Derinant mikroskopiją su mezoskopija, naudojant optinius ir optoakustinius be etikečių režimus | mokslinės ataskaitos

Derinant mikroskopiją su mezoskopija, naudojant optinius ir optoakustinius be etikečių režimus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vaizdo gavimas ir jutimas
  • Fotoakustika

Anotacija

Biologijai reikia stebėjimo esant kelioms geometrinėms skalėms - tai savybė, kurios paprastai nesiūlo vienas vaizdavimo būdas. Mes sukūrėme hibridinę optinę sistemą, kuri ne tik teikia skirtingus kontrasto režimus, bet ir siūlo vaizdą skirtingomis geometrinėmis skalėmis, pasiekdama nepaprastai plačią skiriamąją gebą ir 1000 kartų didesnį tūrį, palyginti su apimtimis, nuskaitytomis optiniu mikroskopu. Sistema derina optoakustinę mezoskopiją, optoakustinę mikroskopiją ir dviejų fotonų mikroskopiją, pastaroji integruoja antrąjį ir trečiąjį harmoninės kartos režimus. Pelės ausies ir zebrafish lervos ex-vivo vaizdavimas be etikečių rodo hibridinės sistemos teikiamą kontrastą ir mastelio papildomumą. Mes demonstruojame aukščiausią anatominę orientaciją, kurią suteikia talpa be etikečių ir hibridinė operacija, naudojant fluorescencinę mikroskopiją ir dinamišką pasirinkimą tarp regėjimo lauko ir skiriamąją gebą, atveriančius naujas galimybes biologinėje vizualizacijoje.

Įvadas

Optinė mikroskopija vaidina esminį vaidmenį tiriant struktūrinę ir funkcinę informaciją ląsteliniame ir požiediniame lygyje, taip pat stebint ląstelių organizavimą ir formavimąsi organuose 1 . Tačiau fotonų išsklaidymas audiniuose neleidžia mikroskopiškai vaizduoti gylyje, viršijančiame kelis šimtus mikrometrų in vivo . Šis apribojimas draudžia viso kūno ar organo lygiu atlikti optinius mikroskopijos tyrimus su mažais gyvūnais ir paskatino sukurti mezoskopinius optinius metodus, galinčius nuskaityti didesnius regėjimo laukus ir gylį 2 . Didesnių matymo laukų vaizdas permatomuose bandiniuose buvo pasiektas naudojant optinę projekcinę tomografiją (OPT) 3 ir selektyviosios plokštumos apšvietimo mikroskopiją (SPIM) 4 . Mesoskopinis nepermatomų pavyzdžių atvaizdavimas taip pat įrodytas mezoskopine fluorescencine tomografija (MFT) 5 ir mezoskopiniu optoakustiniu vaizdavimu 6, 7, 8 . Neseniai pristatėme rastrinio nuskaitymo optoakustinę mezoskopiją (RSOM), kuria pasiekiama 4 μm ašinė skiriamoji geba ir ~ 20 μm šoninė skiriamoji geba iki 3 mm gylio ir 7 μm ašinė / ~ 30 μm šoninė skiriamoji geba 5 gyliuose. mm 9 . Tačiau nė vienas iš šių būdų neleidžia tuo pačiu metu pasiekti didelių skverbimosi gylių ir vaizduoti mikroskopu skyros dideliais, neskaidriais bandiniais.

Tačiau daugeliui biologinių pritaikymų, pavyzdžiui, stebint vystymosi mechanizmus ar norint suprasti erdvinį ligos nevienalytiškumą, būtina vienu metu fiksuoti ir ląstelių, ir viso organizmo lygiu vykstančius procesus bei jų tarpusavio sąveiką 1 . Buvo daugybė metodų, kuriais bandoma mikroskopijoje sujungti skirtingus kontrasto mechanizmus. Visų pirma optoakustinė mikroskopija buvo derinta su antrosios harmoninės kartos (SHG) mikroskopija 10, dviejų fotonų ir konokalinės fluorescencijos mikroskopija 11, optinės koherentinės tomografijos (OCT) 12, impulsų aido ultragarso vaizdavimu 13 ir vieno fotono sužadinimo autofluorescencijos vaizdavimu 14 . Tačiau hibridiniai įgyvendinimai, užtikrinantys daugialypį optinį vaizdą, nebuvo dažni. Kylančios optoakustinės sistemos, tokios kaip RSOM, turi keletą būdingų daugialypių galimybių, aptikdamos skirtingus dažnius 9 arba derindamos optinius ir optoakustinius komponentus 15, tačiau jos veikia su vienu matymo lauku ir nepasiekia ribotos optinės difrakcijos skiriamosios gebos, būtinos mobiliesiems telefonams. ir ląstelių vaizdavimas.

Šiame darbe mes ištyrėme galimybę nuskaityti tūrius, kurie yra 10 kartų didesni už įprastus, nuskaitytus optiniu mikroskopu, ir pasiekti priartinimo galimybę naudojant ribotą optinės difrakcijos skiriamąją gebą. Norėdami pasiekti šį trijų dimensijų mastelio lygį, mes ištyrėme RSOM derinį su optiniu ir optoakustiniu mikroskopu, integruotu į vieną hibridinį įrenginį ir bendrą koordinačių sistemą. Galutinis integruotas daugiafotonis ir daugialypis optoakustinis mikroskopas (IMMSOM) sujungia RSOM su optinės skiriamosios gebos optoakustine mikroskopija (OM), dviejų fotonų sužadinimo fluorescencija (TPEF), antrosios harmonikos kartos (SHG) ir trečiosios harmonikų kartos (THG) mikroskopu. (žr. 1 pav.). Mes apklausėme visų hibridinėje sistemoje naudojamų modelių vaizdavimo be etikečių galimybes ir toliau demonstruojame biologinius vaizdavimo gebėjimus, pagrįstus vidinio audinio kontrastu. Vaizdo atvaizdavimo be etikečių pranašumai buvo ypač ištirti optoakustinės mezoskopijos ir mikroskopijos derinio kontekste, vaizduojant tuos pačius anatominius žymenis, kad būtų galima pasiekti tikslią orientaciją ir įvairaus mastelio registraciją tarp skirtingų skalių, toliau integruojant kitą mikroskopiją. režimai. Tai yra kritinis suprojektuotos sistemos parametras, nes tai leidžia tiksliai suderinti optines etiketes ir nelinijinius signalus ribotos optinės difrakcijos skiriamąja geba su mezoskopijos skenavimu, pasiekiamą ribota akustine difrakcija.

Image

Visas dydis

Rezultatai

Eksperimentinis nustatymas

Įvairialypėje hibridinėje vaizdavimo sistemoje (2 pav., Metodų skyrius) naudojami du skirtingi optoakustinių ir netiesinių modulių lazerio šaltiniai, sujungti į apverstą mikroskopą. Tiek daugiafotonė, tiek optoakustinė mikroskopija naudoja fokusuotą šviesos apšvietimą, tuo tarpu RSOM naudoja platų apšvietimą, paprastai per kelių milimetrų spindulio apskritimą.

Image

a ) IMMSOM sistemos schema OM konfigūracija. Skirtingi skenavimo režimai yra pavaizduoti ( b ) OM, c ) RSOM ir ( d ) THG matavimams. Atitinkama dalis, kuri perkeliama nuskaitymui, nurodoma rodyklėmis. Santrumpos: A, stiprintuvas; DAQ, duomenų kaupimo kortelė; DM, dichroinis veidrodis; F, optinis filtras; FM, atverčiamas veidrodis; GM, galvanometriniai veidrodžiai; Aš, rainelės diafragma; IM, apverstas mikroskopas; L, objektyvas; M, veidrodis; ND, neutralaus tankio filtras; OL, objektyvas; P, smeigtukas; PD, foto diodas; PMT, daugkartinio vaizdo vamzdelis; S, motorizuota xyz pakopa; SCC, nuskaitymo valdymas; SH, mėginio laikiklis; STC, scenos valdymas; UT, ultragarsinis keitiklis.

Visas dydis

Erdvinės skiriamosios gebos apibūdinimas

Norėdami apibūdinti optoakustinės mikroskopijos modalumo erdvinę skiriamąją gebą, išmatuojome 954 nm skersmens juodus polistireno mikrosferas. Vienos sferos vaizdas buvo gautas nuskenavus 8 μm × 8 μm plotą 0, 2 μm žingsniais. 3 (a) paveiksle pavaizduotos mikrosferos Gauso šoninis (mėlyna linija, R2 = 0, 997) ir ašinis (juoda linija, R2 = 0, 993) profilio brėžiniai. Didžiausio intensyvumo projekcijos (MIP) šoniniame ir ašiniame vaizduose pavaizduotos atitinkamai viršutine ir apatine įdubomis. Visas šoninio profilio plotis ties puse maksimumo (FWHM) buvo 910 nm, atitinkantis numatytą šoninę skiriamąją gebą 829 nm (žr. Skyrių „Metodai“). Stebėtą idealaus „Airy“ disko (584 nm) nukrypimą nuo FWHM greičiausiai lėmė netobula lazerio spindulio kokybė ir optinės aberacijos. Nors optoakustinės mikroskopijos sistemos šoninę skiriamąją gebą lemia objektyvo fokusavimo galimybės, ašinę skiriamąją gebą reguliuoja daviklio 16 aptikimo juostos plotis. Jis buvo nustatytas kaip 5, 78 μm, kaip apibrėžta FWHM ašies mikrosferos profilyje. Kita vertus, RSOM modalumo erdvinė skiriamoji geba priklauso tik nuo naudojamo keitiklio savybių, nes apšviestas plotas yra daug platesnis nei jo akustinis fokusavimas. Ankstesniame darbe buvo parodyta, kad ji yra ~ 30 μm šone ir ~ 7 μm ašimi iki 5 mm gylio 17 .

Image

a ) Juodojo 954 nm ilgio mikrosferos OM matavimas. Įdėklai rodo vaizduojamos sferos MIP šoniniame (viršuje) ir ašiniame (apačioje) vaizde. Gauso profilio brėžinius iliustruoja mėlyna (šoninė) ir juoda (ašinės) kreivės. b ) 100 nm fluorescencinių nanodalelių su TPEF ir stiklo-oro optinės sąsajos su THG matavimai. Įdėkle pavaizduotas šoninis nano rutulio vaizdas. Mėlyna ir juoda kreivės rodo atitinkamai Gauso sferos profilius (šoninė, TPEF) ir stiklo-oro sąsają (ašinė, THG). Svarstyklės: 2 μm.

Visas dydis

Kalbant apie daugiafotonių modulių erdvinės skiriamosios gebos apibūdinimą, mes taikėme dvi skirtingas metodikas, kad tiksliai nustatytume mažiausią detalę, kurią išspręsta sukurta sistema gali išspręsti šonine ir ašine kryptimis. Tiksliau, šoninė skiriamoji geba buvo įvertinta atliekant TPEF vaizdavimą 100 nm fluorescencinėse sferose, o ašinė skiriamoji geba buvo eksperimentiškai nustatyta matuojant THG profilį stiklo ir oro sąsajoje su standartine 170 μm viršelio plokšte. 3 (b) paveiksle pavaizduotas įdėklo pavaizduotos fluorescencinės nanosferos šoninis profilio brėžinys su Gauso kreive (mėlyna linija, R2 = 0, 999). Tai davė 1, 75 μm FWHM, kuris atitinka apskaičiuotą šoninę skiriamąją gebą. Nuokrypį nuo ribotos difrakcijos, 1, 18 μm, dydžio pirmiausia galima pateisinti nekompensuotomis sistemos optinėmis aberacijomis. Antrasis paveikslėlis 3 pav. (B) iliustruoja ašinius THG taškinius matavimus. Gauso dera (juoda linija, R2 = 0, 998) davė 5, 84 μm FWHM. Pastaroji reikšmė iš esmės reiškia išmatuotą konokalinį parametrą (fokusavimo gylį), nes įrodyta, kad esant griežtam fokusavimui tiek sužadinimo, tiek Harmonikos spinduliams būdingas tas pats ašinis laipsnis 18 .

Hibridinis pelės ausies vaizdavimas

Norėdami parodyti sukurtos IMMSOM sistemos įvairiapusiškas galimybes, iš pradžių mes pavaizdavome iškirptą pelės ausį. Pirmiausia atlikome matavimus, naudodami RSOM modalumą, nuskaitydami 2 mm x 2 mm bandinio sritį. Vaizdas buvo sukurtas imant rekonstravimo tūrio absoliučios vertės MIP ~ 0, 4 mm gylyje, atitinkančio ausies storį. 4 pav. (A) pavaizduota pelės ausies viso aptikimo juostos pločio (raudona spalva) ir aukšto dažnio (žalsvai mėlyna spalva) atvaizdai, parodantys skirtingo dydžio kraujagysles. Kadangi mažesnės struktūros paprastai sukuria aukštesnius dažnius nei didesnės, aukšto dažnio paveikslėlyje pirmiausia yra aukštos skyros savybės. Atlikus mezoskopijos matavimą, vėlesniam didelės skiriamosios gebos mikroskopijos vaizdavimui buvo pasirinktas mažas plotas, esantis 375 μm × 375 μm (pažymėtas balta dėžute) ties vieno iš didesnių kraujagyslių bifurkacija. 4 (d) paveikslas parodo optoakustinės mikroskopijos matavimo MIP, parodantį didelę skiriamąją gebą didžiojo indo išsišakojimą, taip pat mažesnes savybes (paryškintas baltomis rodyklėmis), kitaip neryškias ar nematomas per RSOM. Be to, pastebimas kontrasto pokytis dideliame vaizduojamame inde.

Image

a ) Didesnio regiono RSOM vaizdas, vaizduojantis viso aptikimo juostos pločio (raudona) ir aukšto dažnio (žalsvai mėlynos spalvos) atvaizdus. Baltas langelis rodo mikroskopijos nuskaitymo sritį su ( b ) šviesiu lauku, c ) TPEF, d ) OM, e ) SHG ir f ) THG būdais. g ) OM, SHG ir THG vaizdų perdanga.

Visas dydis

Tada tas pats regionas buvo pavaizduotas kartu su SHG ir THG būdais. Vaizdai buvo užfiksuoti per 50 μm gylį. SHG ir THG mikroskopu nuskaityto tūrio MIP yra pavaizduoti atitinkamai 4 (e) ir 4 (f) paveiksluose. THG signalai daugiausia buvo gaunami optinėje sąsajoje tarp dangtelio stiklo ir išorinio pelės ausies odos epidermio sluoksnio. Šis stratifikuotas plokščiasis epitelis, kaip žinia, daugiausia susideda iš dauginančių ir diferencijuojančių keratinocitų, kurių struktūra aiškiai matoma 4 pav. (F). Vidutinis šių ląstelių skersmuo yra 25 μm. Atlikdami THG vaizdus, ​​galime papildomai išskirti didelę sritį, kuriai būdingi ląstelių nebuvimas ir minimalus signalo generavimas. Šiame regione taip pat pastebima, kad yra trys tiksliai apibrėžti subregionai, greičiausiai, plaukų folikulai. Kita vertus, SHG vaizduojant kolageną sudaro apatinis dermos odos sluoksnis 19 . Dėl santykinai nedidelio tiriamojo bandinio storio, atrodo, kad kolageno sluoksnis seka keratinocitų struktūrą tankiai ląstelių apgyvendintame regione. Tačiau be ląstelių gautas kontrastas yra pakankamas, kad būtų galima parodyti atitinkamų kolageno virpuliukų struktūrą ir vidinį pasiskirstymą. Vėliau tūris antrą kartą buvo nuskaitytas, kad būtų užfiksuotas TPEF, atsirandantis dėl autofluorescencijos, kurią daugiausia sukelia elastinas 19, kuris yra pagrindinis tarpląstelinės matricos komponentas dermos sluoksnyje (4 pav. (C)). Nors šiuo atveju TPEF vaizdas yra gana panašus į atitinkamą SHG pasiskirstymą, galime pastebėti ryškų signalo skirtumą trijose plaukų folikulų srityse, rodančius, kad juose nėra kolageno kiekio. Galiausiai, palyginant su CCD kamera, buvo užfiksuotas tiriamo lauko šviesus lauko vaizdas, parodytas 4 pav. (B). OM, SHG ir THG vaizdų perdanga parodyta 4 pav. (G).

Hibridinės zebrafish lervos vaizdavimas

Norėdami toliau tirti IMMSOM veikimą su kitu bandiniu, mes papildomai pavaizdavome 6 dienų amžiaus laukinio tipo zebrafish lervą ex-vivo , išmatuodami ~ 4, 5 mm ilgio ir ~ 0, 6 mm skersmens. Mes atlikome panašią procedūrą, kaip aprašyta atliekant pelės ausies matavimą. RSOM vaizdas, atspindintis visą aptikimo juostos plotį, kai nuskaitymo sritis yra 4 mm × 4 mm, pavaizduotas 5 pav. (A). Tai parodo tipiškas šonines (L) ir centrines (C) pigmento juosteles išilgai žuvies kūno. Be to, galima nustatyti papildomus anatominius požymius, tokius kaip akys (E) ir vidiniai organai (O) 9 . Vėlesni mikroskopijos tyrimai buvo atlikti pasirinktoje 315 μm × 315 μm srityje (pažymėta balta dėžute) centrinėje lervos kūno vietoje. 5 pav. (B) iliustruotas OM vaizdas, kuriame aiškiai matomi melanocitai aplink vidurinę plokštumą žuvies kūne. Palyginus su šviesaus lauko vaizdu (5 pav. (C)) tame pačiame kūno gylyje, OM vaizdas suteikia geresnius kontrastinius pokyčius melanocituose (pažymėtus baltomis rodyklėmis). Apatinės melanocitų eilutės neryškumas atsiranda dėl jų padėties už apšvietimo židinio ribų, kurio konokokinis parametras buvo keli μm.

Image

a ) Zebrafish RSOM vaizdas, vaizduojantis šonines (L) ir centrines (C) melanocitų juosteles, vidinius organus (O) ir akis (E). Mikroskopiniai vaizdai buvo gauti iš baltos spalvos langelio nurodytos vietos. Vaizdai buvo atlikti naudojant ( b ) OM, ( c ) šviesų lauką, ( d ) SHG ir ( e ) THG būdus. f ) OM, SHG ir THG vaizdų perdanga.

Visas dydis

Tuo pat metu 5 paveikslo d (e) paveiksluose pavaizduoti SHG ir THG vaizdai parodė lervos kūno raumenų struktūrą toje pačioje židinio plokštumoje kaip ir atliktas OM matavimas. SHG paveikslėlyje galima atskirti įvairius raumenų segmentus (myomerus), sudarančius žuvies kūno raumenis. Erdvinė modalumo skiriamoji geba yra pakankama norint išspręsti vieno raumens virputes, kurios dėl ryškių anizotropinių optinių savybių 21 veikė kaip pagrindinis SHG signalų 20 šaltinis. Be to, THG signalai daugiausia kilo iš regionų tarp miomerų, greičiausiai reprezentuojančių vertikalią miozeptą; ploni jungiamojo audinio lakštai, kurie atskiria ir palaiko miomeras ir prie kurių yra pritvirtintos miofibrilės. Galiausiai 5 pav. (F) parodo trigubo modulio vaizdą kaip OM, SHG ir THG signalų perdangą.

Diskusija

Mes sukūrėme hibridinę optinio ir optoakustinio vaizdo gavimo sistemą (IMMSOM), pasiekdami unikaliai didelę skiriamąją gebą ir gylio skverbimosi diapazoną, sujungdami optinį ir optoakustinį mezoskopijos ir mikroskopijos metodus į vieną įrenginį. Naudodama įvairaus kontrasto vaizdus be etikečių, sistema pademonstravo galimybę tuo pačiu metu vizualizuoti įvairius anatominius biologinių organizmų požymius, nereikalaujant išorinių etikečių. Sistemos veikimas įvairiais masteliais buvo paryškintas vaizduojant didelius pavyzdžius, parodant išplėstą matymo lauką naudojant RSOM ir priartinimo galimybes, paremtas optiniu ir optoakustiniu mikroskopu. Taikant tą patį kontrastą, RSOM ir optoakustinę mikroskopiją galima sklandžiai derinti, pateikiant tikslų koordinačių kadrą papildomam daugiafotonių vaizdų registravimui. Šiuo atžvilgiu hibridinė sistema pademonstravo pirmąjį pranašumą, nes leidžia geriau orientuotis nuskaitymo metu ir, atsižvelgiant į pirminį mėginio RSOM vertinimą, gali atvaizduoti svarbų regioną ar regionus dinamiškai parinkti.

Hibridiniu pelės ausies vaizdavimu mes parodėme, kad bendrą ausies kraujagyslių vaizdą per išplėstą 2 mm × 2 mm regos lauką galima išgauti per visą ausies storį. Įgimtas šio modelio mastelio keitimas leido vienu metu vizualizuoti didesnius ir mažesnius indus, atskirai apdorojant aukštus dažnius, kuriuos sukuria mažesnės savybės ir kurie paprastai yra užmaskuoti žemo dažnio signalais. Tada mes pademonstravome „IMMSOM“ priartinimo galimybę, atlikdami pasirinktos srities didelės skiriamosios gebos vaizdą vaizduojant aplink matomą kraujagyslę. Be to, antrasis ir trečiasis harmonikų vaizdavimas be etikečių atskleidė pagrindinę odos ir audinio struktūrą bei komponentus (indus, kolageną, elastiną ir keratinocitus), suteikdamas papildomą morfologinį kontrastą, tiksliai registruotą RSOM regos lauke.

Kitas IMMSOM daugiapakopių galimybių ir kontrastingumo papildomumo pavyzdys buvo pateiktas hibridiniu būdu atvaizduojant laukinio tipo zebrafish lervą, kartu vizualizuojant keletą anatominių struktūrų, tokių kaip melanoforai, miomerai ir vertikalioji myosepta. Naudodami mezoskopinius ir mikroskopinius optoakustinius vaizdavimo būdus, mes sugebėjome atskleisti bendrą pigmento pasiskirstymą visoje žuvyje, taip pat struktūrines detales, susijusias su pavieniais melanoforais pasirinktame dominančiame regione. Taigi IMMSOM suteikia galimybę tuo pačiu metu ištirti pigmento susidarymą zebrafish ląstelių ir viso organizmo lygiu, tuo pačiu susiejant tuos procesus su kitomis anatominėmis struktūromis esant ribotai optinės difrakcijos skiriamąja geba.

Apskritai, čia pateikta hibridinė sistema siūlo didelį vystymosi biologijos tyrimų potencialą, suteikdama išsamų vaizdą apie skirtingus papildomus anatominius ypatumus skirtingu mastu, nereikalaujant dažymo, o RSOM palengvina didelės skiriamosios gebos vaizdų peržengimą per optinės difuzijos ribą. Tikimasi, kad šie gebėjimai padės geriau suprasti morfologinius procesus, tuo pačiu užfiksuoti ląstelių, audinių ir organų lygmens organizmus besivystančiuose organizmuose 1 .

Dabartiniame etape IMMSOM perdavimo būdo konfigūracija riboja jo galimą pritaikymą in vivo mažiems organizmams ar plokščiams egzemplioriams, tokiems kaip pelės ausis ar uodega. Sistemos diegimas refleksijos režimu galėtų panaikinti šiuos apribojimus. Pirmąjį atspindžio režimo daugiamodalinės mikroskopijos, įskaitant OM, pavyzdį galima rasti 22 pav. Be to, OM modulio įgijimo greitis galėtų būti pagerintas, panaudojant esamus galvanometrinius veidrodžius, kad būtų galima nuskaityti pluoštą ateityje. Galiausiai, pridėjus kelis sužadinimo bangos ilgius, būtų galima dar labiau diferencijuoti įvairias audinių struktūras, pasižyminčias būdingais absorbcijos spektrais.

Metodai

Eksperimentinis nustatymas

Optoakustiniuose modeliuose naudojamas impulsinis diodais pumpuojamas kietojo kūno lazeris („Flare HP PQ Green 2k 500“, „Innolight GmbH“, Hanoveris, Vokietija; energija impulsui: 570 μJ, impulsų plotis: 1, 8 ns, pasikartojimo dažnis: 1, 2 kHz, M 2 : ~ 1, 3), kad mėginys būtų apšvitintas esant 515 nm bangos ilgiui. Lazerio pluošto sujungimui su tinkamai modifikuotu apverstu optiniu mikroskopu naudojamas apverstas veidrodis (AxioObserver.D1, Zeiss, Jena, Vokietija). Optoakustinei mikroskopijai lazerio spindulys silpninamas naudojant neutralaus tankio filtrus, siekiant sumažinti pulso energiją židinyje. Erdviniam filtravimui naudojamas 25 μm smeigtukas, o pluoštas praplečiamas iki didesnio nei objektyvo objektyvo užpakalinė anga („Plan Apochromat 10X“, Zeiss, Jena, Vokietija; oro panardinimas, NA: 0, 45). Taigi į mėginį sufokusuojama tik vidinė pluošto dalis, o išorinę dalį užstoja rainelės anga, todėl švaresnė difrakcija yra riboto fokusavimo. Mėginys dedamas ant 170 μm storio stiklinio dugno Petri lėkštelės virš objektyvo. Jis užpilamas vandeniu, kad būtų užtikrintas efektyvus akustinis mėginio sujungimas su ultragarso detektoriumi. Sferiniu būdu sufokusuotas keitiklis (SONAXIS, Besancon, Prancūzija; pralaidumas: apytiksliai 25–125 MHz, židinio nuotolis: 1, 8 mm, F / D: ~ 1), kuris yra virš pavyzdžio, kurio centrinis dažnis yra 78 MHz ir yra išlygintas bendraašiai ir konfokaliniai apšvietimo atžvilgiu. Prieš kiekvieną matavimą derinimas atliekamas sufokusuojant lazerį ant plonos juodo lako vietos šalia mėginio ir maksimaliai padidinant signalo amplitudę, išdėstant keitiklį trimis matmenimis. Aptikti plačiajuosčio ryšio garsiniai signalai sustiprinami naudojant mažo triukšmo stiprintuvą (AU 1291, Miteq, Niujorkas, JAV; padidėjimas: 63 dB) ir įrašomi per greitojo 12 bitų skaitmeninį keitiklį („Compuscope EON 121 G20“, „Gage Applied“, „Lockport“, JAV). ; maksimalus mėginių ėmimo dažnis kanale: 1 GS / s). Duomenų gavimą skatina greitas fotodiodas (DET36A, Thorlabs, Newton, NJ, JAV), kuris nustato lazerio išvesties metu išsklaidytą šviesą. Norint įrašyti vaizdą, pavyzdys nuskaitytas laipsniškai šonine kryptimi, naudojant labai tikslų motorizuotą ksy-etapą (MLS203 2, „Thorlabs“) ant mikroskopo, o keitiklis ir apšvietimas lieka fiksuoti. Kiekvienoje matavimo vietoje užfiksuojami laiko atžvilgiu optoakustiniai signalai ir vidutiniškai dvidešimt kartų apskaičiuojami siekiant pagerinti SNR.

Rasterinio nuskaitymo optoakustine mezoskopija (RSOM) 515 nm spindulys sufokusuojamas lęšiu, esančiu žemiau mėginio laikiklio, kad visas pavyzdys būtų apšviestas jo atidarymo kūgiu. Objektyvą ir objektyvo mikroskopijos ypatybes galima lengvai pakeisti objektyvo revolveriu. Priešingai nei OM, matavimo metu mėginys išlieka fiksuotas, tuo tarpu keitiklis rastriniu būdu nuskaitomas aukščiau mėginio, naudojant dvi motorizuotas linijines pjezo stadijas (M 683, 2U4, Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Vokietija). 3D vaizdams vaizduoti, keitiklio židinio taškas yra šiek tiek virš bandinio paviršiaus. Transformatoriaus vertikalus išdėstymas pasiekiamas aukšto tikslumo z laipteliu (M 501.1DG, „Physik Instrumente GmbH & Co. KG“). Abiem optoakustiniais būdais duomenų kaupimas ir skenavimo valdymas atliekamas naudojant Matlab (Mathworks, Natick, MA).

Kalbant apie tris daugia fotonų mikroskopijos būdus, efektyviai sužadiname atitinkamus netiesinius optinius procesus (SHG, THG ir TPEF), panaudodami Yb pagrindu kietojo kūno femtosekundės lazerinį generatorių, skleidžiantį artimą infraraudonosios spinduliuotės šviesos spindulį esant centrinis 1043 nm bangos ilgis (YBIX, laiko juostos plotis, Ciurichas, Šveicarija; impulso plotis: 170 fs, vidutinė išėjimo galia: 2, 8 W, pasikartojimo dažnis: 84, 4 MHz). Iš pradžių lazerio spindulys yra silpninamas per tinkamą neutralaus tankio filtrų derinį, o vėliau kolimizuojamas ir sumažinamas jo skersmuo dviejų lęšių teleskopo sistema. Po to sija nukreipiama į didelio tikslumo galvanometrinių veidrodžių rinkinį (6215H, „Cambridge Technology“, Bedfordas, Masačusetsas, JAV), kuris naudojamas greitam rastriniam skenavimui atlikti tiriamojo bandinio pasirinktoje xy plokštumoje. Vėliau lazerio spindulys atsispindi tinkamu dichroiniu veidrodžiu (DMSP805R, Thorlabs, Niutonas, Naujasis Džersis, JAV), kuris atspindi 1043 nm bangos plotą, šešis kartus praplečiamas teleskopine lęšių sistema, būdamas tipiškos 4f konfigūracijos, ir galiausiai. sujungtas į apverstą mikroskopą. Ribinis difrakcijos fokusavimas pasiekiamas tuo pačiu objektyvu, kuris naudojamas OM. Kiekvienos vaizdavimo sesijos židinio plokštuma parenkama per didelės skiriamosios gebos motorizuotą pjezoelektrinę z-pavarą (MZS500 E, Thorlabs), kuri yra sumontuota kartu su xy-pakopa mikroskopo viršuje. Sukurti SHG arba TPEF atgaliniai signalai renkami atspindžio režimu, einant atvirkštiniu keliu per objektyvo lęšį ir matomai skaidrų dichroinį veidrodį. Tinkamas siauro dažnių diapazono trukdžių trukdžių filtras (FB520 10, „Thorlabs“), jei naudojamas SHG, ir ilgosios eigos filtras (FGL550, „Thorlabs“), skirtas TPEF, pasirenka norimą aptikimo bangos ilgių diapazoną, prieš signalus įrašinėjant per ypač jautrų fotojuostelį (PMT) ( H9305 03, Hamamatsu, Hamamatsu miestas, Japonija). Kita vertus, pirmiausia į priekį sklindanti THG radiacija yra renkama perdavimo režimu, naudojant papildomą aptikimo kanalą, kurį sudaro asferinis kondensatoriaus lęšis (ACL25416U, „Thorlabs“; oro panardinimas, NA: 0, 79), UV spinduliais dengtas fokusavimo objektyvas (LA4052). -UV, Thorlabs), spalvoto stiklo filtras (FGUV5, Thorlabs), labai skaidrus aptinkamame THG ultragarso bangos ilgyje - ~ 348 nm, ir galiausiai antras identiškas PMT. Du kartus iš eilės matuojant ultragarso keitiklį ir THG kanalą, galima tiksliai pasiekti, netrukdant tiriamojo bandinio. Sukurtų daugiafotonių signalų skaitmeninimas ir gavimas, taip pat galvanometrinių veidrodžių valdymas atliekamas naudojant 16 bitų DAQ kortelę (PCIe 6363, National Instruments, Austin, Texas, USA; maksimalus mėginių ėmimo dažnis kanale: 1 MS / s). Tiriamasis lauko bandinys stebimas naudojant CCD kamerą („AxioCam ICc 1“, Zeiss, Jena, Vokietija). Kelių fotonų sąrankos įrenginių sinchronizavimas yra visiškai kontroliuojamas naudojant specialiai sukurtas LabVIEW programas.

Vaizdo rekonstravimas, bendra registracija ir apdorojimas

Optoakustinėje mikroskopijoje vaizdo rekonstruoti nereikia, nes efektyvus akustinis signalas generuojamas tik optinio židinio tūriu, kuris yra daug mažesnis už keitiklio akustinį fokusą (~ 23 μm šoniniu ir ~ 200 μm ašies atžvilgiu centriniu dažniu). Signalai dažnių juostoje filtruojami diapazone 25–125 MHz, o signalo gaubtai apskaičiuojami naudojant Hilberto transformaciją.

Atvirkščiai, RSOM taip pat aptinka nefokusinius signalus, todėl būtina tomografinio vaizdo rekonstrukcija. Manoma, kad signalus kiekvienoje matavimo padėtyje nustato taško detektorius, esantis keitiklio židinyje, ir, paskui, 3D filtruota atgaline projekcija projektuoja į jautrumo lauko tūrį. Detektoriaus jautrumo laukas modeliuojamas kaip hiperboloidas su ribotu fokusavimo skersmeniu ir Gauso svertiniu šoniniu skerspjūviu. Prieš atkuriant vaizdą, optoakustiniai signalai dažnių juostoje filtruojami 25–125 MHz diapazone. 3D projekcijos kodas yra įdiegtas „Matlab“ ir veikia grafikos procesoriuje.

Mikroskopinių modulių registracija buvo atlikta prieš biologinius eksperimentus atvaizduojant siūlės fantomą. Buvo pataisyti atskiri skirtingo modalumo pokyčiai atsižvelgiant į šviesaus lauko vaizdą, kuris buvo atskaitos taškas.

Galutinis visų formų įrašytų vaizdų apdorojimas buvo atliktas „ImageJ“.

Erdvinės skiriamosios gebos apibūdinimas

Optoakustinės mikroskopijos modalumo erdvinės skiriamosios galios apibūdinimo fantomą sudarė juodo polistireno mikrosferos, kurių skersmuo 954 nm (Polybead, Polysciences Inc., Warrington, Pensilvanija). Pirmiausia mikrosferos buvo apdorotos ultragarso vonioje, kad būtų išvengta aglomeracijų, ir pritvirtintos gryname agare. Plonas agaro fantomo gabaliukas buvo dedamas ant indo su stikliniu dugnu, uždengtas ultragarso geliu akustiniam sujungimui ir uždarytas plastikinės folijos gabalėliu. Išmatuota, kad impulsų energija mėginyje yra ~ 12 nJ. Norint įvertinti sistemos šoninę skiriamąją gebą, pradinis mikrosferos profilis buvo apytiksliai suderintas pagal Gauso formą, o vardinis skersmuo atitinka ± 3σ. Buvo manoma, kad matavimo procesas yra mikrosferos profilio su Gauso pluošto fokusavimu konversija. Taigi, šoninė skiriamoji geba galėtų būti nustatyta įvertinus išraišką

Image

kur FWHM exp parodo išmatuotą mikrosferos FWHM ir d sph tikrąjį jo skersmenį. Skyriaus apibūdinimui mes panaudojome neapdorotus optoakustinius signalus, neskaičiuodami vokų.

Šoninė daugiafotonių elementų skiriamoji geba buvo įvertinta atliekant TPEF vaizdavimą 100 nm fluorescencinėse sferose („TetraSpeck“ fluorescencinių mikrosferų dydžio rinkinys, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, JAV), veikiančioms kaip taško kaip signalo šaltiniai ir iš esmės parodančioms xy vaizdą. taško paskirstymo funkcija (PSF) galutiniame paveikslėlyje. Kita vertus, atitinkama ašinė skiriamoji geba buvo nustatyta atliekant THG z-nuskaitymą 500 nm žingsniais, naudojant efektyvų efektyvų standartinį 170 μm dangtelį (Nr. 1.5, Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen, Vokietija). netiesinis signalo sužadinimas viršutinėje stiklo ir oro optinėje sąsajoje. Abiem atvejais impulsų energija židinio plokštumoje buvo įvertinta ~ 1, 3 nJ.

Hibridinis pelės ausies vaizdavimas

Išgriebta pelės ausis buvo įdėta į gryną agarą stiklinio dugno indo viduje. RSOM matavimo FOV buvo 2 mm × 2 mm, o keitiklio skenavimo žingsnio dydis buvo 3 μm. Įsigijimo laikas buvo ~ 6 min. Atlikome dvi rekonstrukcijas, naudodamos visą aptikimo juostos plotį 25–125 MHz vienais atvejais, o viršutinę pralaidumo pusę - 75–125 MHz, kitu atveju. OM matavimui mėginys buvo nuskaitytas 1, 8 μm žingsniais 375 μm × 375 μm srityje per ~ 80 min. Norint pagerinti SNR, signalų vidurkis buvo keturiasdešimt kartų, o impulsų energija mėginyje padidinta iki ~ 85 nJ.

Daugiafotoniai vaizdai buvo užfiksuoti tame pačiame regione kaip ir OM nuskaitymas per 50 μm gylį 2 μm vertikaliais žingsniais ir vidutiniškai dvidešimt kartų apskaičiuoti siekiant pagerinti SNR. Pavienis vidutinis vaizdas buvo įgytas per ~ 30 s visose daugiafotonėse sąlygose. Kiekvieno vaizdo taškų dydis buvo 508 nm, o impulsų energija mėginyje buvo ~ 1, 3 nJ.

Hibridinės zebrafish lervos vaizdavimas

Lerva buvo dedama ant indo su stikliniu dugnu, uždengta ultragarso geliu ir užklijuota plastikinės folijos gabalėliu. RSOM matavimas buvo atliekamas nuskaitymo srityje 4 mm × 4 mm su ~ 10 min nuskaitymo laiku ir 5 μm žingsnio dydžio keitikliu. Vėlesnis OM nuskaitymas buvo atliktas su 315 μm × 315 μm FOV, kurio įgavimo laikas ~ 65 min. Kadangi melaninas yra stiprus absorberis matomoje srityje, mėginio energija buvo sumažinta iki ~ 8 nJ, kad būtų išvengta bandinio sugadinimo.

Atliekant daugiafotonius matavimus, fs lazerio impulsų energija taip pat turėjo būti sumažinta iki ~ 0, 5 nJ, kad būtų išvengta fotoduomenų poveikio dėl stiprios melanino absorbcijos. The SHG and THG images were recorded following the averaging of thirty frames for SNR enhancement, while pixel size and acquisition time were similar to the mouse ear imaging session. Saturated pixels were removed in order to improve the visibility of the respective images.

No live specimens were used in the experiments.

Papildoma informacija

How to cite this article : Soliman, D. et al . Combining microscopy with mesoscopy using optical and optoacoustic label-free modes. Mokslas. Atstovas 5, 12902; doi: 10.1038/srep12902 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.