Dviejų aplinkai reikšmingų melsvabakterių lyginamoji transkriptika atskleidžia netikėtą transkriptų įvairovę | nežinomas žurnalas

Dviejų aplinkai reikšmingų melsvabakterių lyginamoji transkriptika atskleidžia netikėtą transkriptų įvairovę | nežinomas žurnalas

Anonim

Dalykai

  • Jūrų mikrobiologija
  • Mikrobų genetika
  • Transkriptika

Anotacija

Prochlorococcus yra gausiai ir ekologiškai svarbių jūrų melsvabakterių gentis. Čia pateikiame išsamų dviejų Prochlorococcus padermių transkriptų struktūros ir sudėties palyginimą , kurie, nepaisant jų panašumų, pritaikė savo genų fondą prie specifinių aplinkos apribojimų. Mes pateikiame genomo masto transkripcijos pradžios vietų (TSS) žemėlapius, skirtus abiems organizmams, kurie yra dviejų labiausiai skirtingų kladų atstovai iš dviejų pagrindinių ekotipų, pritaikytų atitinkamai esant dideliam ir silpnam apšvietimui. Mūsų duomenys rodo, kad trijų ketvirtadalių genų antikūnų transkripcija yra žymiai didesnė nei kitų bakterijų. MIT9313 paderme atradome šimtus TSS genų, ypač 16 iš 29 prochlorosino genų. Tiesioginis palyginimas atskleidė labai menką TSS išsaugojimo vietą ir nekoduojančių nuorašų pobūdį tarp abiejų padermių. Mes aptikome ypač trumpus 5 ′ netransliuojamus regionus, kurių vidutinis ilgis yra atitinkamai tik 27 ir 29 nt MED4 ir MIT9313, o 8% visų baltymus koduojančių genų vidutinis atstumas iki pradinio kodono yra tik 10 nt ar net trumpesnis. Šie radiniai ir akivaizdus Shine – Dalgarno motyvo nebuvimas leidžia manyti, kad be lyderio ir ribosomų baltymo S1 priklausomas vertimas yra alternatyvūs transliacijos inicijavimo mechanizmai Prochlorococcus srityje . Mes darome išvadą, kad viso genomo antisense transkripcija yra pagrindinis transkripcijos iš šių santykinai mažų genomų komponentas ir kad jų transkripcijos architektūroje egzistuoja iki šiol nepripažintas didelis genų raiškos sudėtingumo ir kintamumo laipsnis.

Įvadas

Prochlorococcus yra jūrinis ir vienaląstis melsvadumblis, kuriame gyvena 40–40 ° pietų platumos oligotrofiniai atvirieji vandenynai (Partensky et al., 1999). Šiose vietose Prochlorococcus skaičiuoja fitoplanktoną, kuriame yra ne daugiau kaip 5 × 105 ląstelių viename mililitre, ir sudaro didelę dalį fotosintetinės biomasės (Goericke ir Welschmeyer, 1993; Vaulot ir kt., 1995). Vandenyno ekosistemai didelę įtaką turi Prochlorococcus , Prochlorococcus užkrečiančių cianofagų ir SAR11 apvalkalo alfaproteobakterijų sąveika. Jei pastarasis priklauso nuo organinių medžiagų, kurias gamina pirminiai gamintojai, tokie kaip Prochlorococcus , cianofagai prisideda prie šios sąveikos, lizuodami Prochlorococcus , todėl organinės medžiagos tampa prieinamos (Thompson ir kt., 2013). Buvo apibrėžti du atskiri ekotipai, atsižvelgiant į jų prisitaikymą prie didelio apšvietimo (HL; pavyzdžiui, MED4 kamieno) arba silpno apšvietimo režimų (LL; pavyzdžiui, MIT9313 kamienas) (Moore ir kt., 1995). Tačiau kiti ekologiniai veiksniai, tokie kaip temperatūra, maistinės medžiagos ir konkurentų gausa, taip pat turi įtakos ekotipų pasiskirstymui (Johnson ir kt., 2006). HL ir LL ekotipus galima dar suskirstyti į šešis skirtingus poskyrius: du - ryškiojo ekotipo (HLI ir HLII) ir keturis - silpno apšvietimo ekotipui (LLI-LLIV) (Kettler ir kt., 2007). Pagal šią klasifikaciją MED4 ir MIT9313 žymi dvi toliausiai susijusias Prochlorococcus odeles (HLI vs LLIV). Nors jų 16S rRNR yra 97, 5% identiški, jų baltymų kodavimo potencialas skiriasi: 1955 m. Anotavuose nurodyti MED4 baltymai, 2843 - MIT9313, o pasidalijamame tik 1447 genai (kaip nustatyta atlikus BLAST paiešką naudojant e vertę 10). −8 ). Padermėms būdingų atvirų skaitymo rėmų (ORF) rinkinyje yra genai, koduojantys fotosintetinius baltymus, taip pat genai, kurie dalyvauja maisto medžiagų įsisavinime, asimiliacijoje ir metabolinėse funkcijose (Rocap et al., 2003; Kettler et al., 2007). Tai rodo, kad galėtų būti ekologiniam tipui būdingų reguliavimo elementų, kurie specialiai kontroliuoja šias funkcijas, todėl gali būti tikimasi, kad abi rūšys skirsis.

12-ojo Prochlorococcus izoliato genomai buvo visiškai sukonkruoti , atskleidžiant kompaktiškų ir supaprastintų genomų tendenciją (Dufresne et al., 2003; Rocap et al., 2003; Kettler et al., 2007). Toks genomo racionalizavimas buvo pripažintas svarbiu daugeliui kitų atvirų vandenynų jūrinių bakterijų, tokių kaip alfaproteobakterijų SAR11 klado atstovai (Grote et al., 2012), ir buvo aiškinamas kaip tipiškas jūrų bakterioflanktono pritaikymas oligotrofijai ( Swan ir kt., 2013). Dėl šio supaprastinimo Prochlorococcus genomai pasigenda guanino ir citozino liekanų, yra tankiai supakuoti su mažais intergeniniais regionais ir juose yra tik keli genai, koduojantys baltymus, dalyvaujančius transkripcijoje, signalo perdavime ir genų ekspresijos reguliavime (Dufresne ir kt., 2003). ; Rocap ir kt., 2003; Kettler ir kt., 2007). Tokie genomo požymiai buvo pripažinti ir daugeliui kitų bakterioflanktono rūšių (Swan ir kt., 2013).

Nepaisant jų tankiai pakeistų genomų ir santykinai mažo skaičiaus transkripcijos baltymų reguliatorių (tik penkių ir aštuonių sigmų faktoriai, šeši ir septyni atsako reguliatoriai, atitinkamai šeši ir 10 histidino kinazių atitinkamai MED4 ir MIT9313 (Scanlan ir kt., 2009). ), Prochlorococcus geba prisitaikyti prie aplinkos trikdžių. Nustačius santykinai didelį nekoduojamų RNR (ncRNR) skaičių MED4 (17 mažų RNR ir 24 antisense RNR (asRNR)), galima teigti, kad reguliavimo RNR gali atlikti svarbų vaidmenį reguliuojant genų ekspresiją Prochlorococcus (Steglich ir kt., 2008). NcRNR Yfr1 buvo parodyta pagrindinių išorinių membranų baltymų PMM1119 ir PMM121 kontrolės funkcija (Richter ir kt., 2010). Visai neseniai tam tikru metu per dangaus ciklą buvo nustatyti 73% visų MED4 genų antisense nuorašai (Waldbauer ir kt., 2012). Šis procentas yra žymiai didesnis nei anksčiau pranešta genų, susijusių su asRNR molekulėmis, dalis bet kurioje bakterijoje, kuri buvo 46% didžiausia Helicobacter pylori ir mažiau kitose bakterijose (Georg ir kt., 2009). Be to, buvo pranešta, kad asRNR gausa yra palyginti didelė MED4, vidutiniškai 35% atitinkamos mRNR koncentracijos (Waldbauer ir kt., 2012). Nepaisant gausios turimos informacijos apie genomą, įžvalgos apie transkripcijos architektūrą ir potencialiai reguliuojančių RNR molekulių skaičių ir tipą iš esmės yra fragmentiškos ir apsiriboja MED4.

Remiantis didelio tankio mikrotraumos hibridizacijomis, keletas tyrimų pateikė vertingos informacijos apie MED4 genus ir tam tikru mastu apie MIT9313 genus, kurie yra diferencijuotai ekspresuojami tokioms aplinkai svarbioms pertraukoms kaip lengvas stresas, fosforas, azotas ir geležies badas bei fagas. infekcija (Martiny ir kt., 2006; Steglich ir kt., 2006; Tolonen ir kt., 2006; Lindell ir kt., 2007; Thompson ir kt., 2011) ir todėl yra prisitaikę prie tų sąlygų. Tačiau, išskyrus eksperimentinį 25 transkripcijos pradžios vietų (TSS) nustatymą MED4 (Vogel ir kt., 2003) ir cpeB (Steglich ir kt., 2005), psbA , psbC , psbD ir pcbA genų TSS atvaizdavimą. (Garczarek ir kt., 2001) nėra informacijos apie promotorius, kurie iš tikrųjų naudojami Prochlorococcus. Mūsų tyrimo derinimas su ankstesnėmis mikrotraumų analizėmis paskatins tikslinę naujų reguliavimo promotoriaus elementų paiešką Prochlorococcus , kuris iki šiol ribojamas žiniomis apie NtcA reguloną (Tolonen et al., 2006) ir cianobakterijų Pho skaičiavimo modeliavimo tyrimais., LexA ir cAMP receptorių baltymų regulonai (Su ir kt., 2007; Li ir kt., 2010; Xu ir Su, 2009).

Čia pateikiame dviejų Prochlorococcus padermių, reprezentuojančių du pačius įvairiausius kladus, dviejų pagrindinių ekotipų, pritaikytų aukšto ir silpno apšvietimo sąlygoms, transkriptų palyginamąją analizę. Mes panaudojome tris skirtingas didelio pralaidumo metodikas (454 ir „Solexa“ sekų sudarymo platformas) kartu su diferenciniu RNR-seq metodu, selektyviu pirminių transkriptų analizei ir visuotiniam TSS žemėlapių sudarymui (Sharma et al., 2010), taip pat „Affymetrix“ aukšta. - tankio mikroatspaudai, skirti nepriklausomam antisenso nuorašų patikrinimui. Tai papildėme skaičiavimo ir eksperimentiniu pasirinktų genų patvirtinimu. Pateikiame genomo masto abiejų padermių TSS žemėlapius, turinčius vieną nukleotido skiriamąją gebą, leidžiančią palyginti transkripcijos aktyvumą. Mes nustatėme aukštą antisense transkripcijos laipsnį ir nustatėme naujas ncRNR. Išskyrus su fotosinteze susijusius genus, baltymus koduojančių genų TSS ir asRNR nėra išsaugoti, o tai rodo didelį jų transkripcijos architektūros kintamumą.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Pirminės dviejų Prochlorococcus padermių transkriptos yra labai įvairios

Dviejų „ Prochlorococcus“ padermių transkriptomoms apibūdinti buvo naudojami visi MED4 ir MIT9313 kultūrų RNR mėginiai, išauginti standartinėmis sąlygomis, kad būtų sukurtos dvi kryptims būdingos cDNR bibliotekos, leidžiančios diferencijuoti pirminių nuorašų ir perdirbtų nuorašų seką. Bakterijose dauguma pirminių nuorašų 5 ′ galuose turi trifosfatą, atsirandantį dėl transkripcijos, tuo tarpu perdirbti arba suskaidyti RNR fragmentai turi 5 ′ monofosfato arba 5 ′ hidroksilo. Šie skirtumai buvo panaudoti sintetinant dvi kiekvieno štamo cDNR bibliotekas: vieną iš pradinio, neapdoroto RNR fondo, kuriame yra ir pirminių, ir perdirbtų nuorašų ((-) cDNR biblioteka), ir kitą iš RNR, praturtintą pirminiais nuorašais selektyviai skaidydamas RNR, kuriuose yra monofosfatų, naudojant Terminator 5 'P priklausomą egzonukleazės ((+) cDNR biblioteką) (Sharma ir kt., 2010; Mitschke ir kt., 2011). Atlikus sekos šių abiejų padermių diferencinių bibliotekų seką, rodmenys buvo susieti su MED4 ir MIT9313 genomais (1 lentelė), o abiejų padermių −10 elementams buvo suformuotos dvi atskiros kiekvienai pozicijai būdingos balų matricos (papildomos lentelės S2 ir S3). . Šios specifinės padėties įvertinimo matricos buvo pagrįstos nukleotidais visų pažymėtų gTSS –7–12 padėtyse su mažiausiai 11 skaitymų (9927 5 ′ galai - MED4 ir 13 626 - MIT9313). Vėliau, atsižvelgiant į TSS, filtro kriterijumi buvo naudojamas mažiausios padėties balų matricos 2, 0 rodiklis −10 elementui. Dėl to paties −10 elemento sekos motyvo buvo gautos skirtingos MED4 ir MIT9313 balų vertės dėl GC kiekio skirtumo (30, 8% MED4 genome ir 47, 5% MIT9313). Iš 26 anksčiau apibūdintų gTSS (baltymus koduojančių genų TSS) (Vogel ir kt., 2003; Steglich ir kt., 2005) 18 buvo identifikuoti tiesiogiai. Dviejų iš aštuonių trūkstamų gTSS naujų −10 elementų rezultatas buvo mažesnis nei 2, 0, o keturių neatitiko skaitymo skaičiaus kriterijaus, nurodydami, kad MED4 yra dar didesnis aktyvių TSS skaičius. Remiantis ankstesniais rezultatais (Vogel ir kt., 2003), tikslinė −35 promotoriaus elemento „TTGACA“ paieška davė labai mažą 3, 3% (MED4) arba 2, 1% (MIT9313) TSS pogrupį su konservuota E. coli - kaip −35 elementas.

Pilno dydžio lentelė

Iš viso buvo nustatyti 4126 ir 8587 TSS, skirti MED4 ir MIT9313, gautus iš Solexa ir 454 sekos duomenų, kurie buvo toliau klasifikuojami į gTSS (baltymus koduojantys genai), aTSS (asRNR), nTSS (potencialūs ncRNR) arba iTSS (genų viduje). (daugiau informacijos žr. Medžiaga ir metodai) (papildomos S4 ir S5 lentelės ir papildomos bylos S1 – S6). Maždaug pusei visų baltymus koduojančių genų (MED4, 49% ir MIT9313, 41%) būtų galima priskirti gTSS. Keista, tačiau nebuvo geros koreliacijos tarp labai išreikštų genų MED4 ir MIT9313 (papildoma S6 lentelė). Labai išreikštoje TSS dominuoja gTSS, po kurios eina nTSS, įskaitant perdavimo-Messenger RNR - vienintelę nTSS, dalijamą tarp abiejų padermių tarp 20 geriausiųjų, ir naujai patikrintas ncRNR Yfr23 (MED4), Yfr102 ir Yfr103 (MIT9313) (papildoma S6 lentelė). ). Norėdami gauti daugiau informacijos, skaitykite skyrių apie ncRNR. Vienintelis gTSS iš 20 geriausiųjų sąrašų, aptinkamas abiejuose štamuose , yra psbEFLJ operono transkripcija, koduojanti citochromo b559 alfa ir beta subvienetus ir PSII L ir J baltymus (papildoma S6 lentelė). Kiti 20 geriausių sąrašų pavyzdžiai aiškiai nurodo genų ekspresijos ryšį su Prochlorococcus fiziologija - pavyzdžiui, kaip iliustruota MED4, turinčio tokius genus kaip pcb ar hli10, kurie koduoja vienintelį lengvo derliaus baltymą ir vieną iš aukšto lygio , gTSS. - šviesos sukeliami baltymai. Kitas skirtumas tarp abiejų transkriptų yra TSS tankis. Vidutinis atstumas tarp dviejų iš eilės einančių TSS yra atitinkamai 353 nt ir 563 nt, MIT9313 ir MED4. Aukštojo TSS tankio MIT9313 funkcinė svarba išlieka neaiški.

Atskirų su fotosinteze susijusių genų TSS išsaugojimas

Mes ieškojome gTSS, išsaugoto tarp abiejų kamienų (apibrėžtų identišku atstumu iki transliacijos pradžios vietos ± 10 nt). Iš 1447 MED4-MIT9313 bendrų baltymus koduojančių genų 436 buvo susiję su vienu ar daugiau gTSS. Iš jų 214 turi konservuotą gTSS (papildoma S7 lentelė). Funkcinio sodrinimo analizė atskleidė, kad su fotosinteze susiję genai šioje grupėje buvo atstovaujami per daug (praturtėjimo balas 7, 54). Tarp su fotosinteze susijusių genų randama tokių, kurie koduoja tiek I fotosistemos ( psaC, psaD, psaE ir psaF ), tiek II fotosistemos ( psbA, psbB, psbE, psbH, psbO ir psb28 ) baltymus . Kiti šios kategorijos genai koduoja elektronų perdavimo baltymus ( petE, petH ) ir citochromo b6 / f kompleksinius komponentus ( petB ). Kadangi daugelis šių genų yra operonuose, tai dar didesnis skaičius su fotosinteze susijusių genų priklauso šiai klasei. Tai parodo konservuotas gTSS prieš psbE , faktiškai skatinantis psbEFLJ transkripciją. Kitų funkcinių klasių praturtėjimas nebuvo toks ryškus kaip fotosintezės genų; tačiau šis praturtėjimas turėjo gerą statistinę informaciją. Šios klasės apima histidino metabolizmą, aminoacil-tRNR biosintezę, genus, koduojančius NAD (P) H-chinono oksidoreduktazės subvienetus, ribosominius baltymus ir terpenoidinio stuburo biosintezę, kurių praturtėjimo balai buvo tarp 3, 5 ir 1, 4. Ypač ribosomų baltymų genų, turinčių panašią transkripcijos iniciaciją, skaičius yra dar didesnis, nes daugelis šių genų yra organizuoti didžiuliuose operonuose. Šie duomenys rodo, kad daugelio namų tvarkymo procesų genų reguliavimas yra konservatyvaus reguliavimo pagrindas.

5′UTR į Prochlorococcus

Vidutinis atstumas nuo gTSS iki baltymus koduojančių genų pradinio kodono Prochlorococcus pasirodė labai trumpas: atitinkamai MED4 ir MIT9313 buvo 26 ir 28 nt (1 paveikslas), palyginti su 42 nt Synechocystis PCC6803 (Mitschke et. al., 2011) arba 43 nt H. pylori (Sharma ir kt., 2010). Pusė visų MED4 (56%) ir MIT9313 (53%) baltymus koduojančių genų turi 5′UTR ilgį nuo 10 iki 40 nt, o didžiausias dažnis yra atitinkamai 17 ir 15 nt (1 paveikslas). Visose MED4 ir MIT9313 5′UTR ieškojome „Shine – Dalgarno“ sekos „RGGRGG“, išskyrus trumpesnes nei 17 ar 15 nt ir leidžiančias vieną neatitikimą. Iš 905 MED4 5′UTR ir 1202 MIT9313 5′UTR 29 genai MED4 ir 156 MIT9313 genai turi galimą Shine – Dalgarno seką nuo –4 iki –23 srityje. Šis dažnis yra lygus atsitiktinai parinktam 6-nt ilgio motyvui. Ieškodami papildomos „YCCYCC“ sekos, tame pačiame paieškos regione aptikome labai panašų skaičių 23 MED4 ir 161 MIT9313 5′UTR su tuo motyvu. Šios išvados rodo nedidelį, jei koks nors, funkcinį „Shine – Dalgarno“ sekos vaidmenį Prochlorococcus . E. coli srityje Shine – Dalgarno seka yra sujungta su 16S rRNR anti-Shine – Dalgarno seka, įtvirtinant 30S ribosomų subvienetą aplink pradinį kodoną, kad būtų sudarytas iniciacijos kompleksas, apimantis nuo –35 iki +19 sritį (Hüttenhofer ir Noller, 1994). Nors „ Prochlorococcus“ 16S rRNR seka turi tą pačią anti-SD seką, kaip aprašyta E. coli , Shine – Dalgarno sekos nebuvimas ir didelis baltymą koduojančių genų, turinčių santykinai trumpus 5′UTR, skaičius rodo alternatyvius transliacijos inicijavimo būdus. geriausia naudoti Prochlorococcus . Taip pat žinomi kiti transliacijos inicijavimo E. coli mechanizmai, tokie kaip ribosominio baltymo S1 prisijungimas prie 5RNR mRNR (Boni ir kt., 1991), ir tai gali būti tinkamiausias transliacijos inicijavimo mechanizmas, naudojamas Prochlorococcus . Daugelyje cianobakterijų yra du homologiški ribosomų S1 baltymai Rps1a ir Rps1b (2 paveikslas). Rps1a baltymai yra labiau susiję su jų ortologais nei su jų paraloginiu Rps1b baltymu. Be to, atrodo, kad ortologiniai Rps1b baltymai yra įvairesni nei ortologiniai Rps1a baltymai. Dublikuotų S1 baltymų išsaugojimas melsvadumbliuose rodo svarbų Rps1b vaidmenį; vis dėlto mįslinga, ar ji taip pat užsiima vertimu. Numatoma, kad du MED4 ir MIT9313 homologai bus 40, 8 ir 45, 1 kDa (34% sekos tapatumas) ir 40, 5 ir 45, 2 kDa (29% sekos identiškumas). Mutsuda ir Sugiura (Mutsuda ir Sugiura, 2006) parodė, kad Synechococcus elongatus PCC 6301 38 kDa S1 baltymas (Rps1a) yra susijęs su efektyviu vertimo inicijavimu, susiejant jį su sekundėmis, kuriose gausu pirimidino, neatsižvelgiant į tai, ar „Shine – Dalgarno“ seka. S. elongatus Rps1a seka identiška 75% Prochlorococcus homologų (40, 8 kDa MED4 ir 40, 5 kDa MIT9313), tuo tarpu S. elongatus Rps1b tapatumas centriniame-C galiniame regione yra tik 34% ir 38 %, atitinkamai (45, 1 kDa MED4 ir 45, 2 kDa MIT9313).

Image

MED4 ( a ) ir MIT9313 ( b ) gTSS promotorius, taip pat 5′UTR charakteristikos. Remiantis 1182 MED4 ir 1383 MIT9313 gTSS, buvo aptiktas minus –10 elemento motyvas 6–8 nt prieš transkripcijos inicijavimo vietą, po kurio sekė periodinis AT ruožo signalas, esantis MED4. Ypač trumpi 5′UTR, kurių vidutinis ilgis yra 26 nt (MED4) ir 28 nt (MIT9313), o nėra konservuotos Shine – Dalgarno sekos. Tai rodo alternatyvius transliacijos inicijavimo būdus, nepriklausomus nuo 16S rRNR tarpininkaujamų ribosomų jungimosi. MED4 bendras 5′UTR ilgis yra 17 nt, o MIT9313 - 15 nt. Daugumos baltymus koduojančių genų 5′UTR ilgis yra nuo 10 iki 40 nt.

Visas dydis

Image

Bajeso atliktas filogenijos (Huelsenbeck ir Ronquist 2001) nurodytas ribosominių S1 baltymų tyrimas cianobakterijose, gramteigiamose ir gramneigiamose bakterijose remiantis papildomo failo S7 suderinimu. Mes kaip išeitį panaudojome poisson greičio matricą, gama paskirstyto greičio kitimą, Oscillochloris trichoides DG-6 ir sustojome pasiekę vidutinį 0, 0116 padalijimo dažnių sd. Skaičiai mazguose parodo užpakalinę tikimybę. Cianobakterijų grupavimas atliekamas pagal Schirrmeister ir kt., 2011. Žvaigždute pažymėtos melsvabakterės ( Gloeobacter violaceus PCC 7421 ir Cyanobacterium UCYN-A) neturi Rps1b homologo.

Visas dydis

Kitas transliacijos inicijavimo mechanizmas egzistuoja bešvinėms mRNR, kurioms trūksta 5′UTR ir tiesiogiai suriša 70S ribosomą, papildytą N -formilmetionilo pernešimo RNR (Moll ir kt., 2002). Abiejose padermėse mes nustatėme, kad ∼ 8% visų gTSS yra per pirmuosius 10 nt iki pradinio vertimo kodono, o tai rodo, kad Prochlorococcus vyksta vertimas be lyderio. Tai sutinka su skaičiavimo prognozėmis, paremtomis 953 bakterijų ir 72 archeologiniais genomais, kurie leido manyti, kad be lyderio transkripcija yra plačiai paplitusi tarp bakterijų (207 iš 953 genomų), nors ir nėra dominuojanti (Zheng et al., 2011). Pradedama 30 MED4 ORF ir 41 MIT9313 ORF transkripcija pirmajame pradinio kodono nukleotide. 21 MED4 ir 34 MIT9313 genais tai vienintelis aptinkamas TSS standartinėmis augimo sąlygomis. Išskyrus tris homologus, be lyderių nuorašai nėra išsaugomi tarp MED4 ir MIT9313 ir yra tolygiai paskirstomi visame genome. Vienintelės išimtys yra „ ruvB“, „degT“ ir PMED4_05961 / P9313_15281 homologai, koduojantys Holliday sankryžos DNR helikazę „RuvB“, „DegT / DnrJ / EryC1 / StrS“ aminotransferazės šeimos baltymą ir anksčiau neaptiktą karboksizomos apvalkalo baltymą „CsoS1d“ (Klein et al., 2009). . Visi šie trys baltymai yra labai konservuoti visoje melsvadumblių bakterijoje; todėl jų vertimas be lyderio gali būti išsaugotas už dviejų čia nagrinėtų atmainų. Kartu mūsų duomenys rodo, kad S1 baltymo tarpininkaujama ir be lyderio transliacija yra transliacijos inicijavimo mechanizmai, tuo tarpu nuo Shine – Dalgarno sekos priklausomas vertimo inicijavimas vaidina antrinį vaidmenį (jei išvis) Prochlorococcus . Zheng ir kt. (2011) nustatė cianobakterijoms būdingų sekų parašus 5′UTR ir pasiūlė, kad turi egzistuoti kiti iki šiol nežinomi vertimo inicijavimo mechanizmai, kurie visiškai atitinka mūsų rezultatus.

Alternatyvus TSS prochlorosino genuose

Mūsų duomenys rodo, kad daug TSS yra baltymus koduojančių genų koduojamame regione, iš kurių tik 37 iTSS (nuorašai, inicijuojami geno viduje) yra išsaugoti tarp 377 bendrų MED4-MIT9313 genų, susijusių su iTSS. Kai kurie iTSS iš tikrųjų yra neteisingai pažymėtų pradinių kodonų gTSS dėl automatinio ORF iškvietimo, kuris paprastai apibrėžia ilgiausią įmanomą ORF kaip CDS regioną. Iš 22 MED4 ir 155 MIT9313 iTSS per pirmąsias 50 nt anotatu pažymėtų kompaktinių diskų, neturinčių papildomo gTSS, 3 MED4 ir 61 MIT9313 iTSS buvo klasifikuoti neteisingai dėl netinkamo pradinio kodono anotavimo. Mes juos pataisėme ir perkvalifikavome juos kaip gTSS (papildomos S4 ir S5 lentelės). ITSS, esanti ORF 3 ′ regionuose, kurie yra šalia pasroviui po ORF, gali sukelti mažiausiai 101 nt pasroviui priklausančio ORF UTR. Tačiau yra įrodymų, kad iTSS poklasis sukelia trumpesnius, labai tikėtinus, funkciškai svarbius nuorašus. Tarp tokių yra TSS, esančių prochlorosino ( procA ) genuose, iš kurių 29 homologai egzistuoja MIT9313 (Li ir kt., 2010). Prochlorosinai yra lantipeptidai, kurie yra persijoti ribosominiu būdu ir po transpozicijos modifikuoti peptido pirmtako C-galo branduolio srityje ir yra išskiriami tioeterio aminorūgštimis lantioninu ir metillentioninu (Willey ir Van der Donk, 2007). ProcA brendimas užbaigiamas proteolitiniu būdu pašalinant N-galo lyderio seką, kuri pati nėra modifikuota, ir susidaro aktyvus metabolitas (Willey ir Van der Donk, 2007). Visi 29 homologai yra ekspresuojami standartinėmis augimo sąlygomis, nors ir žemu ekspresijos lygiu (papildoma S10 lentelė). 11 iš 29 procA genų transkripcija prasideda tik prieš anotuotą geną, tuo tarpu 16 procA homologų turi gTSS ir bent vieną papildomą iTSS (papildoma S8 lentelė). Įdomu tai, kad vidutinis iTSS atstumas iki C-galo šerdies peptido yra 26 nt, tai labai panašus į vidutinį 5′UTR ilgį 28 nt, kuris buvo nustatytas visoms MIT9313 gTSS.

Šiaurinės hibridizacijos su specifiniais zondais, nukreiptais į 5′UTR ir procA1.4 N-galinę sritį arba C-galą, įskaitant iTSS, davė aiškių signalų, kuriuos galima priskirti pilno ilgio pirmtako peptido nuorašams, taip pat nuorašai, prasidedantys pažymėtame ITSS ir apimantys visą šerdies peptidą (3 pav.). Šių 3 'nuorašų funkcinis tinkamumas išlieka paslaptingas, nes šerdies peptidas prasideda ne nuo metionino ar alternatyvaus pradinio kodono. Yra du procA genai - procA2.3 ir procA4.1 -, kurie yra perrašomi tik iš iTSS. Įdomu tai, kad pagrindinis procA2.3 peptidas prasideda metioninu ir rodo skirtingus 70-, 90-, 200- ir 400-nt ilgio signalus, kai tiriama pagal 3'UTR pagrindinį peptidą (3 paveikslas). 200 nt fragmentas yra pats gausiausias iš visų aptiktų ir gali apimti visą šerdies peptidą plius 3′UTR 80 nt. Remiantis sekos nustatymo duomenimis, tiriant 5′UTR sritį, signalai nebuvo stebimi nei įprastomis augimo sąlygomis (3 paveikslas), nei prisitaikant prie įvairių streso sąlygų (duomenys nepateikti). Tik procA2.3 šerdies peptido transkripcija kelia klausimą, ar išverstas šerdies peptidas be lyderio peptido iš viso galėtų būti paverstas bioaktyvia forma; bendras brendimo būdas prasideda peptido pirmtako modifikavimu posttransliaciniu bifunkciniu lantionino sintetazės būdu ir tam, kad fermentas surištų substratą, reikia bent tam tikrų lyderio peptido dalių (Xie et al., 2004) arba jei šerdies peptido neįmanoma modifikuotas, taip atlikdamas kitą funkciją. Jei alternatyviu būdu prochlorosiną būtų galima paversti bioaktyviu junginiu, atsirastų visiškai naujas lantipeptidų sintezės įrankis - grupė mažų peptidų, kuriuos maisto pramonė jau įprasta naudoti kaip konservantus ir klinikinius. daugelio vaistų atsparių patogenų sukeltų infekcijų likvidavimo laukas (Piper ir kt., 2009).

Image

ProkA genų apžvalga procA1.4 ( a ) ir procA2.3 ( b ) skaitymo pasiskirstymas pagrįstas Solexa žemėlapių [+] (tamsiai pilkos linijos) ir [-] (šviesiai pilkos linijos) cDNR bibliotekų ir šiaurinių blot hibridizacijų skaičiavimais. zondai (raudonos dėžės), atpažįstantys 5 ′ arba 3 ′ sritį. Žemėlapių, kuriuose atsiranda TSS, regionai pažymėti mėlynais (gTSS) ir oranžiniais (iTSS) laukeliais. Elementas −10 pažymėtas žaliu langeliu. Nuorašo ilgis, nustatytas šiaurinės hibridizacijos būdu, pateikiamas kaip šviesiai mėlynos spalvos langeliai. Iš viso 10 μg visos RNR buvo įpilta į 10% PAA gelius ir nufilmuota ant nitroceliuliozės membranų.

Visas dydis

Didelis trumpų cis koduotų asRNR dažnis

Pranešama apie visur esančius cis koduojamų asRNR atvejus įvairioms bakterijoms (apžvelgta Georg and Hess, 2011), o kiekviename naujame paskelbtame transkripto duomenų rinkinyje yra naujų antisense transkripcijos pavyzdžių. Tačiau mus nustebino didelis genų, kurie buvo susieti su bent viena asRNR, skaičius. Iš viso MED4 ir MIT9313 buvo nustatyti atitinkamai 1117 ir 1789 genai, turintys asRNR 454 duomenų rinkinyje, bei 1600 ir 2280 genai, esantys Solexa duomenų rinkinyje. Bendras genų, turinčių asRNR, skaičius „Solexa“ ir 454 duomenų rinkiniuose buvo atitinkamai 1008 (54% visų genų) ir 1625 (57% visų genų) atitinkamai MED4 ir MIT9313 (3 paveikslas). Be to, diferenciniam RNR-seq metodui pritaikėme alternatyvų metodą ir hibridizuotus Prochlorococcus specifinius Affymetrix mikrotraumus su tiesiogiai Cy3 pažymėtais RNR iš kultūrų, auginamų standartinėmis sąlygomis ar keliomis streso sąlygomis (daugiau informacijos rasite medžiagoje ir metoduose) (Papildomos rinkmenos S8 ir S9). Kadangi šių mikrotraumų zondai iš pradžių buvo sukurti hibridizacijai su cDNR, signalo intensyvumas, viršijantis ribą, suteiktų informacijos apie asRNR egzistavimą ir išraišką, hibridizuojant su tiesiogiai pažymėta RNR. Iš viso mes radome 1875 ir 2613 genus, susijusius su atitinkamai MED4 ir MIT9313 asRNR, kurie patvirtina galimą pasaulinę antisense transkripciją Prochlorococcus . Anksčiau buvo pranešta apie aukštą MEDEN4 antisense transkripcijos laipsnį (Waldbauer ir kt., 2012) ir, remiantis pateiktais duomenimis, atrodo, kad jis būdingas ne tik šviesai pritaikytiems ekotipams, bet ir mažam apšvietimui pritaikytiems kamienams. . Pažymėtina, kad trijų asRNR identifikavimui taikytų metodų sutapimas buvo mažesnis, nei tikėtasi, ir tai galima paaiškinti skirtingais skirtingų technologijų šališkumais (Harismendy ir kt., 2009; Raabe ir kt., 2014). Norėdami užtikrinti mūsų analizės pagrįstumą, mes apsvarstėme tik tas asRNR, kurios buvo patvirtintos bent dviem metodais (papildomas paveikslas S1). Dėl to tiek MED4, tiek MIT9313 maždaug trys ketvirtadaliai visų genų turi asRNR.

Norėdami geriau suprasti asRNR ypatybes Prochlorococcus , mes nustatėme vidutinį nuorašo ilgį ir santykinį asRNR gausą, palyginti su mRNR. Šiai analizei aTSS ir gTSS duomenys buvo surinkti į ilgesnius nuorašus, naudojant RNASeg segmentavimo algoritmą (bus paskelbti kitur). Stechiometrinis vidutinis mRNR santykis su asRNR rodmenimis buvo 19 ir 15, o vidutinis asRNR ilgis buvo atitinkamai 242 ir 408 nt MIT9313 ir MED4. Iš 616 bendrų genų su asRNR tik 52 asRNR buvo išsaugoti padėties atžvilgiu. Kadangi mes pastebėjome labai tankų promotoriaus pasireiškimą tiek MIT9313 (kas 353 nt), tiek MED4 (kas 563 nt), šios trumpos asRNR galėjo būti tik stabilūs nefunkciniai šalutiniai produktai, pavyzdžiui, dvisienių pavidalų. RNR.

Tačiau vien asRNR gausa paskatino mus išsamiau ištirti šios klasės molekulių funkcinį svarbą. Mes pasirinkome tariamas MED4 ir MIT9313 asRNR ir išbandėme jų galimą diferencialinę išraišką įvairiomis streso sąlygomis. Visos patikrintos asRNR parodė pakitusį ekspresijos elgesį vienoje ar keliose sąlygose, palyginti su standartinėmis augimo sąlygomis (4 paveikslas). CynS (PMM0373) koduoja cianą, kuri paverčia cianatą į anglies dioksidą ir amoniaką ir, atrodo, atlieka svarbiausią vaidmenį naudojant cianatą, o ne detoksikuojant MED4 (Kamennaya and Post, 2011). Įdomu tai, kad azotą ribojančiomis sąlygomis yra sukeliama nt 300 nt asRNR, kuri gali turėti svarbų vaidmenį reguliuojant cynS (4a pav.). YocE (PMM1378, desA ) koduoja II tipo riebalų rūgščių desaturazę, o jos ekspresija indukuojama esant žemai temperatūrai ir esant dideliam apšvietimui „ Synechococcus PCC7002“ (Sakamoto ir kt., 1997, 1998). Mūsų duomenys rodo galimą yocE asRNR tarpininkaujamą yocE reguliavimą stacionarios fazės ir geležį ribojančiomis sąlygomis (4a pav.). Manganą rišančio II baltymo Y baltymo mRNR, užkoduota psbY , yra padengta 120 nt ilgio asRNR (4b paveikslas). PsbY ir genas, esantis tiesiai pasroviui, gidA (PMT1049, turintis NAD surišantį domeną), atrodo, yra organizuotas dicistrone (4b pav.), O psbY asRNR gali sudaryti sąlygas atsieti psbY ir gidA genų ekspresijos reguliavimą. ∼ 130 nt asRNR apima P9313_10131 3 ′ sritį - geną, turintį homologiją su Synechococcus CC9311 tiolio oksidoreduktaze (4b paveikslas). Specifinis asRNR gausos sumažėjimas azoto badavimo metu rodo jos įsitraukimą į genų ekspresijos reguliavimą P9313_10131.

Image

MED4 ( a ) ir MIT9313 ( b ) atrinktų asRNR patikrinimas ir ekspresinių pokyčių nustatymas esant kelioms streso sąlygoms (D - tamsa, -Fe - geležies išeikvojimas, HL - didelis apšvietimas, HS - šilumos šokas, CS - šaltas šokas, -N - azoto trūkumas, C - standartinės augimo sąlygos ir SP - nejudanti fazė) naudojant šiaurinius blotus. 5S RNR buvo naudojama kaip įkrovos kontrolė. Genų išdėstymas ir aprėptis su pirminės (juodos) arba antrinės (pilkos) bibliotekos skaitymais parodyti apačioje. Rodyklės rodo TSS pozicijas.

Visas dydis

Šie keli pavyzdžiai nurodo labai sudėtingą reguliavimo tinklą per asRNR ir pabrėžia svarbų funkcinių RNR vaidmenį reguliuojant Prochlorococcus geną.

Nekodinės RNR yra specifinės Prochlorococcus klade

Genų ekspresijos kontrolė per ncRNR yra svarbus MED4 reguliavimo būdas (Axmann ir kt., 2005; Steglich ir kt., 2008). Tačiau iki šiol nebuvo pakankamai informacijos apie ncRNR kiekį kituose Prochlorococcus štamuose . Iš 20 anksčiau aprašytų ncRNR, esančių MED4 (Axmann ir kt., 2005; Steglich ir kt., 2008), 16 taip pat čia buvo aptikti naudojant diferencinį RNR-seq metodą. Be to, rankiniu būdu patikrinę nTSS arba atlikdami skaičiavimo prognozes naudodami RANDfold (Bonnet et al., 2004) (6 pav. Ir papildomas S2 paveikslas bei papildoma S9 lentelė), radome šešis naujus ncRNR. Dėl MIT9313 anksčiau buvo nustatytos tik penkios nRRNR, kurios yra visi MED4 ncRNR homologai. Taikydami tuos pačius paieškos kriterijus, kaip ir MED4, MIT9313 ir kai kuriuose potencialiuose ncRNR kandidatuose aptikome penkias papildomas ncRNR, tačiau su dviprasmiškais hibridizacijos rezultatais (papildomas paveikslas S3). Iš sekos rezultatų (300 nTSS iš 454 duomenų rinkinio ir 639 iš „Solexa“ duomenų) galime tikėtis, kad MIT9313 bus aptikta daugiau ncRNR. Penkios naujos identifikuotos ncRNR, esančios MIT9313, atsiranda tik (priešingai nei žinomos ncRNR) esant silpnam apšvietimui pritaikytuose ekotipuose (5 pav. Ir papildoma S4 pav. Bei papildoma lentelė S10). Vienintelė išimtis yra Yfr103, kuris taip pat egzistuoja Synechococcus padermėse CC9311, CC9605 ir CC9902. Tokiu pat būdu naujai aptiktų MED4 ncRNR homologai apsiriboja didelio ryškumo klodu arba vyksta tik MED4 - pavyzdžiui, Yfr26 ir Yfr27. Iš to darome išvadą, kad dauguma Prochlorococcus ncRNR yra specifiški labai lengviems ir silpniems kladėms, o tai rodo šių reguliatorių funkcinę svarbą prisitaikymui prie kladėms būdingų nišų. Gerai užfiksuota, kad ncRNR dažnai reguliuojamos atsižvelgiant į aplinkos sąlygas, kuriose jos vaidina. Todėl aišku, kad išbandytų ncRNR kiekis reagavo prisitaikant prie šviesos, maistinių medžiagų ir temperatūros svyravimų (5 pav.). Stipriausias ncRNR raiškos atsakas buvo aptinkamas azoto trūkumo ir nejudančios fazės metu. Anksčiau buvo pranešta, kad kitos bakterijos prisitaiko prie azotą ribojančių sąlygų ir nejudančios fazės per reguliavimo grandines, kuriose dalyvauja ncRNR (Jäger ir kt., 2009; Fröhlich ir kt., 2012).

Image

NcRNR kandidatų patikrinimas atliekant Northern blot hibridizaciją. MED4 ir MIT9313 buvo pritaikytos skirtingos streso sąlygos ir 5 μg visos ekstrahuotos RNR buvo atskirtos ant PAA gelių ir išblukintos ant nitroceliuliozės membranų. RNR dydis buvo įvertintas atliekant RNR kopėčių interpoliaciją ir sekos duomenis. Palyginti su kontroline hibridizacija, septynių skirtingų įtempių pokytis (normalizuotas atsižvelgiant į vidinį 5S rRNR) yra pateiktas log2.

Visas dydis

Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų duomenys patvirtina anksčiau pasiūlytą ncRNR svarbą MED4 reguliavimo tinkle - požiūrį, kad dabar jį galima išplėsti iki silpnai apšviesto MIT9313 padermės ir tikriausiai Prochlorococcus .

Išvados ir galimos pasekmės

Mes atradome tankią promotoriaus veiklą abiejuose štamuose ir labai įvairią transkriptų architektūrą tarp MED4 ir MIT9313. Didžiąją dalį naujai identifikuotų nuorašų sudaro asRNR, o tai leidžia daryti išvadą, kad nuorašo fondas yra beveik dvigubai sudėtingesnis nei anotuotų genų kiekis tiek MED4, tiek MIT9313. Trumpo asRNR kaupimasis gali būti veiksnys, prisidedantis prie pranešto trumpo RNR pusinės eliminacijos laiko (2, 4 minutės) (Steglich ir kt., 2010), nepaisant Prochlorococcus lėto dvigubėjimo laiko, paprastai vieno per dieną (Partensky et al., 1999). ). Šios trumpos asRNR yra ne tik poravimas prie mRNR tobulų substratų, skirtų ribonukleazės III, atpažįstančio dvigrandinę RNR, bet ir dalinis mRNR-asRNR dupleksų sutapimas taip pat galėtų generuoti papildomas ribonukleazės E įėjimo vietas viengrandiuose regionuose (Stazic et al. ., 2011), kuri yra pagrindinė ribonukleazė reguliuojamoje mRNR ribolizėje. Taigi didelis ribonukleazės substrato prieinamumas gali padidinti RNR apyvartą. Didelis asRNR skaičius, palyginti su baltymų reguliatoriais Prochlorococcus, galėtų paaiškinti trumpą 5′UTR ilgį; šie regionai yra būtini genų reguliavimui per baltymų reguliatorius (ir trans-veikiančias ncRNR), tačiau yra mažiau svarbūs reguliuojant asRNR.

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • GSE17075

Eilių skaitymo archyvas

  • SRR1045146
  • SRR1045147

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

  3. 3.

    Papildomas S3 paveikslas

  4. 4.

    Papildomas S4 paveikslas

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma S1 lentelė

  2. 2.

    Papildoma S2 lentelė

  3. 3.

    Papildoma S3 lentelė

  4. 4.

    Papildoma S4 lentelė

  5. 5.

    Papildoma S5 lentelė

  6. 6.

    Papildoma S6 lentelė

  7. 7

    Papildoma S7 lentelė

  8. 8.

    Papildoma lentelė S8

  9. 9.

    Papildoma S9 lentelė

  10. 10.

    Papildoma lentelė S10

Tekstiniai failai

  1. 1.

    Papildoma byla S1

  2. 2.

    Papildoma byla S2

  3. 3.

    Papildoma byla S3

  4. 4.

    Papildoma byla S4

  5. 5.

    Papildoma byla S5

  6. 6.

    Papildoma byla S6

  7. 7

    Papildoma byla S7

  8. 8.

    Papildoma byla S8

  9. 9.

    Papildoma byla S9

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento „ISME Journal“ svetainėje (//www.nature.com/ismej)