandas 37 ° C temperatūroje. Buvo paimti alantoidinio skysčio mėginiai ir nustatytas HA aktyvumas su 1% vištienos raudonųjų kraujo kūnelių. Visi teigiami buvo padalijami į dalis ir laikomi - 80 ° C temperatūroje. Norint išvengti kryžminio užkrėtimo kiaušinių inokuliacijos ir alantoidų skysčių rinkimo metu, buvo taikomi griežti sterilūs metodai. Visi procedūros metu naudoti instrumentai prieš naudojimą buvo autoklavuojami ir po kiekvieno kiaušinio dezinfekuojami 70% etanoliu. Kiekvienas mėginys buvo padalintas į dvi alikvotas ir viruso išskyrimo procedūrai buvo naudojamas tik vienas alikvotas. Kai HA tyrimas buvo teigiamas, buvo atliktas hemagliutinino slopinimo (HI) tyrimas, siekiant nustatyti izoliuoto AIV ir Niukaslio ligos viruso (NDV) HA potipį. Hemagglutinino (HA) potipiai pirmiausia buvo nustatyti pagal kiekvieno potipio vištienos serumo anti-HA, tada buvo naudojami specialūs PGR metodai, siekiant papildomai identifikuoti HA ir NA potipius.

Virusai ir ląstelės

Šiame tyrime naudoti H3N2, H3N6, H3N8 ir H5N6 virusai buvo išskirti naudojant 10 dienų amžiaus specifinius patogenų neturinčius embrionuotus vištų kiaušinius. Iki naudojimo virusai buvo laikomi 70 ° C temperatūroje. Madino – Darbio šunų inkstų (MDCK) ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (Gibco), papildytoje 5% vaisiaus vaisiaus serumo ir 100 UI / ml penicilino bei 100 μg / ml streptomicino. A549 ląstelės buvo palaikomos F-12K maistinių medžiagų mišinyje (Gibco), papildytame 10% galvijų vaisiaus serumo ir 100 UI / ml penicilino bei 100 μg / ml streptomicino. Visos ląstelės buvo inkubuotos 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 .

RNR ekstrahavimas ir RT-PGR amplifikacija

Virusinės RNR buvo išgaunamos iš virusais užkrėsto alantoidinio skysčio viruso RNR mini rinkiniu (QIAGEN). cDNR buvo susintetinti iš vRNR atvirkštinės transkripcijos būdu su Uni12 pradmeniu ir amplifikuoti PGR su pradmenimis, papildančiais konservuotą promotorių ir kiekvieno geno segmento nekoduojančią sritį (pradmenų sekos buvo pateikiamos paprašius).

Evoliucinė analizė

Filogenetiniai ryšiai buvo nustatyti remiantis maksimalios tikimybės (ML) metodu, kurį galima rasti „PhyML“ (3.1 versija) 43, ir patikrinta MEGA (5.2.2 versija) 44, naudojant tą patį metodą. Kiekvieno mazgo tvirtumui nustatyti buvo panaudotos SPR (šaknų genėjimas ir pakartotinis persodinimas) filialų apsikeitimas ir 1 000 įkrovos atkarpų replikacijų. „JModelTest“ (2.1.7 versija) 45 buvo naudojamas tinkamiausiam nukleotidų pakeitimo modeliui parinkti, kurie yra: GTR + I N6 duomenų rinkiniui, K2 + Γ M1, HKY + Γ NP, GTR + Γ PA, GTR + Γ PB1, o GTR + Γ - PB2. Visos sekos buvo suderintos MUSCLE (3.8.31 versija) 46, vadovaujantis suderintomis baltymų sekomis.

Virusų augimo kreivės ląstelėse

Virusai buvo pasėti į MDCK ir A549 vienkartinius sluoksnius su 10 4 50% kiaušinių infekcine doze (EID 50 ). Praėjus valandai po užkrėtimo, ląstelės buvo pakeistos šviežiu OPTI-MEM (turinčiu 0, 25 μg / ml TPCK-tripsino H3 potipio virusams) ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje. Viruso turintys supernatantai buvo surinkti įvairiais laiko momentais, po infekcijos (hpi) ir titruojami kiaušiniuose. Parodyti augimo duomenys buvo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis.

Pelės tyrimas

Norint įvertinti AIV virulentiškumą ir replikaciją žinduoliuose, penkioms BALB / c pelių grupėms (6 savaičių patelėms iš „Vital River Co. Ltd.“, Pekinas, Kinija) buvo paskiepyti virusai 10 6 EID 50, 50 μl tūrio. Norint nustatyti virusų replikaciją pelėse, trys pelės buvo sunaikintos praėjus 3 dienoms po inokuliacijos (dpi), jų nosies turbinatai, plaučiai, inkstai, blužniai ir smegenys buvo surinkti viruso titravimui kiaušiniuose. Likusios pelių ligos ir mirtis dvi savaites buvo stebimos.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Li, X. et al. Bendra H5N6, H3N2, H3N8 cirkuliacija ir naujojo H3N6 pakartotinio porcijos atsiradimas vietinėje bendruomenėje Hunano provincijoje Kinijoje. Mokslas. Rep. 6, 25549; „doi“: 10.1038 / srep25549 (2016).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.