Sudėtinės glicidilo metakrilato dekstrano (dex-gma) / želatinos nanodalelės, skirtos lokaliam baltymų perdavimui | acta pharmaologica sinica

Sudėtinės glicidilo metakrilato dekstrano (dex-gma) / želatinos nanodalelės, skirtos lokaliam baltymų perdavimui | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Lokalizuotas augimo faktorių pristatymas turi didelę potencialą kaip būsima terapinė strategija audinių inžinerijos ir regeneracinės medicinos srityse. Šiame tyrime buvo sukurta ir įvertinta nanodalelių nešiklio paskirtis pateikti periodonto regeneracijos augimo faktorius.

Metodai:

Naujos sudėtinės nanodalelės, kurių pagrindinės dalys yra glicidilmetakrilato dariniu sudaryti dekstranai (Dex-GMA) ir želatina, buvo pagamintos lengvu metodu, nenaudojant jokių organinių tirpiklių. Gautų nanodalelių konfigūracija buvo įvertinta perdavimo elektronų mikroskopu, skenavimo elektronų mikroskopu ir atominės jėgos mikroskopu. Jų paviršiai buvo apibūdinami zeta potencialo matavimais, po kurių jų savybės, įskaitant patinimą, skilimą, vaisto išsiskyrimą ir citotoksiškumą, taip pat buvo ištirtos naudojant in vitro modelius.

Rezultatai:

Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP) dalelių dydis svyravo nuo 20 iki 100 nm ir parodė vientiso dispersinio dydžio pasiskirstymą (vidutinis skersmuo 53, 7 nm) ir stipriai neigiamą paviršiaus zetos potencialą (−20 mV). DG-NP buvo būdingos geromis terpių, įskaitant dekstranazę, patinimu ir skilimo savybėmis. In vitro vaisto atpalaidavimo tyrimai parodė, kad efektyvus kaulų morfogenezinio baltymo (BMP) išsiskyrimas iš DG-NP buvo išlaikytas daugiau nei 12 dienų skilimo sąlygomis, kai daugiau nei 90% įkrauto BMP išsiskyrė. Atliekant citotoksiškumo bandymus 24 valandas nebuvo nustatyta jokios reikšmingos ląstelių žalos, kurią sukėlė DG-NP.

Išvada:

Šie bendrieji rezultatai rodo, kad GD NP vykdo pagrindines augimo faktoriaus pateikimo sąlygas. Atlikdami tolesnius in vivo tyrimus, šios nanodalelės gali pasiūlyti perspektyvią priemonę aktyviams vaistams perduoti į periodontitą.

Įvadas

Regeneracinės medicinos tikslas yra paskatinti pažeistų audinių atstatymą atsižvelgiant į natūralų pacientų gydomąjį potencialą. Sėkmingam audinių regeneravimui būtina aprūpinti vietines ląsteles natūralia ląstelių mikroaplinka, pateikiant dirbtinę tarpląstelinę matricą (ECM) ir pateikiant augimo faktorius; tokioje aplinkoje ląstelės gali efektyviai daugintis ir diferencijuoti 1 . Yra žinoma, kad lokalus bioaktyvių molekulių tiekimas yra šios mikroaplinkos pagrindas, o norima atpalaidavimo technologija dažnai padidina augimo faktorių stabilumą in vivo ir prailgina audinių regeneracijos biologinių funkcijų palaikymą. Nepaisant to, dar reikia nustatyti optimalius pristatymo būdus 2, 3 .

Tarp galimų strategijų, kaip pasiekti pakankamą biologinį aktyvumą ir augimo faktorių biologinį prieinamumą audinių inžinerijai ir regeneracijai, nanodalelių nešikliai, sintetinami iš biologiškai skaidžių polimerų, yra įdomus metodas, kaip padidinti vietoje vartojamų terapinių molekulių įsisavinimą ir pernešimą 4, 5 . Nors biologiškai skaidžios poli ( D , L -laktido ko-glikolido) (PLGA) ir PLGA pagrindu pagamintų polimerų nanodalelės / mikrodalelės buvo plačiai ištirtos kaip nešikliai kontroliuojamoms makromolekulinių terapinių vaistų ( pvz. , Baltymų, peptidų, vakcinų, genų, antigenai ir augimo faktoriai) 4, mes norime sukurti augimo faktorių nešiotojus iš natūraliai gaunamų biomedžiagų, tokių kaip polisacharidai ir želatina. Šios medžiagos įrodė biologinį suderinamumą (pripažintą JAV maisto ir vaistų administracijos) ir parodė daugybę fizikinių ir cheminių savybių, dėl kurių jos gali būti pritaikytos įvairiems klinikiniams tikslams 6, 7, 8, 9, 10 vaistų tiekimo sistemose. Vaistų tiekimo sistemų, kurias galima greitai perkelti į klinikinę aplinką, kūrimas, siekiant padėti pacientams, turi didelį ekonominį ir gydomąjį potencialą, o natūralios medžiagos, gautos iš medžiagų, galėtų būti laikomos pagrindinėmis kandidatėmis į tokias procedūras.

Mes pranešėme apie keletą mikrosferos sistemų, pagamintų iš glicidilo metakrilato dekstrano (Dex-GMA) ir (arba) želatinos, kontroliuojamam baltymų išsiskyrimui, ir parodėme jų pranašumus in vitro ir in vivo 6, 7, 8, 9, 10 . Remdamiesi patirtimi gaminant mikrosferos tiekimo sistemas, šiame tyrime nanodalelių nešikliams sintetinti naudojome tas pačias neapdorotas biomedžiagas (Dex-GMA ir želatiną). Kaip aptarėme neseniai paskelbtoje apžvalgoje, sukryžminus Dex-GMA ir želatiną gali susidaryti sistema, kuri yra fermentiniu būdu, bet nėra hidroliziškai skaidoma 3 . Taigi tai sudarytų vaistų tiekimo sistemas, kurios pasirinktinai galėtų pateikti savo turinį tik tose vietose, kur yra tinkamas biologinis fermentas. Be to, nanodalelių dalelės gali būti injekuojamos ir gali pagerinti terapinių agentų pasiskirstymą, kai jie naudojami esant anomalistiniams periodonto defektams, taigi tai yra perspektyvesnis įrankis nei mikrodalelių sistemos, apie kurias anksčiau pranešėme 6, 7, 8, 9 . Atlikus tolesnius in vivo tyrimus, šiuo metu aptariamos nanodalelės gali tapti potencialia priemone, leidžiančia pristatyti aktyvius vaistus į periodontitą.

medžiagos ir metodai

Medžiagos

„Dextran T-70“ („Dex“, M W 69800 su 5% atšakų) buvo įsigytas iš „Xia-si Biochemical Co“ (Pekinas, Kinija); A 250 tipo žydėjimo želatiną (pH i = 8, 5, 1% vandenyje) tiekė „Nitta“ želatina (Osaka, Japonija). Karinės medicinos mokslo akademijoje (Pekinas, Kinija) buvo gautas BMP-2 (cheminis ekstrahavimas iš žievės kaulo) su 5, 0 izoelektriniu tašku (IEP) vandeninio tirpalo pavidalu (5%, m / m ). Cheminis dekstrano modifikavimas glicidilo metakrilatu (GMA) buvo atliktas naudojant mūsų anksčiau aprašytą metodą, ir buvo paruošti trys Dex-GMA tipai, kurie skiriasi pakaitų laipsniu (DS; 4.7; 6.3 ir 7.8) 9 . Akrilo rūgštis (AA) (Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd, Šanchajus, Kinija) buvo išdžiovinta MgS04, po to prieš naudojimą distiliuojama. N, N ′ -Metileno bisakrilamidas (MBA) (Fluka) buvo perkristalintas iš metanolio. Cerio (IV) amonio salietros (CAN) buvo perkristalintos iš praskiestos azoto rūgšties, kurioje yra amonio salietros, visos buvo gautos iš Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd (Šanchajus, Kinija). Visos kitos cheminės medžiagos buvo analitinio lygio ir buvo naudojamos kaip gautos.

Kaulų morfogenezinio baltymo (BMP) purškiamasis užšaldymas džiovinant

Vandeninis BMP-2 tirpalas buvo atomizuotas naudojant dviejų skysčių antgalį nerūdijančio plieno kameroje; perdirbimo sąlygos buvo pasirinktos taip, kad būtų sumažintas dalelių dydis po pirmojo suspensijos inkapsuliacijos proceso etapo. Srutos buvo surinktos į nerūdijančio plieno skardines ir supilstomos į stiklinius indus, kurie, prieš tai atšaldžius lentynas, buvo liofilizuoti iki –40 ° C. Džiovinti BMP milteliai buvo laikomi –20 ° C temperatūroje.

Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP) paruošimas

Paruošimo schema buvo atlikta pagal deksrano pagrindu pagamintų stabilių nanodalelių sintezę viename etape, padedant savaiminiam surinkimui, pranešė Tang ir kiti (2006) su nedideliais pakeitimais 11 . Trumpai tariant, 2 mg Dex-GMA (DS = 7, 8) ir 8 mg želatinos buvo ištirpinti 50 ml dejonizuoto vandens 25 ° C temperatūroje, maišant ir maišant azotą. Tada iš eilės buvo pridedamas 1, 0 ml CAN (0, 5 mg / ml) tirpalas 1, 25 ml 0, 1 mol / L azoto rūgšties ir 1, 0 mg AA. Po dvidešimt minučių cemento (IV) buvo naudojamas kaip transplantato kopolimerizacijos iniciatorius, pridedamas MBA ir reakcija palaikoma 30 ° C 4 valandas. Po to pridedama 1 mol / l NaOH, kad būtų neutralizuota reakcijos sistema. Galiausiai gauta suspensija 3 dienas filtruojama prieš dejonizuotą vandenį, naudojant membraninį maišelį su 14 000 išpjaustyta molekuline mase, kad būtų pašalinti nesureagavę monomerai ir neskiepytas poli (akrilo rūgštis) (PAA) maišomas purtyklėje. stalas (70 r / min) esant 4 ° C. Po to supernatantas buvo išmestas, o nuosėdos buvo resuspenduotos 10 ml PBS (pH 7, 4). Galutiniai vandeniniai tirpalai buvo liofilizuojami, kad būtų gautos kietos Dex-GMA / želatinos nanodalelės (DG-NP).

BMP imobilizavimas DG-NP

BMP buvo imobilizuotas ant DG-NP, pamerkiant nanodaleles vandeniniuose BMP tirpaluose, naudojant anksčiau aprašytus 9 metodus, kuriuose tarp BMP (kurio IEP yra 5, 0) ir rūgštinės želatinos (kai IEP yra 8, 5) susidarė poliioninis kompleksas 12. . Trumpai tariant, DG-NP (5 mg) buvo sumaišyti su 1 ml purškiamai užšaldytu džiovintu BMP (pradinė koncentracija 0, 1, 0, 5, 1, 0, 1, 5 arba 2, 0 mg / ml) fosfato buferiniame druskos tirpale (PBS), pH 7, 4, ir mišinys inkubuotas 4 ° C temperatūroje 1 valandą, atsargiai maišant. Po adsorbcinio įkrovimo, BMP imobilizuotos nanodalelės du kartus buvo plaunamos PBS ir pakartotinai suspenduojamos 10 mg / ml tirpale PBS. Tada pakrauto BMP kiekis buvo įvertintas Lowry metodu 13 . BMP imobilizuotos nanodalelės buvo pridėtos prie to paties tūrio 4% natrio dodecilsulfato (SDS), kad ištirptų nanodalelės, ir tada buvo nustatytas BMP įkrovos kiekis. BMP imobilizacijos efektyvumas (IE) nanodalelėms buvo apskaičiuotas taip:

Image

BMP kapsuluotų DG-NP paruošimas

Norint paruošti BMP kapsuluotus DG-NP, į reakcijos sistemą prieš pridedant MBP buvo pridedamas BMP, naudojant 2 ml purškiamu užšaldymu išdžiovinto BMP (pradinės koncentracijos 0, 1, 0, 5, 1, 0, 1, 5 arba 2, 0 mg / ml). kiekviena partija. BMP apkrovos kiekis taip pat buvo išmatuotas minėtu Lowry metodu, kuriame apskaičiuotas kapsuliuotas BMP efektyvumas nanodalelėse:

Image

Perdavimo elektronų mikroskopija, skenavimo elektronų mikroskopija ir atominės jėgos mikroskopo matavimai

Neapkrautos nanodalelės buvo stebimos naudojant transmisijos elektronų mikroskopiją (TEM) po užšalimo lūžio. Nedidelis lašas vandeninių nanodalelių suspensijos buvo supiltas į 100 μm gylio simetrišką taurę. Tada mėginys buvo užšaldytas naudojant aukšto slėgio aušinimo įrenginį HPM 010 (Bal-Tec). Fraktacija, ofortas ir šešėliavimas naudojant aktyvatorių platinos anglį (Pt – C) buvo atlikti „Bal-Tec“ aparate (modelis BAF 400T). Po to paviršiaus kopijos buvo plūduruojamos, paprastai panardinant mėginį į iš eilės einančias vandens / acetono, vandens, NaOH (1 mol / L), vandens ir acetono vonias. Galiausiai, kopijos buvo surenkamos ant neuždengtų 400 tinklelių tinklelių, kurie vėliau buvo sumontuoti TEM („PHILIPS CM120 BioTwin“) patikrinti. TEM stebėjimai buvo atlikti LEO 912 Omega didelės raiškos mikroskopu, veikiančiu esant 120 kV. Tuo pačiu metu išdžiovinti mikrosferos buvo apibarstyti ant elektrinio klijų popieriaus gabalo, auksu apibarstyti vakuume ir ištirti skenuojančiu elektroniniu mikroskopu (SEM; S-2700, Hitachi, Tokijas, Japonija). Užšalimo būdu išdžiovintos dalelės buvo sumontuotos ant aliuminio pavyzdžio laikiklio ir apdengtos dulkėmis, padengtos aukso paladžiu, kad būtų kuo mažiau paviršiaus. DG-NP ir BMP imobilizuotų nanodalelių morfologija ir dydis taip pat buvo stebimi atominės jėgos mikroskopu (AFM; Aijian Nanometer Co, Šanchajus, Kinija), kuriame lašas nanodalelių suspensijos buvo dedamas ant vario tinklelio, padengto kolodijumi. ir buvo neigiamai nuspalvintas 1% amonio molibdato.

Dalelių dydžio analizė

Šviežiai paruošta DG-NPs suspensija buvo ištirta, ar nėra dalelių dydžio ir pasiskirstymo pagal šviesos sklaidos metodą (90Plus dalelių dydžio analizatorius; Brookhaven Corp, Holtsville, NY). Nanodalelių suspensija buvo praskiesta 10 - 20 kartų etanolio-vandens mišiniu (65:35 tūris / tūris), ir dalelių dydžio analizė atlikta naudojant 90 ° išsibarstymo kampą ir 25 ° C temperatūrą.

Nacionalinių generalinių direktoratų Zeta potencialas

Gautų nanodalelių zeta potencialas buvo išmatuotas Malvern Zetasizer 2000. Nanodalelės buvo ištirpintos buferiuose su skirtingomis pH reikšmėmis, kad matavimo metu pH būtų pastovus. Kiekvienas mėginys buvo matuojamas penkis kartus, o pateiktos vertės yra šių matavimų vidutinės vertės.

Nanodalelių skilimas

Trys partijos DG-NP buvo inkubuotos PBS (pH 7, 4) arba PBS, turinčiose apytiksliai 0, 1 U / ml dekstranazės (iš anksto subalansuotos iki 37 ° C), ir po to inkubuojamos nuolat maišant svyruojančioje vandens vonioje (GFL 1092; 100 r / l). min) 37 ° C temperatūroje 9 . D1, 2, 3, 5, 7, 10 ir 12 metu mėginiai ( n = 3 kiekvienai partijai) buvo paimti iš buferių matavimui. Kiekvienam bandiniui buvo užfiksuotas šlapiasis svoris ( Ww ) iškart pašalinus iš buferio ir sausas svoris ( Wd ) po 24 valandų džiovinimo vakuume. Atitinkamai, DG-NP NP raukšlių santykis kiekvienu laiko momentu buvo apskaičiuojamas pagal šią lygtį: patinimo santykis (Rs) = ( Ww - Wd ) / Wd . Ši vertė leidžia įvertinti vandens santykį (g) grame sausų DG-NP kiekvienoje partijoje atitinkamu laiko momentu. Be to, procentinis DG-NP masės nuostolių procentas kiekvienu laiko momentu buvo nustatytas pagal šią lygtį:% DG-NP masės nuostolių = ( Wx - Wd ) / Wx , kur Wx yra pradinis DG-NP svoris (prieš dedant į buferis).

In vitro BMP imobilizuotų nanodalelių tyrimas

Išleidimo eksperimentas buvo atliktas taikant metodą, aprašytą ankstesniame mūsų leidinyje 9, ir atliktas in vitro taip. BMP imobilizuotos nanodalelės (10 mg) buvo suspenduotos 1 ml PBS, nesant dekstrazės (0, 1 U / ml, „Sigma Chemicals“), ir įdėtos į mikrotubulą. BMP koncentracija buvo 1, 2 mg / ml nanodalelių suspensijos. Vamzdeliai buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje, maišant. Skirtingais laiko tarpais buvo paimta 100 μL mėginių ir 15 minučių centrifuguota 14 000 sūkių per minutę greičiu. Į supernatantą išleistas BMP kiekis buvo nustatytas Lowry metodu. Reikšmės buvo nurodytos kaip vidutinis ± standartinis nuokrypis.

Citotoksiškumo tyrimas su MTT

Žmogaus periodonto raiščių ląstelės (PDLC) buvo gautos iš premoliarų, ištrauktų dėl ortodontinių priežasčių iš trijų 14 metų pacientų, naudojant eksplanto kultūras, kaip aprašyta anksčiau. Šiame tyrime naudojami PDLC buvo tarp trečios ir penktos ištraukų. Tyrimų protokolą patvirtino Ketvirtojo karo medicinos universiteto etikos komitetas (Sianas, Kinija). Trumpai tariant, PDLC buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 2 x 102 ląstelių / ml, ir buvo kultivuojamos (37 ° C, 5% CO 2 ) terpėje, kurioje yra 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS). Ląstelės buvo inkubuojamos 4 valandas su skirtingomis nanodalelių koncentracijomis (0, 5–5 mg / ml), po to tris kartus plaunamos PBS ir toliau auginamos terpėje 24 valandas. Į auginimo terpę buvo įpilta MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromido) reagento (2, 5 μl) alikvotinės dalies (2, 5 mg / ml), o ląstelės inkubuotos 2 h. Tada supernatantas buvo pašalintas ir mėlynasis formazano produktas buvo išplautas po 12 h ląstelių lizės 200 ml SDS (25% 0, 1 mol / l NaOH). Sugertis buvo išmatuota mikrotekinių plokštelių skaitytuve, esant 540 nm bangos ilgiui. Mėlynojo dažiklio išnykimas koreliavo su ląstelės gyvybingumu. Neapdorotos ląstelės buvo naudojamos kaip atskaitos ir buvo manoma, kad jos atspindi 100% gyvybingumą, tuo tarpu paraformaldehido tirpalu (5%, 15 min.) Apdorotų ląstelių gyvybingumas buvo 0%. Ląstelės, apdorotos vien lizės reagentu, buvo naudojamos kaip kontrolė. Duomenys buvo išreikšti ląstelių gyvybingumu lyginant su etaloninėmis ląstelėmis.

Rezultatai

GD NP charakteristikos

Liofilizuotų DG-NP morfologija buvo apibūdinta naudojant TEM, SEM ir AFM. Kaip neigiamai nuspalvintas reagentas, siekiant palengvinti TEM stebėjimą, buvo panaudota fosfungunginė rūgštis, o DG-NPs neigiamai nuspalvintas TEM vaizdas parodytas 1 paveiksle. Nanodalelės buvo gerai proporcingos dydžio ir sferinės formos. Matuojant SEM metodais, DG-NP buvo atskirtos nuo suspensijos centrifuguojant ir liofilizuojamos. Tada dulkėmis padengtais mėginiais buvo tiriama paviršiaus morfologija esant SEM. Abu nanodalelių pavyzdžiai rodo sferinę morfologiją lygiu ir lygiu paviršiumi (2A pav.). 2B paveiksle pavaizduota liofilizuotų DG-NP, kurių trimatis sferinis vaizdas yra mažesnis kaip 100 nm, AFM nuotrauka. DG-NP taip pat buvo tiksliai apibūdinti dalelių dydžiu naudojant „Brookhaven 90-Plus“ dalelių dydžio analizatorių. Vidutinis dalelių dydis buvo 53, 7 nm; apytiksliai 60% nanodalelių buvo siauresnio dydžio, pasiskirstymo intervale nuo 40 iki 60 μm (3 paveikslas).

Image

Reprezentatyvus elektroninių mikroskopinių transmisijų, nepažeistų džiovintų Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP), vaizdas po neigiamo dažymo 2% ( m / t ) fosfotungstine rūgštimi (dalelių skersmuo mažesnis nei 100 nm).

Visas dydis

Image

Liofilizuotų Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP) morfologiniai stebėjimai (dalelių skersmuo mažesnis nei 100 nm). (A) Neapkrautų DG-NP reprezentacinis nuskaitymo elektronų mikroskopijos vaizdas. (B) Tipinis iškrautų DG-NP atominės jėgos mikroskopijos vaizdas.

Visas dydis

Image

Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP) dalelių dydis ir pasiskirstymas naudojant „Brookhaven-90Plus“ dalelių dydžio analizatorių (duomenys iš reprezentatyvios DG-NP partijos). Pastebėtas monospersinis dispersijos dydis, kurio skersmuo svyravo nuo 20 iki 100 nm, o daugiau nei 60% nanodalelių dydžiai buvo dar siauresni - nuo 40 iki 60 nm.

Visas dydis

Atlikdami bandomuosius eksperimentus, mes nustatėme, kad Dex-GMA pakaitalo laipsnis (DS) neturi reikšmingos įtakos gaunamų DG-NP bioetanolio potencialui. Iš Dex-GMA (DS = 7, 8) ir želatinos paruoštos nanodalelės turėjo stipriai neigiamą zeta potencialą (−20 mV), kurį galima priskirti prie bazinio įkrauto želatinos, esančios netoli 14 paviršiaus, elektrostatiniam atstūmimui.

BMP IE ir EE parodė reikšmingą skirtumą tarp skirtingų įkalinimo būdų (1 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad kapsuliavimas, priešingai nei paviršiaus imobilizacija, buvo pagrindinis baltymų įkėlimo į DG-NPs mechanizmas. Didžiausias BMP imobilizacijos ant nanodalelių paviršiaus kiekis buvo maždaug 100 μg BMP miligrame DG-NP. Tačiau kai buvo naudojamas kapsuliavimo metodas, šios vertės pasiekė maždaug 250 μg BMP vienam miligramui DG-NP (2 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Kadangi augimo faktorių biologinis aktyvumas turi būti išlaikytas juos perdirbant ir išleidžiant iš tiekimo sistemos, būtina, kad nešiklio perdirbimo medžiaga nepažeistų augimo faktorių. Tačiau augimo faktorių kapsulė į nešiklius dažnai praranda bioaktyvumą 3 . Todėl tinkamiausias būdas yra augimo faktoriaus įtraukimas į nešiklį po pagaminimo. Atsižvelgiant į galutinę reikiamą BMP koncentraciją periodonto regeneracijai, 100 μg BMP vienam miligramui DG-NP yra pakankamas mūsų galutiniam naudojimui. Todėl imobilizacijos metodas buvo taikomas atliekant šiuos eksperimentus atliekant BMP apkrovą.

Patinimas ir DG-NP masinis praradimas

4A ir 4B paveiksluose pavaizduoti DG-NP bandymo ir masės praradimo profiliai standartiniame PBS. Po pirmųjų 24 valandų pusiausvyros patinimo santykiai (R) buvo maždaug 18 kartų, o masės nuostolių vertės buvo nuo 10% iki 15%. Per kitas 11 dienų išsipūtimo santykis ir DG-NP masės išliko gana pastovios. Tačiau PBS, turinčiame dekstranazės, buvo nustatyti dideli patinimo santykiai ir masės nuostolių vertės (4C, 4D paveikslas). 2-osios fazės pabaigoje (d 2) DG-NP padidėjimo santykis buvo (29, 9 ± 7, 3) ir greitai pasiekė 42, 3 karto po 5 d inkubacijos. Pasibaigus 3 fazei (d 12), šios nanodalelės buvo visiškai suskaidytos.

Image

Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP) PBS (A ir B) arba PBS, kurių sudėtyje yra dekstranazės, koncentracija maždaug 0, 1 U / ml (pietų santykis, Rs) ir skilimo (masės nuostolio%) profiliai in vitro PBS (A ir B) arba PBS. C ir D). Duomenys yra gauti iš trijų tipinių partijų, o vertės yra išreikštos trijų partijų, atliktų per tris nepriklausomus eksperimentus, vidurkiu ± standartiniu nuokrypiu.

Visas dydis

BMP imobilizuotų DG-NP atleidimo elgesys

Norėdami ištirti baltymų išsiskyrimo elgesį, BMP imobilizuoti DG-NP (96, 42 μg BMP vienam miligramui DG-NP) buvo tiesiog suspenduoti PBS, esant arba be dekstranazės. BMP išsiskyrimas buvo nustatytas in vitro dinamikos metodu. BMP išsiskyrimas iš nanodalelių, kurių BMP buvo 100 μg miligrame DG-NP, buvo atliekamas 37 ° C temperatūroje PBS (pH 7, 4). BMP išsiskyrimas iš BMP imobilizuotų nanodalelių įvyko labai lėtai, sukaupus mažiau kaip 20% per 12 dienų (5 paveikslas). Be to, Dex-GMA DS neturėjo įtakos šiam atpalaidavimo elgesiui PBS, nesant dekstrazės (duomenys neparodyti), ir tas pats reiškinys buvo pastebėtas ankstesniuose mūsų insulino pakrautų dekstrano-ko-želatinos mikrosferų išleidimo tyrimuose 9 . Atitinkamai, kadangi dekstrano ko-želatinos biomedžiaga yra fermentiškai skaidoma 9, galutinio BMP išsiskyrimo iš DG-NPs tikimasi tik tada, kai terpėje yra hidrolizuojantis fermentas, pavyzdžiui, dekstranazė.

Image

In vitro BMP imobilizuotų Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NPs) BMP išsiskyrimo profiliai standartiniame fosfato buferiniame tirpale, esant dekstranazei (pH 7, 4) per 12 dienų, arba be jos. Atskiri taškai rodo vidutines vertes ± standartinį nuokrypį nuo keturių DG-NP mėginių.

Visas dydis

Kaip parodyta 5 paveiksle, DG-NPs, palyginti su standartine PBS, esant santykinai pastoviam BMP išsiskyrimo profiliui, esant dekstranazei. Buitinių išmetamųjų teršalų vertės DG-NP buvo 47, 9% ± 5, 7%; po to buvo stebimas lėtesnis palaikomas BMP išsiskyrimas (2 ir 3 fazės) per 12 dienų atpalaidavimo laikotarpį. Tiksliau, mes nustatėme, kad DG-NPs išsiskyrimas buvo sprogus, 2 fazės išsiskyrimo greitis buvo maždaug 5, 0% per dieną nuo d 1 iki d 3, o 3 fazės išsiskyrimo greitis buvo maždaug 0, 4% per dieną nuo d 4 iki d 12. Tiesą sakant, galutinė sukaupta generalinių direktoratų NP išleidimo vertė buvo didesnė kaip 90%. Ilgesniam išsiskyrimo laikui mes nustatėme, kad galutinis sukauptasis išleidimas yra maždaug 100% (po 20 dienų; duomenys nepateikti). Šie duomenys rodo, kad DG-NP gali būti visiškai suskaidomi per 20 dienų, esant dekstranazei. Tačiau BMP išsiskyrimo profiliai standartiniame PBS, nesant dekstrazės, parodė kinetiką tik su reikšmingu pliūpsniu ir labai lėtai atpalaiduojančiu po pradinio pliūpsnio atpalaidavimo (5 paveikslas); ši kinetika leidžia manyti, kad BMP išsiskyrimą iš DG-NP gali kontroliuoti biologinio skaidymo savybės.

Citotoksiškumo bandymas in vitro

Nanodalelių biologinis suderinamumas buvo įvertintas in vitro atliekant citotoksiškumo testą, naudojant PDLC. Po inkubacijos išlikusios ląstelės buvo įvertintos MTT tyrimu. Ištirtas PDLC proliferacija ir gyvybingumas, atsižvelgiant į tuščių ir BMP imobilizuotų nanodalelių 0, 5, 1 ir 5 mg / ml koncentraciją po 24 valandų inkubacijos. Ląstelių proliferacijai nepaveikė nė viena nanodalelė, o ląstelių gyvybingumas buvo palaikomas aukštesnis nei 85%. Tačiau reikšmingas nuo dozės priklausomas poveikis ląstelių gyvybingumui buvo pastebėtas naudojant BMP imobilizuotus nanodalelių preparatus ( P <0, 01) (6 paveikslas). Šis atradimas reiškia, kad šios nanodalelės gali būti naudingos kaip baltymų nešiotojos, neturinčios jokio reikšmingo citotoksinio poveikio, ir gali apsaugoti pakrautų baltymų biologinį aktyvumą.

Image

BMP imobilizuotų Dex-GMA / želatinos nanodalelių (DG-NP) (nepakrautų ir įkeltų į BMP) citotoksiškumas , nustatytas in vitro atliekant citotoksiškumo testą, naudojant periodonto raiščių ląsteles (PDLC). Ląstelių gyvybingumo rezultatai parodomi po PDLC inkubacijos, naudojant tris skirtingas koncentracijas nuo 0, 5 iki 5, 0 mg / ml 24 valandas. Duomenys pateikiami kaip vidutinės vertės ± standartinis nuokrypis ( n = 8). c P <0, 01, palyginti su nepakrautais nanodalelių preparatais.

Visas dydis

Diskusija

Pastaraisiais metais buvo dedama daug pastangų plėtojant vaistų pristatymo nanotechnologijas, nes jos siūlo tinkamas priemones mažo molekulinio svorio vaistams, taip pat makromolekulėms, tokioms kaip baltymai, peptidai ar genai, pristatyti lokaliai arba tikslingai tiekiant į dominančius audinius 4, 5., 15 . Apskritai, nanodalelės gali būti naudojamos lokaliam biomolekulių pristatymui į tikslinius audinius, tirpinant vaistus, skirstomus į kraujagysles, ir pagerinant terapinių agentų, ypač baltymų, peptidų ir nukleorūgščių vaistų, stabilumą prieš fermentinį skaidymą (nukleazės ir proteazės). ) 4 . Šių įvedimo sistemų nanometrų dydžių diapazonai suteikia tam tikrų aiškių vaistų teikimo pranašumų audinių inžinerijos ir regeneracinės medicinos srityse. Dėl savo ląstelių ir po mikrometrų dydžio, nanodalelės įsisavina santykinai daugiau ląstelių nei mikrodalelės ir paprastai efektyviai jas pasisavina ląstelės 15 . Tai leidžia efektyviai pristatyti terapinius agentus į kūno vietas 16 . Be to, moduliuodamas polimero charakteristikas, galite kontroliuoti terapinio agento išsiskyrimą iš nanodalelių, kad pasiektumėte norimą terapinį lygį tiksliniame audinyje tiek, kiek pakanka optimaliam terapiniam efektyvumui 4, 5 . Be to, nanodalelės gali būti pristatomos į tolimas taikinių vietas arba lokaliai, naudojant kateterį, naudojant minimaliai invazinę procedūrą, arba konjuguojant su biospecifiniu ligandu, galinčiu nukreipti jas į tikslinį audinį ar organą 4, 16 . Todėl nanodalelės gali būti plačiau naudojamos vaistų pristatymo, regeneracinės medicinos ir audinių inžinerijos srityse. Dėl šių priežasčių, nepaisant gerų rezultatų, kuriuos jau pasiekėme iš dekstranako-želatinos mikrosferų 6, 9, mes esame įdomūs kurdami naują BMP nano nešiklį.

Taikant lengvą savarankiško surinkimo metodą, šiame tyrime Dex-GMA / želatinos nanodalelės buvo sėkmingai susintetintos tiesiai iš monomerų, nenaudojant jokių organinių tirpiklių ar paviršiaus aktyviųjų medžiagų. Gautos nanodalelės turėjo stipriai neigiamą zetos potencialą (–20 mV), kurį galima priskirti prie bazės esančios bazinės želatinos, esančios netoli paviršiaus, elektrostatiniam atstūmimui. Nanodalelių struktūrą gali sudaryti dekstrano pagrindo šerdis su išoriniu želatinos apvalkalu. Zeta potencialo reikšmė yra svarbi dalelių savybė, nes ji gali turėti įtakos dalelių stabilumui. Elektrostatinis atstumas tarp dalelių, turinčių tą patį elektros krūvį, neleidžia kauptis šioms dalelėms 14 . Norėdami ištirti želatinos pasiskirstymą paviršiuje, nanodalelės buvo suspenduotos įvairaus pH lygio (pH 4–8) buferiuose ir tada buvo nustatytas zetos potencialas. Zeta potencialas nepasikeitė, kai pH vertės svyruoja nuo 5 iki 8. Tačiau jis padidėjo, kai pH sumažėjo nuo 4 iki 5, ir pasiekė −7 mV, kai pH buvo 4. Zeta potencialo pokytis gali atsirasti dėl jonizuojant želatiną, esančią netoli paviršiaus, tačiau tokiai šerdies ir apvalkalo konfigūracijai reikia įtikinamesnių įrodymų. Patinimo ir skilimo bandymų metu mes pastebėjome reiškinį, labai panašų į tą, kuris buvo aptiktas dekstrano-ko-želatinos mikrosferose, ištyrinėtose mūsų ankstesniuose tyrimuose 7, 9 . DG-NPs skaidomi PBS tik esant dekstranazei, ir buvo gautas geras suderinimas tarp eksperimentiškai išmatuotos ir teoriškai numanomos baltymų atpalaidavimo kinetikos.

Mūsų tyrime buvo sėkmingai pasiektas BMP įsitvirtinimas nanodalelėse. Palyginus su neapkrautomis nanodalelėmis, BMP pakrautos nanodalelės reikšmingai nepakito, atsižvelgiant į dalelių dydį, ir parodė monomiumo dydžio pasiskirstymą. Mūsų rezultatai parodė, kad BMP įsiskverbimo efektyvumas labai priklausė nuo konjugacijos metodo ( ty imobilizacijos ar kapsuliavimo). Galima daryti prielaidą, kad IE daugiausia buvo nustatoma pagal GD NP plotą. BMP paviršiaus imobilizacijos atveju teorinis BMP, imobilizuoto ant paviršiaus, kiekis gali padidėti, nes mažėja dalelių dydis. Tiesą sakant, IE, kurį stebėjome, buvo ne daugiau kaip 100 μg BMP vienam miligramui DG-NP. Kai mes panaudojome kapsuliuotą metodą, į nanodalelių kapsuliuoto BMP kiekis buvo maždaug 250 μg vienam miligramui DG-NP, maksimaliai (pradinė BMP koncentracija 2 mg / ml). BMP pakrovimo į nanodaleles talpa buvo žymiai didesnė už maksimalų ant paviršiaus imobilizuoto BMP kiekį ( P <0, 01). Todėl darome išvadą, kad nanodalelių vidinė erdvė turėjo didelę galimybę krauti baltymus. Šis rezultatas rodo, kad kapsulė, priešingai nei paviršiaus imobilizacija, atrodė kaip pagrindinis baltymų pakrovimo mechanizmas. Paviršiaus imobilizavimas turėtų būti pirmas pasirinkimas, kai atsižvelgiama į pakrautų baltymų biologinį aktyvumą, su sąlyga, kad 1) vaisto pakrovimas gali atitikti galutinių paraiškų reikalavimus ir 2) imobilizuotas mechanizmas gali užtikrinti ilgalaikį vaisto išsiskyrimą reikiamu laikotarpiu. .

BMP ir nanodalelių sąveika yra labai stabili, galbūt dėl ​​elektrostatinės sąveikos tarp rūgštaus BMP ir bazinės želatinos grupių 12 . Šiame tyrime naudojamos želatinos IEP buvo 8, 5, taigi ji buvo „pagrindinė“ želatina. Dėl to BMP (kurio IEP yra apie 5, 0) gali būti gerai absorbuojamas į bazinį želatinos hidrogelį, laikui bėgant per abu įstrigimo procesus. Tai galima paaiškinti elektrostatiniu ryšiu tarp teigiamai įkrautų augimo faktorių ir želatinos 9, 12 . Dėl šios priežasties mūsų galutinis BMP imobilizacijos lygis siekė maždaug 100 μg BMP vienam miligramui DG-NP. Dekstranas yra natūralus polisacharidas, o būdingas α-1, 6-gliukozidinis ryšys yra hidrolizuotas dekstranazės 11 . Eksperimentai parodė, kad dekstranazių darinius taip pat gali skaidyti dekstranazė ir kad dėl didėjančio pakaitalo laipsnio skilimo greitis yra lėtesnis 11 . Mes tikimės panaudoti tiek želatinos ( ty joninės sąveikos tarp priešingai įkrautų molekulių), tiek dekstrano ( ty fermento skilimas be greito tirpinimo) pranašumus, kad būtų sukurta patobulinta kompozicinė biomedžiaga, galinti atpalaiduoti vaistų molekules gaubtinėje žarnoje po polisacharido nanodalelių hidrolizės. pagal dekstranazę.

Kaip ir tikėtasi, per pirmąsias 24 valandas ne-skilimo sąlygomis (PBS, jei nėra dekstranazės), iš DG-NP buvo desorbuota mažiau nei 20% integruoto BMP. Po to trūko tolesnės esminės desorbcijos, tuo tarpu pastebėtas didelis pradinis įkomponuotų vaistų desorbcija mikrosferose, gaunamose iš simpleksinio dekstrano 8 . Taigi darome išvadą, kad per joninę sąveiką imobilizuotas baziniam želatinos hidrogeliui BMP buvo išleistas in vivo, daugiausia dėl mikro nešiklio skaidymo. Todėl BMS nebuvimas arba lėtas atpalaidavimas iš nanodalelių PBS gali būti suprantamas kaip sąveikos tarp baltymo ir Dex-GMA / želatinos skiepų pasekmė. Tiesą sakant, keli tyrimai parodė, kad Dex-GMA / želatinos hidrogelis nėra skaidomas neutraliame buferiniame tirpale 7, 9 . Ankstesniame tyrime mes taip pat pastebėjome, kad dekstrano turinčios mikrodalelės skaidomos dekstranazės - fermento, plačiai paplitusio tarp gyvų organizmų, katalizuojančio γ-glutamilo junginių hidrolizę 8 . Tikimasi, kad į baltymus kapsuliuoti DG-NP gali išlaisvinti baltymus ląstelėje arba in vivo , įvesdami fermentus, tokius kaip dekstranazė. Kaip parodyta 4 paveiksle, tariamai DG-NP skaidosi tik PBS, kuriame yra dekstranazės. These results indicate that the release of proteins from DG-NPs is controlled primarily enzymatically during the entire release period and that different speeds of enzymatic degradation result in different release rates.

It has been reported that spontaneous regeneration of 50% to 70% can be expected in an acute defect model, and local application of growth factors like BMP can promote periodontal tissue regeneration 1, 2, 3 . The mechanisms driving this regeneration are unclear. The development of ossification in periodontal defects is itself a complex biological process that requires intricately regulated interactions between cells, locally acting growth factors, mechanical loading ( eg , pressure and tension forces), systemic hormones and growth factors, and the matrix components in which these entities interact 13, 14 . However, it is certain that BMP in DG-NPs may spread evenly from the periodontal defect and, over time, stimulate new bone formation in tissue where pooling or localized accumulation of BMP did not occur. Therefore, the loaded BMP may be utilized by the surrounding cells or tissues more efficiently. To evaluate the biological effects of BMP in DG-NPs on periodontal wound healing in vivo , animal experiments should be performed before any further preclinical experiments are taken into consideration. Future work should focus on precisely localized growth factor delivery by nanoparticles, and applications of these nanoparticles in both bone and periodontal repair should be emphasized. This is an area, along with the tissue engineering and regenerative fields, in which the clinical usage of growth factors could have great impact in the near future.

For local delivery of bioactive drugs, the carrier must be clinically and mechanically manageable, biologically acceptable, and able to support wound stability 2 . It is promising that our implanted DG-NPs are able to protect loaded biomolecules from degradation and release them for extended time periods. In light of our previous study, dextran-co-gelatin has proven to be a good biomaterial for the controlled release of several biologically active molecules 9, 17 . While work continues to improve its release technology through the use of composite scaffolds and biomaterial modification, more studies are required to characterize the sorption and release profiles of a wider variety of biomolecules from this carrier 18, 19 . The utility and potential of nanoparticle drug delivery systems have been demonstrated, and it has been shown that tailored delivery is possible 20, 21, 22, 23 . Many chemical and engineering questions specific to these designed systems have been addressed 24, 25 . The broad scope application of micro/nano-systems requires testing in case-by-case studies, and it may not always be clear how systems will perform during in vivo tests compared to controlled, laboratory environments 26, 27, 28, 29 . However, synthesizing delivery systems for active drugs and promoting their application for the treatment of different bone defects is a realistic prospect.

Išvada

Novel dextran- and gelatin-based copolymers formed nanoparticles with a mean diameter of roughly 53.7 nm and a mono-dispersed size distribution when prepared using a facile synthesis method assisted by self-assembly. The DG-NPs showed a highly negative zeta potential in PBS. BMP was successfully entrapped onto these nanoparticles and demonstrated sustained release for 12 d under degradation conditions. In vitro cytotoxicity testing showed that the present nanoparticles did not induce any cytotoxicity against PDLCs. Thus, these DG-NPs may be considered promising biodegradable and biocompatible protein carriers for modulated biodistribution as well as site- and/or cell-specific drug delivery systems. With further studies, these nanoparticles may have the potential to serve as candidate growth factor-vehicles for periodontal tissue regeneration enhancement.

Autoriaus indėlis

Dr Fa-ming CHEN and Prof Zhi-fen WU designed the research; Dr Fa-ming CHEN, Dr Zhi-wei MA, and Prof Guang-ying DONG performed the research; Dr Fa-ming CHEN analyzed the data; Dr Fa-ming CHEN and Dr Zhi-wei MA wrote the paper.