Sutraukiantis tachikininų poveikis triušio plonajai žarnai | acta pharmaologica sinica

Sutraukiantis tachikininų poveikis triušio plonajai žarnai | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti tachikinino receptorių vaidmenį atliekant spontaninius išilginių ir apskrito lygiųjų raumenų susitraukimus iš triušio plonosios žarnos ir nustatyti P (SP) veikimo mechanizmą.

Metodai:

Buvo paruošti triušio dvylikapirštės žarnos, jejunum ir ileum segmentai. Spontaniniai išilginių ir apskrito lygiųjų raumenų susitraukimai buvo užfiksuoti kompiuteriu per izometrinį jėgos keitiklį. Specifiniai tachikinino receptorių agonistai ir antagonistai buvo įpilti į organų vonią.

Rezultatai:

Tachikinino NK1 receptorių (SP ir [Sar9] SP), NK2 receptorių (NKA ir (β-Ala8) -NKA) ir NK3 receptorių (NKB ir Senistų) agonistai sukėlė plonosios žarnos susitraukimus. Susitraukimus sumažino NK1 receptorių antagonistas L-733 060, NK2 receptorių antagonistas GR-94800 ir NK3 receptorių antagonistas SB 218795. SP sukeltus susitraukimus taip pat sumažino atropinas, verapamilis, PKC inhibitorius staurosporinas ir PLC inhibitorius U73122.

Išvada:

Ttachikinino NK1, NK2 ir NK3 receptoriai tarpininkauja triušio žarnyno lygiųjų raumenų susitraukimams. Be to, per tachikinino NK1 receptorius SP veikia tiesiai į lygiųjų raumenų ląsteles.

Įvadas

Tachikininai (TK) yra neuropeptidų šeima, paskirstyta per žinduolių centrinę ir periferinę nervų sistemas. TK veikia kaip 1, 2, 3 žinduolių virškinimo trakto neuronų ir ląstelių (tokių kaip lygieji raumenys, sekrecinis epitelis ir liaukos) neuromediatoriai. Jie yra svarbūs sužadinamieji žarnyno nervų sistemos pernešėjai, dalyvauja koordinuojant virškinimo trakto judrumą ir yra galingi spazmogenai beveik kiekviename žinduolių žarnyno regione 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Medžiaga P (SP), neurokininas A (NKA) ir neurokininas B (NKB) yra tachikininai, gauti iš dviejų preprotachikinino (PPT) genų 1, 7, 8, 9, 10 . Medžiaga P ir neurokininas A (NKA) yra enterinės nervų sistemos neuronuose, kur jie, atrodo, egzistuoja kartu su acetilcholinu (ACh) 11 . SP, NKA ir NKB susitraukia beveik visose virškinimo trakto dalyse, veikdamos skirtingus receptorių tipus 4, 12 .

TK receptoriai buvo įtraukti į normalią, gynybinę ir patologinę virškinimo trakto (GI) funkcijas 13, 14, 15, 16 . Trys tachikinino receptorių tipai, kurie buvo identifikuoti pagal jų genominę ir molekulinę struktūrą, šiuo metu yra vadinami NK1, NK2 ir NK3 tachikinino receptoriais 1 . Jie yra nevienalytiškai pasiskirstę kiekvienoje rūšyje. Tachikinino NK1 receptoriai yra plačiai ekspresuojami nervų sistemoje tiek centriniame, tiek periferiniame lygmenyje, jo yra neuronuose, raumenyse ir įvairių tipų imuninėse ląstelėse 2, 3 . Tachikinino NK2 ​​receptoriai pirmiausia aptinkami periferijos nervuose, ir atrodo, kad jo ekspresija centrinėje nervų sistemoje (CNS) yra ribojama specifinių smegenų branduolių 3, 17 . Tachikinino NK1, NK2 ir (arba) jų receptorius ekspresuoja neuronai, Kajal intersticinės ląstelės, žarnyno raumenys, epitelis, kraujagyslės ir imuninė sistema specifiškai ląstelėms, regionams ir rūšims, 1, 15, 18., 19 . Tachikinino NK3 receptoriai, priešingai, pirmiausia yra ekspresuojami CNS ir buvo aptikti tik tam tikruose periferiniuose audiniuose, pavyzdžiui, žmogaus ir žiurkės gimdoje, žiurkės mezenterinėje venoje ir tam tikruose enteriniuose neuronuose iš įvairių rūšių 15, 20, 21 žarnų.

TK daro įtaką virškinimo trakto motorinei veiklai ne tik tiesiogiai veikdami raumenis, bet ir veikdami kitas motoriką reguliuojančias sistemas8. Šio darbo tikslas buvo in vitro ištirti tachikinino receptorių įtaką spontaniniams triušio plonosios žarnos išilginių ir apskrito lygiųjų raumenų susitraukimams, naudojant specifinius kiekvieno tachikinino receptorių agonistus ir antagonistus, taip pat nustatyti SP veikimo mechanizmą.

medžiagos ir metodai

Naujosios Zelandijos patinai, sveriantys 2–2, 5 kg, buvo palaikomi pastovioje temperatūroje (22 ° C) naudojant standartinius triušių pašarus ir laisvą prieigą prie vandens. Naudota įranga, elgesys su gyvūnais ir jų aukos atitiko Europos Tarybos teisės aktus 86/609 / EEB dėl eksperimentinės gyvūnų apsaugos. Eksperimentinius protokolus patvirtino Saragosos universiteto (Ispanija) etikos komitetas.

Tirpalai ir medžiagos

Krebso tirpale buvo šie (mmol / l): NaCl 120, KCl 4, 7, CaCl 2 2, 4, MgSO 4 1, 2, NaHC03 24, 5, KH 2 PO 4 1 ir 5, 6 gliukozė 37 ° C temperatūroje, kad pH būtų 7, 4. Kai kurie eksperimentai buvo atlikti su Ca2 + neturinčiu Krebso tirpalu, iš kurio nebuvo praleistas CaCl2 ir į kurį buvo pridėta EGTA 0, 5 mmol / L.

Acetilcholinas (ACh), atropinas, guanetidinas, verapamilis, heksametonis, N ω -nitro- L- argininas ( L -NNR), etilenglikolio- bis (β-aminoetileteris) - N , N '-tetraacto rūgštis (EGTA), ryanodinas, ir „Substance P“ (SP) buvo nupirkti iš „Sigma“ (Madridas, Ispanija). Neurokininas A (NKA), neurokininas B (NKB), [Sar9] SP, (β-Ala8) -neurokininas A [(β-Ala8) -NKA], [sukcinil-Asp6, Me-Phe8] -SP (senistai), ir GR-94800 buvo gauti iš American Peptide (Sunnyvale, CA, JAV). Tetrodotoksinas (TTX), staurosporinas, U 73122, L-733060 ir SB 218795 buvo įsigyti iš „Tocris“ (Bristolis, JK). Thapsigarginą maloniai paaukojo bendrovė „Alomone Labs“ (Jeruzalė, Izraelis). Visos cheminės medžiagos buvo analitinės kokybės. TTX ir staurosporinas buvo ištirpinti atitinkamai rūgštiniame buferyje (pH 4, 8) ir etanolyje. Thapsigarginas, ryanodinas ir U 73122 buvo paruošti dimetilsulfokside (DMSO). Likę vaistai buvo ištirpinti Milli-Q vandenyje. Visi tirpalai buvo laikomi -20 ° C temperatūroje, o kasdien buvo skiedžiami švieži tirpalai.

Lygaus raumens segmentų paruošimas

Po 24 val. Pasninko gyvūnai buvo humaniškai sunaikinti smūgiu į galvą. Triušio dvylikapirštės žarnos, jejunum ir žarnyno gabalėliai buvo pašalinti, nuplauti, išlaisvinti nuo mezenterinio prisitvirtinimo ir supjaustyti į mažesnius segmentus. Viso storio segmentai (10 mm ilgio) buvo pakabinti išilginių ir apskritų lygiųjų raumenų pluoštų kryptimi į termostatu kontroliuojamą (37 ° C) organų vonią (10 ml talpos), kurioje yra Krebso tirpalas, ir buvo nuolat dujuojami 95% O2 ir 5 % CO 2 .

Kiekvienas segmentas buvo prijungtas prie izometrinio jėgos keitiklio (Pioden UF1, Graham Bell House, Kenterberis, JK) ir pasyviai ištemptas iki pradinės 20 mN įtampos. Mechaninio aktyvumo signalas buvo sustiprintas, užfiksuotas kompiuteryje vėlesnei analizei naudojant „Mac Lab System / 8e“ kompiuterinę programą (AD Instruments Inc, Milfordas, MA, JAV) ir suskaitmenintas po du mėginius per sekundę per kanalą. Prieš bandymą segmentams buvo leista 60 min. Subalansuoti Krebso tirpale.

Eksperimentiniai protokolai

Kiekvienas eksperimentinis protokolas buvo sistemingai atliekamas dviem ar trimis dvylikapirštės žarnos, jejunum ir blauzdikaulio segmentais, paimtais iš to paties triušio ir pakartotinai trimis ar keturiais skirtingais gyvūnais. Segmentai, kurie neparodė savaiminio aktyvumo, buvo išmesti; taigi kiekvienas preparatas buvo jo paties kontrolė.

Nekumuliacinės SP (NK1, NK2 ir NK3 receptorių agonistų) koncentracijos ir atsako kreivės buvo sudarytos pridedant SP (1 nmol / L iki 10 μmol / L) į vonią 3 minutes.

Norėdami nustatyti tachikinino receptorių potipius, mes 3 minutes ištyrėme keletą specifinių tachikinino receptorių agonistų vonioje: [Sar9] SP (100 nmol / L, NK1 receptoriaus agonistas), NKA ir (β-Ala8) -NKA (100 nmol). / L, NK2 receptorių agonistai) ir NKB bei Senktų (100 nmol / L, NK3 receptorių agonistai). Be to, mes ištyrėme L-733060 (1 μmol / L), GR-94800 (100 nmol / L) ir SB 218795 (1 μmol / L), atitinkamai NK1, NK2 ir NK3 receptorių antagonistus, SP nurodytu būdu. susitraukimai. Be to, L-733060, GR-94800 ir SB 218795 buvo tiriami atitinkamai su [Sar9] SP-, (β-Ala8) -NKA- ir Senkites sukeltais susitraukimais išilginio ir apskrito plonosios žarnos raumenyse. Šiame darbe naudojami antagonistai arba inhibitoriai buvo įpilti į vonią 15 minučių prieš pridedant atitinkamą agonistą.

Norėdami ištirti neuronų perdavimą, segmentai 15 minučių buvo inkubuojami su tetrodotoksinu (1 μmol / L) arba heksametoniu (100 μmol / L), prieš pridedant [Sar9] SP, (β-Ala8) -NKA arba Seneks.

Cholinerginiam perdavimui tirti segmentai buvo inkubuojami su atropinu (1 μmol / l); adrenerginis perdavimas buvo įvertintas inkubuojant segmentus su atropinu (1 μmol / L) + guanetidinu (1 μmol / L); neuronų perdavimas buvo tiriamas pridedant atropino (1 μmol / L) + tetrodotoksino (1 μmol / L), o NO išsiskyrimas buvo tiriamas inkubuojant mėginius su atropinu (1 μmol / L) + L -NNR (100 μmol / L).

Norėdami ištirti Ca 2+ poveikį SP sukeliamiems išilginių ir apskrito lygiųjų raumenų susitraukimams plonojoje žarnoje, segmentai buvo veikiami Ca 2+ neturinčiais Krebso tirpalais, turinčiais 0, 5 mmol / l EGTA; verapamilis (100 nmol / L), nuo įtampos priklausantis Ca2 + -kanalo inhibitorius; thapsigargin (100 nmol / L), sarkoendoplazminio retikulumo Ca 2+ -ATPazių inhibitorius; arba ryanodinas (100 nmol / L), Ca 2+ išsiskyrimo iš sarkoplazminio retikulumo inhibitorius. Be to, buvo ištirtas staurosporino (100 nmol / L), baltymo kinazės C (PKC) inhibitoriaus ir U 73122 (100 nmol / L), fosfolipazės C (PLC) inhibitoriaus, poveikis SP sukeliamoms susitraukimams.

Duomenų analizė

Visi žarnyno segmentai, įtraukti į analizę, parodė spontaninius susitraukimus. Tachikinino receptorių agonistų motorinės reakcijos (MR) buvo išmatuotos pagal integruotą mechaninį aktyvumą (IMA) per sekundę, išreikštą mN / s, ir normalizuotos skerspjūvio ploto kvadratiniame milimetre (CSA), kaip mes anksčiau aprašėme 22. . Rezultatai buvo išreikšti procentine dalimi nuo įvairių agonistų kontrolinių verčių (100%).

Vidutinė efektyvioji koncentracija (EC 50, SP koncentracija, reikalinga 50% efekto sukūrimui) ir 95% pasikliovimo ribos buvo apskaičiuoti naudojant tiesinę mažiausiųjų kvadratų regresiją.

Reikšmės išreiškiamos kaip vidurkis ± SEM. Vidutinės reikšmės buvo palygintos naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), o P vertės buvo patikrintos naudojant Scheffé F testą. Statistiškai reikšmingi buvo P <reikšmių skirtumai <0, 05.

Rezultatai

Tachikinino receptorių agonistų poveikis savaiminiam judrumui

Triušio dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir žarnyno raumenys in vitro parodė ciklinius, fazinius ir ritminius spontaninius susitraukimus 23 . Norėdami ištirti tachikinino receptorių vaidmenį spontaniniame triušio plonosios žarnos judrume, ištyrėme specifinius šių receptorių agonistus. SP (nuo 1 nmol / L iki 10 μmol / L), NK1, NK2 ir NK3 receptorių agonistas, sukėlė triukšmingų triušio dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir blauzdikaulio išilginių ir apskritųjų lygiųjų raumenų toninius susitraukimus. Šie SP sukeliami susitraukimai priklausė nuo koncentracijos (1 lentelė ir 1 paveikslas). EC50, apskaičiuota iš nekumuliacinių išilginių ir apskrito lygiųjų raumenų koncentracijos ir reakcijos kreivių, buvo 40 nmol / L ir 160 nmol / L dvylikapirštėje žarnoje, 120 nmol / L ir 200 nmol / L jejunum ir 80 nmol / L. ir atitinkamai 200 nmol / L šiluminėje žarnoje.

Pilno dydžio lentelė

Image

Nuo koncentracijos priklausomas SP (1 nmol / L – 10 μmol / L) poveikis triušio dvylikapirštės žarnos dvylikapirštės žarnos išilginio ir apskrito lygiųjų raumenų spontaniniams susitraukimams. Rodyklių galvutės rodo agentų pridėjimą.

Visas dydis

[Sar9] SP (100 nmol / L, NK1 receptoriaus agonistas), NKA ir (β-Ala-8) -NKA (100 nmol / L, NK2 receptorių agonistai) ir NKB ir Senktide (100 nmol / L, NK3 receptorių agonistai). ) sukeltų susitraukimų trijuose išilginio ir apskrito žarnos raumenų segmentuose (2 pav.). Palyginome skirtingų agonistų kontraktilines reakcijas su reakcija į SP (2 lentelė). [Sar9] SP sukeliami susitraukimai buvo panašūs į tuos, kuriuos sukelia SP abiejų lygiųjų raumenų tipuose iš trijų plonosios žarnos segmentų. (β-Ala8) -NKA, NKB ir Senkutės sukėlė silpnesnius susitraukimus nei SP abiejų lygiųjų raumenų tipuose. Testuotų agonistų stiprumo tvarka buvo [Sar9] SP> SP> NKA> NKB> (β-Ala8) -NKA = Senktų (2 lentelė).

Image

SP (100 nmol / L), NKA (100 nmol / L), NKB (100 nmol / L), [Sar9] SP (100 nmol / L), (β-Ala-8) -NKA (100 nmol / Dėl spontaninių triušių dvylikapirštės žarnos lygiųjų raumenų spontaninių susitraukimų. Rodyklių galvutės rodo agentų pridėjimą.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Tachikinino receptorių antagonistų poveikis

Mes taip pat išbandėme specifinių TK receptorių antagonistų poveikį SP-, [Sar9] SP-, (β-Ala8) -NKA- ir Senkitetų sukeltiems susitraukimams. L-733060 (1 μmol / L), GR-94800 (100 nmol / L) ir SB 218795 (1 μmol / L), atitinkamai NK1, NK2 ir NK3 antagonistai, sumažino SP sukeltus susitraukimus (100 nmol / L) (3 lentelė). L-733060 (1 μmol / L) sumažino [Sar9] SP (100 nmol / L) sukeltus susitraukimus visuose žarnyno segmentuose, išskyrus ilgąjį blauzdikaulio raumenį (3A pav., 3D). GR-94800 (100 nmol / L) sumažino (β-Ala8) -NKA (100 nmol / L) sukeltus susitraukimus visuose žarnyno segmentuose, išskyrus dvylikapirštės žarnos žiedinį raumenį (3B, 3E paveikslas). SB 218795 (1 μmol / L) šiek tiek sumažino Senktų sukeltus susitraukimus (100 nmol / L), nors šis sumažėjimas buvo statistiškai reikšmingas tik apatinio žandikaulio žiediniam raumeniui (3C pav., 3F).

Pilno dydžio lentelė

Image

(A ir D) L-733060 (L, 10–6 mol / L), tetrodotoksino (TTX, 10–6 mol / L) ir heksametonio (Hex, 10–4 mol / L) poveikis susitraukimams, kuriuos sukelia tachikinino NK1, [Sar9] SP (Sar9, 100 nmol / L) agonistas, išilginio ir apskrito lygiųjų raumenų, gautų iš triušio dvylikapirštės žarnos, jejunum ir šiluminės žarnos. (B ir E) GR-94800 (GR, 100 nmol / L), TTX ir Hex poveikis susitraukimams, kuriuos sukelia tachikinino NK2 ​​(β-Ala 8) -NKA (β-NKA, 100 nmol / L) agonistas. ) iš triušio dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir blauzdikaulio išilginių ir apskritų lygiųjų raumenų. (C ir F) SB 218795 (SB, 100 nmol / L), TTX ir Hex poveikis susitraukimams, kuriuos sukelia tachikinino NK3 agonistas Senistai (Sk, 100 nmol / L) triušio išilginiuose ir apskrituose lygiuosiuose raumenyse. dvylikapirštėje žarnoje, jejunum ir ileum. Stulpeliai rodo vidutines integruoto mechaninio aktyvumo reikšmes (TK agonisto procentas), o vertikalios juostos nurodo SEM. b P <0, 05, c P <0, 01. Skaičiai skliausteliuose nurodo segmentų skaičių.

Visas dydis

Tetrodotoksino (TTX) ir heksametonio poveikis TK receptorių agonistų sukeltiems susitraukimams

Mes ištyrėme, ar TK receptorių agonistai veikia tiesiogiai raumenis, ar netiesiogiai, nervų lygyje, naudojant TTX (1 μmol / L), Na + kanalų blokatorių neuronuose, ir heksametonio (100 μmol / L), blokatorių. nikotino receptoriai. TTX ir heksametonas sumažino [Sar9] SP (100 nmol / L) sukeltus susitraukimus visuose segmentuose, išskyrus žandikaulio išilginį raumenį (3A pav., 3D). TTX ir heksametonas sumažino (β-Ala8) -NKA (100 nmol / L) sukeltus susitraukimus visų trijų žarnyno segmentų žiediniame raumenyje (3E pav.). Hexamethonium, bet ne TTX, sumažino šiuos išilginio raumens susitraukimus (3B pav.). TTX sumažino Senktų sukeltus susitraukimus (100 nmol / L) visuose žarnyno segmentuose, išskyrus žandikaulį ir blauzdikaulio išilginius raumenis (3C paveikslas, 3F). Heksametonas sumažino šiuos susitraukimus visuose žarnyno segmentuose, išskyrus žiedinį žandikaulio raumenį (3C pav., 3F).

Atropino, guanetidino, TTX ir L- NNA poveikis SP poveikiui

Norėdami ištirti SP atsakų mechanizmą, mes ištyrėme, ar SP veikė tiesiogiai raumenis, ar netiesiogiai nervų lygyje. Žarnyno segmentų apdorojimas atropinu (1 μmol / l) 15 min. Sumažino SP sukeltus susitraukimus plonosios žarnos išilginiuose ir žiediniuose raumenyse (4A, 4B paveikslas). Papildomo poveikio atropino (1 μmol / L) sumažėjusiems SP susitraukimams nepastebėta, kai trys žarnyno segmentai buvo inkubuojami su atropinu (1 μmol / L) ir guanetidinu (1 μmol / L), atropinu (1 μmol / L). ) plius TTX (1 μmol / L) arba atropino (1 μmol / L) ir L- NNR (100 μmol / L) (4A, 4B paveikslai).

Image

Atropino (A, 1 μmol / L), atropino ir guanetidino (A + G, 1 μmol / L), atropino ir TTX (A + TTX, 1 μmol / L) ir atropino (1 μmol / L) ir L poveikis -NNR (100 μmol / L) (A + L -NNR) dėl susitraukimų, kuriuos sukelia SP (100 nmol / L) triušio dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir blauzdikaulio išilginiuose (A) ir apskrito (B) raumenyse. Stulpeliai nurodo vidutines integruoto mechaninio aktyvumo vertes (SP%), o vertikalios juostos nurodo SEM. e P <0, 05, c P <0, 01. Skaičiai skliausteliuose nurodo segmentų skaičių.

Visas dydis

Tarpląsteliniai SP veikimo mechanizmai

SP sukeltos susitraukimai (100 nmol / L, 3 min.) Buvo sumažinti Ca2 + neturinčiame Krebso tirpale, kuriame yra 0, 5 mmol / L EGTA, arba esant verapamiliui (100 nmol / L, 15 min), nuo įtampos priklausančiam Ca 2+ kanalo inhibitorius, išilginiame ir apskritime esančiuose dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir blauzdikaulio raumenyse (5A, 5B paveikslai). Žarnyno segmentų inkubacija 15 min. Su tapsidringinu (100 nmol / L), sarkoendoplazminio retikulumo Ca 2+ -ATPazių inhibitoriumi, arba ryanodinu (100 nmol / L), Ca 2+ išsiskyrimo iš sarkoplazminio retikulumo inhibitoriumi., nepakeitė sutraukiamojo atsako į SP (5A, 5B paveikslai); tačiau SP sukeltos susitraukimai sumažėjo esant staurosporinui (1 μmol / L, 15 min.), PKC inhibitoriui, ir U 73122 (100 nmol / L, 15 min.), PLC inhibitoriui, išilginiuose ir apskrituose raumenyse. plonoji žarna (5A, 5B paveikslai).

Image

Ca 2+ neturinčių tirpalų, turinčių 0, 5 mmol / L EGTA (0Ca), verapamilio (V, 100 nmol / L), thapsigargino (T, 100 nmol / L), ryanodino (R, 100 nmol / L), staurosporino, poveikis. St, 100 nmol / L) ir U 73122 (U, 100 nmol / L) dėl susitraukimų, kuriuos sukelia SP (100 nmol / L), triušio dvylikapirštės žarnos, jejunum ir iluminio raumens išilginiuose (A) ir apskrito (B) raumenyse. . Stulpeliai nurodo vidutines integruoto mechaninio aktyvumo vertes (SP%), o vertikalios juostos nurodo SEM. b P <0, 05, c P <0, 01. Skaičiai skliausteliuose nurodo segmentų skaičių.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime SP ir [Sar9] SP, NK1 receptorių agonistai, sukėlė triušio plonosios žarnos išilginio ir apskrito lygiųjų raumenų susitraukimus; esant [Sar9] SP, susitraukimai buvo didesni. L-733060, stiprus NK1 antagonistas, žymiai sumažino SP ir [Sar9] SP sukeltus susitraukimus. Tai rodo, kad egzistuoja NK1 receptoriai, kurie moduliuoja šiuos susitraukimus triušio plonojoje žarnoje. Mūsų rezultatai sutinka su kitų autorių išvadomis, kad tachikinino NK1 receptoriai yra susiję su žarnyno peristaltika 24 ir sužadinančiu neadrenerginiu bei necholinerginiu (NANC) perdavimu pelių ileum 25 .

Kaip parodyta mūsų eksperimentiniame modelyje, NKA ir (β-Ala8) -NKA, taip pat NKB ir Senkutai, tachikinino NK2 ​​ir NK3 receptorių agonistai, atitinkamai, sukėlė susitraukimus triušio plonosios žarnos išilginiame ir apskritime esančiuose lygiuosiuose raumenyse, tačiau šie susitraukimai buvo silpnesni nei tie, kurie buvo iškviesti SP. Esant toms pačioms koncentracijoms, NKA ir NKB sukėlė stipresnius susitraukimus nei (β-Ala8) -NKA ir Senktide. Be to, GR-94800 ir SB 218795, stiprūs ir selektyvūs NK2 ir NK3 antagonistai, atitinkamai sumažino SP sukeltus susitraukimus, o GR-94800 sumažino (β-Ala8) -NKA sukeliamus susitraukimus. SB 218795 iš dalies sumažino Senktų sukeltus susitraukimus visuose žarnyno segmentuose, nors ir nežymiai. Triušiams peristaltikos reguliavimas izoliuotoje distalinėje dvitaškėje greičiausiai vyksta suaktyvinus postjunkcinius sužadinimo tachikinino NK1 receptorius 24 . NK1 receptoriai taip pat dalyvauja mažėjančiose relaksantų reflekso reakcijose ir kylančioje susitraukime 26 . NK1 ir NK2 receptoriai aktyvuojami SP ir NKA sukeltų kontraktinių reakcijų metu šunų žarnos apvaliosios raumens 27 raumenyse ir tarpininkauja neadrenerginiam, necholinerginiam sužadinimo neurotransmisijai žiurkėno ileum 28 . Žiurkės žarnyno raumenų ląstelėse aprašytas NK1, NK2 ir NK3 tachikinino receptorių sambūvis 29 .

Mūsų tyrime tirtų agonistų stiprumas buvo įvertintas taip: [Sar9] SP> SP> NKA> NKB> (β-Ala8) -NKA = Senktų. Ši išvada atitinka kitus tyrimus su trimis TK receptorių potipiais, kuriuose NK1 receptorių stiprumas buvo SP = hHK-1≥NKA> NKB, o NKA> NKB> SP> hHK-1 (žmogaus hemokininas 1), skirtas NK2 receptoriams, ir NKB> NKA> hHK-1 (žmogaus hemokininas 1)> SP, skirtas NK3 receptoriui 5, 30, 31, 32 .

Mes ištyrėme, ar TK receptorių agonistai veikia tiesiogiai raumenis ar netiesiogiai nervų lygyje, naudodami TTX, Na + kanalų blokatorių neuronuose, ir heksametonio, nikotininių receptorių blokatorių. TTX ir heksametonas sumažino išilginio ir apskrito lygiųjų raumenų [Sar9] SP, (β-Ala8) -NKA ir Senktų sukeltus susitraukimus, kas rodo, kad yra preganglioninių nervų keliai. Tačiau faktas, kad tik nedidelė TK agonisto reakcijos dalis buvo užblokuota TTX arba heksametonio, rodo, kad pagrindinį kontraktilumo atsaką lemia TK receptoriai, esantys ant lygiųjų raumenų ląstelių. Iš tiesų, TTX ir heksametonas nekeičia susitraukimų, kuriuos sukelia įvairūs TK receptorių agonistai Suncus murinus ileum 6, 33 . Pranešama, kad tachikinino NK1, NK2 ir (arba) jų receptorius ekspresuoja neuronai, Kajalo intersticinės ląstelės, žarnyno raumenys, epitelis, kraujagyslės ir imuninė sistema specifiškai ląstelėms, regionams ir rūšims. 1, 3, 18, 19 . Tachikinino NK3 receptoriai, priešingai, pirmiausia yra ekspresuojami centrinėje nervų sistemoje ir buvo aptikti tik tam tikruose periferiniuose audiniuose, tokiuose kaip žmogaus ir žiurkės gimda, žiurkės mezenterinė vena ir tam tikri enteriniai neuronai iš įvairių rūšių žarnų 3, 20 .

Šiame tyrime mes ištyrėme SP veikimo mechanizmą triušio plonosiose žarnyno lygiuose raumenyse. SP sukėlė dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir blauzdikaulio išilginio ir apskrito lygiųjų raumenų susitraukimus nuo koncentracijos. Apskrito raumenų EC50 buvo šiek tiek didesnis nei plonosios žarnos išilginių raumenų. Šie rezultatai atitinka susitraukimus, kuriuos sukelia SP, aprašyti triušio ileumo 34 izotoniniuose įrašuose išilginiuose raumenyse.

Rezultatai parodė, kad SP sukeliami susitraukimai sumažėjo tirpaluose, kuriuose nėra Ca 2+ ir esant verapamiliui, tuo tarpu thapsigargin ar ryanodine jie nebuvo modifikuoti. Šie rezultatai rodo, kad tarpląstelinis Ca 2+ yra svarbesnis SP sukeltų susitraukimų metu, nei tarpląstelinis Ca 2+ ir kad tarpląstelinis Ca 2+ patenka į ląstelę nuo įtampos priklausomais Ca 2+ kanalais. Staurosporinas, PKC inhibitorius, ir U 73122, PLC inhibitorius, sumažino SP sukeltus susitraukimus plonosios žarnos išilginiuose ir apskrito raumenyse, ir tai rodo šių tarpląstelinių pasiuntinių vaidmenį. Verapamilis sumažina SP poveikį triušio ileum 34 . Ca 2+ antagonistai, tokie kaip verapamilis, nifedipinas ir diltiazemas, sumažina spontanišką avių dvylikapirštės žarnos veiklą 35 . Pelių storosios žarnos miocituose SP esant nedidelėms koncentracijoms hiperpolarizuoja raumenų ląsteles ir, esant didesnei koncentracijai, padidina bazinę citoplazminę Ca 2+ koncentraciją, padidindama Ca 2+ antplūdį per L tipo Ca 2+ kanalus. Be to, nifedipinas ir PFK inhibitorius GF 109203 blokavo SP sukeltą poveikį 36 . NK1 antagonistai konkurencingai slopina fosfolipazės C aktyvaciją [Pro9] SP kultivuojamuose žievės astrocituose37. Ankstesniuose tyrimuose spontaninių žarnyno susitraukimų amplitudė sumažėjo dėl laisvųjų Ca 2+ tirpalų, verapamilio ir nifedipino, o padidėjo thapsigarginas ir ciklopiazono rūgštis; tačiau tarpląstelinis ir tarpląstelinis Ca 2+ tarpininkauja ACh ir KCl sukeltiems susitraukimams 23, o K + kanalai tarpininkauja spontaniškiems triušio žarnyno susitraukimams 38 .

Šiame tyrime atropinas (1 μmol / L) sumažino SP sukeltus susitraukimus dvylikapirštės žarnos, žandikaulio ir blauzdikaulio išilginiuose ir žiediniuose raumenyse, tuo tarpu atropinas ir guanetidinas, atropinas ir TTX (1 μmol / L) arba atropinas ir L - NNA nesukėlė papildomo poveikio, palyginti su vien atropinu. Šie rezultatai rodo, kad atliekant SP sukeltus susitraukimus, suaktyvinant muskarininius receptorius, dalyvauja cholinerginis nervų kelias. Mūsų rezultatai, atvirkščiai, neturi teigiamo vaidmens adrenerginiams ir nitreginiams keliams, nes guanetidinas ir L- NNA nekeičia SP reakcijos; tačiau atropinas (0, 35 μmol / L) arba TTX (0, 31 μmol / L) įpilami į vonią 2 minutes prieš pridedant SP neturi įtakos SP sukeltam poveikiui triušio ileum 34 . Šis autorius išbandė trumpalaikį atropino poveikį susitraukimų amplitudėms esant mažesnei koncentracijai. Atropinas (1 μmol / L) slopina triušio gaubtinės žarnos, kuriai tarpininkauja NK2, varymo greitį ir sumažina TK receptorių agonistų poveikį Sancus murinus ileum 33, 39 . Mūsų rezultatai iš dalies sutampa su kitų pranešimų rezultatais, kai atropinas sumažino NK1 agonistų sukeltus susitraukimus ir padidino L- NNA 25, 40 . Šie autoriai siūlo, kad sužadinantis neadrenerginis ir necholinerginis perdavimas žiediniame raumenų sluoksnyje būtų vykdomas tachikininų, kurie daugiausia veikia NK1 receptorius, veikiančius cholinerginius nervus ir lygiųjų raumenų ląsteles.

Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad tachikinino NK1, NK2 ir NK3 receptoriai sukelia susitraukimus triušio žarnyno lygiajame raumenyje. Be to, tarpląsteliniai Ca 2+, PKC, fosfolipazės C ir cholinerginiai neuronai tarpina SP sukeliamus susitraukimus. Mes siūlome, kad SP tiesiogiai veiktų lygiųjų raumenų ląsteles per tachikinino NK1 receptorius.

Autoriaus indėlis

María Divina MURILLO sukūrė tyrimą ir parašė darbą. Marta Sofía VALERO ir Diego Santos FAGUNDES atliko tyrimus ir išanalizavo duomenis. Straipsnį parašė Laura GRASA. Miguelis Angelas PLAZA ir María Pilar ARRUEBO prisidėjo prie šio straipsnio diskusijų skyriaus.