Eritromiciną gaminančios bakterijos saccharopolyspora erythraea visa genomo seka nrrl23338 | gamtos biotechnologijos

Eritromiciną gaminančios bakterijos saccharopolyspora erythraea visa genomo seka nrrl23338 | gamtos biotechnologijos

Anonim

Anotacija

Saccharopolyspora erythraea yra naudojamas pramoniniu būdu gaminti antibiotiką eritromiciną A, kurio dariniai atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį medicinoje. Nuoseklią šios dirvos bakterijos chromosomą sudaro 8 212 805 bazinės poros, kuri, kaip prognozuojama, koduos 7 724 genus. Jis yra apskritas, kaip ir patogeninių aktinomicetų Mycobacterium tuberculosis ir Corynebacterium diphtheriae , tačiau skirtingai nei aktinomicetų modelio Streptomyces coelicolor A3 (2) ir artimai susijusių Streptomyces avermitilis linijinės chromosomos. S. erythraea genome yra mažiausiai 25 genų sankaupos žinomiems ar numatomiems antriniams metabolitams gaminti, mažiausiai 72 genai, kaip numatoma, kad sukels atsparumą daugeliui įprastų antibiotikų klasių ir daugybę dubliuotų genų rinkinių, kad paremtų jo saprofitinį gyvenimo būdą. Galimybė gauti S. erythraea genomo seką pagerins jos biologijos supratimą ir palengvins racionalų štamų vystymąsi, kad būtų galima sukurti kliniškai svarbių antibiotikų gamintojus su dideliu titru.

Pagrindinis

S. erythraea („Waksman 1923“) „Labeda 1987“, šukos. nov. 1 yra gramneigiama gijinė bakterija, iš pradžių nustatyta kaip Streptomyces erythraeus, bet vėliau priskirta Saccharopolyspora genčiai. Nepaisant šio perklasifikavimo, biologijoje jis buvo laikomas labai artimu tikriems streptomicetams, tokiems kaip S. avermitilis ir pavyzdiniam organizmui S. coelicolor A3 (2), kurių visiški linijiniai genomai buvo paskelbti 2, 3 . S. erythraea gamina eritromiciną A, svarbų plataus veikimo spektro antibiotiką prieš patogenines gramteigiamas bakterijas 4 . Eritromicino komercinė svarba paskatino intensyvius jo biosintezės tyrimus, o susijusių būdų genetinė inžinerija žada padidinti potencialiai vertingų antrinių metabolitų poliketidų analogų gamybą 5 . Tai atgaivino pastangas padidinti deformacijų produktyvumą. Istoriškai laukinio tipo aktinomicetų kamienai buvo atsitiktinai mutagenizuojami ir atrenkami keliais etapais, siekiant gauti perteklinius mutantus norimo antrinio metabolito gamybai pramonėje. Tačiau dėl genomo masto gali būti įmanoma greičiau optimizuoti tokių aktinomicetų padermes. Pateikiame visą S. erythraea genomo seką ir palyginame ją su kitomis aktinobakterijomis, kurių genomai buvo sekvenuoti. Panaudotas štamas NRRL23338 yra originali S. erythraca NRRL2338 padermės 6 forma, kuri dabar yra vadinama NRRL23338 balta.

Rezultatai

S. erythraea genomo sekos nustatymas ir genų anotacija

Pagrindiniai chromosomų sekos bruožai parodyti 1 lentelėje ir 1 paveiksle. Esant 8 212 805 bp, jis pagal dydį yra palyginamas su S. coelicolor M145 (8, 7 Mbp) ir S. avermitilis MA-4680 (9, 0 Mbp) linijiniais genomais. Tačiau akivaizdu, kad S. erythraea genomas yra žiedinis, o ne linijinis - topologija, kuria ji dalijasi su kitomis aktinobakterijomis, tokiomis kaip M. tuberculosis 7, C. diphtheriae 8, Nocardia farcinica 9 ir Frankia spp 10 . S. erythraea chromosomoje yra 7198 numatomos baltymus koduojančios sekos (CDS), kurių bendros savybės yra pateiktos 1 lentelėje. 4 777 (66, 4%) jų numanomą funkciją galima priskirti užkoduotiems baltymams (1 papildoma lentelė internete). . Iš likusiųjų, 829 (11, 5%) parodė panašumą į hipotetinius kitų genomų baltymus, o 1 592 (22, 1%) neturėjo esminio panašumo į numatomus baltymus viešosiose duomenų bazėse. CDS 11 numeracijos pradiniu tašku pasirinktas dnaA geno iniciacijos kodonas, esantis greta replikacijos pradžios oriC . Vidutinis S. erythraea chromosomos GC kiekis yra 71, 1%, o GC poslinkis yra pastebimai mažesnis šalia oriC . Yra aiški kodavimo paklaida pirmaujančiosios grandinės naudai (59, 1%), o ryškus GC poslinkio inversija gali būti matoma oriC, o taip pat priešingoje chromosomos pusėje oriC , kur, tikėtina, replikacija baigiasi (1 pav.). Chromosomos regione (iš viso 4, 4 Mbp), besitęsiančiame iš abiejų oriC pusių (1 pav.), Atrodo, yra didžioji dalis (85%) genų, kurie, kaip manoma, yra būtini. Šio regiono galus žymi plačios, žymiai mažesnio GC kiekio regionai (1 pav.). Šiame branduolio regione (svarbus ir S. avermitilis 2, ir S. coelicolor 3 linijinių genomų bruožas) genų eiliškumas rodo reikšmingą liekanų išsaugojimą, kai palyginimui naudojamos kitos aktinobakterijos, nors aplink oriC įvyko daugybė inversijų (pav. .2). Regionuose, esančiuose už šerdies, kur chromosoma akivaizdžiai išsiplėtė, S. erythraea turi daug daugiau ortologų su N. farcinica ar S. coelicolor, nei su M. tuberculosis , kaip tikėtasi, tačiau ortologų (abipusiai geriausiai paveiktos poros) poromis pagal BLASTP paieškas E <10e –10 ) kiekvienu atveju yra atsitiktinai išsibarstę chromosomoje (2 pav.). Palyginti su linijiniais streptomicitų genomais, šiame „neekonominiame“ S. erythraea genomo regione yra labai daug įterpimo sekų (93 iš 13 atskirų šeimų, 2, 3% genomo), kurios beveik visos yra susijusios su transpozazėmis. Šių pasikartojančių elementų rekombinacija galėjo paskatinti stebimą ortologinių genų vietų atsitiktinumą, palyginti su streptomiceto genomais. Pusė intarpų sekos elementų yra dviejuose pagrindiniuose klasteriuose, kurių greitis yra atitinkamai 2, 5–3, 1 Mbp ir 5, 4–5, 75 Mbp (1 pav.). Šie regionai taip pat turi žymiai mažesnį GC kiekį (1 pav.), O tai rodo ankstesnį horizontalų genų perdavimą. Trečiajame mažesnio GC kiekio regione (6, 06–6, 24 Mbp) yra keletas nežinomų funkcijų CDS (SACE_5463, SACE_5483 ir SACE_5523), kurie taip pat gali būti įgyti perduodant horizontalų geną. Norint gauti tikslią genų, potencialiai įgytų perduodant horizontalų geną, identifikavimą ir, jei įmanoma, nustatyti galimą tokių genų kilmę 12, reikės atlikti papildomą darbą 12 . Yra keturi rRNR genų rinkiniai, kurių kiekviename neįprastai yra dubliuotas 5S rRNR genas. S. erythraea nuo sekamų streptomicetų padermių taip pat skiriasi tuo, kad turi sel operoną ( selA-D ) selenocisteinil-tRNR gamybai, įskaitant pačią selenocisteinil-tRNR, atpažįstančią specifinius UGA sustojimo kodonus ( selC , SACE_3551). Anksčiau aprašytos ir iš dalies sekvuotos plazmidės pSE101 (nuoroda 13) ir pSE211 (nuoroda 14) yra atitinkamai integruotos 10, 9 kbp ir 17, 3 kbp dalys.

Pilno dydžio lentelė

Image

Išorinė skalė yra sunumeruota megabazėmis nuo replikacijos pradžios ( ori ) ir žymi šerdies (mėlyną) ir nepagrįstą (geltoną) chromosomų sritis. 1 ir 2 apskritimai (iš išorės į vidų), visi genai (atitinkamai atvirkštinė ir priekinė kryptys) pagal spalvą koduojami spalva (juoda, energijos apykaita; raudona, informacijos perdavimas ir antrinis metabolizmas; tamsiai žalia, susijusi su paviršiumi; žalsvai mėlyna, degraduoja didelės molekulės; rausvai raudona, mažų molekulių skilimas; geltona, centrinė arba tarpinė medžiagų apykaita; šviesiai mėlyna, reguliatoriai; oranžinė, konservuota hipotetinė; ruda, pseudogenai; šviesiai žalia, nežinoma; pilka, įvairi); 3 ratas, atrinkti esminiai genai (ląstelių dalijimui, DNR replikacijai, transkripcijai, transliacijai ir aminorūgščių biosintezei, spalvų kodavimas, kaip ir 1 ir 2 apskritimams); 4 ratas, pasirinkti antriniai metaboliniai genai (trys didžiausi PKS klasteriai, pažymėti ERY, PKE ir PKS3); 5 apskritimas, mobilūs genetiniai elementai (mėlyna, transpozazės; raudona, profažai / integruotos plazmidės); 6 apskritimas, GC turinys; apskritimas 7, GC poslinkis ((G - C / G + C), chaki rodo reikšmes> 1, purpurinės vertės <1).

Visas dydis

Image

a ) M. tuberculosis . b ) N. farcinica . c ) S. coelicolor . Kiekvieno genomo DnaA yra 0 padėtyje. Taškai parodo abipusį geriausią atitikimą (pagal BLAST palyginimą 49 ) tarp ortologų (atitikmenys tos pačios stygos raudonai ir priešingos stygos mėlynai).

Visas dydis

Chromosomos topologija

Anksčiau buvo pranešta, kad S. erythraea NRRL2338 genomas yra linijinis, kaip nustatyta pagal restrikcijos žemėlapius 15, tačiau šie duomenys taip pat atitinka žiedinį genomą, jei atsižvelgiama į labai mažus (ir lengvai nepastebimus) numatomus fragmentus iš tariamų galų. (Papildomas 1 pav. Internete). Iš mūsų sekų analizės nebuvo rasta įrodymų, kad yra galinių apverstų pakartotinių sekų, genų, koduojančių su terminais susijusių baltymų ar kokių nors kitų anksčiau aprašytų linijinių streptomicetų genomų 16, 17, 18 bruožų. Skirtingai nuo S. coelicolor ir S. avermitilis , S. erythraea taip pat turi genus, primenančius tiek xerC (SACE_2322, SACE_6041), tiek xerD (SACE_2295, SACE_3643, SACE_5095, SACE_5242), kurie kartu sudaro vietai būdingą rekombinacijos sistemą, skirtą dimerų cirkuliacijai išspręsti. Vengėme ekstensyvaus S. erythraea NRRL23338 padermės iš NRRL kultūros kolekcijos tvarkymo ar praėjimo. Tai yra anksčiau aprašyta „balta“ mažiau pigmentuota forma 6, kurioje eritromicino buvo žymiai daugiau nei „raudonos“ formos, nurodytos kaip NRRL2338 raudona. Taigi panašu, kad genomo apskritumas yra šio tipo kamieno bruožas. Neseniai atlikome plataus masto DNR sekos nustatymą iš kito NRRL2338 izoliato ir vėl neradome tiesiškumo įrodymų (duomenys nepateikti). Lieka tikėtina, kad kitos S. erythraea giminės gali būti linijinės, ir kad mūsų suvestinis žiedinis genomas atsirado neseniai. Alternatyva yra tai, kad topologijos skirtumas yra senas ir atspindi taksonominį S. erythraea atskyrimą nuo streptomicetų. Buvo manoma, kad neįprasti linijiniai streptomicitų genomai galėjo atsirasti integruojant linijinę plazmidę į 19, 20 apvalią chromosomą.

Genų palyginimas su S. coelicolor ir S. avermitilis

Pagrindinė vietinio suderinimo paieškos įrankio baltymų grupavimo programa (BLASTCLUST; mažiausias 70% aprėptis, mažiausiai 30% tapatumas) buvo naudojama norint parodyti, kad 3589 (50%) numatomų CDS klasterių susideda į daugiagenes šeimas, kurias greičiausiai sukėlė genas. dubliavimasis evoliucijos metu. Manoma, kad šių šeimų genų pasiskirstymas ir skaičius prisideda prie S. erythraea išgyvenimo labai konkurencingoje, labai kintančioje dirvožemio aplinkoje (1 papildoma lentelė). Yra daugybė genų, kurie gali būti naudojami reaguojant į įvairius gynybinius ar stresinius reiškinius. Įdomu tai, kad atsižvelgiant į įrodymus dėl galimo genų įgijimo perduodant horizontalų geną, S. erythraea turi 20 restrikcijos endonukleazių ir aštuonias konkrečiai vietai būdingas metiltransferazes. Nors jų atpažinimo sekų apibrėžti neįmanoma, buvo tikimasi, kad kartu šie restrikcijos fermentai sudarys didelę barjerą gaunamoms DNR. Taip pat yra susieti genai pglY (SACE_5129) ir pglZ (SACE_5128), kurie tarpininkauja imunitetui nuo bakteriofago φC31 infekcijos. Be rekombinacinių taisymo genų recA (SACE_1736) ir recB (SACE_0087, SACE_1056, SACE_2242, SACE_6256), taip pat yra recF (SACE_0005) ir GT neatitinkančių taisomųjų endonukleazių (SACE_1556), neturinčių atitikmens S. avermitilis ar S. coelicolor . Iš viso 30 genų turi produktus, kurie gali būti naudojami užtikrinant ar išsaugojant teisingą baltymų sulankstymą, įskaitant dvi kopijas iš trijų chaperone baltymų groEL (SACE_0527, SACE_0543), groes (SACE_0927, SACE_7319) ir dnaJ (SACE_1480, SACE_7208). Taip pat tikėtina, kad reaguojant į stresinę S. erythraea yra 22 genai, susiję su uspA ( Escherichia coli 'universaliu streso baltymu'), ir genai, koduojantys daugybę šaltojo šoko baltymų. Iš viso 1118 genai (15, 5%) yra susiję su reguliavimu. Kaip ir S. avermitilis ir S. coelicolor atveju , neįprastai didelis jų skaičius (38) koduoja alternatyvius RNR polimerazės sigma faktorius, leidžiančius užprogramuoti tam tikrų genų rinkinių transkripciją. Yra daugybė genų, koduojančių kitus transkripcijos veiksnius, įskaitant 101 į TetR panašius, 34 į GntR panašius ir 48 į LysR panašius reguliavimo baltymus (2 papildoma lentelė internete). Reagavimą į besikeičiančias aplinkos sąlygas ir maistinių medžiagų prieinamumą tarpininkauja mažiausiai 42 jutiklių kinazės ir 113 dviejų komponentų atsako reguliatoriai. Yra 40 genų, koduojančių serino / treonino baltymų kinazes, ir daugybė įvairių eukariotų tipo baltymų fosfatazių. Iš viso 658 genai (8, 9%) yra susiję su transportavimu į ląstelę arba iš jos, koduojantys daugybę baltymų, veikiančių kaip permeazės, jonus ar cukrų surišantys pernešėjai arba ATP varomi transmembraniniai siurbliai. Prognozuojama, kad iš ląstelės bus išskiriami įvairūs skaidomieji fermentai, įskaitant septynias chinatazes ir daugybines proteinazes bei gliukanazes, ir, matyt, šie vaidina pagrindinį vaidmenį skaidydami heterogeninius alternatyvius maisto šaltinius dirvožemyje. Yra kobalamino priklausomos metionino sintazės (SACE_3898) ir ribonukleotidų reduktazės (SACE_1764) versijos, taip pat nuo kobalamino nepriklausomi fermentai, katalizuojantys tas pačias reakcijas (atitinkamai SACE_4744 ir SACE_1282, SACE_1283). Nors S. erythraea yra laikoma įpareigojančiąja aerobe, mes nustatėme du užbaigtus nitratų reduktazės genų grupes, tai rodo, kad esant žemiems deguonies lygiams gali būti alternatyvių elektronų receptorių. Detoksikacija yra pagrindinė dirvožemio bakterijų funkcija, o S. erythraea, kaip ir anksčiau nustatyti sekvestituoti streptomicetai, turi daugybę pernešėjų genų, tarpininkaujančių atsparumui įvairiems sunkiesiems metalams, taip pat nemažą citochromo P450 fermentų kohortą (36). Kai kurie iš jų turi žinomą vaidmenį atliekant specifinius hidroksilinimo etapus vykstant eritromicino ir kitų antrinių metabolitų 21, 22, 23 sintezei, tačiau manoma, kad kiti gali atlikti selektyvų organinių medžiagų oksidaciją ir detoksikaciją.

Genai atsparumui antibiotikams

S. erythraea genomas padeda paaiškinti bakterijos vidinį atsparumą įvairiausiems antibiotikams, nes jis koduoja daugybę fermentų, kurie, kaip numatoma, inaktyvuos įprastas antibiotikų klases. Yra 17 β-laktamazių genų ir dvi makrolidų esterazės. Viena iš šių esterazių (SACE_0712) patenka į anksčiau surinktą eritromicino biosintetinio geno klasterį ir yra inaktyvuota įterpiant transposoną, tačiau antroji (SACE_1765) gerai suderinama su autentiškomis eritromicinui atsparių bakterijų eritromicino esterazėmis. Tai gali būti iki šiol nepastebėtas vaidmuo reguliuojant eritromicino biosintezę. Genuose yra chloramfenikolio (SACE_0228), daunorubicino (SACE_0206, SACE_0207), linkomicino, kamparo (SACE_7237, SACE_7239), fosmidmicino (SACE_3971), biciklomicino (SACE_60_777, SACE_607, SACE_42_777_space_c2_2777; SACE_42_777_space_c42_2777; SACE_42_7772;, vankomicino ir susijusių glikopeptidų (SACE_7320, SACE_2593, SACE_2926), taip pat streptomicino fosfotransferazės genų (SACE_5997), spektinomicino fosfotransferazės (SACE_4273), aminoglikozido N-3′-acetilo-60-amino-60-aminosteroatransferazės (SACE_60). dvi tariamos makrolidų glikoziltransferazės (SACE_1884, SACE_3599). Atrodo, kad mažiausiai 21 CDS koduoja dioksigenazes, susijusias su atsparumu bleomicino baltymui, ir, be žinomo ermE rRNR metiltransferazės geno (SACE_0733), yra dar 11 ribosomas modifikuojančių rRNR metiltransferazių. Sergant S. avermitilis , antroji triptofanil-tRNR sintetazės 2 versija gali būti atspari antibiotikui indolmycinui, kuris nukreiptas į įprastą šio fermento versiją. Norint nustatyti, ar S. erythraea dubliuotų aminoacil-tRNR sintetazės genų atvejai (trys - cisteinui, du - lizinui, treoninui ir triptofanui) - turi tokią reikšmę.

Antrinių metabolitų gamybos potencialas

S. erythraea yra geriausiai žinomas kaip organizmas, naudojamas pramoniniu mastu gaminti makrolidų poliketidą eritromiciną A. Genų grupės klasifikuoja eritromiciną ( ery ) 121 ir antrąją nežinomos funkcijos modulinę poliketidų sintezę (PKS) ( pke ) 22, anksčiau buvo analizuojami, kaip ir III tipo PKS genas (SACE_1243, rppA ), kuris generuoja rausvą pigmentą, būdingą S. erythraea 23 . Genominė seka atskleidė dar 22 klasterius poliketidų, terpenų ir neribosomiškai sintezuotų peptidų biosintezei. Šių klasterių pasiskirstymas chromosomoje nėra vienodas: tik keturi (įskaitant eritromiciną) yra „branduolio“ srityje, kurioje yra dauguma svarbiausių genų (1 pav.), O vienas iš šių keturių grupių ( nrps1 ) yra inaktyvuotos dėl „framehift“ mutacijų. Dvidešimt viena iš klasterių yra už šio regiono ribų. Atrodo, kad vienas iš netipinių PKS genų grupių (3 pav. Ir 3 papildoma lentelė internete) rodo, kad vienas iš nesočiųjų riebalų rūgščių, tokių kaip eikozapentaeno rūgštis, biosintezės yra pfa ( pfa ). Dauguma kitų yra moduliniai ir tikimasi, kad jie generuos specifinius poliketidus, kurių ilgis yra nuo 2 iki 9 poliketidinių vienetų (išsamią informaciją apie numatomus domenus rasite internete pateiktoje 4 papildomoje lentelėje). Du (SACE_5308, pks7 ; ir SACE_5532, pks8 ) užkoduos daugiafunkcius vieno modulio PKS fermentus, matyt susijusius su iteracinėmis poliketidų sintezėmis, dalyvaujančiomis enedinų arba metilsalicilo rūgšties sintezėje. Anksčiau nebuvo aptikta nė vieno iš šių PKS ar pke PKS hipotetinių produktų, nors buvo atlikta plati paieška naudojant 50 skirtingų kietų ir skystų terpių 22 . Stebėtina, kad nėra II tipo PKS genų, koduojančių aromatinių poliketidų biosintezę. Tai yra būdingas natūralių produktų biosintezės komponentas tipiniuose streptomicituose, tokiuose kaip S. coelicolor ir S. avermitilis , kur jie įprastai valdo antibiotikų ir sporų pigmentų sintezę. . Todėl stebėtina, kad jų nėra S. erythraea . S. erythraea genome taip pat yra nemažai genų grupių, koduojančių neribosominius peptidų sintetazes (NRPS) (4 pav. Ir 3 papildoma lentelė). Šios modulinės daugelio fermentų sistemos yra plačiai paplitusios tiek bakterijose, tiek grybuose, o jų produktai apima (dažnai ciklinius) peptidinius antibiotikus, imunosupresantus, tokius kaip ciklosporinas, penicilinai ir geležį šalinantys junginiai (siderophores). Nors geležis yra gausus dirvožemio elementas, dėl žemo biologinio jos prieinamumo atrodo, kad ypač didelis dirvožemio bakterijų genų kiekis koduoja baltymus, susijusius su geležies įsisavinimu ir pasisavinimu. Daugelis streptomicetų sintezuoja nepeptidinius hidroksamato sideroforus, tokius kaip desferrioksaminas E, sintetinamas iš lizino ir ornitino, tačiau šiam 24 keliui reikalingų genų nėra S. erythraea . Palyginus NRPS sekas su autentiškų NRPS sekomis, galima nustatyti tikėtiną kiekvieno multienzimio fermento komplementą ir padaryti preliminarias dedukcijas į tikėtiną peptido produkto struktūrą (5 papildoma lentelė internete). Mūsų prognozės grindžiamos struktūros „specifiškumo kodu“ 25, kuris kartu su vėlesniais patikslinimais 26, 27 pateikia naudingus užuominas apie kiekvienoje stadijoje įvestos aminorūgšties pobūdį. Tai tikrai bus naudinga atliekant natūralių S. erythraea nrps genų produktų genomo kasymą , tačiau svarbu pabrėžti, kad dabar yra daugybė pavyzdžių, kai išskirti junginiai skiriasi nuo tų, kurie numatyti tokiais metodais (žr. pavyzdys, neseniai atlikta esminė šoninio barofelio struktūros pataisa iš S. coelicolor 28 ). Iš S. erythraea NRPS turinčių genų grupių, nrps3 (SACE_2691-2703) ir nrps5 (SACE_3028-3039) gali valdyti sideroforų gamybą, nes abiejuose yra keli genai, kurių numatomi baltymų produktai yra panašūs į baltymus, būtinus geležies sideroforų atpažinimui ir pernešimui. . S. erythraea gamina bent vieną hidroksamato sideroforą 29 . Įdomu tai, kad S. erythraea turi visą genų, primenančių mikobakterijos Stigmatella aurantiaca 30, mxc genus, reikalingus 2, 3-dihidroksibenzoo acil-O-AMP, kuris yra pagrindinis katecholio tipo sideroforų mikochelino pirmtakas, sintezei iš choristinės rūgšties, sąrašą. SACE_3854, mxcD; SACE_3852, MxcF; SACE_3855, mxcC; SACE_3853, mxcE). S. erythraea C-5 pirmtakus, susijusius su terpenoidų biosinteze, matyt, sukuria metileritritolio fosfato kelias, kuriame yra visi genai. Terpenoidiniai metabolitai vaidina įvairius vaidmenis bakterijose, pavyzdžiui, teikdami elektronų pernešimo grandinės chinono komponentus, modifikuotas tRNR rūšis ir karotinoidinius pigmentus, apsaugančius nuo UV spindulių. Iš šešių esančių terpeno sintazės genų (3 papildoma lentelė internete) trys ( tpc1 , tpc3 ir tpc5 ) rodo esminį panašumą į terpenų ciklazes kituose organizmuose, kurie, kaip žinoma, gamina geosminą - seskviterpeną, kuris suteikia dirvožemiui būdingą kvapą. Taip pat apynių spiečius yra labai panašus į S. avermitilis (SAV1650-1654) ir S. coelicolor (SCO6760-6764) grupes, kurios, kaip manoma, nukreipia hopanoidų gamybą 31 . Šie junginiai siūlomi siekiant sumažinti oro grybienos išsausėjimo stresą. Išsisklaidę kitoje genomo dalyje, yra papildomų genų, galinčių dalyvauti antrinius metabolitus gaminančiuose keliuose. Pvz., Yra dalinis karotinoidų biosintetinių genų rinkinys (SACE_3271, SACE_3272, SACE_1713, SACE_3269, SACE_3539). Triptofano halogenazės (SACE_4919) ir antrosios halogenazės (SACE_4927) buvimas gali reikšti, kad šioje padermėje susidaro halogenų turintys metabolitai. CDS SACE_4230-4233 labai primena S. coelicolor ramCSAB genus, kurie yra naudojami į lantibiotikams panašų peptidą SapB, ​​veikiantį kaip morfogenas, padedant gaminti oro hipas 32 . Dar du galimus lantibiotinės sintetazės genus koduoja SACE_4389 ir SACE_4025.

Image

abc , ABC pervežėjas; acc , acil-CoA karboksilazė; acd , acil-CoA dehidrogenazė; acp , acilo nešiklio baltymai; acs , į acil-CoA sintetazę panašus genas; amo , amino oksidazė, amt , aminotransferazė; at , aciltransferazė; BCP , biotino karboksi nešiklio baltymas; cbs , karbamoiltiltransferazė; puodelis , į kupiną panašūs baltymai; dah , DAHP sintazė; dh , dehidratazė; eff , efflux genas; ermE , eritromicino atsparumo geno rRNR metiltransferazė; eritis , eritromicinas; gt , glikoziltransferazė; hmg, HMG-CoA sintazė; ks , ketosintetazė; ksIII , į FabH panašus baltymas; be O- metiltransferazės; oksi , oksidoreduktazės; p450 , citochromas P450; pfa , polinesočiųjų riebalų rūgščių sintazė; pke , oktaketido sintazė; sta , į StaD panašus baltymas te , tioesterazė.

Visas dydis

Image

abc , ABC pervežėjas; acs , į acil-CoA sintetazę panašus baltymas; bla , β-laktamazė; cys , į cisteino sintazę panašus baltymas; mcd , malonil-CoA dekarboksilazė; mtb, į mtbH panašus baltymas; oktato , ornitino karbamoiltransferazės; ocd , ornitino / lizino ciklodeaminazė; oksi , oksidoreduktazės, raudonos , reduktazės; gurkšninis , siderophore sąveikaujantis baltymas; sirP , į SirP panašūs baltymai; reg , reguliavimo baltymai; tioesterazė.

Visas dydis

Genai, prisidedantys prie eritromicino gamybos

Nors daugumoje poliketidinių antibiotikų genų grupių yra vienas ar keli reguliuojantys genai, jų nebuvimas erio biosintetinio geno klasteryje kliudė pastangoms sustiprinti eritromicino gamybą kitokiu būdu, išskyrus manipuliavimą terpe, atsitiktinį mutagenezę ir atranką. Genomo sekos prieinamumas leis visapusiškai apibrėžti mechanizmą, pagal kurį kontroliuojama eritromicino gamyba S. erythraea , suprantant tiek klasikinį tam tikrų anglies, azoto ir fosforo šaltinių slopinimą, tiek specifinius keliui būdingų reguliatorių vaidmenį. Tuo tarpu jau yra įrodymų, susijusių su neplintamu Aeromicrobium eritromitu , kad didėjant srautui tiekiant metabolizmą (papildomas 2 pav. Internete), stipriai veikia eritromicino išeigą 33 . Eritromicino gamybai reikalingas propionil-CoA, kad būtų pradinis vienetas, ir ( 2S ) -metilmalonil-CoA, kad būtų galima išplėsti vienetus antibiotiko poliketidinei grandinei. Ankstesni bandymai apibrėžti proksimalinius kelius, kuriais grindžiami šie statybiniai blokai, davė neįtikinamų rezultatų 34, o genomo sekos analizė dabar rodo tam tikras priežastis. Pavyzdžiui, nuo biotino priklausomas propionil-CoA karboksilinimas yra nusistovėjęs kelias į ( 2S ) -metilmalonil-CoA (3 pav.), O S. erythraea atrodo, kad yra bent penki genetiniai lokusai, pasižymintys nepaprastai įvairiais baltymais. architektūros, kurios gali koduoti fermentą, katalizuojantį šią reakciją (papildomas 3 pav. internete) 35, 36 . Reikės tolesnio darbo, siekiant atjungti šių genų rinkinių indėlį į eritromicino biosintezę. Antrasis siūlomas būdas ( 2S ) -metilmalonil-CoA vyksta pertvarkant sukcinil-CoA, katalizuojamą nuo adenozilkobalamino priklausomos metilmalonilo-CoA mutazės, tačiau taip gaunamas metilmalonilo-CoA ( 2R ) -izomeras, o ne (2S). ) -izomeras. Mūsų analizė atskleidė geną, koduojantį autentišką metilmalonilo-CoA epimerazę (SACE_6238), kuris pavers ( 2R ) - ir (2S) -izomerus 37 . Kiekviename iš S. avermitilis (SAV2857) ir S. coelicolor (SCO5398) yra šio geno atitikmuo. Yra vienas klasteris adenozilkobalamino priklausomų metilmalonil-CoA mutazių genų (SACE_5638-5640). S. erythraea , skirtingai nei daugelis streptomicetų, neturi krotonilo-CoA reduktazės ar nuo adenozilkobalamino priklausomos izobutirilo-CoA mutazės homologo, paaiškindamas jos nesugebėjimą pateikti butiratų vienetų poliketidų biosintezei 38, 39 ; jis taip pat neturi meaA homologo S. coelicolor , kuris buvo susijęs su metilmalonilo-CoA tiekimu iš acetoacetil-CoA 40 . Dabar prieinama visa genomo seka suteikia pagrindą sisteminiams metodams nustatyti ir manipuliuoti tokiais maitinimo takais, siekiant padidinti poliketidų gamybą. Tai taip pat yra atskaitos taškas integruotai S. erythraea metabolizmo genomo masto analizei, kaip neseniai buvo pateikta S. coelicolor 41 .

Diskusija

Kaip ir kitos tirtos dirvožemio bakterijos, S. erythraea turi nepaprastą potencialą gaminti įvairių rūšių antrinius metabolitus, kurių daugelis veikia antibiotikus. Nors jie nėra būtini augimui laboratorinėmis sąlygomis, akivaizdu, kad gebėjimas gaminti tokius junginius yra bruožas, suteikiantis nemažą pranašumą, kuris nusveria nemažas energetines šio arsenalo išlaikymo išlaidas. Pavyzdžiui, buvo pabrėžta, kad daugybė modulinių poliketidų sintazės genų rinkinių toje pačioje ląstelėje evoliucijos metu gali padidinti rekombinacijos tarp jų tikimybę ir sukelti naujus ir galbūt vaisingus biosintezės kelius 42 . Reikės tolesnio darbo, siekiant nustatyti daugelio neatskleistų kelių produktų chemines struktūras ir biologinį aktyvumą, tačiau mūsų rezultatai pabrėžia, kad net gerai ištirtose bakterijose yra nemažas neišnaudotas potencialas gaminti įvairius cheminius junginius. Atrodo, kad dauguma prognozuojamų produktų yra unikalūs šiai padermei. S. erythraea genomo seka pateikė įrodymų, kad genų organizacija ir funkcijos labai skiriasi nuo streptomicitų, patvirtindamos ankstesnes taksonomines ir biochemines įžvalgas. Dabar bus galima tiesiogiai analizuoti genetinius skirtumus tarp laukinio tipo padermės ir padermių, gautų iš jos, mutuojant ir atrenkant, kurie naudojami pramoniniame eritromicino A gamyboje esant aukštam titrui. Nors tokie palyginimai greičiausiai nebus iškart informatyvūs, dėl daugybės neutralių ar net žalingų mutacijų jie turėtų suteikti naują impulsą ieškoti tokių padermių antibiotikų perprodukcijos priežasčių.

Metodai

Sekavimas ir surinkimas.

S. erythraea NRRL2338 genomo viso genomo sekos nustatymas buvo atliktas naudojant dažnai pjaustančius restrikcijos fermentus, o 2–10 kbp fragmentai buvo klonuoti į plazmidinius vektorius. Kosmidai (32–46 kbp intarpai) taip pat buvo generuojami iš genominės DNR ir buvo sukonkretinti, kad būtų galima gauti papildomos skaitymo ir poros informacijos; užtikrinti didesnį atrinktų regionų aprėptį; ir užpildyti spragas. Likusios spragos ir neaiškumai buvo uždaryti naudojant PGR produktus iš specialiai sukurtų oligonukleotidų pradmenų. Sekų surinkimas buvo atliktas naudojant „Phrap assembler 43“, o redagavimas atliktas naudojant „consed“ versiją 14 (nuoroda 44). Pakartojimai buvo išspręsti atliekant mini surinkimą atskiroms genomo dalims, o gautas sutarimas buvo integruotas į pagrindinį genomo rinkinį. Duomenys iš esmės sutapo (su viena išimtimi - žr. Tekstą ir 1 pav.) Su paskelbtais Ase I ir Dra I apribojimų žemėlapiais 15 . Galutiniame rinkinyje buvo 72 537 sekos skaitymai, iš jų 51 626 - viso genomo kulka, 5069 - iš kosmidinio klono kulkosvaidžio ir 6 470 - iš kosmidinių galų, ir 8 808 - iš kosmido pradmenų vaikščiojimo, 262 - iš specifinių PGR produktų ir 302 - iš pastolių. pasikartojantys IS regionai. Kartu tai užtikrino 7, 1 karto aprėptį ir apskaičiuotą klaidų lygį <1 100 000 bazių sutarimo sekos.

Genomo analizė ir anotacija.

CDS buvo nuspėjami ir komentuojami naudojant programą fgenesB 45 (//www.softberry.com/), apmokyti ab initio ir rankiniu būdu kuruojami naudojant Artemis (8 versija) 46 ir vidinių PERL scenarijų rinkinį. CDS komentarai buvo pagrįsti įvykiais į KEGG ir Uniprot duomenų bazes ir surūšiuoti pagal COG 47 funkcinę duomenų bazę. tRNR genai buvo numatyti naudojant tRNAscan 48 . Duomenų paieškai buvo naudojama programa BLAST 49 (NCBI versija 2.2.15), o baltymų šeimų klasteriams generuoti buvo naudojama BLASTclust (NCBI BLAST paskirstymo dalis). „Interproscan 50“ buvo naudojamas patvirtinti domenų priskyrimus.

Prisijungimo kodai.

EMBL / „GenBank“: Genomo seka buvo saugoma duomenų bazėje, jos registracijos numeris AM420293.

Pastaba: papildomą informaciją galima rasti „Nature Biotechnology“ tinklalapyje .

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • AM420293

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomas 1 pav

    Sekamos žiedinės S. erythraea chromosomos restrikcijos žemėlapis ir jo palyginimas su eksperimentiniu būdu gautu žemėlapiu, paskelbtu Reeves ir kt . (1998).

  2. 2.

    2 papildoma lentelė

    Baltymų šeimos S. erythraea ir susijusiuose genuose.

  3. 3.

    3 papildoma lentelė

    Antrinių metabolitų genų grupių pasiskirstymas S. erythraea .

  4. 4.

    4 papildoma lentelė

    Pamatinė CDS funkcija S. erythraea modulinėse poliketidinėse sintezėse.

  5. 5.

    5 papildoma lentelė

    Adenilinimo domeno specifiškumą lemiantys likučiai, numanomas aminorūgščių specifiškumas ir S. erythraea neribosominių peptidų sintetazių (NRPS) domeno organizacija.

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas 2 pav

    Ryškūs metaboliniai keliai, užtikrinantys eritromicino pirmtakus.

  2. 2.

    Papildomas 3 pav

    S. erythraea acil-CoA karboksilazių baltymų struktūra.

  3. 3.

    1 papildoma lentelė

    S. erythraea NRRL2338 baltymų klasifikacija pagal jų KSG ortologus.