Lyginamoji genomika atskleidžia judriojo patogeniškumo chromosomas fusariume | gamta

Lyginamoji genomika atskleidžia judriojo patogeniškumo chromosomas fusariume | gamta

Anonim

Dalykai

  • Lyginamoji genomika
  • DNR perkeliami elementai
  • Grybelio patogenezė

Anotacija

Fusarium rūšys yra vieni svarbiausių fitopatogeninių ir toksigeninių grybelių. Norėdami suprasti molekulinius Fusarium genties patogeniškumo pagrindus, palyginome trijų fenotipiškai skirtingų rūšių genomus: Fusarium graminearum , Fusarium verticillioides ir Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici . Mūsų analizė atskleidė F. oxysporum linijai būdingus (LS) genominius regionus, kurie apima visas keturias chromosomas ir sudaro daugiau nei vieną ketvirtadalį genomo. LS regionuose gausu transposonų ir genų, turinčių aiškų evoliucijos profilį, tačiau susijusius su patogeniškumu, rodančiu horizontalųjį įgijimą. Eksperimentiškai parodome dviejų LS chromosomų perkėlimą tarp F. oxysporum padermių, nepatogeninį štamą paversdami patogenu. LS chromosomų perkėlimas tarp kitaip genetiškai izoliuotų padermių paaiškina polifiletinę šeimininko specifiškumo kilmę ir naujų patogeninių linijų atsiradimą F. oxysporum . Šie atradimai pakelia grybelio patogeniškumo raidą į naują perspektyvą.

Pagrindinis

Fusarium rūšys yra vieni iš pačių įvairiausių ir labiausiai paplitusių augalų patogeninių grybų, sukeliančių ekonomiškai svarbių pūlių, šaknų puvinių ar gluosnių 1 . Kai kurios rūšys, tokios kaip F. graminearum ( Fg ) ir F. verticilioidai ( Fv ), pasižymi siauru šeimininko diapazonu, daugiausia užkrėsdami javus (1a pav.). Priešingai, F. oxysporum ( Fo ) pasižymi nepaprastai plačiu šeimininko diapazonu, užkrėsdamas ir vienaląsčius, ir dviskilčius augalus 2, ir yra besivystantis žmonių su imunitetu 3 ir kitų žinduolių 4 patogenas. Fusarium rūšys skiriasi ne tik nuo šeimininko adaptacijos ir specifiškumo, bet ir reprodukcijos strategijos. Kai kurie, pavyzdžiui, Fo , yra neseksualūs, tuo tarpu kiti yra ir seksualūs, ir seksualiniai, turintys savigydą (homothallizmas) arba priversti pereiti (heterothallizmą) (1b pav.).

Image

a, Maksimalios tikimybės medis, naudojant 100 genų sujungtas baltymų sekas, atsitiktinai parinktas iš 4694 „ Fusarium“ ortologinių genų, turinčių aiškų ryšį 1: 1: 1: 1 tarp „ Fusarium“ genomų ir turinčių unikalių atitikmenų Magnaporthe grisea , Neurospora crassa ir Aspergillus nidulans . Medis buvo pastatytas naudojant PHYML 35 (WAG evoliucijos modelis 36 ). Šakos paženklintos 10 000 pakartotinių įkrovos atkarpų procentine dalimi. b - d, fenotipinis kitimas Fusarium genties atstovuose : b, kukurūzų ( Fv ) branduolių puvinio ( Fv ), pomidorų vytulio ( Fol ), pomidorų gluosnio ( Fol ), kviečių galvos pūtimo ( Fg ) ir žirnio ( Fs ) šaknies puvinio ligos simptomai ); c) Fv ( Gibberella moniliformis ), Fol (be seksualinės būsenos), Fg ( G. zeae ) ir Fs ( Nectria haematococca ) periferinės būsenos ; ir d, Fv , Fol , Fg ir F mikro- ir makrokonidijos. Svarstyklės, 10 μm. Fg gamina tik makrokonidijas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Anksčiau grūdų patogeno Fg genomas buvo sekvenuotas ir parodyta, kad jis koduoja didesnį baltymų skaičių su patogeniškumu susijusiose baltymų šeimose, palyginti su nepatogeniškais grybais, įskaitant numatomus transkripcijos faktorius, hidrolizinius fermentus ir transmembraninius pernešėjus 5 . Mes suklasifikavome dvi papildomas Fusarium rūšis, Fv , kukurūzų patogeną, gaminantį fumonizino mikotoksinus, galinčius užteršti grūdus, ir F. oxysporum f.sp. lycopersici ( Fol ), pomidorų patogenas . Pateikiame lyginamąją šių trijų rūšių genomų analizę.

Rezultatai

Genomo organizacija ir genų grupės

Mes sekame Fv kamieną 7600 ir Fol kamieną 4287 (metodai, 1 papildoma lentelė), naudodamiesi viso genomo šovinio metodu, ir surinkome seką naudodami Arachne (1 lentelė, nuoroda 6). Pastolių chromosomų lygio nustatymas buvo pasiektas pritvirtinus agregatus prie genetinio Fv žemėlapio (nuoroda 7) arba optinio Fol žemėlapio (papildoma informacija A ir 2 lentelė). Mes numatėme Fol ir Fv genus ir pakartotinai anotavome naują Fg genomo rinkinį naudodami rankinio ir automatinio anotavimo derinį (papildoma informacija B). „ Fol“ genomas (60 megabazių) yra maždaug 44% didesnis nei artimiausių rūšių Fv (42 Mb) ir 65% didesnis nei Fg (36 Mb), todėl gaunamas didesnis baltymus koduojančių genų skaičius. Folyje (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Trijų Fusarium genomų giminiškumas leido generuoti didelio masto nedviprasmiškus suderinimus (1–3 pav.) Ir labai patikimai nustatyti ortologinius genų rinkinius (metodai, papildoma informacija C). Vidutiniškai Fol ir Fv ortologai turi 91% nukleotidų sekos identiškumo, ir abu turi 85% identiškumo su Fg kolegomis (papildomas 4 pav.). Tarp trijų genomų buvo nustatyta daugiau kaip 9000 konservuotų sintetinių ortologų. Palyginus su kitais asomocitų genomais, šie trijų rūšių ortologai yra praturtinti numatytais transkripcijos veiksniais ( P = 2, 6 × 10 -6 ), litiniais fermentais ( P = 0, 001) ir transmembraniniais pernešėjais ( P = 7 × 10 -9 ) (Papildoma informacija C ir papildomos 3–8 lentelės), atsižvelgiant į rezultatus, pateiktus dėl Fg genomo 5 .

Fusarium rūšys gamina įvairius antrinius metabolitus, įskaitant mikotoksinus, kurie toksiški žmonėms ir kitiems žinduoliams 8 . Iš trijų genomų mes nustatėme iš viso 46 antrinių metabolitų biosintezės (SMB) genų grupes. Mikro matricų analizė patvirtino genų bendrą raišką 14 iš 18 Fg ir 10 iš 16 Fv SMB genų grupių. Dešimt iš 14 Fg ir aštuoni iš 10 Fv bendrai išreikštų SMB genų klasterių yra nauji (papildoma informacija D, papildomas 5 pav. Ir 9 papildoma lentelė bei internetinė medžiaga), pabrėžiant galimą neapibūdintų antrinių metabolitų poveikį grybeliui. biologija.

Linijai būdingos chromosomos ir patogeniškumas

Folo genomo rinkinyje yra 15 chromosomų, Fv - 11 ir Fg - tik keturios (1 lentelė). Mažesnis Fg chromosomų skaičius yra chromosomų susiliejimo rezultatas, palyginti su Fv ir Fo , o Fg suliejimo vietos atitinka anksčiau aprašytus didelės įvairovės regionus (papildomas 3 pav., Ref. 5). Visuotinis trijų Fusarium genomų palyginimas rodo, kad padidėjusią genominę teritoriją Folyje lemia papildomos unikalios sekos, kurios daugiausia yra papildomose chromosomose. Folio sintetiniai regionai apima maždaug 80% Fg ir daugiau kaip 90% Fv genomo (papildoma informacija E ir 10 papildoma lentelė), vadinami genomų „šerdimi“. Išskyrus proksimalinius telomerų regionus, visos 11 sujungtų chromosomų Fv rinkinyje (41, 1 Mb) atitinka 11 iš 15 chromosomų Folyje (41, 8 Mb). Šiose chromosomose buvo išlaikyta tiesinė genų tvarka tarp Fol ir Fv , išskyrus vieną chromosomų translokacijos įvykį ir keletą vietinių pertvarkymų (2a pav.).

Image

a, Argo 37 taškinis MEGABLAST sulyginimas (1 × 10 -10 ) tarp Fv ir Fol, parodantis chromosomų atitikmenis tarp dviejų genomų juodose brūkšniuotose dėžutėse. Vertikalios mėlynos linijos iliustruoja chromosomų translokacijas, o raudonos brūkšninės horizontalios dėžutės pabrėžia Fol LS chromosomas. b, Sintetinių suderinimų tarp Fol ir Fv bendras vaizdas ir perkeliamų elementų pasiskirstymas. Liaudies jungčių grupės yra parodomos kaip atskaitos, o kiekvienos jungčių grupės šviesiai pilko fono ilgis yra apibrėžtas Fol optiniu žemėlapiu. Kiekvienai chromosomai i eilutė parodo genomo pastolius, išdėstytus ant optinių jungčių grupių, atskirtų pastolių pertraukomis. Pastolių numeriai Fol pateikiami virš blokų; ii eilutėje parodytas sintetinis Fv chromosomų žemėlapis su viena pagrindine translokacija tarp chr 4 / chr 12 Folyje ir chr 4 / chr 8 Fv ; iii eilutė rodo perkeliamų elementų tankį, apskaičiuotą naudojant 10 kb langą. LS chromosomos apima keturias ištisas chromosomas (chr 3, chr 6, chr 14 ir chr 15) ir 1 ir 2 chromosomos dalis (27 pastoliai, 31 pastoliai), kurios neturi panašumo į sintetines chromosomas Fv, bet yra praturtintos TE. c, dvi iš keturių Fol LS chromosomų, rodančių tarp- (žaliąją) ir vidinę (geltonąją) chromosomų segmentines dubliavimosi vietas. Trys pėdsakai žemiau yra TE (tankiai mėlynos linijos), išskiriamų baltymų genų (žalios linijos) ir su lipidų metabolizmu susijusių genų (raudona linija) tankio pasiskirstymas. Chr, chromosoma; Un, nesupažindinta.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Unikalios Fol sekos yra nemaža (40%) Fol rinkinio dalis, paskirta kaip Fol linijai būdingi ( Fol LS) regionai, kad būtų galima atskirti juos nuo konservuoto branduolio genomo. „ Fol LS“ regionuose yra visos keturios chromosomos (3, 6, 14 ir 15 chromosomos), 1 ir 2 chromosomos dalys (atitinkamai 27 ir 31 pastoliai) ir dauguma mažų pastolių, neprisirišusių prie optinio žemėlapio (1 pav. 2b). Iš viso „ Fol LS“ regionai apima 19 Mb, o tai sudaro beveik visus didesnio dydžio „ Fol“ genomus.

Pabrėžtina, kad LS regionuose yra daugiau kaip 74% atpažįstamų perkeliamų elementų (TE) Fol genome, įskaitant 95% visų DNR transpozonų (2b pav., 6 papildomas paveikslas ir 11 papildoma lentelė). Priešingai nei mažas pasikartojančių sekų kiekis ir minimalus TE kiekis Fv ir Fg genomuose (1 lentelė ir 11 papildoma lentelė), apie 28% viso folomo genomo buvo nustatyta kaip pasikartojanti seka (metodai), įskaitant daugelį retroelementų ( į kopiją panašūs ir į čigonus panašūs LTR retrotransposonai, LINE (ilgi susikertantys branduoliniai elementai) ir SINE (trumpai susikertantys branduoliniai elementai) ir DNR transposonai ( Tc1-marineris, HAT- panašūs , Mutatoriai ir MITE) (papildoma informacija E.3 ), taip pat kelios didelės segmentinės kopijos. Daugelis TE yra viso ilgio ir pateikiamos kaip labai panašios kopijos. Ypač gerai reprezentatyvios DNR transpozonų klasės Folyje yra pogo , HAT tipo elementai ir MITE (iš viso maždaug 550, 200 ir Atitinkamai 350 egzempliorių.) Be to, yra viena vidinė chromosominė ir dvi tarpchromosominės segmentinės dubliavimosi, iš viso apytiksliai 7 MB, todėl kai kurių regionų kopijos yra trigubai ar net keturis kartus (2c pav.)., šie regionai turi 99% sekos tapatumo (papildomas 7 pav.), nurodant naujausius pasikartojimo įvykius.

Tik 20% numatomų genų Fol LS regionuose gali būti klasifikuojami remiantis homologija su žinomais baltymais. Šie genai yra žymiai praturtinti ( P <0, 0001) funkcinėms kategorijoms „išskiriami efektoriai ir virulencijos faktoriai“, „transkripcijos faktoriai“ ir „baltymai, dalyvaujantys signalo perdavime“, tačiau trūksta namų tvarkymo funkcijų genų (papildoma informacija E ir papildomos 12–18 lentelės). Tarp genų, kurių numatoma funkcija yra susijusi su patogeniškumu, buvo žinomi efektoriniai baltymai (žr. Toliau), taip pat nekrozę ir etileną sukeliantys peptidai 9 bei įvairūs išskiriami fermentai, kurie, kaip numatoma, ardo ar modifikuoja augalų ar grybelių ląstelių sienas (papildoma informacija E ir papildoma informacija 14, 15 lentelės). Pažymėtina, kad daugelis šių fermentų yra ekspresuojami ankstyvose pomidorų šaknų infekcijos stadijose (papildomos 15, 16 lentelės ir papildomas 8 pav.). Lipidų apykaitos genų ir iš lipidų gaunamų antrinių pasiuntinių išplėtimas Fol LS regionuose rodo svarbų lipidų signalizacijos vaidmenį grybelio patogeniškume (papildomas 9 pav. Ir 13, 17 papildomos lentelės). Transkripcijos faktorių sekų, susijusių su FTF1 , genu, perrašytu specialiai ankstyvosiose F. oxysporum f infekcijos stadijose, šeima. sp. Phaseoli (papildoma informacija E ir papildoma 4 lentelė; nuoroda 10) taip pat plečiama.

Neseniai paskelbtas labiau išsiskyrusios rūšies F. solani 11 genomas leido išplėsti lyginamąją analizę, kad apimtų didesnę evoliucijos struktūrą (1 pav.). Tuo tarpu „branduolio“ genomai yra gerai išsaugoti tarp visų keturių sekveniuotų Fusarium rūšių, Fol LS regionų taip pat nėra F (papildomas 2 pav.). Be to, F turi tris LS chromosomas, besiskiriančias nuo genomo branduolio 11 ir Fol LS regionų. Apibendrinant galima pasakyti, kad kiekvienoje iš keturių Fusarium rūšių yra branduolys, turintis aukštą sintezės lygį, tuo tarpu Fol ir F turi LS chromosomas, besiskiriančias pasikartojančiomis sekomis ir genais, susijusiais su šeimininko ir patogeno sąveika.

LS regionų kilmė

Buvo apsvarstyti trys galimi LS regionų kilmės paaiškinimai Fol genome: (1) Fol LS regionai buvo paskutiniame bendrame keturių Fusarium rūšių protėviuose, bet vėliau buvo selektyviai ir savarankiškai prarasti Fv , Fg ir Fs linijose vertikalios perdavimas; (2) LS regionai atsirado dėl pagrindinio genomo dėl dubliavimosi ir skirtumų Fol linijoje; ir (3) LS regionai buvo įgyti horizontaliu perdavimu. Norėdami atskirti šias hipotezes, mes palyginkome Fol LS regionų genų sekų charakteristikas su Fusarium branduolio regionų genų ir kitų gijų grybelių genų sekų ypatybėmis. Jei „ Fol LS“ genai turi aiškių ortologų kitose „ Fusarium“ rūšyse arba paralogus pagrindiniame „ Fol“ regione, tai turėtų sudaryti palankesnes sąlygas vertikaliam perdavimui arba dubliavimui su nukrypimo hipotezėmis. Mes nustatėme, kad nors 90% „ Fol“ genų pagrindiniuose regionuose turi homologus kituose dviejuose „ Fusarium“ genomuose, apie 50% „ Fol LS“ regionų genų trūksta homologų nei Fv, nei Fg (1 × 10 –20 ). Be to, yra mažesni Fol ir Fv ortologų sekų skirtumai pagrindiniuose regionuose, palyginti su Fol ir Fg ortologais (3a pav.), Atsižvelgiant į filogenijos rūšis. LS genai, turintys homologus kitose Fusarium rūšyse, priešingai, yra maždaug vienodai nutolę tiek nuo Fv, tiek Fg genų (3b pav.), Rodantys, kad LS genų filogenetinė istorija skiriasi nuo genų, esančių genomo pagrindiniame regione.

Image

BLAST balų santykio (BSR) 30 išsklaidymo brėžiniai pagrįsti trijų krypčių baltymų, užkoduotų šerdies regionuose ( a ), ir Fol LS chromosomų ( b ) palyginimais. Skaičiai nurodo procentą genų, kuriems trūksta homologinių sekų Fv ir Fg (apatiniame kairiajame kampe), esančių Fv, bet ne Fg ( x- axis) ir esančių Fg, bet ne Fv ( y- axis). c, LS regionuose užkoduotų baltymų filogenetinis ryšys yra neatitikimas. Maksimalios tikimybės medis buvo sukonstruotas panaudojant 100 genų sujungtas baltymų sekas, atsitiktinai parinktas iš 362 genų, turinčių homologus septyniuose atrinktuose asomocitų genomuose, įskaitant keturis Fusarium genomus, M. grisea , N. crassa ir A. nidulans . Medžiai buvo pastatyti naudojant PHYML 35 (WAG evoliucijos modelis 36 ). Šakų procentiniai dydžiai parodo vertę, pagrįstą 10000 įkrovos duomenų rinkiniu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Tiek kodonų panaudojimo lentelės, tiek kodonų adaptacijos indekso (CAI) analizė rodo, kad LS koduojantys genai naudoja skirtingą kodono naudojimą (papildoma informacija E.5, papildomas 10 pav. Ir 19 papildoma lentelė), palyginti su konservuotais genais ir Fv genais. genomą, toliau palaikydami jų skirtingą evoliucinę kilmę. Reikšmingiausi skirtumai buvo nustatyti su aminorūgštimis Gln, Cys, Ala, Gly, Val, Glu ir Thr, o „ Fol LS“ genuose pirmenybė buvo teikiama G ir C, palyginti su A ir T (20 papildoma lentelė). Tokį GC poslinkį atspindi ir šiek tiek didesnis GC kiekis jų trečiosiose kodonų padėtyse (papildomas 11 pav.).

Iš 1 285 LS koduojamų baltymų, turinčių homologus NCBI baltymų rinkinyje, beveik visi (93%) turi geriausią BLAST poveikį kitiems ascomycete grybeliams (papildomas 12 pav.), Tai rodo, kad Fol LS regionai yra grybelinės kilmės. Filogenetinė analizė, pagrįsta sujungtais mėginiais iš 362 baltymų, turinčių homologus septyniuose atrinktuose asomocitų genomuose, įskaitant keturis sekvensuotus Fusarium genomus, Magnaporthe grisea 12, Neurospora crassa 13 ir Aspergillus nidulans 14, - jų kilmė priklauso Fusarium genčiai, bet bazinė trims. artimiausios Fusarium rūšys Fg , Fv ir Fol (3c pav., 21 papildoma lentelė). Visi kartu padarome išvadą, kad horizontalus įsigijimas iš kitos Fusarium rūšies yra pats palankiausias Fol LS regionų kilmės paaiškinimas.

LS regionai ir priimančiosios specifika

F. oxysporum yra laikomas rūšių kompleksu, sudarytu iš daugybės skirtingų nelytinių linijų, kurios gali būti patogeniškos skirtingų šeimininkų atžvilgiu arba nepatogeninės. Fol LS regionai labai skiriasi seka tarp Fo padermių, turinčių skirtingą šeimininko specifiškumą, kaip nustatoma pagal Fo 5176 padermės, Arabidopsis 15 patogeno ir EST (išreikštos sekos žyme) sekų Illumina seką iš Fo f. sp. vasinfectum 16, medvilnės patogenas (papildoma informacija E.2). Nepaisant mažesnio nei 2% bendro Fol ir Fo 5176 sekų skirtumų (papildomas 13A pav.), Daugumai sekų Fol LS regionuose nėra atitikmens Fo 5176 (papildomas 13B pav.). Taip pat „ Fov EST“ 16 sekos turi labai aukštą nukleotidų sekos tapatumą su Fol genomu (vidutiniškai 99%), tačiau jos sutampa tik su pagrindinėmis Folio sritimis (papildoma informacija E.2). Didelio masto genomo polimorfizmas Fo srityje taip pat akivaizdus dėl skirtingų padermių kariotipo skirtumų (papildomas 14 pav.) 17 . Anksčiau apie Nectria haematococca 18 ir Alternaria alternata 19 grybus buvo pranešta apie mažas, polimorfines ir sąlygiškai nepakeičiamas chromosomas, sukeliančias specifinį šeimininko virulentiškumą. Patogeninių F. oxysporum izoliatuose nėra mažų (<2, 3 Mb) ir kintamų chromosomų (papildomas 14 pav.), Tai rodo, kad Fol LS chromosomos taip pat gali būti konkrečiai susijusios su patogeniška adaptacija.

Fo patogeniškumo chromosomų perkėlimas

Gerai užfiksuota, kad Fol kolonizuojant pomidorų ksilimo sistemą 20, 21 išsiskiria maži baltymai ir bent du iš jų, Six1 (Avr3) ir Six3 (Avr2), yra susiję su virulentiškumo funkcijomis 22, 23 . Įdomu tai, kad šių baltymų genai, taip pat plantoje išskiriamos oksidoreduktazės ( ORX1 ) 20 genas yra 14 chromosomoje, vienoje iš Fol LS chromosomų. Visi šie genai yra konservuoti štamuose, sukeliančiuose pomidorų vytulį, tačiau kituose štamuose jų nėra 24 . Genomo duomenys leido identifikuoti trijų papildomų mažų iš plantacijos išskiriamų baltymų, esančių 14 chromosomoje, genus , pavadintus SIX5 , SIX6 ir SIX7 (22 papildoma lentelė), remiantis anksčiau gautais masės spektrometrijos duomenimis 20 . Kartu šie septyni genai gali būti naudojami kaip žymekliai kiekvienam iš trijų superkontigių (SC 22, 36 ir 51), lokalizuotų 14 chromosomoje, identifikuoti (23 papildoma lentelė ir papildoma 15 pav.).

Atsižvelgiant į sujungtus eksperimentinius duomenis ir skaičiavimo duomenis, mes pasiūlėme, kad 14-osios chromosomos gali būti atsakingos už Folo patogeniškumą pomidorų atžvilgiu ir kad jos mobilumas tarp padermių galėtų paaiškinti jo buvimą pomidorų vytimo patogeniuose, apimančiuose keletą kloninių linijų, turinčių polifiletinę formą Fo rūšių kompleksas, tačiau nėra kitų giminių 24 . Norėdami patikrinti šias hipotezes, mes ištyrėme, ar galima perkelti 14 chromosomą ir ar perkėlimas pakeistų patogeniškumą tarp skirtingų Fo padermių, naudojant žymenis 14 chromosomos plantacijose išskiriamuose baltymuose. Fol 007, štamas, galintis sukelti pomidorų vytimą, buvo inkubuotas kartu su nepatogeniniu izoliatu ( Fo -47) ir dviem kitais padermėmis, patogeniškomis atitinkamai meliono ( Fom ) ar banano ( Foc ) atžvilgiu. Genas, suteikiantis atsparumą zeocinui ( BLE ), buvo įterptas arti SIX1 kaip žymeklis, kad būtų galima pasirinkti 14 chromosomos perkėlimą iš donoro padermės į Fo -47, Fom arba Foc . Priimamos padermės buvo transformuotos atsparumo higromicinui genu ( HYG ), atsitiktinai įterptu į genomą; buvo pasirinkti trys nepriklausomi higromicinui atsparūs transformantai iš kiekvieno padermės recipiento. Skirtingų kamienų mikrokonidijos buvo išskirtos ir sumaišytos santykiu 1: 1 agaro lėkštelėse. Sporos, atsirandančios ant šių plokštelių po 6–8 dienų inkubacijos, buvo parinktos dėl atsparumo zeocinui ir higromicinui. Dvigubos vaistams atsparios kolonijos buvo išgautos naudojant Fom ir Fo -47, tačiau nenaudojant Foc kaip recipiento, maždaug 0, 1-10 milijonų sporų dažniu (24 papildoma lentelė).

Patogeniškumo tyrimai parodė, kad dvigubi vaistams atsparūs štamai, gauti iš Fol- 007 inkubavimo su Fo -47, vadinamu Fo -47 +, įgijo galimybę įvairiais laipsniais užkrėsti pomidorus (4a, b pav.). Priešingai, nė viena dviguba vaistams atspari padermė, gauta iš Fol- 007 inkubavimo kartu su Fom , negalėjo užkrėsti pomidorų. Visuose Fo -47 + padermėse buvo didelės 14-osios chromosomos porcijos, kaip parodė 7-jų genų žymenų PGR amplifikacija (4c pav., Papildomas 15 pav. Ir papildoma informacija F). Tėvų padermės, taip pat seka padermė Fol 4287, turi skirtingus kariotipus. Tai leido mums chromosomų elektroforeze nustatyti, ar visa Fol 007 14 chromosoma buvo perkelta į Fo -47 + padermes. Visi Fo -47 + kamienai turėjo tą patį kariotipą kaip Fo -47, išskyrus vieną ar dvi papildomas mažas chromosomas (4d pav.). Patvirtinta, kad chromosoma, esanti visose Fo -47 + padermėse (4d pav., Rodyklės numeris 1), yra 14 chromosoma iš Fol 007, atsižvelgiant į jos dydį ir Southern hibridizaciją naudojant SIX6 zondą (4e pav.). Įdomu tai, kad dvi dvigubai vaistams atsparios padermės ( Fo -47 + 1C ir Fo -47 + 2A 4a pav.), Sukėlusios aukščiausią ligos laipsnį (4a, b pav.), Turi antrą papildomą chromosomą, atitinkančią dydį. iki mažiausios chromosomos donoro padermėje Fol 007 (4d pav., rodyklė Nr. 2).

Image

a ) Pomidorų augalai, užkrėsti Fol 007, Fo -47 arba dvigubais vaistams atspariomis Fo -47 + padermėmis (1A – 3C), gautomis iš šio tėvų derinio, praėjus dviem savaitėms po pasėjimo, kaip aprašyta b . b . Aštuoni iš devynių Fo -47 + kamienų, gautų sujungus Fol 007 ir Fo -47, rodo patogeniškumą pomidorų atžvilgiu. Vidutinis pomidorų daigų ligos sunkumas buvo matuojamas praėjus 3 savaitėms po inokuliacijos į pasirinktus vienetus (au). Bendras kraujagyslių fenotipas ir rudumo laipsnis buvo įvertintas skalėje nuo 0 iki 4: 0, jokių simptomų nebuvo; 1, šiek tiek patinęs ir (arba) sulenktas hipokotilas; 2, vienas arba du rudi kraujagyslių pluoštai hipokotile; 3, mažiausiai du rudi kraujagyslių ryšuliai ir augimo iškraipymai (stiprus stiebo lenkimas ir asimetrinis išsivystymas); 4, visi kraujagyslių ryšuliai yra rudi, pasodinti arba negyvi, ar suvilgę. c) SIX genų ir ORX1 buvimas Fom , Fo -47 ir Fol izoliatuose bei dvigubai vaistams atspariose padermėse, gautose iš Fol / Fom ir Fol / Fo -47 koekubacijos , įvertintas PGR naudojant genomo DNR. Bendros inkubacijos buvo atliktos su paryškintais parodytais izoliatais. Ištirti trys nepriklausomi Fom ir Fo -47 transformatoriai su atsitiktinai įterptu atsparumo higromicinui genu (H1, H2, H3). d., Fo -47 + padermės, gautos iš Fol 007 / Fo -47 koinkubacijos, turi tą patį kariotipą kaip Fo -47, plius viena ar dvi chromosomos iš Fol 007. Protoplastai iš Fol 4287, Fol 007 (su BLE 14 chromosomoje). ), trys nepriklausomi Fo -47 (juostos Fo -47 H1, H2 ir H3) HYG transformatoriai ir devynios Fo -47 + padermės (juosta 1A – 3C, skaičius 1, 2 arba 3 nurodo HYG atsparų transformatorių, iš kurio jie buvo gauti) ant CHEF (homogeninio elektrinio lauko kontūrų apklijuoto) gelio. S. pombe chromosomos buvo naudojamos kaip molekulinio dydžio žymeklis. 1 ir 2 rodyklės nurodo kitas chromosomas Fo -47 + padermėse, palyginti su Fo -47. e, d punkte pavaizduoto CHEF gelio Southern blot, hibridizuotas su SIX6 zondu, parodantis, kad 14 chromosoma (1 rodyklė d ) yra visose padermėse, išskyrus Fo -47 (H1, H2 ir H3).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami griežtai įvertinti, ar papildoma genetinė medžiaga, išskyrus 14 chromosomą, galėjo būti perkelta iš Fol 007 į Fo -47 + padermes, sukūrėme PGR pradmenis, skirtus 29 chromosomos specifinių žymenų amplifikavimui iš Fol007, bet ne Fo-47 . Šie žymekliai (vidutiniškai po du kiekvienai chromosomai) buvo naudojami Fo- 47 + kamienams tikrinti, ar nėra Fol 007 išvestų genominių sričių (papildoma informacija F.4 ir papildomas 16 pav.). Buvo parodyta, kad visi Fo -47 + padermės turi 14 chromosomos žymenis (papildomas 17 pav.), Bet ne Fol 007 žymekliai, esantys bet kurioje šerdies chromosomoje, patvirtinantys, kad pagrindinės chromosomos nebuvo perkeltos. Įdomu tai, kad dvi Fo -47 + padermės (1C ir 2A), turinčios antrąją mažą chromosomą ir sukėlusios daugiau ligos simptomų, taip pat buvo teigiamos dėl papildomo Fol 007 žymens (papildomas 17 pav.), Susijusio su dideliu dubliuotu LS regionu Folyje. 4287: 18 pastolių (1, 3 Mb 3 chromosomoje) ir 21 pastolių (1, 0 Mb 6 chromosomoje) (2c pav.). 1C ir 2A padermėse buvo patvirtinta didžioji arba visos pastolių 18/21 sekos buvimas patvirtintas naudojant papildomas devynias pradinių genų žymenų poras, išsklaidytas per šį regioną (duomenys nepateikti, apie pradmenų sekas žr. Papildomas 25a, b lenteles) (). 4d pav.).

Apibendrinant, darome išvadą, kad Fo -47 + padermių patogeniškumas pomidorų atžvilgiu gali būti konkrečiai siejamas su Folo 14 chromosomos, kurioje yra visi žinomi mažų genų plantatuose išskiriami baltymai, įgijimu. Be to, kitų LS chromosomų genai gali dar labiau padidinti virulentiškumą, kaip parodė du padermės, turinčios papildomą LS chromosomą iš Fol 007. Fol 007 fone neradome dvigubo vaistams atsparaus padermės su pažymėta Fo -47 chromosoma. . Taip pat atsitiktinai pažymėtas Fol 007 transformantas nepadarė dvigubos vaistams atsparios kolonijos, kai jos buvo inkubuojamos kartu su Fo -47 (duomenys nepateikti). Tai rodo, kad perkėlimas tarp padermių gali būti apribotas tam tikromis chromosomomis, kurias gali nulemti įvairūs veiksniai, įskaitant dydį ir TE kiekį chromosomoje. Jų polinkį pernešti patvirtina faktas, kad mažiausia Fol chrizmos LS chromosoma perėjo į Fo -47, dviem iš devynių atvejų nepasirenkant atsparumo vaistams.

Diskusija

Palyginus Fusarium genomus, paaiškėjo nuostabi aseksualių rūšių Fol genomo struktūra ir dinamika. Šis pomidorų patogenas turi keturias unikalias chromosomas, sudarančias daugiau nei ketvirtadalį jo genomo. Genų sekos charakteristikos LS regionuose rodo atskirą šių regionų evoliucinę kilmę. Eksperimentiškai mes parodėme, kad visos LS chromosomos gali būti perkeltos per paprastą dviejų inkubacinių inkubacijų procesą tarp dviejų kitaip genetiškai išskirtų Fo narių. Santykinis naujų pomidorų patogeninių genotipų generavimo paprastumas patvirtina hipotezę, kad toks pernešimas tarp Fo padermių galėjo įvykti gamtoje 24 ir turi tiesioginį poveikį mūsų supratimui apie kintantį grybelinių patogenų pobūdį. Nors ir retai, horizontalus genų perkėlimas buvo užfiksuotas kituose eukariotuose, įskaitant metazoanus 25 . Tačiau anksčiau nebuvo pranešta apie spontanišką tokios didelės genomo dalies horizontalų perkėlimą ir tiesioginį su tuo susijusio patogeniškumo šeimininkui perkėlimą.

Horizontalus šeimininko specifiškumo veiksnių perkėlimas tarp kitaip nutolusių ir genetiškai izoliuotų Fo linijų gali paaiškinti akivaizdžias polifiletines šeimininko specializacijos ištakas 26 ir greitą naujų patogeninių linijų atsiradimą kitokiais skirtingais ir nesuderinamais genetiniais fonais 27 . Fol LS regionai yra praturtinti genais, susijusiais su šeimininko ir patogeno sąveika. Šių chromosomų mobilizavimas vienu atveju galėtų perkelti visą genų rinkinį, reikalingą šeimininko suderinamumui, į naują genetinę liniją. Jei kilmės recipiento aplinkos adaptacija būtų kitokia nei donoro, perkėlimas galėtų padidinti bendrą ligos atvejų skaičių šeimininko organizme, nustatydamas patogeniškumą genetinėje fone, iš anksto pritaikytoje vietos aplinkoje. Tokios žinios apie greito patogeno adaptacijos mechanizmus turės įtakos kuriant ligų valdymo strategijas žemės ūkio aplinkoje.

Metodų santrauka

Genomo sekos sudarymas ir surinkimas

Visi genomo šovinių (WGS) rinkiniai Fv (8 × aprėptis) ir Fol (6, 8 × aprėptis) buvo sukurti naudojant „Sanger“ sekos nustatymo technologiją ir surinkti naudojant „Arachne 6“ . Fiziniai žemėlapiai buvo sukurti pritvirtinant agregatus atitinkamai Fv genetinio ryšio 7 ir Fol optiniuose žemėlapiuose.

Hierarchinės sintezės apibrėžimas

Vietinio išlyginimo inkarai buvo aptikti naudojant „PatternHunter“ (1 × 10 10 ) (nuoroda 28). Gretimi inkarų rinkiniai, turintys konservatyvią tvarką ir orientaciją, buvo sujungti į grandinę 10 kb atstumu ir filtruoti taip, kad nė vienas blokas nepersidengtų su kitu bloku daugiau kaip 90% jo ilgio.

Pasikartojančių sekų identifikavimas

Pakartojimai buvo aptikti ieškant genomo sekos pagal save, naudojant „CrossMatch“ (≥ 200 bp ir ≥ 60% sekos panašumo). Pilno ilgio TE buvo anotuojami naudojant skaičiavimo prognozių ir rankinio patikrinimo derinį. Dideli segmentiniai dubliavimai buvo nustatyti naudojant „Map Aligner 29“ .

Proteomų apibūdinimas

Ortologiniai genai buvo nustatyti remiantis BLASTP ir porų sintetiniais suderinimais (SI). Blastų balų santykio testai 30 buvo naudojami norint palyginti baltymų ryšį tarp trijų genomų. Kodono naudojimo dažnumui apskaičiuoti buvo naudojamas EMBOSS įrankis „cusp“ (//emboss.sourceforge.net/). Genų ontologijos terminai buvo priskirti naudojant „Blast2GO 31“ programinę įrangą (BLASTP 1 × 10 20 ) ir buvo patikrinti sodrinimo, naudojant Fišerio tikslų testą, pataisytą daugybiniam tyrimui 32 . Genų šeimoms apibūdinti buvo naudojamas homologinės paieškos ir rankinio patikrinimo derinys. Pašalinus baltymus, gautus iš TMHMM, buvo identifikuoti naudojant SignalP (//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), naudojant baltymus SignalP (//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)., „Phobius“ (išskyrus pirmąsias 50 aminorūgščių) ir „TargetP“ (RC balas 1 arba 2) prognozes. Maži cisteino išskiriami baltymai buvo išskiriami kaip išskiriami baltymai, kurių ilgis yra mažesnis nei 200 aminorūgščių ir kuriuose yra ne mažiau kaip 4% cisteino liekanų. GPI (glikozilfosfatidilo inozitolio) baltymai buvo identifikuoti pagal GPI inkaro prijungimo signalą tarp numatomų išskiriamų baltymų, naudojant pasirinktinį PERL scenarijų.

Prisijungimai

Duomenų indėliai

Visus sekų rodmenis galima atsisiųsti iš NCBI pėdsakų saugyklos. „ Fv“ ir „ Fol “ rinkiniai buvo atiduoti „GenBank“ prie projekto priedų AAIM02000000 ir AAXH01000000. Išsamią informaciją galima rasti palyginamojoje „Broad Fusarium“ svetainėje: //www.broad.mit.edu/annotation/genome/fusarium_group.3/MultiHome.html.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Šiame faile yra papildomos informacijos apie (A) genomo sekos sudarymą, surinkimą ir žemėlapių sudarymą; (B) Anotacija; (C) bruožai, būdingi Fusarium genomams; (D) antrinio metabolizmo genų grupių; (E) Fusarium oxysporum LS chromosomų ypatybės ir (F) LS chromosomų perkėlimas iš vieno štamo į kitą.

  2. 2.

    Papildomi skaičiai

    Šioje byloje yra papildomos S1-S20 figūros su legendomis.

  3. 3.

    Papildomos lentelės

    Šiame faile yra papildomų S1-S25 lentelių.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.