Nuolatinė šviesa padidina sinchroniškumą tarp paros elementų ir parodo, kad pelės, turinčios vpac2 signalą, turi trūkumų | mokslinės ataskaitos

Nuolatinė šviesa padidina sinchroniškumą tarp paros elementų ir parodo, kad pelės, turinčios vpac2 signalą, turi trūkumų | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių neuromokslas
  • Cirkadiniai mechanizmai
  • Cirkadiniai ritmai ir miegas
  • Fiziologija

Anotacija

Atskiri neuronai suprachiasmatiniuose branduoliuose (SCN) turi tarpląstelinį molekulinį laikrodį ir naudoja tarpląstelinius signalus sinchronizuodami savo laiko apskaitos veiksmus, kad SCN galėtų koordinuoti smegenų fiziologiją ir elgesį. Neuropeptido vazoaktyvus žarnyno polipeptidas (VIP) ir jo VPAC 2 receptorius sudaro pagrindinį tarpląstelinių signalų sistemų SCN komponentą ir kritiškai kontroliuoja ląstelių sujungimą. Tarpląstelinio laikrodžio arba tarpląstelinių neuropeptidų signalizacijos mechanizmų mutacijos, tokios kaip VIP-VPAC 2 signalizacijos, gali sukelti SCN neuroninių laikrodžių desinchronizavimą ir elgesio ritmo praradimą. Svarbus chronobiologijos tikslas yra sukurti intervencijas, kaip ištaisyti dieninio laiko apskaitos trūkumus. Čia parodyta, kad ilgas nuolatinės šviesos poveikis skatina sinchroniškumą tarp SCN laikrodžio ląstelių ir maždaug 24 valandų ritmo išraišką pelėse, kuriose tarpląstelinis signalizavimas sutrinka praradus VIP-VPAC 2 signalus. Šis tyrimas pabrėžia SCN sinchroniškumo svarbą elgesio ritmams išreikšti ir atskleidžia, kaip neinvazinės manipuliacijos išorinėje aplinkoje gali būti panaudotos siekiant įveikti neurocheminius komunikacijos trūkumus šioje svarbioje smegenų sistemoje.

Įvadas

Žinduoliuose vyraujantis šviesą suaktyvinantis cirkadinis širdies stimuliatorius yra pagumburio suprachiasmatiniuose branduoliuose (SCN). Atskiri SCN neuronai veikia kaip autonominiai cirkadiniai generatoriai, išreiškiantys ~ 24 val. Virpesius pagrindiniuose laikrodžio genuose / baltymuose, pavyzdžiui, per1-2 / PER1-2 1 . Tokius tarpląstelinius molekulinius ritmus galima vizualizuoti per kelis ciklus in vitro atskirose gyvų SCN smegenų pjūvių ląstelėse, paruoštose iš pelių, kuriose sustiprintas destabilizuotas žalias fluorescuojantis baltymas (eGFP) nurodo per1 promotoriaus aktyvumą ( per1 :: eGFP pelės 2 ). Ritminė laikrodžio genų išraiška pati savaime neapibrėžia SCN laiko; šie autonominiai ląstelių generatoriai turi sinchronizuoti savo veiklą, kad gautų pakankamai amplitudės ir nuoseklumo visuotinį SCN išėjimą, kad organizuotų cirkadinius ritmus viso gyvūno fiziologijoje ir elgsenoje 3 . Intra-SCN signalizavimui naudojami įvairūs neuromediatoriai, įskaitant arginino vazopresiną (AVP), vazoaktyvų žarnyno polipeptidą (VIP), gastriną atpalaiduojančio peptido (GRP) glutamatą ir γ-aminosviesto rūgštį (GABA). Tiek VIP, tiek jo receptorių, VPAC 2, ekspresuoja SCN neuronai 4, 5, o tarpląstelinis ryšys per VIP-VPAC 2 signalizaciją vaidina pagrindinį vaidmenį sujungiant SCN ląstelių laikmačius 6, 7 . Pavyzdžiui, pelėms, kurioms nėra VIP ar VPAC 2 ekspresijos (atitinkamai Vip - / - ir Vipr2 - / - ), yra ryškūs jų elgesio ir fiziologijos pokyčiai, o laikrodžio genų / baltymų SCN išraiška labai sumažėja 8, 9, 10, 11 . Iš tikrųjų, palyginti su elgesio ritmo laukinio tipo (WT) per1 :: eGFP pelėmis, SCN, vienos ląstelės osciliatoriai Vipr2 - / - × per1 :: eGFP SCN yra mažesnio skaičiaus, osciliuoja mažesne amplitude ir yra prasčiau sinchronizuotas 7 . Todėl in vivo pastebėtas cirkados deficitas gali būti tiksliai suskirstytas į SCN laikrodžio ląstelių aktyvumo ex vivo vertinimus.

Gyvūnai, kuriems trūksta tarpląstelinių molekulinių laikrodžių, gali išreikšti neobjektyvų cirkadinį elgesį nuolatinėje tamsoje (DD) 12, o SCN ritmai laikrodžio genuose paprastai būna neryškūs ar sutrikdyti 13, 14, 15 . Įdomu tai, kad elgesio ir SCN molekulinius ritmus galima atkurti palaikant juos pastovioje šviesoje (LL) 16, 17, 18 . Šviesos informacija perduodama SCN per retinohipotalaminį taką (RHT), naudojant glutamatą ir hipofizės adenilato ciklazę aktyvinantį polipeptidą (PACAP) kaip neurotransmiterius 19, 20, ir skatina laikrodžio genų, įskaitant per1 21, ekspresiją . Gali būti, kad LL suteikia toninį sužadinimo impulsą SCN ir taip apeina tarpląstelinius molekulinius pažeidimus 16, nors neaišku, ar LL taip pat gali atkurti cirkadinį aktyvumą pelėms, turinčioms tarpląstelinius signalizacijos defektus. Kadangi Vipr2 - / - pelės ekspresuoja visus žinomus laikrodžio genus, nors ir sumažėjusiais 8 lygiais, ir kadangi Vipr2 - / - pelių šviesos įvesties kelias yra nepažeistas 22, 23, 24, 25, mes ištyrėme, ar LL gali išgelbėti elgesį ir SCN ląstelių ritmai šiame cirkadinės sistemos modelyje susilpnėjo dėl to, kad buvo sutrikdyta pagrindinė tarpląstelinio sinchronizavimo trasa. Mes pranešame, kad išplitęs LL poveikis skatina Vipr2 - / - pelių elgesio ritmą ir tarpląstelinę SCN sinchroniją. Tai rodo, kad manipuliacijos, paremtos neinvazinėmis apšvietimo strategijomis, gali būti veiksmingos, siekiant pagerinti cirkadinio žmogaus kompetenciją, ir pabrėžia plastinį SCN cirkadinio funkcijos pobūdį.

Rezultatai

Diferencinis pastovaus apšvietimo poveikis važiuojančių ratais WT ir Vipr2 - / - pelėms

Ir WT, ir Vipr2 - / - pelės daugiausia intensyvų vairavimą važiavo tik tamsiąja LD ciklo faze. Perkeliant į LL, WT pelės elgėsi pagal ankstesnius 26, 27, 28 aprašymus, sukeldamos didelę lokomotorinio aktyvumo fazės vėlavimą (~ 5 val.) Ir slopindamos ratų važiavimą, palyginti su LD (~ 110 aps./h.) esant LL palyginti su ~ 400 aps / h LD; p = 0, 001; t- testas; n = 12; 1a pav., b). Pradinį ritmo sutrikimą, trukusį ~ 2–3 dienas, daugumai (11 iš 12) asmenų stebėjo tvirtesni ritmai, kurie išliko per visas 36 išnagrinėtas LL dienas. Skirtingai nuo DD elgesio, kai WT pelių aritmiškumas yra nedažnas ir netikėtas 24, 29, 30, viena WT pelė nesugebėjo išreikšti identifikuojamų cirkadinių ritmų elgesyje LL, parodydama, kaip anksčiau buvo pranešta, kad LL gali sutrikdyti WT cirkadinius ritmus lokomotorinis aktyvumas. Laikui bėgant, čia išnagrinėta LL, reikšmingų ritminių WT pelių procentinių pokyčių nepastebėta ( p = 0, 677; Fišerio tikslus testas su Freemano-Haltono pratęsimu; n = 12; 1 pav. 1 e; ankstyvas prieš vidurį ir vėlai LL; nors taip pat žr. 4a pav.) Ir reikšmingo ritmo stiprumo pokyčio nėra ( p = 0, 25; suporuotas t- FFT spektrinės galios testas ankstyvajame ir vėlyvajame LL; n = 12; 1h pav.). Iš tikrųjų 50% WT asmenų rodė padidėjusią spektrinę galią vėlyvoje LL, palyginti su ankstyva, o 50% - sumažėjusia (1i pav.). Kaip įprasta LL, ritmingos WT pelės išreiškė vidutinį laikotarpį, kuris buvo žymiai ilgesnis (25, 03 ± 0, 11 h; žr. 1a, b pav.), Nei stebimas šiam kamienui DD 7, 31 .

Image

Aktogramos, rodančios WT ir Vipr2 - / - pelių elgseną važiuojant ratu, esant LD ir LL, su nemokamomis FFT spektrogramomis LL duomenų daliai ( a - d ). Apibendrintos histogramos parodo WT ir Vipr2 - / - pelių ritmą LL ( e, f ) ir vėlesniame DD pelių pogrupyje ( g, taip pat žr. 2 pav.); ritmo stiprumas (FFT spektrinė galia) ankstyvajame ir vėlyvajame LL ( h ) ir pelių procentas, parodęs didėjantį ir mažėjantį ritmo stiprumą laikui bėgant (LL). Po pirminio sutrikimo LL pagerina Vipr2 - / - pelių cirkadinį elgesį. Pradiniam palyginimui DD ritmingumo duomenys pateikiami g grupėje 12 Vipr2 - / - pelių, kurios buvo veikiamos LL-DD-LL sąlygomis, pogrupyje (aktogramos parodytos 2 pav.). Actogramos parodo atskirų gyvūnų elgesį ir yra pavaizduotos dvigubai, kiekvienoje eilutėje nurodant 2 dienų duomenis iš eilės. Spektrogramos pateikiamos horizontaliai suderintos su atitinkamais elgesio duomenimis, o vertikalios baltos punktyrinės linijos rodo 24 valandų laikotarpio žymę. Spalvų skalė normalizuojama tarp 0 spektrinės galios (purpurinės) ir vidutinės spektrinės galios, pridedant 3 standartinius nuokrypius (μ + 3σ; raudona). Spalvų skalė spektrogramoms ( b - d ) yra tokia, kaip parodyta a punkte. Pilkas atspalvis ant aktogramų rodo tamsą. ( E, f ) histogramos legendos pateiktos g punkte. F skydelyje parodytas reikšmingas ritmiškų Vipr2 - / - pelių dalies padidėjimas per laiką LL ( p <0, 001; Fišerio tikslus testas su Freemano-Haltono pratęsimu), tokio efekto nėra abiejų Vipr2 - / - pelių DD ( g ) ir WT pelės LL ( e ). H skydelyje parodytas reikšmingas Vipr2 - / - pelių ritmo stiprumo (FFT spektrinės galios) padidėjimas vėlyvajame LL ir ankstyvajame LL ( p <0, 01; suporuotas t- testas). I skydelyje pateikiama vaizdinė iliustracija, kad ritmo stiprumas bėgant laikui padidėja daugumai Vipr2 - / - pelių, bet ne WT pelėms. * p <0, 05; *** p <0, 001.

Visas dydis

Image

Vipr2 - / - pelių, laikomų LL sąlygomis 36 dienas, elgesys su ratukais , parodant 36 dienas, po to 36 dienas perkeltos į DD, prieš antrą 36 dienų veikimą LL ( a ). Perkeliant į DD, ritmingos Vipr2 - / - pelės neišlaiko ~ 24 valandų ritmo, išreikšto LL, ir tampa aritminiais arba rodo trumpesnį (~ 22, 4 h) ritmą važiuojant ratu (taip pat žr. 24 ). Vėliau pakartotinai veikiant LL, Vipr2 - / - pelės greitai keičia važiavimą ratu, kad vėl parodytų atvirą ritmą ir būdingą ilgesnį laikotarpį (~ 24 val.), Išreikštą LL. Actogramos brėžiniai ir šešėliai, kaip parodyta 1 pav. Skydeliai ( b, c ) rodo atitinkamai LL1, DD ir LL2 laikotarpio langelį ir ūsą bei ritmo histogramą, įvertintą per paskutines 12 kiekvienos epochos dienų. Ūsai nurodo didžiausią ir mažiausią laikotarpio duomenų taškų diapazoną. *** p <0, 001.

Visas dydis

Image

Sudėtiniai ritmo brėžiniai rodo per1 :: eGFP profilius 30 atskirų SCN ląstelių dviem smegenų pjūviais iš kiekvieno genotipo. Intarpai rodo sumažintą ląstelių pasirinkimą, kad būtų lengviau vizualizuoti sinchroniškumą ir pabrėžti skiltelių ląstelių sinchroniškumo skirtumus. ( a - b ) ( vidurinės plokštės ): fotomikrografai, rodantys ritmo pjūvių per1 :: eGFP didžiausią ir mažiausią išraišką ir reprezentatyvūs vaizdai iš lygiaverčių aritminių pjūvių laiko taškų. Intarpai rodo regionus, pažymėtus baltomis dėžutėmis, esant didesniam padidinimui (atkreipkite dėmesį į ritminių pelių SCN sinchronizuotą smailę ir mažiausią išraišką ir trūksta nuoseklių skirtumų dienos ir nakties metu aritminių pelių SCN). ( a, b ) ( apatinės plokštės ): Rayleigh'o grafikai, rodantys piko per1 :: eGFP ekspresijos laiką ritminėse SCN ląstelėse, analizuojamose vienoje gabaliuko kultūroje. Rodyklių galvutės nurodo atskirų ląstelių didžiausio fluorescencijos laiką, centrinės linijos ilgis rodo sinchroniškumo laipsnį tarp atskirų ląstelių didžiausio išraiškos laiko (išreikštas Rayleigh R; ilgesnė linija rodo didesnę sinchroniją), o vidinis sulaužytas žiedas rodo sinchroniškumo statistinio reikšmingumo riba. ( c - h ): histogramos, apibūdinančios analizuotus ritmo parametrus per1 :: eGFP raiškai pjaunant ritmines ir aritmines WT ir Vipr2 - / - peles. Skydelių d - h raktas yra toks, koks parodytas c skydelyje. Elgesio ritmingumas buvo vertinamas per paskutines 10–14 dienų prieš skerdimą LL ir pateikiami palyginant pelių, klasifikuojamų kaip elgesio ritmika ir aritmija, SCN parametrus, nepriklausomai nuo laiko LL (kuris nagrinėjamas 4 pav.). ( H ) skydelyje parodyti laikotarpių ir fazių skirtumai tarp SCN nugaros ir ventralinių SKN kultūrų iš elgesio ritmo ir aritmijos WT ir Vipr2 - / - pelių kultūrose. Abiejuose genotipuose dauguma elgesio ritmo pelių SCN kultūrų buvo sinchronizuotos ( d, e ), tuo tarpu nė viena SCN kultūra iš elgesio aritmiškų gyvūnų neišreiškė reikšmingai sinchronizuotų ląstelių ritmų ( e ). SCN pjūviai iš elgesio ritmo WT pelių turėjo žymiai daugiau ritminių ląstelių ( c ), tuo tarpu SCN pjūviai iš elgesio ritmo Vipr2 - / - pelių parodė mažesnį nugaros ir ventralinį regioninį nevienalytiškumą periode ir fazėje ( h ).

Visas dydis

Image

Vipr2 - / - duomenys apibūdina teigiamą trijų krypčių koreliaciją tarp ilgėjančio LL, didesnio elgesio ritmo ir didėjančios SCN ląstelių sinchronijos ( d - f ). WT pelėms elgesio ritmas teigiamai koreliuoja su SCN ląstelių sinchronija ( c ). Ir atvirkščiai, abiejų šių parametrų santykis su laiku WT pelėms esant LL LL blogai atitinka linijines tendencijas (nutrūkusi linija a, b plokštėse), tačiau galiausiai po to pamažu mažėja ritmas ( a ) ir sinchroniškumas ( b ) po prailginta (> 29 dienų) LL trukmė (pridėtos lengvos nenutrūkstos linijos, kad vizualiai būtų naudojamasi; nors apie šių duomenų pogrupių statistinį vertinimą skaitykite pagrindiniame tekste> 29 dienas LL). Duomenys skydeliuose c - f pateikiami su linijinėmis tendencijų linijomis (sunkiomis nenutrūkstamomis linijomis), kurios užtikrino aukštą tinkamumą ir kiekvienu atveju iliustruoja linijinį reitinguotų duomenų santykį (visos duomenų grupės skydeliuose ( c - f ) rodo reikšmingą koreliaciją; Spearmano rho = 0, 755 ( p = 0, 0025) ( c ), 0, 522 ( p = 0, 038) ( d ), 0, 6 ( p = 0, 007) ( e ) ir 0, 512 ( p = 0, 0215) ( f ).

Visas dydis

Daugumai Vipr2 - / - asmenų pasireiškė akivaizdžiai sutrikdyti ritmai patekus į LL, nors, skirtingai nei WT pelėms, šis sutrikimas išliko žymiai ilgiau nei pirmąsias 2–3 dienas LL (1c pav., D). Tiesą sakant, nors paprastai ~ 50% Vipr2 - / - pelių sukuria tvirtus LD judėjimo ritmus (1g ir 2 pav. Ir žr. 24 pav . ), Tik ~ 30% Vipr2 - / - pelių (7 iš 24) pasireiškė atpažįstami dieniniai ritmai. važiuojant ratais ankstyvojo LL metu (1f pav.). Tačiau ilgėjant LL trukmei ritmingų asmenų procentas žymiai padidėjo ir vėlyvojo LL metu pasiekė 83% (20 iš 24 asmenų) (1f pav.; P = 0, 00032, Fisherio tikslus testas su Freemano-Haltono pratęsimu; n = 24). . Atsižvelgiant į tai, Vipr2 - / - pelių ritmo stiprumas laikui bėgant reikšmingai padidėjo LL (1 pav.; P = 0, 040; suporuotas t- FFT spektrinės galios testas ankstyvoje ir vėlyvoje LL; n = 24). 75% Vipr2 - / - asmenų (1i pav.). Taigi LL poveikis Vipr2 - / - lokomotoriniams ritmams priklausė nuo laiko, o po trumpalaikio pradinio ritmo sutrikimo, po ilgo ekspozicijos pasireiškė ritmą stiprinantis poveikis.

Ritminės Vipr2 - / - pelės (n = 20) išreiškė vidutinį 24, 29 ± 0, 08 h periodą LL, žymiai trumpesnį nei WT pelės tokiomis sąlygomis ( p = 0, 000009; n = 11 WT ir 20 Vipr2 - / - ). Padarius ritminį, Vipr2 - / - pelių laikotarpis išliko pastovus per visą apžiūrėtą laiką (1c, d pav.) Ir buvo ilgesnis, nei buvo pastebėta šiam kamienui DD 24, 32 (ir žr. 2 pav.). Pelių „Vipr2 - / -“ važiavimo ratu aktyvumas ( aps./h. ) Reikšmingai nesumažėjo perkeliant iš LD į LL (atitinkamai 173 ± 23 vs 135 ± 20 aps / h; p = 0, 35; n = 24; pav.) 1c, d), ir šis Vipr2 - / - rato aktyvumo parametras pagal LL reikšmingai nesiskyrė nuo WT gyvūnų, kuriems LL buvo ( p = 0, 50; n = 12 WT ir 24 Vipr2 - / - ).

Taigi, LL poveikis turi žalingą poveikį WT elgesio ritmų išraiškai, tačiau po ilgesnio laikotarpio sukelia Vipr2 - / - pelių ritmo sustiprėjimą su laiku.

Be nuolatinės šviesos nėra nuolatinio LL sukeltų elgesio ritmo patobulinimų

Norint ištirti, ar LL sukeliami elgesio ritmo pokyčiai išliko ir po to, kai trūko šviesos, po pirmųjų 36 dienų LL (LL1) 12 Vipr2 - / - pelių pogrupis buvo perkeltas į DD 36 dienas. Šio pogrupio ritmo charakteristikos buvo tipiškos visai Vipr2 - / - grupei, tirtai LL1. Perkėlus į DD, Vipr2 - / - pelėms greitai atsinaujino elgesio fenotipai, gerai dokumentuoti šiam genotipui DD sąlygomis 24, 32, 33 ; tarp asmenų buvo pastebėtas fenotipų ištisumas, apimantis aritmiškumą ir ritmingumą per trumpą laiką (2a pav.). Nors 83% šios kohortos išreiškė cirkadinį elgesio ritmą LL1 pabaigoje, tik 50% buvo ritmiški DD metu, o šių ritmų laikotarpis, jei jis buvo, sutrumpėjo ~ 1, 6 h nuo beveik 24 h iki ~ 22, 4 h (24, 03 ± 0, 04 h šiam pogrupiui LL1 (n = 10) iki 22, 41 ± 0, 04 h DD (n = 6); p <0, 001; 2 pav.). Šių pelių ritmas akivaizdžiai nepasikeitė per visą čia išnagrinėtą DD (1g ir 2a pav.). Šis pogrupis Vipr2 - / - pelėms vėliau buvo grąžintas į LL dar 36 dienas (LL2), kurio metu kiekvienas individas išreiškė lokomotorinį fenotipą, atitinkantį jo elgesį LL1 metu (83% (10 iš 12) ritmiško LL2, vidutinis laikotarpis 24.05). ± 0, 05 val .; 2 pav.). Vipr2 - / - pelėms, pakartotinai paveiktoms antrąja LL epocha, tendencija greičiau įgyti į LL panašų elgesio fenotipą nei pradinio LL poveikio metu (pvz., 2a pav.).

Tarpląstelinė sinchroniškumas SCN susijęs su elgesio ritmiškumu

Atsižvelgdami į nuo laiko priklausomą LL poveikį Vipr2 - / - elgesiui, toliau įvertinome LL sukeltų elgesio pokyčių koreliaciją su per1 :: eGFP išraiška SCN. Atskira elgesio fenotipų WT ir Vipr2 - / - pelių kohorta buvo išpjaustyta atsitiktinai paskirtais laiko momentais padidinus LL trukmę ir, naudodamiesi konfokaline mikroskopija, pavaizdavome per1 :: eGFP išraišką gyvuose SCN turinčiuose smegenų pjūvių kultūrose iš kiekvieno individo (pav. 3).

Pelės, naudojamos šioje tyrimo dalyje, parodė tas pačias elgesio ritmo tendencijas, kaip ir atliekant pirminius elgesio tyrimus, pateiktus anksčiau. Iš tiesų, visų Vipr2 - / - pelių, naudotų konokaliniam vaizdavimui, klasifikavimas pagal elgesio ritmiškumą paskerdimo metu išaiškino reikšmingą teigiamą koreliaciją tarp laiko LL ir reitinguoto elgesio ritmo (Spearmano rho vertė 0, 522; p = 0, 038; R 2 = 0, 387). ; n = 16; 4d pav.). Tiesinė tendencijos linija blogai atitiko WT laiko LL duomenis pagal elgesio ritmo laipsnį ( R2 = 0, 085; 4a pav.), Ir šie duomenys nebuvo reikšmingai koreliuojami (Spearmano rho = −0, 442; p = 0, 15; n = 12). ). Vis dėlto duomenų vizualinis aiškinimas atskleidė, kad ilgą laiką gydant LL (> 29 dienas) WT pelių ritmingumas nuosekliai mažėjo. Tai asociacija, kuri pasiekė statistinę reikšmę šiam gyvūnų pogrupiui (Spearmano rho = −0, 813; p = 0, 005; n = 10; 4a pav.).

Norėdami įvertinti ryšį tarp elgesio ritmo ir cirkadinių funkcijų SCN vienos ląstelės lygyje, padalijome per1 :: eGFP išraiškos duomenis kiekvienam genotipui į 2 grupes; asmenys elgesio ritmiškai paskerdimo metu (n = 9 WT; n = 10 Vipr2 - / - ), o asmenys - elgesio aritmijos paskerdžiant (n = 3 WT; n = 6 Vipr2 - / - ). Gyvūnų skerdimo laikas buvo nustatytas prieš pradedant eksperimentą, todėl gyvūnų elgesio ritmo laipsnis tam neturėjo įtakos. Elgesio ritmu sergančių WT pelių SCN pjūviai turėjo žymiai didesnį ritminių atskirų ląstelių procentą nei elgesio aritmijos konsistencijos gabaliukai (99, 6 ± 0, 4%, palyginti su 96, 7 ± 1, 9%; p = 0, 016; 3a, c pav.). Įdomu tai, kad neradome jokio žymaus ritmiškų ląstelių procentinio skirtumo tarp elgesio ritmiškų ar aritminių Vipr2 - / - pelių pjūvių (abi ~ 80% ląstelių ritminių; p = 0, 380; 3b, c pav.).

Svarbu tai, kad šis elgesio ir SCN ląstelių ritmingumo santykio skirtumų skirtumas nebuvo pastebėtas dėl SCN ląstelių ritmų sinchroniškumo; mes pastebėjome žymiai didesnę tarpląstelinę sinchroniškumą elgesio ritmo WT ir Vipr2 - / - pelių skiltelėse, nei pjaustytuose iš aritminių konsistencijų (0, 36 ± 0, 05 vs 0, 18 ± 0, 01; p = 0, 0039 [sinchroniškumas ritmingų WT pelių skiltelėse palyginti su aritminėmis WT pelėmis), atitinkamai], ir 0, 41 ± 0, 07, palyginti su 0, 22 ± 0, 03; p = 0, 0284 [pjūviai iš ritmingo ir aritminio Vipr2 - / - gyvūnų]; Rayleigh R vertės; 3a, b, d pav.). Be to, nors 67% elgesio ritmu sergančių WT gyvūnų pjūviai buvo žymiai sinchronizuoti, o 60% iš elgesio ritmo turinčių Vipr2 - / - pelių pjūvių, nė vieno iš elgesio aritmijos pelių, gavusių bet kurį genotipą, pjūviai neturėjo reikšmingos tarpląstelinės sinchronijos (3a, b, pav. e). WT ar Vipr2 - / - pelėms (visos p <0, 05) reikšmingų skirtumų tarp ląstelių elgesio ritmo ir aritmijos pjūvių vidutinio laikotarpio ar amplitudės (visos p <0, 05) nebuvo, nors ir Vipr2 - / - virpesių periodas, ir amplitudė buvo pastovūs. mažesnis nei WT virpesiai, neatsižvelgiant į elgesio ritmą (visi p <0, 001; 3f pav., g).

Kadangi regioninis SKN laikotarpio ir fazės nevienalytiškumas anksčiau buvo susijęs su cirkadinės sinchronijos 34 palaikymu, mes toliau įvertinome šių parametrų skirtumus tarp SCN nugaros ir ventralinių sričių abiejų genotipų elgesio ritmo ir aritmijos pelėms. WT SCN nerasta reikšmingų pokyčių dorsal-ventriniame periode ar fazės heterogeniškume tarp elgesio ritmo ir aritmijos gyvūnų (3h pav.). Tačiau Vipr2 - / - SCN skirtumuose tarp periodo ir fazės tarp dorsalinės ir ventrinės sričių buvo žymiai mažesni (taip pat mažiau kintami; žr. Mažesnį SEM) pjūviai iš elgesio ritmo pelių (3 pav.), Būdingas nuoseklus su patobulinta ląstelių sinchronizacija elgesio ritmu sergantiems gyvūnams.

Galiausiai, norėdami geriau apibūdinti priklausomus nuo elgesio ritmikos, SCN sinchroniškumo ir laiko LL ryšius nuo genotipo ir laiko, mes apskaičiavome Spearmano rango koreliacijos koeficientus šiems parametrams, naudodamiesi elgesio duomenimis, suskirstytais pagal ritmo tvarką. Tiek WT (n = 12), tiek Vipr2 - / - (n = 16) pelėms nustatėme reikšmingą koreliaciją tarp reitinguoto elgesio ritmo ir tarpląstelinės sinchronijos ( p = 0, 0025 [Spearman rho = 0, 755] WT ir p = 0, 0215 [0, 512]). Vipr2 - / - ) ir kad linijinė tendencijos linija gerai tinka duomenims (atitinkamai R2 = 0, 462 ir 0, 168; 4c pav., F). Atsižvelgdami į tai ir teigiamą koreliaciją tarp laiko LL ir elgesio ritmo Vipr2 - / - pelėse (4d pav.), Mes taip pat nustatėme reikšmingą teigiamą ryšį tarp laiko LL ir SCN tarpląstelinės sinchronijos Vipr2 - / - pelėse ( p = 0, 007; rho = 0, 6; 4e pav.). Tačiau WT pelėms, kaip stebėjome santykį tarp LL ir elgesio ritmo (žr. Aukščiau; 4a pav.), Laikas LL nebuvo reikšmingai koreliuojamas su SCN sinchroniškumu (Spearmano rho = −0, 374) ir bloga tiesine tendencijos linija. pritaikyti duomenys ( R2 = 0, 010; 4b pav.). Panašiai kaip laikas, kai WT pelėms buvo nustatytas LL santykis su elgesio ritmu, tačiau vizualiai aiškinant laiką LL ir ląstelių sinchroniškumo grafike WT pelėms, buvo siūloma laipsniškai mažinti sinchroniškumą vėliau LL po ilgesnės (> 29 dienos) LL trukmės; Mes nustatėme reikšmingą koreliaciją tarp šių parametrų WT pelėms, kai mes įvertinome tai> 29 dieną tik LL pogrupyje gyvūnų (Spearmano rho = −0, 875; p = 0, 001; n = 10; 4b pav.).

Diskusija

Čia parodome, kad ilgalaikis nuolatinės šviesos poveikis, neinvazinis aplinkos manipuliavimas, skatina ~ 24 valandų elgesio ritmą ir stabilius, sinchronizuotus ląstelių ritmus pagrindiniame dieniniame pelių, turinčių tarpląstelinį signalą, širdies stimuliatoriuje. Tai visiškai prieštarauja to paties dirgiklio, nuolatinės šviesos ekspozicijos, sukeliančiai žalingą ir galimą žalingą poveikį cirkadiniams ritmams gyvūnams su nepažeista paros laiko sistema. Šios išvados suteikia naują įžvalgą apie to, kaip pelėms, kurioms trūksta signalizacijos per VPAC 2 receptūrą, cirkadinio ritmo elgesio ir vienos ląstelės lygmeniu atstatymas; pagrindinis SCN tarpląstelinio ryšio kanalas.

LL skirtingai pakeitė elgesio ritmo išraišką atskiroms VT ir Vipr2 - / - pelėms. Norėdami nustatyti galimus veiksnius, pagrindžiančius cirkadinį elgesio profilį, įvertinome abiejų genotipų ritminių ir aritminių gyvūnų SCN laikrodžio ląstelių sinchroniškumą. Palyginti su elgesio ritmu sergančiais asmenimis, elgesio aritmijos pelių per1 :: eGFP SCN neuronų sinchroniškumas buvo sumažintas, nepriklausomai nuo genotipo. Iš tikrųjų abiejuose genotipuose statistiškai reikšmingos tarpląstelinės sinchronijos nebuvo pjaustant visus elgesio aritmija sergančius asmenis. Svarbu tai, kad elgesio ritmu sergančių gyvūnų SCN laikrodžio ląstelių sinchroniškumo laipsnis nesiskyrė tarp WT ir Vipr2 - / - pelių, nepaisant mažesnės ritmingų atskirų ląstelių dalies Vipr2 - / - SCN. Pelėms Vipr2 - / - nustatėme, kad ritminiais asmenimis tiek laikotarpiui, tiek fazei buvo sumažinti regioniniai skirtumai tarp SCN nugaros ir ventralinių sričių. Iš esmės abiejuose genotipuose didesnis elgesio ritmas buvo susijęs su padidėjusia vidine SCN sinchronizacija, tačiau skirtingos SCN cirkadinės architektūros ypatybės lemia šį poveikį pelėms, turinčioms nepažeistas ir sutrikdytas paros laiko sistemas. Pabrėžtina, kad generuojant ir palaikant tvirtus audinių lygio virpesius 34, 35, 36, 37, 38, kasdienis ir erdvinis SCN cirkadinių funkcijų organizavimas. Iš tiesų pranešta, kad vienaląsčių svyravimai susikaupia į nugaros ir ventralinius SCN subregionus, mažesnis laikotarpių skirtumas tarp šių subregionų yra susijęs su didesne ląstelių sinchronija 38 . Šie duomenys atitinka sumažintą dorsalinio ir ventralinio SCN periodo skirtumą elgesio ritmu pasižyminčioms Vipr2 - / - pelėms, sergantiems LL, ir padidėjusią šių pelių SCN ląstelių sinchroniją, taip pat ilgesnį jų laisvo elgesio periodą.

Ankstesnis pranešimas apie atstatytą pelių, turinčių tarpląstelinio molekulinio laikrodžio defektus, elgesio ritmą buvo lydimas įrodymo, kad taip pat galima atkurti audinių lygio ritmus, susijusius su laikrodžio genų ekspresija16. Vis dėlto neaišku, ar šiame ir kituose modeliuose taip pat padidėjusi SCN ląstelių sinchronija. Panašiai, nors ankstesnėje ataskaitoje buvo pateikta išankstinių įrodymų, kad žlugdantis LL poveikis Vip - / - pelėms 39 yra šiek tiek sumažėjęs, tokiomis sąlygomis šiame modelyje nebuvo pranešta apie SCN funkciją. Dabartiniai mūsų duomenys rodo, kad tarpląstelinio signalizacijos deficito poveikis sumažėja veikiant LL, todėl pagerėja ratų važiavimo ritmai ir padidėja SCN ląstelių sinchronija. Įdomu tai, kad, atsižvelgiant į mūsų WT duomenis pailgintame LL (> 29 dienose), gyvūnams, kuriems yra visiškai funkcionuojantys tarpląsteliniai ir tarpląsteliniai SCN procesai, ir iš tikrųjų kai kuriems laikrodžio geno mutantams, kuriems būdingas ne toks sunkus elgesio fenotipas, LL poveikis paprastai susijęs su sutrikti SCN molekulinė ir neuronų funkcija, taip pat sutrikdyti kitus elgesio ir fiziologinius ritmus. 26, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 . Taigi nuolatinė šviesa dažnai kenkia cirkadiniam ritmui gyvūnams, turintiems stiprų arba visiškai funkcionuojantį dieninį laikrodį, tačiau ji gali būti naudinga gyvūnams, kuriems labai susilpninta paros sistema. Be to, ne tik LL poveikis suaugusiųjų dieninėms sistemoms, bet ir gyvulių palaikymas LL sergant jų vystymosi metu taip pat gali turėti įtakos vėlesnei dieninei funkcijai; Nepažeistos žiurkės ir pelės, laikomos po LL vystymosi metu, sumažino ritmo sutrikimus, kai laikomos po LL kaip suaugusios 50, 51, ir pelės, kurioms trūksta pagrindinių laikrodžio genų Cry1 ir Cry2 ( Cry1 - / - Cry2 - / - ), kai jos auginamos po LL sąlygos, išreikštas pagerintu ritmingumu nuolatinėje tamsoje, palyginti su LD pakeltomis kolegomis 52 . Šiuo metu nežinomas neuropeptidų turinčių pelių LL augimo poveikis elgesio ir SCN ritmui bei sinchroniškumui, nors Ono ir kt. (2013) praneša, kad skirtingai nuo Vipr2 - / - pelių, laikant suaugusias LD išaugintas Cry1 - / - Cry2 - / - peles LL, nepagerėja lokomotorinio aktyvumo cirkadiniai virpesiai.

Ilgalaikis LL poveikis sąlygojo didesnę Vipr2 - / - pelių, turinčių aiškų cirkadinį ritmą, procentą, nei matyti DD (dabartiniai duomenys, taip pat 24, 32, 53 ), ypač pelių ritmingumas DD buvo neprognozuojami kiekvieno asmens atsakymai į LL. Skirtingai nuo suplanuotų savanorių mankštų, kurių ritmą skatinantys važiavimai su neuropeptidais signalizuojančiomis pelėmis, kurių raumenys nepakankami, trunka iki 4 savaičių, kai mankštos režimas pasibaigia 53, LL ritmą skatinantys veiksmai elgesyje greitai pablogėja perkeliant į DD. Tai parodo skirtingų išorinių dirgiklių ilgalaikio pertvarkymo savybių skirtumus pelių, turinčių tarpląstelinių signalų trūkumą, cirkadinėje sistemoje 9, 54 . Šie duomenys rodo, kad norint organizuoti „ Vipr2 - / - SCN“, norint pagerinti elgesio ritmą, būtina nuolat palaikyti šį signalą. Tačiau pradinis pastovios šviesos poveikis sutrikdė Vipr2 - / - pelių elgesio ritmą, o tai taip pat rodo ilgalaikį SCN pritaikymą ir perstatymą nuolatos įjungiant šviesos įvesties kelius. Iš tiesų, pratęsiančios LL stabilizuojantys elgesio ritmai buvo tvirtai atkuriami; pakartotinis Vipr2 - / - pelių ekspozicija LL antrą 36 dienų bloką iškėlė tuos pačius elgesio parametrus, kurie buvo stebimi per pirmąsias 36 dienas, nors įdomu, kad į LL panašus fenotipas atrodė greičiau įgyjamas. šios antrosios ekspozicijos metu parodant, kad nors šio fenotipo DD netenkama, kai kurie pagrindiniai pokyčiai bent iš dalies išlieka.

Yra keletas galimų mechanizmų, pagrindžiančių patobulintą SCN ląstelių sinchroniją ir patobulintą ritmingą važiavimą ratu, atsirandantį dėl nuolatinės šviesos poveikio. Elektrofiziologiniai tyrimai atskleidė, kad suaugusiųjų Vipr2 - / - SCN neuronai yra linkę į hiperpolarizaciją 55 ir yra mažiau spontaniškai aktyvūs nei SCN neuronai iš suaugusių C57BL / 6 pelių 56 . Vipr2 - / - SCN neuronai išlaiko ūmų reagavimą į glutamaterginius signalus 56, tokius, kaip tie, kurie perduoda fotinę informaciją iš tinklainės į SCN per RHT 19 . Be to, padidėjęs elektrinis aktyvumas suaugusiesiems Vipr2 - / - SCN palaikomas in vitro reaguojant į nuolatinę gliutamaterginę stimuliaciją per kelias valandas 57 . Kadangi RHT naudoja ir glutamatą, ir PACAP, tikėtina, kad padidėjęs glutamaterginis tonas arba pasikeitę glutamato ir PACAP santykiai, atsirandantys dėl pastovios šviesos poveikio kelioms savaitėms, sužadina Vipr2 - / - neuronus ir pagerina jų sinchroniškumą, stimuliuojant. faktorius (-iai), nepriklausantys (-i) nuo VIP-VPAC 2 signalizacijos. Kandidatai į šį sąrašą yra: GABA, GRP ir Neuromedin S, SCN neuronams būdingi neurochemikalai, susiję su ląstelių ir ląstelių ryšiu, ir SCN sinchronija 6, 32, 57, 58 ; AVP, gausus SCN būdingas neuropeptidas 59, 60 su pakitusia ekspresija po LL 5 ; ir signalizavimas per adenozino receptorius, kurie turi įtakos SCN jautrumo tinklainės įvesties 61 modifikavimui. Be to, optinės sinapsės SCN rodo plastiškumą 62 ir gali būti, kad nuolatinė šviesa sukelia sinapsinių kontaktų ir tarpų jungčių 63 rekonstravimą, kad pagerėtų SCN tarpląstelinis ryšys.

Outwith the direct effects of RHT signaling to the SCN, altered LL behavior of mice lacking 5-HT1a receptors suggests the potential for mechanistic involvement of arousal pathways in mediating the actions of LL on the circadian system 28 . Indeed, the possibility of increased activity of extra-SCN neural oscillators under LL has yet to be investigated and cannot be excluded 64 . Intriguingly, an as yet unidentified dopamine-sensitive extra-SCN oscillator, with the potential to explain a variety of non-canonical circadian phenomena, has recently been reported 65, 66 . Interactions between such an oscillator and a weakened, but intact and functional SCN, such as that of Vipr2 −/− mice, provide a further possible avenue for investigation in the context of the current data.

In conclusion, our data illustrate that long-term exposure to LL promotes behavioral rhythmicity and SCN cellular synchrony in mice with deficient VIP-VPAC 2 signaling. Further, we present evidence that, regardless of genotype, behavioral rhythmicity correlates closely with intercellular synchrony in the master circadian pacemaker but that, in WT SCN, this is associated with an increase in rhythmic cells, whilst in the Vipr2 −/− SCN, this is associated with reduced regional heterogeneity.

Metodai

Gyvūnai

This study used adult male and female mice that expressed the per1 ::eGFP reporter and either expressed the Vipr2 gene (WT) or lacked expression of the VPAC 2 receptor ( Vipr2 −/− , see 7 ). Prior to experimentation, all mice were group housed under a 12 h light:12 h dark (LD) cycle with ad libitum access to food (Beekay, B&K Universal, Hull, UK) and water. Environmental temperature was maintained at ∼ 23 °C and humidity at ∼ 40%. All procedures and experimental protocols were carried out in accordance with the UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 and approved by The University of Manchester Review Ethics Panel.

Experimental Design and Behavioral Assessment

WT and Vipr2 −/− mice were individually housed in running wheel-equipped cages under a 12:12 LD cycle for 7–14 days (~3 × 10 14 photons/s/cm 2 lights on [~110 μW/cm 2 lights on, from a broad spectrum fluorescent light source]) then released into LL (~3 × 10 14 photons/s/cm 2 ). Wheel revolutions were recorded in Chronobiology Kit (Stanford Software Systems, Santa Cruz, California, USA) using 5 min bins for analysis. Animals of each genotype were divided into 2 cohorts for assessment of 1) the effects of LL on wheel-running behavior (n = 12 WT, n = 24 Vipr2 −/− ) and 2) correlation of the effects of LL on wheel-running behavior with SCN per1 ::eGFP expression (n = 12 WT, n = 16 Vipr2 −/− ).

For experiment 1, mice were free-run undisturbed for 36 days of LL (LL1) during which behavioral rhythms were assessed in early (1-12 days), mid (13-24) and late LL (25-36). After LL1, n = 12 Vipr2 −/− mice were placed in DD for 36 days before a further 36 day LL epoch (LL2). The remaining Vipr2 −/− mice (n = 12) and all WT mice (n = 12) were removed from the experiment after LL1. Rhythmicity was assessed by 4 experienced observers, blind to genotype and experimental conditions, using a combined evaluation of locomotor actograms, periodograms, average waveforms and the time-frequency spectrogram obtained from sliding window fast Fourier transform (FFT) 34, performed with a 7-day window that slid at 1-hr increments through wheel-running time series data smoothed with the Hodrick-Prescott filter (processed using Mathematica, Wolfram Research). In the majority of cases assessments of rhythmicity were unanimous (>90%), but for the infrequent cases where a consensus decision could not be easily reached, a final decision on rhythmicity was based on objective analysis of average waveforms. We determined that for a behavioral epoch to be considered rhythmic, a window centred on the most active part of the average waveform, consisting of 50% of its duration, should contain at least 75% of total activity. This method was validated on our entire data set and generated results entirely consistent with our prior assessments of behavior where we had initially been able to classify rhythmicity. For behavioral epochs that were clearly arrhythmic and for which no period could be determined from either periodogram analysis or visual inspection of actograms, a nominal value of 24 h was used to generate average waveforms. Where behavioral epochs were considered rhythmic, period was assessed in Chronobiology Kit using eyefit regression lines through onsets of activity and confirmed with spectral power analysis and Chi 2 periodograms.

For experiment 2, mice were initially free-run in LL, as in experiment 1, though culled after increasing durations of LL ranging from a minimum of 22 days, to a maximum of 39 days. As the aim of this experiment was to investigate a possible association between time in LL, behavioral rhythmicity and SCN circadian function, mice were randomly assigned a cull timepoint in LL prior to the experiment commencing. This avoided the possibility of unintentional bias associated with selecting cull timepoints after behavioral data had already been collected. Immediately following cull, SCNs were collected for confocal imaging of per1 ::eGFP expression. Behavioral rhythms were analyzed for the last 10–14 days before cull and the behavior of all mice ranked in order of rhythmicity for correlation with SCN per1 ::eGFP data and duration of time in LL. Ranking was performed blind by 4 experienced observers and correlated strongly ( R 2 = 0.675; p < 0.0001) with the percentage of activity contained during a 50% window of the average waveform using the methods described above. Experimenters were blind to both the identity of mice in behavioral experiments and the parameters of SCN per1 ::eGFP data at the time of assessment for ranking of behavior. Behavior was further categorized as either rhythmic or arrhythmic (using the same procedure as in experiment 1) to make within-genotype comparisons of SCN per1 ::eGFP data according to behavioral rhythmicity.

Confocal Imaging

Mice were culled by cervical dislocation following isoflurane anesthesia (Baxter Healthcare Ltd., Norfolk, UK), at circadian time (CT) 2–6 (to avoid different cull times influencing circadian parameters of SCN function 67, 68 ). Cultures were prepared as described previously 7 using 250 μm thick SCN-containing coronal brain slices and 100 μg/ml and 25 μg/ml penicillin-streptomycin (Gibco Invitrogen Ltd, Paisley, UK) in collection medium and culture medium, respectively. Cultures were stored in darkness at 37 °C for ~24 h before imaging per1 ::eGFP fluorescence using a C1 confocal system running on a TE2000 inverted microscope (Nikon, Kingston, UK). Images were captured with a 10 x 0.3NA PlanFluotar objective (Nikon) and the system maintained at 37 °C. A 488 nm laser was used for excitation and emitted fluorescence detected using a 515/30 nm bandpass filter. 8 image 'Z' stacks were acquired every hour for ~120 h, using 4x Kalman averaging, 1.5x confocal zoom, an open pinhole and 0.2 Hz frame rate. Each stack covered a total Z depth of 32 μm and images were recorded at 512 × 512 pixels. Stacks were collapsed to an average projection using ImageJ and fluorescence profiles across time assessed for 30 individual cells selected at random 7 using a region of interest tool. Raw fluorescence data were corrected for variations in background brightness by subtracting the brightness of a standardized, non-eGFP expressing, extra-SCN region from each data value before corrected data were smoothed using a 3 h running mean.

Cells were rated as rhythmic or arrhythmic by two experienced observers and amplitude, period and phase (time of peak at 12–36 hours) were assessed for each analyzed cell. The period of cellular rhythms was calculated using peak-peak and trough-trough durations for at least two cycles and phase data for individual cells were used to create Rayleigh plots to quantify the synchrony (phase-clustering) of rhythms between cells within each SCN 69 . Amplitude was calculated as the brightness differential from the peak used for phase analysis (12–36 hours into recording) to the following trough. Regional differences in period and phase within the SCN between behaviorally rhythmic and arrhythmic animals (period and phase heterogeneity) were assessed by classifying the location of each analyzed cell as either dorsal or ventral, based on anatomical characteristics of the SCN, and comparing the mean difference in each parameter between cells located in these two subregions.

Statistika

As appropriate, statistically significant differences in continuous data were determined using either t -Tests (paired or unpaired) or one/two way ANOVA with a priori pairwise comparisons. Categorical data for the percentage of rhythmic and arrhythmic animals were analyzed using Fisher's Exact Test with Freeman-Halton extension. Rayleigh Tests were used to determine statistical significance of cellular synchrony and the Rayleigh R statistic used to quantify the degree of synchrony. Statistical significances of correlations for ranked data were assessed using the non-parametric Spearman's Rank Order Test. All statistical tests were run with α set at p < 0.05 required for significance, using Microsoft Excel, Graphpad Prism, the VasserStats online statistical resource (//vassarstats.net/) and custom MATLAB scripts provided by Dr. Timothy Brown (University of Manchester).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.