Flt3 ligando ir gm-csf genų koekspressija moduliuoja imuninius atsakus, kuriuos sukelia her2 / neu dna vakcina | vėžio genų terapija

Flt3 ligando ir gm-csf genų koekspressija moduliuoja imuninius atsakus, kuriuos sukelia her2 / neu dna vakcina | vėžio genų terapija

Anonim

Anotacija

DNR vakcina ir dendritinių ląstelių (DC) pagrindu sukurta vakcina atsirado kaip perspektyvi vėžio imunoterapijos strategija. DC išplėtimui buvo panaudotas į Fms panašus tirozinkinazės 3-ligandas (Flt3L) ir granulocitų – makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GM-CSF). Anksčiau buvo pranešta, kad GM-CSF koduojančios plazmidės derinys su HER2 / neu DNR vakcina daugiausia sukelia CD4 + T-ląstelių tarpininkaujamą priešnavikinį imuninį atsaką. Šiame tyrime mes ištyrėme imuninės reakcijos moduliavimą pelių Flt3L ir GM-CSF, kurie veikė kaip genetiniai pagalbininkai bicistroninių (pFLAG) ir monocistroninių (pFL ir pGM) plazmidžių formose HER2 / neu DNR vakcinai (pN-neu ). Bendras Flt3L ir GM-CSF ekspresija žymiai pagerino blužnies DC subrendimą ir antigeno pateikimą. Pelėms, vakcinuotoms pN-neu kartu su pFLAG, buvo pastebimas didesnis infiltruojančios DC skaičius imunizacijos vietoje, didesnė interferono-y gamyba ir sustiprėjęs splenocitų citolitinis aktyvumas. Svarbu tai, kad vakcinuotoms pelėms buvo sukeltas stiprus CD8 + T-ląstelių sukeliamas priešvėžinis imunitetas prieš šlapimo pūslės navikus, natūraliai per daug eksploatuojančius HER2 / neu. Bendrai kalbant, mūsų rezultatai rodo, kad pelių Flt3L ir GM-CSF genai, išeksplikuoti bicistroninės plazmidės, moduliuoja imuninių reakcijų klasę ir gali būti pranašesni už tuos, kuriuos padengia dvi atskiros monocistroninės plazmidės, kaip genetinius HER2 / neu DNR vakcinos priedus.

Įvadas

Kai suaktyvinamos, antigenu (Ag) perkeltos dendritinės ląstelės (DC) migruoja į drenažo limfmazgius, kur jos gruntuoja Ag-specifines CD4 + ir CD8 + T ląsteles. 1, 2 Tirpių rekombinantinių Fms tipo tirozinkinazės 3-ligando (Flt3L) ir granulocitų - makrofagų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (GM-CSF) skyrimas pelėms daro papildomą poveikį blužnies DC skaičiaus išplėtimui. 3 Flt3L turi augimą stimuliuojantį poveikį DC pirmtakams ir gali generuoti daugybę DC in vivo . 4, 5, 6 Be to, GM-CSF gali įdarbinti Ag pateikiančias ląsteles, pirmiausia DC. 7 Virusinių vektorių 8 arba atskiros plika plazmidės DNR, koduojančios Flt3L arba GM-CSF, pavieniui ar kartu, įvedimas į ląsteles skirtingais pasėjimo būdais ir būdais buvo tiriami metodai, skirti sustiprinti DC sukelto priešnavikinį imunitetą. 9, 10, 11, 12, 13, tačiau mūsų žiniomis, nebuvo pranešimų, kuriuose būtų aprašytas tiek pelių Flt3L, tiek GM-CSF, kuriuos koduoja arba dvi atskiros monocistroninės plazmidės, arba bicistroninės plazmidės, naudojimas kaip genetiniai pagalbininkai. moduliuoti DNR vakcinos sukeltą imuninį atsaką prieš specifinę su naviku susijusią Ag.

ErbB-2 / HER2 / neu onkogenas koduoja 185 kDa transmembraninį glikoproteiną, kuris turi tirozinkinazės aktyvumą ir priklauso epidermio augimo faktoriaus receptorių šeimai. 14, 15 HER2 / neu yra vienas iš tinkamiausių antigenų taikinių antigenų, taip pat ląstelių ir humoralinių imuninių reakcijų taikinys. Naviko atmetimui, kurį sukelia vakcinacija nuo HER2 / neu DNR, reikia CD4 + T ląstelių. 16, 17. Be to, CD4 + T ląstelės yra pagrindiniai priešnavikiniai efektoriai, kuriuos sukelia imunizacija HER2 / neu ir GM-CSF. 18, 19 Šiame tyrime mes panaudojome HER2 / neu DNR vakciną, norėdami ištirti adjuvantinį pelių Flt3L ir GM-CSF poveikį skirtingoms plazmidžių konstravimo formoms. Mes parodėme, kad Flt3L ir GM-CSF, kaip genetinių pagalbinių medžiagų, ekspresija sukėlė CD8 + T-ląstelių tarpininkaujamą priešnavikinį imuninį atsaką. Šie rezultatai šiek tiek skyrėsi nuo ankstesnių pranešimų, rodančių, kad apsauga, kurią sukelia HER2 / neu DNR vakcina kartu su GM-CSF koduota plazmidė, daugiausia priklauso nuo CD4 + T-ląstelių. 18, 19 Stebina, kad bicistroninės ekspresijos plazmidė pasirodė esanti veiksmingesnė kaip genetinis adjuvantas nei dviejų monocistroninių plazmidžių derinys, aktyvuodamas DC ir stiprindamas natūralių žudikų (NK) ir T ląstelių citolitinį aktyvumą pelių pelės šlapimo pūslės navike-2 (MBT). -2) naviko modelis. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad Flt3L ir GM-CSF koekspressija yra perspektyvi strategija modifikuoti priešnavikinių imuninių reakcijų klasę ir padidinti DNR vakcinų nuo navikų susijusių antigenų efektyvumą.

Rezultatai

Įvairių skiepijimo vektorių konstravimas ir apibūdinimas

Mes sukūrėme pFLAG, kuris kartu ekspresuoja GM-CSF ir Flt3L, susietus su IRES elementu, taip pat pFL, pGM ir pN-neu, kurie atitinkamai išreiškė žiurkės p185neu Flt3L, GM-CSF ir N-galinį tarpląstelinį domeną. COS-7 ląstelės, transfekuotos pFLAG, pFL, pN-neu arba pcDNA3.1 plazmidės DNR, buvo tiriamos dėl Flt3L ar p185neu ekspresijos. 1a paveiksle parodyta, kad Flt3L ekspresija buvo aptinkama COS-7 ląstelėse, transfekuotose pFLAG arba pFL imunohistocheminiu dažymu. Be to, COS-7 ląstelės, perkeltos su pN-neu, bet ne su kontroliniu vektoriu, išreiškė p185neu, kaip nustatyta intracitoplazminiu dažymu, naudojant srauto citometriją (1b paveikslas). Kai COS-7 ląstelės buvo transfekuotos pFLAG, GM-CSF koncentracija supernatante praėjus 24 ir 36 valandoms po transfekcijos buvo atitinkamai 2709, 28 ± 20, 26 ir 4194, 06 ± 38, 79 pg ml- 1, kaip nustatyta fermentais sujungtame imunosorbentų tyrime. . Panašiai, GM-CSF koncentracijos pGM perkeltų COS-7 ląstelių supernatante per 24 ir 36 valandas po transfekcijos buvo atitinkamai 3082, 13 ± 27, 61 ir 4862, 37 ± 51, 31 pg ml- 1 .

Image

PN-neu ir citokinų ekspresijos vektorių apibūdinimas in vitro ir in vivo . a ) Imunohistocheminis Flt3L ekspresijos aptikimas COS-7 ląstelėse, transfekuotose pFLAG, pFL arba kontroliniu vektoriu. Buvo atliktas valdymo pultas, kuriame anti-Flt3L antikūnas nebuvo praleistas dažant COS-7 ląsteles, transfekuotas pFLAG. ( b ) HER2 / neu ekspresijos srauto citometrinė analizė COS-7 ląstelėse, transfekuotose pN-neu. Transfekuotos COS-7 ląstelės buvo inkubuotos su IgG2a izotipu, norint dažyti foną. Parodytas N-neu ekspresuojančių ląstelių procentas. ICS, intracitoplazminis dažymas. ( c ) Pelių, įšvirkštų pFLAG, vėžio formavimasis, vėliau sukeliantis naviką. C3H / HeN pelėms kas savaitę buvo švirkščiama tris kartus pFLAG arba kontroliniu vektoriu (50 μg), arba fiziologiniu tirpalu. Po septynių dienų po paskutinės imunizacijos pelės buvo užkrėstos MBT-2 ląstelėmis (1, 5x106). Duomenys parodomi kaip pelių, kuriose nėra naviko, procentinė dalis po kiekvienos grupės užkrėtimo naviku ( n = 8) ir atspindi du nepriklausomus eksperimentus. P = 0, 0249 pFLAG prieš kontrolinį vektorių ir P = 0, 0031 pFLAG prieš druskos tirpalą pagal log-rank testą. ( d ) MHC-II paviršiaus išraiškos CD11c + splenocituose iš pelių, įšvirkštų pFLAG arba pFL / pGM, aptikimas. Pelės, imunizuotos pFLAG (50 μg), pFL (50 μg) ir pGM (50 μg) arba kontroliniu vektoriu (50 μg), kaip aprašyta aukščiau, buvo nužudytos praėjus 7 dienoms po paskutinės imunizacijos, o jų splenocitai buvo tiriami fenotipiškai ir funkciškai. Bluso CD11c + ląstelių, išreiškusių MHC-II, procentai (vidurkis ± sd), apskaičiuoti iš keturių nepriklausomų pFLAG, pFL / pGM, vektoriaus ir fiziologinio tirpalo eksperimentų, buvo 50, 32 ± 3, 81, 47, 49 ± 3, 67, 40, 83 ± 5, 22 ir 41, 00 ± 2, 62%, atitinkamai. P = 0, 02 pFLAG prieš vektorių ir pFL / pGM prieš fiziologinį tirpalą; P = 0, 006 pFLAG prieš fiziologinį tirpalą. Parodyta reprezentatyvi histograma iš trijų pelių iš keturių nepriklausomų eksperimentų. ( e ) sustiprinta MLR stimuliacija DC, išskirto iš pelių, gaunančių pFLAG. Allogeninės atsakiklio T ląstelės (105) iš BALB / cJ pelių 3 dienas buvo stimuliuojamos mitomicinu C apdorotu DC iš C3H / HeN pelių, gaunančių įvairius citokinų plazmidžius skirtingais S: R santykiais. T-ląstelių proliferacija buvo nustatyta naudojant MES pagrįstą ląstelių proliferacijos rinkinį. T-ląstelių augimo indeksas buvo apskaičiuotas kaip stimuliuotų reaguojančių ląstelių OD 490 nm vertės santykis su nem stimuliuotų respondentinių ląstelių santykiu. Pateikti duomenys buvo vidurkis ± sd ( n = 4 arba 5), ​​kurie atitiko du nepriklausomus eksperimentus. P <0, 001 pFLAG prieš pFL / pGM ir pFL / pGM arba vektorius prieš fiziologinį tirpalą, naudojant dvipusį ANOVA. ANOVA, dispersijos analizė; DC, dendritinės ląstelės; Flt3L, Fms tipo tirozinkinazės 3-ligando; MBT-2, pelės šlapimo pūslės navikas-2; MHC, pagrindinis histo suderinamumo kompleksas; MLR, mišri limfocitų reakcija.

Visas dydis

Injekcija su pFLAG sulėtino naviko formavimąsi ir padidino blužnies DC sugebėjimą pateikti Ag

Pelėms, kurioms kas savaitę buvo skiriamos trys pFLAG, kontrolinio vektoriaus ar fiziologinio tirpalo dozės, kas savaitę buvo skiriamos MBT-2 ląstelės, buvo tiriamos pelės nuo auglių, tik pFLAG injekcija apsaugojo pelius nuo auglių. Kaip parodyta 1c paveiksle, auglys kai kuriose kontrolinėse pelėse buvo rastas jau praėjus 6 dienoms po auglio užkrėtimo. Tačiau pFLAG gydytų pelių augliai nebuvo aptinkami tik praėjus 11 dienų nuo auglio užkrėtimo. Be to, 33 dieną, kuri buvo paskutinė užregistruota diena, kai visos pelės dar buvo gyvos, vidutinis naviko tūris buvo 1438, 91 ± 269, 41 mm 3 pFLAG gydytų pelių, 2377, 09 ± 427, 08 mm 3 kontrolinių vektorių gydytų pelių atveju ir 2424, 38. ± 423, 96 mm 3 fiziologiniu tirpalu apdorotoms pelėms. Nors iki 22 dienų visoms pelėms, gavusioms pFLAG, buvo aptiktas naviko formavimasis, tačiau, atlikus Kaplan-Meier analizę, tarp pFLAG gydytų pelių ir kontrolinio vektoriaus gydytų pelių ( P = 0, 0249) ar nevakcinuotų, tarp navikų neatsirado auglių santykis. pelės ( P = 0, 0031) buvo statistiškai reikšmingos (1c paveikslas). Nepaisant to, pelių, gavusių pFLAG, išgyvenimas nepadidėjo reikšmingai, palyginti su jų kontrolinėmis grupėmis (duomenys nepateikti). Šie rezultatai rodo, kad vien tik pFLAG injekcija gali sulėtinti naviko progresavimą, tačiau neturėjo jokios naudos didinant išgyvenamumą.

Atlikus srauto citometrinę analizę, mes nustatėme, kad DC populiacija, kuri ekspresuoja ir CD11c, ir MHC-II molekules, padidėjo pelių splenocituose po injekcijos su pFLAG ar pFL / pGM, bet ne su kontroline plazmidė (duomenys nepateikti). Tada mes išgryninome CD11c + blužnies procesus ir nustatėme jų MHC-II raišką. Daugiau CD11c + ląstelių, gautų iš pelių, įšvirkštų pFLAG (vidurkis ± sd 50, 32 ± 3, 81%) arba pFL / pGM (47, 49 ± 3, 67%), išreiškė MHC-II, palyginti su tomis, kurioms buvo įšvirkšta kontrolinio vektoriaus (40, 83 ± 5, 22%) arba fiziologinio tirpalo (41, 00). ± 2, 62%), apskaičiuota iš keturių nepriklausomų eksperimentų. Skirtumai tarp pFLAG ir vektoriaus ( P = 0, 02), pFLAG ir fiziologinio tirpalo ( P = 0, 006) bei pFL / pGM ir fiziologinio tirpalo ( P = 0, 02) buvo statistiškai reikšmingi. 1d paveikslas rodo reprezentatyvią blužnies CD11c + ląstelių, ekspresuojančių MHC-II, histogramą iš trijų pelių kiekvienoje grupėje iš vieno eksperimento. Tačiau CD86 ekspresijos lygis blužnies CD11c + ląstelėse pelėms nepakito, po pFLAG arba pFL / pGM skyrimo (duomenys neparodyti). Nors iš viso splenocituose buvo įvairių imuninių ląstelių populiacijų, jų proliferacijos greitis tarp keturių grupių nesiskyrė (duomenys nepateikti). Be to, mes skiepijome ir praturtinome DC iš vakcinuotų pelių ir panaudojome jas kaip stimuliatorius ląstelėms mišrių limfocitų reakcijoje. DC iš visų gydymo grupių stimuliavo skirtingą alogeninio T-ląstelių dauginimąsi priklausomai nuo dozės. Pažymėtina, kad DC, išskirtas iš pelių, gaunančių pFLAG, buvo patys veiksmingiausi mišrių limfocitų reakcijų stimuliatoriai (1e pav.).

PN-neu vakcinacija kartu su plazmidės DNR, koduojančia Flt3L ir GM-CSF, padidino DC infiltraciją injekcijos vietoje

Mes ištyrėme raumenų mėginių, gautų iš injekcijos vietos, nuoseklias kriostatų dalis iš pelių, vakcinuotų DNR vakcinomis hematoksilino-eozinu ir imunofluorescenciniu dažymu. 2a pav. Parodyta, kad mononuklearinių ląstelių, įsiskverbiančių į injekcijos vietą, laipsnis buvo toks: pFLAG> pFL / pGM> vektorius> fiziologinis tirpalas, kaip nustatė hematoksilino – eozino dėmė. Infiltruojančių ląstelių tipai nuosekliuose kriostato skyriuose taip pat buvo nustatyti imunofluorescenciniu dažymu specifiniais antikūnais. Imunofluorescencija rodo, kad subrendęs DC, kuris ekspresuoja CD11c ir MHC-II, buvo gausiau rastas pelėms, gaunančioms pN-neu plius pFLAG (2b paveikslas), nei pelėms, gaunančioms pN-neu plius pFL / pGM (2c paveikslas), tuo tarpu DC vargu ar matyta jų valdymo kolegos (2d ir e paveikslai). Pažymėtina, kad ląstelės, kurios ekspresuoja MHC-II, taip pat aptinkamos CD11c ląstelėse. Tai rodo, kad makrofagai taip pat gali patekti į injekcijos vietą pelėms, vakcinuotoms pN-neu kartu su pFLAG arba, mažesniu mastu, su pFL / pGM. Be to, CD8 + ląstelės taip pat buvo aptiktos iš pelių, vakcinuotų pN-neu plius pFLAG (2b pav.), Ir mažesniu mastu iš tų, kurios gavo pN-neu plius pFL / pGM (2c paveikslas). Pažymėtina, kad CD8 raiška buvo stebima kai kuriuose, bet ne visuose DC, kurie kartu ekspresuoja CD11c ir MHC-II (2b ir c pav.). Tačiau T ląstelių nebuvo rasta visuose tirtuose raumenų pjūviuose, kurie buvo aptikti imunohistocheminiu dažymu anti-CD3 antikūnais (duomenys nepateikti). Šie rezultatai rodo, kad pelės, gavusios pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM, į vakcinacijos vietą įsiskverbė tiek CD8 + limfoidinis, tiek CD8 - mieloidinis DC.

Image

Infiltruotų ląstelių apibūdinimas imunizacijos vietoje. Trijų pelių grupės buvo imunizuotos 0 ir 14 dienomis pN-neu (50 μg) kartu su pFLAG (50 μg), pFL (50 μg) plius pGM (50 μg) arba kontroliniu vektoriu (50 μg) ir užmuštos. 21 dieną, o raumenys aplink injekcijos vietą buvo greitai užšaldyti. Serijinės kriostato sekcijos buvo tiriamos H&E dažymu ir imunofluorescencija. ( a ) Mononuklearinių ląstelių, įsiskverbiančių į injekcijos vietą, laipsnis buvo toks: pFLAG> pFL / pGM> vektorius> fiziologinis tirpalas, kaip nustatyta H&E dėme (pradinis padidinimas × 400). Tuo tarpu CD11c, MHC-II ir CD8 ekspresijos buvo aptiktos imunofluorescencijos būdu ląstelėse, infiltruojančiose į injekcijos vietą iš pelių, gaunančių pN-neu plius pFLAG ( b ), ir mažesniu mastu iš pelių, gaunančių pN-neu plius pFL / pGM ( c ). Atkreipkite dėmesį, kad CD11c + ląstelės injekcijos vietoje buvo sunkiai aptinkamos pelėms, gavusioms pN-neu plius kontrolinį vektorių ( d ) arba druskos tirpalui ( e ). Branduoliai buvo priešpriešiniai naudojant DAPI. Sujungtas stulpelis parodo ląstelių, nudažytų CD11c, MHC-II arba CD8 ir DAPI, superpoziciją, kad vizualizuotų kolokalalizaciją. DAPI, 4, 6-diamidino-2-fenilindolas; H&E, hematoksilino eozinas; MHC, pagrindinis histo suderinamumo kompleksas.

Visas dydis

Profilaktinė vakcinacija pN-neu kartu su pFLAG sukeltu stipriu priešvėžiniu imunitetu

Kadangi nespecifinis pFLAG koduojamų citokinų adjuvantinis poveikis gali būti per silpnas, kad slopintų naviko augimą, norint sukelti stiprų priešvėžinį imunitetą MBT-2 naviko modelyje, gali prireikti derinti su DNR vakcina, koduojančia specifinį naviko Ag, pavyzdžiui, HER2 / neu. Tada mes įvertinome vakcinos efektyvumą derindami pN-neu su pFLAG arba pFL / pGM. Pirmiausia įvertinome, ar profilaktinė vakcinacija sukėlė reikšmingą apsauginį imunitetą nuo naviko augimo ir ilgesnį išgyvenimą. Pelėms buvo užkrėstos MBT-2 ląstelės po to, kai joms buvo duotos dvi pN-neu dozės kartu su įvairiais genetiniais priedais, kas 2 savaites. Kaip parodyta 3a paveiksle, auglys išsivystė visoms pelėms, išskyrus tas, kurios gavo pN-neu plius pFLAG. Pelių, skiepytų pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM, auglių augimas buvo žymiai slopinamas per 28 dienas po naviko užkrėtimo, palyginti su abiejų kontrolinių grupių pelėmis. Pažymėtina, kad tik dviem iš septynių pelių, paskiepytų pN-neu plius pFLAG, išsivystė navikai, kurių metu vienam gyvūnui buvo visiškas naviko regresija ir akivaizdus naviko išgydymas, o kitam - labai maža naviko našta. Pažymėtina, kad kai pN-neu ir pFLAG buvo skiriami kartu, 100% pelių išgyveno 100 dienų eksperimentinį laikotarpį (3b paveikslas). Ryškiai priešingai, visos nevakcinuotos fiziologiniu tirpalu gautos pelės mirė per 58 dieną. Nors pelių, vakcinuotų pN-neu kartu su pFL / pGM, išgyvenimo laikas taip pat žymiai padidėjo, palyginti su nevakcinuotų pelių ( P = 0, 0002), pN Neu DNR vakcina kartu su pFL / pGM suteikė tik 28, 6% (2/7) išgyvenamumą 100 dienų po auglio užkrėtimo (3b pav.).

Image

Pelių, vakcinuotų pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM, priešvėžinio imuniteto indukcija profilaktiniame MBT-2 modelyje. C3H / HeN pelės buvo imunizuotos du kartus per 2 savaičių intervalą pN-neu (100 μg) kartu su pFLAG (100 μg), pFL (100 μg) plius pGM (100 μg) arba kontroliniu vektoriu (100 μg). Nevakcinuotoms pelėms buvo skirtas tik fiziologinis tirpalas. Po dviejų savaičių po antrosios imunizacijos pelės buvo pasėjamos MBT-2 ląstelėmis (1, 5x106). ( a ) Naviko tūris kiekvienoje pelių grupėje parodomas iki 42 dienos ( n = 6 arba 7). Kiekviena eilutė žymi vieną atskirą naviką. Atkreipkite dėmesį, kad pelėms, gaunančioms pN-neu ir pFLAG, buvo mažiausias naviko tūris, palyginti su likusiomis trimis grupėmis. b ) parodytos Kaplano ir Meiero išgyvenimo kreivės 100 dieną. Išgyvenimo trukmei apskaičiuoti buvo naudojama užregistruota mirties ar žudymo diena, kai pirminis navikas pasiekė 2500 mm 3 . Duomenys atspindi du nepriklausomus eksperimentus. P = 0, 0002 pFLAG arba pFL / pGM prieš fiziologinį tirpalą; P = 0, 0021 pFLAG vs vektoriui; P = 0, 0065 pFLAG vs pFL / pGM pagal log-rank testą. MBT-2, pelės pūslės navikas-2.

Visas dydis

Terapinė vakcinacija su pN-neu kartu su pFLAG sumažino navikų naštą ir pailgino pelių, turinčių nustatytus navikus, išgyvenamumą

Norėdami ištirti terapinį vakcinų poveikį nustatytiems navikams, kurie labiau mėgdžiojo realias gyvenimo sąlygas, į pelę pasėjome MBT-2 ląsteles; ir po 8 dienų nuo naviko išsivystymo mes tris kartus savaitės intervalais skiepijome naviką turinčias peles pN-neu, kartu su įvairiais genetiniais priedais. Pelės, progresuojančios pN-neu plius pFLAG vakcinuotomis pelėmis, auglio progresavimas buvo lėtesnis nei likusiose trijose pelių grupėse, išskyrus vieną pelę pN-neu plius pFL / pGM vakcinuotų grupių pelėse, turinčiose labai mažą naviko naštą, ir vėliau pasiekiama visiška naviko regresija (4a pav.). Pažymėtina, kad pelių, vakcinuotų pN-neu kartu su pFLAG, išgyvenimas buvo žymiai geresnis, palyginti su pelių, vakcinuotų pN-neu plius kontroliniu vektoriu ( P = 0, 0027) arba nevakcinuotų pelių ( P = 0, 0027) (4b paveikslas).

Image

Terapinis pN-neu derinio su pFLAG poveikis prieš MBT-2 navikus. C3H / HeN pelės 0 dieną buvo pasėjamos MBT-2 ląstelėmis (1, 5 x 10 6 ), po to tris kartus per savaitę skiepijant pN-neu (100 μg) kartu su pFLAG (100 μg), pFL (100 μg) plius. pGM (100 μg) arba kontrolinis vektorius (100 μg). Nevakcinuotoms pelėms buvo skirtas tik fiziologinis tirpalas. ( a ) Naviko tūris kiekvienoje pelių grupėje parodomas iki 50 dienos ( n = 4 arba 5). Kiekviena eilutė žymi vieną atskirą naviką. b ) parodytos Kaplano ir Meiero išgyvenimo kreivės 90 dieną. Išgyvenimo trukmei apskaičiuoti buvo naudojama užregistruota mirties ar žudymo diena, kai pirminis navikas pasiekė 2500 mm 3 . P = 0, 0027 pFLAG vs vektoriui arba fiziologiniam tirpalui pagal log-rank testą. MBT-2, pelės pūslės navikas-2.

Visas dydis

CD8 + T ląstelės vaidino pagrindinį vaidmenį, tuo tarpu CD4 + T ląstelės vaidino dalinį vaidmenį priešvėžiniame imunitete, kurį sukėlė pN-Neu kartu su pFLAG

Kadangi pN-Neu DNR vakcina kartu su pFLAG turėjo apsauginį priešnavikinį imunitetą nuo HER-2 / neu per daug ekspresuojančių MBT-2 navikų profilaktinėje aplinkoje, mes taikėme šį skiepijimo protokolą, kad nustatytume santykinę T-ląstelių pogrupių svarbą apsauginio imuniteto metu. in vivo antikūnų išeikvojimo eksperimentai. Po 30 dienų po auglio užkrėtimo nė vienai iš 13 pelių, paskiepytų pN-neu ir pFLAG, augliai, kurių tūris viršijo 200 mm 3, neatsirado. Tačiau aštuonioms iš devynių vakcinuotų pelių, gydytų anti-CD8 antikūnais, atsirado auglių, kurių dydis viršijo 200 mm 3 . Palyginimui, tik 3 iš 11 vakcinuotų pelių, gydytų anti-CD4 antikūnais, augliai buvo didesni nei 200 mm 3 . Visos nevakcinuotos pelės mirė nuo naviko augimo per 76 dienas po naviko implantacijos. Ryškiai kontrastuojant, daugiau nei 90% gyvūnų, gavusių pN-neu ir pFLAG, nebuvo naviko (5a pav.) Ir išgyveno ilgiau nei 120 dienų (5b paveikslas) po auglio užkrėtimo. CD4 + T ląstelių išeikvojimas paskiepytose pelėse žymiai sumažino priešnavikinį vakcinų efektyvumą, kurį nustatė atsižvelgiant į naviko būklę (5a paveikslas) ir išgyvenamumą (5b paveikslas). Pažymėtina, kad CD8 + T ląstelių išeikvojimas beveik visiškai panaikino priešvėžinį vakcinų efektyvumą. Tačiau CD4 + ir CD8 + T ląstelių išeikvojimas to poveikio dar labiau nepašalino. Apibendrinant, priešvėžinis imunitetas, sukeltas profilaktiškai skiepijant pN-neu ir pFLAG MBT-2 naviko modelyje, priklausė tiek nuo CD4 +, tiek nuo CD8 + T ląstelių, o CD8 + T ląstelės vaidina dominuojantį vaidmenį, o CD4 + T ląstelės veikia pagalbininko vaidmuo.

Image

CD8 + T ląstelės vaidino pagrindinį vaidmenį, tuo tarpu CD4 + T ląstelės vaidino dalinį vaidmenį priešvėžiniame imunitete, kurį sukėlė pN-neu kartu su pFLAG. Pelės buvo imunizuotos pN-neu (100 μg) kartu su pFLAG (100 μg) dienomis −28 ir −14, o 0 dieną buvo užkrėstos MBT-2 ląstelėmis. Be to, pelėms buvo sušvirkšta anti-pelių CD4 ir / arba anti-pelių CD8 monokloniniai antikūnai su savaitės intervalais nuo 9 dienos iki 40 dienos. a ) Duomenys parodomi kaip pelių, kuriose nėra auglio, procentinis procentas nuo auglio užkrėtimo, ir jie atspindi du nepriklausomus eksperimentus. P <0, 0001 vakcinai ir anti-CD4, vakcinoms ir anti-CD8, vakcinoms ir anti-CD4 / CD8 arba fiziologiniam tirpalui prieš vakciną, naudojant log-rank testą. b ) Parodytos Kaplano ir Meiero išgyvenimo kreivės 120 dieną. Duomenys atspindi du nepriklausomus eksperimentus. P <0, 0001 vakcinai plius anti-CD8 ar fiziologinis tirpalas prieš vien vakciną, P <0, 0005 vakcinai plius anti-CD4 / CD8 prieš vakciną ir P <0, 01 vakcinai plius anti-CD4 prieš vakciną pagal log-rank testą. MBT-2, pelės pūslės navikas-2.

Visas dydis

Vakcinacija su pN-neu kartu su pFLAG sustiprino CD8 + T-ląstelių sukeliamą imuninį atsaką

T-ląstelių populiacijos skaičius bendruose splenocituose pelių, gavusių pN-neu kartu su pFLAG, pFL / pGM, kontroliniu vektoriu ar fiziologiniu tirpalu, reikšmingai nepasikeitė (duomenys nepateikti). Remiantis T ląstelių išeikvojimo eksperimentu, parodytu 5a ir b paveiksluose, CD8 + T ląstelės buvo svarbiausi efektoriai, sukeliantys priešnavikinį imunitetą. Norėdami dar labiau patvirtinti HER2 / neu specifinius CD8 + T-ląstelių pirmtakus, kuriuos pelėse sukūrė pN-neu DNR vakcina kartu su pFLAG arba pFL / pGM, mes aptikome CD25 ir IFN-γ ekspresiją paviršiaus blužnies CD8 + T ląstelėmis. CD25, kuris nėra ekspresuojamas ramiai subrendusių T ląstelių, atsiranda aktyvuotų ląstelių paviršiuje. Blužninės T ląstelės 19 h buvo aktyvuotos žiurkės HER2 / neu peptidu, turinčiu MHC I klasės epitopą 19, ir CD25 raiška CD8 + T ląstelėmis buvo nustatyta srauto citometrine analize. Pelės, paskiepytos pN-neu plius pFLAG, sukūrė daugiausiai HER2 / neu specifinių CD8 + CD25 + T-ląstelių pirmtakų, paskui imunizuotų pN-neu plius pFL / pGM (6a pav.). Priešingai, pelėmis, vakcinuotomis pN-neu plius kontroliniu vektoriu, pirmtakai nesukūrė didesnių rezultatų, palyginti su tomis, kurios gavo druskos tirpalą. Be to, mes atlikome dvigubą dažymą CD8 paviršiaus žymeniui ir intracitoplazminiam IFN-γ ant splenocitų, gautų iš imunizuotų pelių, ir po to atlikome srauto citometrinę analizę. Pelės, paskiepytos pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM, sukūrė didesnį kiekį HER2 / neu specifinių CD8 + IFN-γ + T-ląstelių pirmtakų, palyginti su tomis, kurios gaudavo arba pN-neu plius kontrolinį vektorių, arba druskos tirpalą (6b paveikslas). Šie rezultatai kartu parodo, kad pN-neu kartu su Flt3L ir GM-CSF genetiniais priedais sustiprino CD8 + T-ląstelių medijuojamą imuninį atsaką.

Image

HER2 / neu specifinių CD8 + T-ląstelių pirmtakų kiekių nustatymas C3H / HeN pelėse, vakcinuotose pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM. Pelės buvo vakcinuojamos įvairiomis DNR vakcinomis, kaip aprašyta 3 paveiksle. Po keturiolikos dienų trijų pelių splenocitai iš kiekvienos grupės buvo surinkti ir auginami in vitro su HER2 / neu peptidu, apimančiu aminorūgštis 420–429, 19 h. Per paskutines 4 valandas buvo pridėtas Golgistop. Tada ląstelės buvo surinktos ir nudažytos ( a ) paviršiniam CD8 ir CD25 ir ( b ) paviršiaus CD8 ir intracitoplazminiam IFN-γ. CD8 + CD25 + arba CD8 + IFN-γ + T-ląstelių pirmtakų, pelių, imunizuotų įvairiomis DNR vakcinomis, skaičius buvo nustatytas srauto citometrijos metodu. Duomenys išreiškiami CD8 + CD25 + ląstelių / 1, 5 × 105 splenocitų skaičiumi ir CD8 + IFN-γ + ląstelių procentine dalimi splenocituose. Duomenys atspindi du nepriklausomus eksperimentus. ICS, intracitoplazminis citokinų dažymas; IFN-γ, interferonas-γ.

Visas dydis

Mes toliau tyrėme splenocitų, gautų iš pelių, gavusių skirtingus DNR vakcinų derinius, specifinį citolitinį aktyvumą. Blendenai buvo kultivuojami kartu su MBT-2 ląstelėmis, iš anksto apdorotomis mitomicinu C 5 dienas, ir supernatanto IFN-γ kiekis buvo matuojamas fermentais sujungtu imunosorbentų tyrimu. Iš pelių, vakcinuotų pN-neu plius pFLAG, splenocitai sukūrė didžiausią IFN-γ kiekį, paskui skiepyti pN-neu plius pFL / pGM, tuo tarpu tie, kurie gavo pN-neu plius kontrolinį vektorių arba druskos tirpalą, išskyrė nedidelį kiekį IFN-γ (7a paveikslas). Taip pat mes panaudojome laktato dehidrogenazės išsiskyrimo testą, kad papildomai išmatuotume splenocitų citolitinį aktyvumą MBT-2 ląstelių atžvilgiu. Citolitinis aktyvumas buvo tokia tvarka: pFLAG> pFL / pGM> vektorius> fiziologinis tirpalas (7b paveikslas). Ankstesnėse ataskaitose taip pat nurodyta, kad Flt3L baltymas gali sukelti DC diferenciaciją ir NK-ląstelių aktyvaciją. 27, 28, 29 Todėl mes išskyrėme splenocitus ir įvertinome jų NK ​​ląstelių aktyvumą prieš YAC-1 tikslines ląsteles. 28 Pelės, paskiepytos pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM, sukėlė aukštesnį NK-ląstelių aktyvumo lygį nei pelės, paskiepytos pN-neu plius kontroliniu vektoriu ar fiziologiniu tirpalu (7c paveikslas). Visi šie rezultatai rodo, kad pelėms, vakcinuotoms pN-neu kartu su plazmidės DNR, koduojančia Flt3L ir GM-CSF, buvo sukeltas imuninis atsakas, ypač atsakymas į T helper (Th) 1.

Image

Ląstelių tarpinio imuniteto sukėlimas pelėms, vakcinuotoms pN-neu kartu su pFLAG arba pFL / pGM. Pelės buvo vakcinuojamos įvairiomis DNR vakcinomis, kaip aprašyta 3 paveiksle. Po keturiolikos dienų trijų pelių surinkti blužniai aseptiškai buvo pašalinti ir paruošti blužnys. ND, neaptinkamas. ( a ) didesnis pelių, vakcinuotų pN-neu ir pFLAG arba pFL / pGM, didesnis IFN-γ gamyba. Splenocitai buvo pakartotinai stimuliuojami in vitro mitomicinu C apdorotomis MBT-2 ląstelėmis 5 dienas ir supernatanto IFN-γ kiekis buvo įvertintas atliekant fermentais sujungtą imunosorbentą. Pateikti duomenys buvo vidurkis ± sd ( n = 3), kurie buvo nuoseklūs dviejuose nepriklausomuose eksperimentuose. * P <0, 05; *** P <0, 001 pagal Studento testą. ( b ) Padidėjęs splenocitų citolitinis aktyvumas pelėms, vakcinuotoms pN-neu ir pFLAG arba pFL / pGM. Splenocitai buvo pakartotinai stimuliuojami in vitro su 20 U ml −1 žmogaus rekombinantinio IL-2 ir mitomicinu C apdorotų MBT-2 ląstelių 5 dienas. Tada blužnies ląstelės buvo surinktos, inkubuojamos su MBT-2 tikslinėmis ląstelėmis 6 valandas ir nustatomos pagal jų citolitinį aktyvumą. Jei pFLAG prieš vektorių, P <0, 0001, kai E / T santykis 50, P <0, 001, kai E / T santykis yra 25 ir 12, 5, ir P <0, 01, kai E / T santykis yra 6, 25; esant pFLAG ir fiziologiniam tirpalui, P <0, 0001 esant visiems patikrintiems E / T santykiams; esant pFL / pGM vs vektoriui, P <0, 01 esant E / T santykiams 50 ir 25; esant pFL / pGM ir fiziologiniam tirpalui, P <0, 0001 esant E / T santykiams 50, 25 ir 12, 5, P <0, 001, kai E / T santykis 6, 25 pagal Studento t- testą. ( c ) Padidėjęs NK-ląstelių aktyvumas pelėms, vakcinuotoms pN-neu ir pFLAG arba pFL / pGM. Šviežiai išskirti splenocitai buvo inkubuojami su YAC-1 tikslinėmis ląstelėmis 6 val., Po to įvertintas citolitinis aktyvumas. Jei pFLAG prieš vektorių ar fiziologinį tirpalą, P <0, 05, kai E / T santykis yra 50, P <0, 0001, kai E / T santykis yra 25, 12, 5 ir 6, 25; esant pFL / pGM vs vektoriui, P <0, 0001 esant E / T santykiams 25, 12, 5 ir 6, 25; esant pFL / pGM ir fiziologiniam tirpalui, P <0, 0001 esant E / T santykiams 25 ir 12, 5, P <0, 01, kai E / T santykis yra 6, 25 pagal Studento t- testą. ( B ir c ), citolitinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant LDH testą, o E / T santykis žymi efektorinių ląstelių ir taikinių ląstelių santykį. Pateikti duomenys buvo vidurkis ± sd ( n = 3), kurie buvo nuoseklūs dviejuose nepriklausomuose eksperimentuose. ELISA, su fermentais susijęs imunosorbentų tyrimas; IFN-γ, interferonas-γ; LDH, laktato dehidrogenazė; MBT-2, pelės šlapimo pūslės navikas-2; NK, natūralus žudikas.

Visas dydis

Diskusija

Plazmidės DNR, koduojanti Flt3L arba GM-CSF, skatina DC plėtimąsi ir pritraukimą į imunizacijos vietą, o tai gali sukelti stiprią Ag-specifinių T ląstelių imuninę reakciją. 9, 10, 30. Be to, kartu su Flt3L ir GM-CSF koduojančiomis plazmidėmis švirkščiant į odą, DC padidėja veršelių odos inokuliacijos vieta. 30 DNR vakcinacijos būdas yra kritinis parametras naudojant citokinų genetinius priedus. 31 Šiame tyrime mes parodėme, kad plazmidės DNR, koduojančios Flt3L ir GM-CSF, įvedimas į raumenis galėjo modifikuoti priešnavikinių imuninių reakcijų klasę pelėms, gavusioms HER2 / neu DNR vakciną. Daugybė tyrimų patvirtina, kad norint pasiekti sisteminį priešvėžinį imunitetą reikia ir CD4 +, ir CD8 + T ląstelių. Nors ankstesniuose tyrimuose nustatyta, kad apsauga, kurią teikia tik HER2 / neu DNR vakcina 16, 17 arba derinama su GM-CSF koduota plazmidė 18, 19, daugiausia priklauso nuo CD4 + T-ląstelių, šiame tyrime parodome, kad priešvėžinis imunitetas sukelia pN-neu ir pFLAG priklausė tiek nuo CD4 +, tiek nuo CD8 + T ląstelių, dominuojančią reikšmę turėjo CD8 + T ląstelės.

Flt3L ir GM-CSF baltymai turi skirtingą poveikį DC generavimui ir diferenciacijai. 32, 33 Taip pat buvo pasiūlyta, kad atskiri DC pogrupiai, kuriuos sukuria Flt3L ir GM-CSF, gali skirtingai reguliuoti imuninio atsako klasę. Vyraujanti Flt3L forma yra sintetinta kaip transmembraninis baltymas, iš kurio susidaro tirpi forma, greičiausiai proteolitiniu skilimu. Tirpi Flt3L forma (tarpląstelinis domenas) yra funkciniu požiūriu panaši į Flt3L. 34 Šiame tyrime kaip genetinį priedą mes panaudojome tirpią pelių Flt3L formą. 9 Įrodyta, kad tiek tirpios, tiek su membranomis surištos Flt3L formos gali sustiprinti priešvėžinį imunitetą. Tirpi Flt3L forma daugiausia sukuria limfoidinio tipo DC pogrupį, kuris turi aiškų poveikį stimuliuodamas Th1 imuninį atsaką, 3, 4, tuo tarpu GM-CSF sukelia tik mieloidinio tipo DC pogrupį. 3, 33 Taigi, mes manome, kad Flt3L derinys HER2 / neu DNR vakcinoje mūsų tyrime gali smarkiai prisidėti prie imuninių reakcijų klasės moduliavimo, nes Flt3L sukūrė pelių DC, kuris galėtų niežti naivesnes CD8 + T ląsteles ir generuoti atminties ląstelės in vivo . 6 Šiame tyrime ląstelės, įsiskverbusios į injekcijos vietą pelėse, vakcinuotose pN-neu kartu su pFLAG, pasirodė sudarytos iš CD8 + limfoidinio ir CD8 - mieloidinio DC pogrupių. Be to, pFLAG gali būti stipresnis nei pFL ir pGM, sukeldamas limfoidinio tipo DC poaibį. Neseniai buvo pranešta, kad pelių, turinčių nustatytus navikus, gydymas kartu su FltL3 ir GM-CSF baltymais pritraukė daugybę navikų infiltruojančių DC ir sukėlė CD8 + T-ląstelių sąlygotą imuninį atsaką. 36

Pelės blužnies DC gali būti išplėsta į raumenis tiekiant Flt3L arba GM-CSF cDNR. 11 Tačiau stipresnis T-ląstelių proliferacija buvo pastebėtas mišrios limfocitų reakcijos metu, kai stimuliatorius DC atsirado iš pelių, apdorotų Flt3L cDNR, palyginti su pelių, gautų tiek Flt3L, tiek GM-CSF plazmidėmis, pelėmis. Tai leido manyti, kad iš limfoidinės DC, palankiai išplėsta Flt3L, buvo veiksmingiau stimuliuojamos alogeninių T ląstelių proliferacija. 11 Šiame tyrime mes pastebėjome, kad DC atsirado iš pelių, gavusių pFLAG, stimuliavusių didesnį alogeninį T-ląstelių proliferaciją, nei buvo išskirtos iš pelių, gaunančių pFL / pGM. Ankstesniuose tyrimuose buvo nustatyta, kad dviejų citokinų derinys gali turėti papildomą ar net sinergetinį adjuvantinį poveikį, kad būtų naudojamos vakcinos ir genų terapijos plazmidės, kurios kartu ekspresuoja du citokinus. Retrovirusinis vektorius, išreiškiantis GM-CSF ir IL-2 sulietą baltymą, galėtų sukelti didesnį priešnavikinį poveikį nei abu citokinų vektoriai kartu, kai naudojami generuoti citokinų modifikuotas naviko vakcinas. Buvo pranešta, kad plazmidės vektorius, kartu ekspresuojantis GM-CSF ir IL-12, vairuojamus skirtingų promotorių toje pačioje plazmidėje, funkcionuoja kaip genetiniai gripo DNR vakcinos priedai. 38 Be to, bicistroninis retrovirusinis vektorius, kartu ekspresuojantis IFN-α ir IFN-γ, buvo naudojamas pernešti lėtines mieloidinės leukemijos ląsteles. 39 Tačiau šių tyrimų metu 38, 39 tuo pačiu metu atliktas dviejų citokinų ekspressija nebuvo lyginamas su dviejų atskirų plazmidžių, ekspresuojančių vieną citokiną, kartu pateikimu dėl jų imunostimuliacinio efektyvumo. Nors mes negalime atmesti galimybės, kad Flt3L ir GM-CSF išraiškos iš pFLAG gali būti didesnės nei pFL ir pGM išraiškos in vivo , mūsų rezultatai rodo, kad bicistroninis vektorius gali būti pranašesnis už dviejų monocistroninių vektorių derinį tarnaujant kaip genetinis adjuvantas HER2 / neu DNR vakcinai. Kalbant apie genetinių pagalbinių medžiagų naudojimą, įrodyta, kad bicistroniniai konstruktai, ekspressuojantys citokiną ir Ag, o ne du kartu vartojami plazmidės, yra imunogeniški. 12, 40 Taigi, įsivaizduojama, kad tikslus FltL3 ir GM-CSF tiekimas laiku ir erdvėje gali būti naudingas optimaliam priešvėžinio imuniteto indukcijai HER2 / neu DNR vakcina.

Šiame aprašytame darbe, nors vien tik pFLAG nei profilaktiniame MBT-2 modelyje nei išvengė naviko susidarymo, nei pagerino išgyvenamumą, pelėms, vakcinuotoms vien pFLAG, palyginti su jų kontrolinėmis grupėmis, auglio augimas sulėtėjo ir augimo progresavimas sulėtėjo. Šis rezultatas rodo, kad pFLAG turėjo tam tikrą nespecifinį priešnavikinį poveikį navikams. Vienas iš galimų pFLAG vakcinacijos apsauginių mechanizmų gali būti priskiriamas NK-ląstelių aktyvumo padidėjimui. Be to, mūsų rezultatai taip pat rodo, kad pelių, vakcinuotų pN-neu plius pFLAG arba pFL / pGM, splenocitai turėjo stipresnę citolitinę funkciją, apimančią NK-ląstelių aktyvumą. Kadangi Flt3L gali išplėsti ir suaktyvinti pelių blužnies NKDC, unikalų ląstelių pogrupį, turintį ir NK, ir DC savybes, ir Flt3L išplėstą NKDC, turi stiprią citolitinę funkciją ir padidintą T ląstelių stimuliacinį pajėgumą, 41 mes negalime atmesti galimybės, kad NKDC ar kitos efektorinės ląstelės gali dalyvauti priešnavikinėse imuninėse reakcijose. Šiuo tikslu buvo įrodyta, kad DC, išreikštas Flt3L ekspresijai, sustiprina navikams būdingus citotoksinius T ir NK ląstelių atsakus ir sukelia priešvėžinį imunitetą. 42

Šiame tyrime mes pastebėjome, kad bltistroninio pFLAG plazmidės užkoduoto Flt3L ir GM-CSF koekspressija į raumenis padidino DC infiltraciją injekcijos vietoje. Ar pFLAG gavusių pelių, įsiskverbusių į DC, pasiskirstymas įtakos citokinų genetinių priedų apsaugos veiksmingumui; tačiau vis dar neaiškus ir reikalauja tolesnio tyrimo. Laikydamiesi ankstesnių išvadų, 13, 25, nė vienoje apdorotų pelių grupėje nepastebėjome T-ląstelių infiltracijos injekcijos vietoje.

Apibendrinant galima pasakyti, kad Flt3L ir GM-CSF ekspressija bicistroninės plazmidės pagalba su HER2 / neu DNR vakcina sustiprino priešnavikinius imuninius atsakus prieš pelių šlapimo pūslės vėžį, natūraliai viršijančius HER2 / neu. Pelėms, kartu skiriamoms su HER2 / neu DNR vakcina ir genetiniu pagalbiniu pFLAG, DC infiltracija imunizacijos vietoje ir T ir NK ląstelių aktyvumo padidėjimas buvo akivaizdus. Bltistrono vektoriaus kartu ekspresuotų Flt3L ir GM-CSF naudojimo strategiją galima toliau naudoti atliekant įvairius imunoterapinius tyrimus.