Įprastos naviko p53 mutacijos įamžintose ląstelėse iš hupki pelių, heterozigotinių 72 kodone | onkogenas

Įprastos naviko p53 mutacijos įamžintose ląstelėse iš hupki pelių, heterozigotinių 72 kodone | onkogenas

Anonim

Anotacija

Žmogaus p53 geno 72 kodonas yra polimorfinis, koduojantis argininą arba proliną. Čia mes pranešame apie žmogaus p53 „knock-in“ (Hupki) pelės, koduojančios kodono 72 pro variantą, statybą. Naujasis kamienas buvo sukryžmintas su originaliomis Hupki pelėmis (kodono 72 arg / arg ), kad būtų gauti pirminiai embriono fibroblastai, polimorfiniai 72 kodone arba homozigotiniai kodonui 72 pro . Fibroblastai, kultivuojami standartinėmis sąlygomis, buvo įamžinti per 12 savaičių ir įgijo p53 mutacijas, panašias į anksčiau tirtas Hupki 72 kodono arg / arg ląsteles. Žmogaus p53 4–9 egzonų sekvenavimas nemirtingose ​​kultūrose parodė missense mutacijas, pakartotinai rastas žmogaus navikuose. Ląstelių linijose, gautose iš benzo (a) pireno gydytų kultūrų, jungtiniai p53 mutacijų modeliai, gauti eksperimentuose su 3 kodono 72 genotipais, parodė, kad vyrauja G-T transversijos, turinčios kryptį, turinčios kryptį (18 iš 36 mutacijų), ir rūkančiųjų pasikartojančios mutacijos “ plaučių naviko hotspot kodonai 157 ir 273, palaikantys tabako kancerogenų dalyvavimą formuojant mutacijos ženklą rūkalių plaučių vėžyje. Mutacijos ląstelių linijose iš neeksponuotų kultūrų nebuvo klasterizuotos šiuose kodonuose, o G – T transversijos buvo nedažnos (2 iš 52 mutacijų) (tikslus Fišerio testas P <0, 0001). Daugiausia mutacijų (13/16) ląstelių linijose, gautose iš ląstelių, polimorfinių 72 kodone, buvo nustatyta prolino alelyje, prarandant arginino alelį.

Pagrindinis

Neseniai aprašėme būdą, kaip atrinkti ir atpažinti mutagenų sukeltus bazinius pokyčius žmogaus p53 sekose (Liu ir kt., 2004), remiantis kelių tyrėjų išvadomis, kad senėjimo apeiga lengvai atsiranda pelių ląstelėse ir reikalauja tik vieno lemiamo genetinio žingsnio. pvz., p53 funkcijos praradimas (Harvey ir Levine, 1991; Hahn ir Weinberg, 2002). Procedūra, kuria mes naudojame daugybės mutacijų nemirtingose ​​kultūrose, gautose iš pelių fibroblastų, išskirtų iš Hupki (žmogaus p53 įmušimas) (Luo ir kt., 2001) pelių padermių embrionus (HUF). Pakartotinai praeinant nepriklausomų kultūrų rinkinį, įamžintos ląstelių linijos yra lengvai nustatomos ir jas galima tiesiogiai sekti, kad būtų p53 mutacija. Taikydami šį metodą mes parodėme, kad p53 mutantinių ląstelių linijos, atsirandančios iš kultūrų, veiktų žmogaus kancerogenų, dažnai turi bazės pakeitimo tipą, numatytą remiantis pirminių premutageninių DNR aduktų klaidinančiomis savybėmis, ir kad mutacijos, pasirinktos Hupki ląstelių įamžinimui in vitro, atitinka plačiai įvertinti svarbiausius žmogaus naviko p53 mutacijų spektro požymius (vomBrocke et al., 2006).

Žmogaus 72 kodono polimorfizmas

Žmonių populiacijose p53 geno 72 kodonas yra polimorfinis, koduojantis arba argininą, arba proliną. Nors kodono 72 argono alelis anksčiau buvo vadinamas „laukinio tipo“ ir yra labiau paplitęs alelis tarp Šiaurės Europos kilmės asmenų, kodonas 72 pro yra labiau paplitęs alelis kitose etninėse grupėse (Pietsch et al., 2006). . 72 kodono polimorfizmas sulaukė daug dėmesio, nes jis turi įtakos tam tikroms kritinėms biocheminėms p53 baltymo savybėms (Thomas ir kt., 1999; Dumont ir kt., 2003). Daugybė dažnai prieštaringų tyrimų rodo polimorfizmo įtaką ne tik jautrumui vėžiui ir reakcijai į gydymą, bet ir somatinių p53 mutacijų dažniui bei biologiniam poveikiui (Storey ir kt., 1998; Marin ir kt., 2000; Bergamaschi ir kt.). al., 2006; Pietsch ir kt., 2006).

Hupki pelės modelio 72 kodono polimorfinio varianto generavimas

Hupki padermės humanizuotas p53 lokusas, kurį mes generavome, kad gautume pirminius fibroblastus mutagenezės tyrimams, koduoja argininą 72 kodone (Luo ir kt., 2001; Jackson laboratorijos žymėjimas Hupki; Trp53 Tm1 / holl, toliau šioje ataskaitoje vadinamas „ Hupki kodonas 72 arg / arg ). Pirmasis mūsų tikslas šiame tyrime buvo sugeneruoti antrą Hupki kamieną, kuris koduoja proliną 72 kodone, kuris vėliau galėtų būti kryžminamas su anksčiau pastatytu Hupki 72 kodono arg / arg kamienu. Dvi Hupki padermės leistų paruošti HUF mutagenezės p53 eksperimentams, kuriuose būtų aprašytos visos žmogaus p53 kodono 72 konfigūracijos. Tuo tikslu buvo panaudotas nukreipimo vektorius ir strategija (1a pav.) Iš esmės taip, kaip aprašyta anksčiau, kad būtų sukurtas prototipo kamienas ir daigų p53 mutantų darinių padermės (Luo ir kt., 2001; Song ir kt., 2007). Tada gautas „Hupki“ kodono 72 pro / pro štamas (1b pav.), Kuris buvo gyvybingas ir fenotipiškai normalus, tada buvo veisiamas su Hupki arg / arg štamo prototipu, o F2 + heterozigotiniai ir homozigotiniai 13, 5 dienų embrionai buvo surinkti fibroblastų paruošimui. įamžinimo tyrimai.

Image

Naujo Hupki štamo, koduojančio proliną 72 kodone, generavimas. A ) Taikymo strategija. Hupki tikslinio konstrukto (Luo ir kt., 2001) žmogaus p53 genomo DNR fragmento (4–9 egzonai) 72 kodone esančios CGC ir CCC bazės pakaitos buvo įvestos vietoje nukreiptos mutagenezės būdu. Homologiniai rekombinantai iš elektroporuotų ES 14.1 ląstelių buvo sušvirkšti į C57Bl / 6 blastocistas, iš jų gaunant chimerinius palikuonis, kurie buvo užauginti siekiant generuoti palikuonis, pernešančius Hupki kodono 72 pro variantą 4 egzone ( * ) per lytinę gemalą. Pelės iš šių kolonijų buvo veisiamos su Hupki kodono 72 arg / arg kamienu, kad būtų sukurtos Hupki 72 kodono arg / pro heterozigotinės pelės. ( b ) Homki kodono 72 pro / pro ir Pro Hupki kodono 72 arg / pro uodegų genomo DNR Southern blot analizė ir 4 egzono sekos nustatymas patvirtino genotipus. A juosta, WT padermė 129 su endogeniniu pelės p53 (mp53 WT ). B juosta, Hupki kodonas 72 arg / arg (prototipo kamienas; Luo ir kt., 2001). Juosta c, Hupki kodonas 72 arg / pro heterozigotas. D juosta, Hupki kodonas 72 pro / mp53 WT heterozigota. E juosta, „Hupki“ kodonas 72 pro / pro . I fragmentas: Hupki aleliai; II fragmentas: mp53 WT alelis; III fragmentas: pelės pseudogenas. DNR buvo suardyta Bgl II ir BamHI ir tiriama sekomis, atitinkančiomis pelės p53 11 egzoną. Elektrofermos, parodančios p53 kodono 72 vietą genomo DNR iš Hupki arg / arg, pro / pro ir arg / pro pelių uodegų, parodytos dešinėje., 1–3 skydai. c ) Fazinio kontrasto pirminių (p. 1), senstančių (p. 7) ir įamžintų (p. 17) 72 mikrokodono „ pro / pro“ kultūros, (x p. 1).

Visas dydis

Ankstesniame darbe su Hupki kodono 72 arg / arg pelių prototipu mes pastebėjome, kad in vitro sensacija, įamžinimas po ilgo auginimo ir disfunkcinių p53 mutacijų atrinkimas buvo panašus į anksčiau aprašytą laukinių pelių embriono fibroblastų (MEF) ) su normaliu, nemodifikuotu pelės p53 lokusu (Liu ir kt., 2007). Kitas mūsų tikslas šiame tyrime buvo nustatyti, ar HUF kodono 72 arg / pro ir HUF kodono 72 pro / pro pirminėse kultūrose taip pat pasireiškė šis laukinio tipo elgesys atliekant įamžinimo tyrimus. Kaip ir tikėtasi, tiek kodono 72 arg / pro, tiek kodono 72 pro / pro HUF pirminės kultūros parodė tipiškus senėjimo požymius praeinant 6 (po kelių savaičių kultūroje, įprastomis ląstelių kultūros sąlygomis) ir lengvai buvo įamžintos, dažnai per 12 savaičių (pav. 1c). Sėjant (1 psl.) 2 × 10 4 ląstelių cm − 2, auginamas standartinėmis sąlygomis (5% CO 2 normalioje Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje (DMEM), papildyta 10% vaisiaus veršelio serumo) ir serijiniu būdu perpilamas, kai yra konfluentas Praskiedimas santykiu 1: 2 iki 1: 4, dauguma kultūrų (> 95%) įamžintos savaime. Iš septynių nepriklausomų eksperimentų, sudarytų iš 24 pirminių kultūrų (su šiek tiek įbrėžimo dėl užteršimo per 3–4 mėnesius kultūroje) ląstelių linijos buvo patikrintos, ar nėra p53 mutacijos. Maždaug kiekvienoje iš penkių ląstelių linijų buvo padaryta viena mutacija, paprastai DNR rišančiojo domeno pakaitalo bazės pakaitalas, atitinkantis mutaciją, aptinkamą ir daugybėje žmogaus navikų (1a lentelė). Kaip matyti iš 72 kodono argono arg / arg kontrolės kontrolės eksperimentų, G: C iki C: G pakaitalai buvo dažniausias ląstelių linijų sekos pokytis iš neapdorotų kultūrų. Šiuo metu tiriame, ar šias „spontaniškas“ mutacijas sukelia specifiniai reaktyviųjų deguonies rūšių komponentai, atsirandantys dėl nefiziologiškai aukšto deguonies lygio standartinėse auginimo sąlygose, neseniai įrodyta, kad jie sukelia senėjimą pirminėse fibroblastų kultūrose (Parrinello ir kt., 2003). .

Pilno dydžio lentelė

BaP mutagenezė kodono 72 polimorfiniame Hupki modelyje

Žmogaus naviko p53 mutacijų modeliai skiriasi priklausomai nuo vėžio tipo ir pacientų ekspozicijos grupės, iš dalies paaiškintina tuo, kad skirtingi rizikos veiksniai sukelia skirtingus mutacijos spektrus (Hainaut ir Hollstein, 2000; Olivier ir kt., 2002). Rūkalių p53 mutacijos profilis vienareikšmiškai skiriasi nuo nerūkančiųjų navikų modelio (Hainaut ir Pfeifer, 2001). Tabako dūmų mutacijos požymis plaučių vėžiui būdingas dideliu G iki T bazės pakaitalų paplitimu ant neperrašytos gijos, susitelkusios konkrečiose p53 kodavimo sekos vietose, ypač 157 ir 273 kodonuose. Orientacinis DNR adduktų žemėlapio tyrimas parodė, kad benzo (a) pireno (BaP) veiktų žmogaus bronchų epitelio ląstelių, esančių žmogaus p53 genų sekose, mėgstamų aduktų bazių ir koreliacijos tarp rūkančiųjų plaučių navikų mutacijos taškų, patvirtinančių teiginį, kad BaP ir kitų policiklinių aromatinių angliavandenilių ekspozicija tabako dūmuose iš tikrųjų gali būti tiesiogiai atsakingi už rūkalų plaučių ląstelėse randamų būdingų mutacijų parašų sukėlimą (Denissenko ir kt., 1996). Kitas pagrindinis šios hipotezės testas yra mutacijų žemėlapio nustatymas žmogaus p53 gene ląstelėse, eksperimentiškai paveiktose tabako kancerogenais. Svarbu naudoti žmogaus seką kaip mutageno taikinį, nes bazinės sekos kontekstas yra pagrindinis mutacijos spektro veiksnys. Šis reikalavimas buvo įvykdytas atliekant išankstinius mutagenezės eksperimentus su 72 kodono arg / arg HUFs ir parodė, kad į BaP paveiktų HUF įamžintų ląstelių linijose vyravo G – T p53 mutacijos (Liu ir kt., 2005).

Šiame tyrime mūsų galutinis tikslas buvo sukurti Hupki modelyje sudėtinį BaP mutacijų spektrą, atspindintį visas žmogaus kodono 72 konfigūracijas. Šiuo tikslu mes paveikėme nepriklausomus HUF arg / pro ir HUF pro / pro kultūrų rinkinius 1 μM BaP 6–9 dienas, o paskui kultūrą iš eilės pastūmėjome, kad gautume įamžintas ląstelių linijas, kurias reikia sekti, kad būtų p53. mutacija. Iš viso 15 ląstelių linijų buvo padarytos p53 taškų mutacijos, iš kurių 3 turėjo po 2 mutacijas (1b lentelė). Pusė mutacijų (9/18) iš BaP gydomų HUF arg / pro arba HUF pro / pro buvo transversijos iš G į T (1b lentelė), iš kurių dauguma (8 iš 9) buvo orientuotos į premijuotą guaniną ant neperrašytos grandinės, atitinka rezultatus, gautus ląstelių linijose iš BaP gydomų HUF arg / arg kultūrų, kurios anksčiau buvo praneštos, kurios taip pat parodė, kad vyrauja G ir T pakaitalai (Liu ir kt., 2005).

Sudėtinis spektras

Nauji duomenys apie BaP paveiktą ir kontrolinį kodoną 72 arg / pro ir kodoną 72 pro / pro HUF buvo sujungti su ankstesniais duomenimis apie kodono 72 arg / arg HUF, kad būtų gauti sudėtiniai profiliai, parodyti 2 paveiksle. Penkiuose eksperimentuose su BaP paveiktais Iš penkių skirtingų embrionų, reprezentuojančių visus 72 kodono genotipus, išskirtų HUF, iš 36 p53 mutacijų iš viso buvo 18 G – T transversijų, iš kurių 17 buvo orientuotos į prenumeruotą guaniną ant nenurašytos grandinės. Iš 52 mutacijų ląstelių linijose, gautose iš kontrolinių (neapdorotų) kultūrų, tik 2 buvo transversijos iš G į T (G į T mutacijos, BaP ir neapdorotos: Fišerio tikslus testas: P <0, 0001), ir jos buvo rastos 176 kodone ir 275 kodone., ne plaučių vėžio mutacijos taškuose (žr. 2 lentelę). Dažnas sruogų atžvilgiu pakreiptas G – T transversija yra skiriamasis rūkalių plaučių naviko p53 mutacijų požymis, ypač kai jie vyksta 157, 158, 273 kodonuose (Pfeifer ir Hainaut, 2003), ir įrodyta, kad DNR atstatymas vaidina svarbų vaidmenį. tai (Denissenko ir kt., 1998). Ląstelių linijose iš BaP apdorotų HUF 157 ir 273 kodonai taip pat yra pasikartojančios G iki T mutacijų vietos nepriklausomuose eksperimentuose (157 kodonas: 5 atvejai, 3 yra nuo G iki T; kodonas 273: 5, 2 - nuo G iki T)., o kontrolinėse linijose tokių mutacijų nerasta. Hupki modelio 157 ir 273 kodonų suderinamieji su BaP susiję p53 taškai ir rūkančiųjų plaučių navikai yra pastebimi, nes atskiri eksperimentai ir embrionai su skirtingais kodono 72 genotipais prisidėjo prie galutinio atitikimo, taigi jie negali būti „jackpoto“ mutacijos. Atsižvelgiant į tai, kad BaP diolio epoksidas jungiasi kodonuose su metilintu citozinu (Denissenko ir kt., 1997; Chen ir kt., 1998), ląstelių tipų metilinimo būklės skirtumai gali pakeisti mutacijų dažnį konkrečiose CpG mutacijos vietose, priklausomai nuo tiriamų ląstelių sistemos, galbūt dėl ​​to, kad trūko G iki T mutacijų 248 kodono taške Hupki ląstelių linijose.

Image

P53 įmirkytų ląstelių linijų, gautų iš neapdorotų ir benzo (a) pireno (BaP) apdorotų HUF kultūrų, mutacijos modeliai (visi kodono 72 genotipai kartu). a ) Bazinių pakaitų tipas žmogaus p53 koduojančiose sekose įmirkytose ląstelių linijose iš neapdorotų HUF kultūrų (skaidrių juostų) ir BaP apdorotų (užpildytų juostų) kultūrų, visų kodono 72 genotipų [Duomenys sujungti iš šios ataskaitos (HUF arg / pro ir HUF pro / pro 1 lentelė) ir iš paskelbtų duomenų apie HUF arg / arg ląsteles (Liu ir kt., 2004, 2005 ir Feldmeyer ir kt. , 2006). G – T mutacijos ( * ) yra daug labiau paplitusios pP3 mutantų ląstelių linijose iš BaP apdorotų kultūrų nei ląstelių linijose iš neapdorotų kultūrų (2/52 vs 18/36; Fisherio tikslus testas, P <0, 0001) ir atskleidžia stiprią grandinę. poslinkis: 17/18 G iki T mutacijos įvyko tose vietose, kur premutuotas guaninas buvo pastatytas ant neperrašytos gijos. ( b ) 29 bazinių pakaitų pasiskirstymas išilgai p53 koduojančios sekos ląstelių linijose, gautose iš BaP apdorotų HUF kultūrų (visi HUF genotipai kartu). (Pastaba: iš 36 p53 sekos pokyčių ląstelių linijose iš BaP apdorotų kultūrų 29 buvo vienos bazės pakaitalai kodonuose, parodytuose čia. Papildomi vienos bazės pakaitai buvo sujungimo vietose (nepavaizduota)).

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Buvo pasiūlyta, kad vėžio tipui būdingos hpotpot p53 mutacijos, pastebimos žmogaus navikuose, atsiranda dėl specifinio atitinkamo mutanto baltymo poveikio neoplastiniam vystymuisi, sustiprinant jo atranką tam tikrame audinių / ląstelių tipe. Pakartotinis 157 kodono, kaip BaP hotspot, pateikimas HUF, rodo paprastesnį scenarijų, kai bazinės sekos kontekstas ir pirmenybinis elektrofilo prisijungimas prie konkrečios bazės siekia sukurti su ekspozicija susietą mutacijos hotspotą. Bus įdomu sužinoti, ar akroleinas, tiesioginio veikimo tabako mutagenas, neseniai įrodytas, kad jungiasi su guaninais plaučių vėžio p53 geno taškuose, taip pat indukuoja 157 kodono mutacijas HUF tyrime (Feng et al., 2006).

Didesnė vėžio rizika dėl p53 kodono 72 genotipo ir privilegijuotos mutacijos ar LOH asmenims, kurių polimorfiniai yra 72 kodonas, buvo pakartotinai ištirta klinikinių mėginių tyrimuose; vis dėlto dar neturi susidaryti vaizdas. Dviejose iš trijų didelių nesmulkių ląstelių plaučių vėžio kohortų buvo pranešta apie didesnį kodono 72 prolino alelių mutacijų dažnį (Hu ir kt., 2005; Nelson ir kt., 2005; Szymanowska ir kt., 2006). Šiame eksperimentiniame tyrime 13 iš 16 ląstelių linijų iš 72 kodono 72 kodono arg / pro heterozigotinių kultūrų su p53 mutacija ir LOH sukėlė prolino alelio mutaciją praradus arginino alelį (1b lentelė ir duomenys nepateikti), tačiau tendencija nebuvo statistiškai reikšmingas. Nepaisant p53 kodono 72 statuso, įvairių rūšių vėžio tyrimuose yra bendra nuomonė, kad sergant vėžiu, turinčiu mutantą p53, navikuojamas alelis navikams ištrinamas, tai rodo selektyvų slėgį norint išvengti likutinės p53 funkcijos. Tiksli mutacija, ypač dominuojančio neigiamo aktyvumo laipsnis, gali būti svarbus veiksnys, darantis įtaką nepažeisto alelio praradimui (Dearth ir kt., 2007). Cigarečių dūmai padidina LOH naviko slopintuvo lokusuose ir gali suteikti papildomą, nepriklausomą indėlį į trynimo įvykius (Zienolddiny et al., 2001). Tolesni mutagenezės tyrimai, naudojant kodono 72 arg / pro HUF, gali padėti išsiaiškinti veiksnius, susijusius su bet kurio alelio preferenciniu LOH. Be to, HUF ląstelių linijos panelė, vaizduojanti žmogaus p53 DNR surišančio domeno mutacijas cis su kodono 72 arg arba 72 kodonu pro, yra įrankis ištirti polimorfizmo įtaką mutanto p53 elgesiui.

Žodynas

BaP

benzo (a) pirenas

HUF

Hupki embrioniniai fibroblastai

Hupki

žmogaus p53 įsitraukimas